PL193762B1 - Sposób wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego i zestaw do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego - Google Patents

Sposób wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego i zestaw do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego

Info

Publication number
PL193762B1
PL193762B1 PL98342898A PL34289898A PL193762B1 PL 193762 B1 PL193762 B1 PL 193762B1 PL 98342898 A PL98342898 A PL 98342898A PL 34289898 A PL34289898 A PL 34289898A PL 193762 B1 PL193762 B1 PL 193762B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleic acid
specific
anchors
nuclease
target
Prior art date
Application number
PL98342898A
Other languages
English (en)
Other versions
PL342898A1 (en
Inventor
Stephen Felder
Richard Kris
Original Assignee
Stephen Felder
Richard Kris
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stephen Felder, Richard Kris filed Critical Stephen Felder
Publication of PL342898A1 publication Critical patent/PL342898A1/xx
Publication of PL193762B1 publication Critical patent/PL193762B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B01J2219/00662—Two-dimensional arrays within two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Signal Processing For Digital Recording And Reproducing (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

1. Sposób wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze kon- taktuje sie próbke, która moze zawierac docelowy kwas nukleinowy ze specyficznym dla tego kwasu nukleinowe- go fragmentem ochrony przed nukleaza wiazacym sie ze wspomnianym docelowym kwasem nukleinowym, pod- daje sie ta próbke dzialaniu nukleazy skutecznej w trawieniu pozostalego jednoniciowego kwasu nukleinowego i nastepnie kontaktuje sie otrzymana próbke z kombinacja, która przed dodaniem tej wspomnianej próbki, zawiera: i) powierzchnie, zawierajaca wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa sa zasadniczo identyczne, a kazdy obszar obejmuje; ii) co najmniej dwie rózne kotwice, kazda w polaczeniu z; iii) bifunkcjonalnym lacznikiem, który ma pierwsza czesc specyficzna dla kotwicy, i druga czesc, która obejmuje sonde specyficzna dla fragmentu ochrony przed nukleazami, w warunkach skutecznych dla wiazania sie tej kombinacji z fragmentem ochrony przed nukleazami i wykrywa sie zwiazany fragment ochrony. 2. Sposób wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze kon- taktuje sie próbke, która moze zawierac docelowy kwas nukleinowy ze specyficznym dla tego kwasu nukleinowe- go fragmentem ochrony przed nukleaza wiazacym sie ze wspomnianym docelowym kwasem nukleinowym, two- rzac w ten sposób dupleks fragment ochrony przed nukleaza/docelowy kwas nukleinowy, poddaje sie ta próbke dzialaniu nukleazy skutecznej w trawieniu pozostalego jednoniciowego kwasu nukleinowego i nastepnie kontaktu- je sie otrzymana próbke z kombinacja, która przed dodaniem tej wspomnianej próbki, zawiera: i) powierzchnie, zawierajaca wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa sa zasadniczo identyczne, a kazdy obszar obejmuje; ii) co najmniej dwie rózne kotwice, kazda w polaczeniu z; iii) bifunkcjonalnym lacznikiem, który ma pierwsza czesc specyficzna dla kotwicy, i druga czesc, która obejmuje sonde specyficzna dla czesci wspomnianego dupleksu w warunkach skutecznych dla hybry- dyzacji i wykrywa sie kazdy zwiazany fragment ochrony. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego i zestawu do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego. Zarówno sposób według wynalazku jak i zestawy mogą być wykorzystane do równoczesnego przeprowadzania wielu testów biologicznych i chemicznych, z użyciem powtarzalnych uporządkowanych zestawów prób. Zasada działania opiera się na występowaniu wielu obszarów, z których każdy zawiera uporządkowany zestaw rodzajowych cząsteczek kotwiczących (ang. anchor molecules). Cząsteczki te będą w dalszej części zwane „kotwicami. Kotwice są związane z cząsteczkami łącznikowymi (ang. linker molecules) o podwójnej funkcji. Cząsteczki łącznikowe, będą w dalszej części zwane „łącznikami. Każdy z łączników składa się z części specyficznej do kotwicy oraz drugiej części, specyficznej do badanej cząsteczki docelowej. Tak zbudowany układ prób, może służyć do badania obecności jednej lub wielu, oddziaływujących specyficznie cząsteczek docelowych (badanych). Wynalazek może być szeroko stosowany w wielu dziedzinach, zróżnicowanych pod względem natury oddziaływań międzycząsteczkowych, włączając badania nad nowymi lekami, biologię molekularną, biochemię, farmakologię oraz technologie diagnostyki medycznej.
Wiele prób molekularnych, o których mowa w poprzednim akapicie, umieszczonych na różnych nośnikach lub chipach użyto w wielu testów chemicznych i biologicznych. Testy były przeprowadzane w celu ustalenia, czy badane cząsteczki oddziałują z którąkolwiek z prób. Ideą eksperymentu jest ekspozycja przygotowanych prób na badane cząsteczki w określonych warunkach oraz wykrywanie ewentualnej interakcji badana cząsteczka - próba, przez odpowiednie urządzenie detekcyjne.
Opisywane systemy są przydatne przy zdobywaniu informacji zarówno o zastosowanych próbach, jak cząsteczkach docelowych. Przykładowo, użyto ich w poszukiwaniu białek i potencjalnych leków, wiążących się specyficznie z odpowiednim receptorem, w przeszukiwaniu próbek pod kątem występowania mutacji genetycznych lub różnych alleli danych genów w populacji, również w poszukiwaniu specyficznych patogenów lub szczepów patogennych oraz przy badaniu ekspresji genów, przez identyfikację mRNA, którego ilość lub ekspresja jest związana z różnymi warunkami fizjologicznymi, fazami rozwoju lub chorobami.
Wynalazek pozwala na tworzenie kompozycji, urządzeń czy metod, które mogą być wykorzystane w równoczesnym przeprowadzaniu wielu testów chemicznych i biologicznych. Jednocześnie wynalazek ten umożliwia wysokowydajną analizę wielu próbek, przykładowo w przypadku testów diagnostycznych dla licznych próbek pobranych od pacjentów, czy przy analizie wielu potencjalnych leków i środków leczniczych w metodach poszukiwania leków. Dodatkowo, zastosowanie kombinacji prób jest niezwykle pomocne przy wykrywaniu kilku cząsteczek docelowych w pojedynczej próbce. Zastosowana kombinacja obejmuje powierzchnię zawierającą wiele dyskretnych (oddzielnych) obszarów, które można nazwać obszarami testowymi lub studzienkami, z których przynajmniej dwa są praktycznie identyczne. Każda powierzchnia powinna zawierać przynajmniej dwa, ale korzystne jest przynajmniej dwadzieścia lub więcej (np. przynajmniej 25, 50, 96, 864 lub 1536 itd.) takich tożsamych obszarów. Każdy obszar testowy stanowi miejsce podania próbki, zawierającej (lub potencjalnie zawierającej) jedną lub więcej docelowych (badanych) cząsteczek, każdy obszar musi zawierać uporządkowany zestaw prób biologicznych lub chemicznych. (Używając zwrotów: „próbka zawierająca cząsteczki docelowe (badane) czy „wykrywanie cząsteczek docelowych w próbce nie wyklucza się stosowania próbek, nie zwierających cząsteczek docelowych lub takich, gdzie cząsteczki docelowe nie są wykrywane. Zasadniczo wynalazek dotyczy uporządkowanych zestawów do określania, czy cząsteczki docelowe znajdują się próbce, bez względu na to czy są one wykrywane czy nie). Każdy uporządkowany zestaw zawiera zbiór rodzajowych kotwic, związanych z cząsteczkami łącznikowymi o podwójnej funkcji. Każda z cząsteczek łącznikowych składa się z części specyficznej do kotwicy oraz drugiej, specyficznej przynajmniej do jednej z badanych cząsteczek docelowych. Prezentowana kombinacja, po wejściu w kontakt z próbką, zawierającą jedną lub wiele cząsteczek docelowych, które mogą oddziaływać z cząsteczkami wykrywającymi (kotwica i łącznik) a później mogą być wykrywane przez urządzenie detekcyjne. Urządzenie to wykrywa oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami docelowymi i próbami w obszarach testowych, tym samym pokazując wynik testu.
Opisywany wynalazek dostarcza metodologię oraz kompozycje niezwykle użyteczne do wysokowydajnych testów biologicznych. W jednym z zastosowań wynalazek jest używany do wysokowydajnego poszukiwania leków. Przykładowo, jeden test może być przeprowadzony jednocześnie na wielu (np. 100) mikropłytkach, z których każda zawiera 96 studzienek (obszarów testowych). DodatPL 193 762 B1 kowo, w każdej studzience może być przeprowadzane przykładowo 36 testów, dzięki zastosowaniu uporządkowanego zestawu 36 par kotwica-łącznik. Czyli, 100 płytek, w każdej 96 studzienek, a w każdej studzience 36 testów, pozwala na przeprowadzenie 345000 testów. Zatem każdy z9600 różnych leków-kandydatów, może być testowany jednocześnie pod względem 36 parametrów. Testy przeprowadzane w wysokowydajnych układach, dostarczają o wiele więcej informacji dla każdego leku-kandydata, w porównaniu z testami, które sprawdzają tylko jeden parametr w tym samym czasie. Przykładowo, możliwe jest w prostym, wstępnym wysokowydajnym przeszukiwaniu ustalenie, czy potencjalny lek jest selektywny, specyficzny czy nietoksyczny. Inne, niewysokowydajne metody wymagają wnikliwych, następujących po sobie testów dla sprawdzenia wyżej wymienionych parametrów dla każdego leku-kandydata. Wiele odmian wysokowydajnych układów do przeprowadzania testów jest opisanych w przykładach 15-17. Możliwość przeprowadzania bardzo zróżnicowanych testów biologicznych, w tym samym czasie (ze znaczną wydajnością) jest ważną zaletą prezentowanego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego, polegający na tym, że kontaktuje się próbkę, która może zawierać docelowy kwas nukleinowy ze specyficznym dla tego kwasu nukleinowego fragmentem ochrony przed nukleazą wiążącym się ze wspomnianym docelowym kwasem nukleinowym, poddaje się tą próbkę działaniu nukleazy skutecznej w trawieniu pozostałego jednoniciowego kwasu nukleinowego i następnie kontaktuje się otrzymaną próbkę z kombinacją, która przed dodaniem tej wspomnianej próbki, zawiera:
i) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar obejmuje;
ii) co najmniej dwie różne kotwice, każda w połączeniu z;
iii) bifunkcjonalnym łącznikiem, który ma pierwszą część specyficzną dla kotwicy i drugą część, która obejmuje sondę specyficzną dla fragmentu ochrony przed nukleazami, w warunkach skutecznych dla wiązania się tej kombinacji z fragmentem ochrony przed nukleazami i wykrywa się związany fragment ochrony.
Następnie przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego, polegający na tym, że kontaktuje się próbkę, która może zawierać docelowy kwas nukleinowy ze specyficznym dla tego kwasu nukleinowego fragmentem ochrony przed nukleazą wiążącym się ze wspomnianym docelowym kwasem nukleinowym, tworząc w ten sposób dupleks, fragment ochrony przed nukleazą/docelowy kwas nukleinowy, poddaje się tą próbkę działaniu nukleazy skutecznej w trawieniu pozostałego jednoniciowego kwasu nukleinowego i następnie kontaktuje się otrzymaną próbkę z kombinacją, która przed dodaniem tej wspomnianej próbki, zawiera:
i) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar obejmuje;
ii) co najmniej dwie różne kotwice, każda w połączeniu z;
iii) bifunkcjonalnym łącznikiem, który ma pierwszą część specyficzną dla kotwicy i drugą część, która obejmuje sondę specyficzną dla części wspomnianego dupleksu w warunkach skutecznych dla hybrydyzacji i wykrywa się każdy związany fragment ochrony.
W korzystnym wykonaniu tego sposobu każdy obszar zawiera co najmniej cztery różne kotwice oligonkleotydowe, ewentualnie może też zawierać co najmniej osiem różnych kotwic oligonkleotydowych. Także korzystnie, obszar taki może zawierać co najmniej około 64 różnych kotwic oligonukleotydowych.
Każdy obszar korzystnie może zawierać, co najmniej około 96 do około 1536 zasadniczo identycznych oddalonych przestrzennie obszarów.
Każdy z wymienionych obszarów może zawierać od 4 do 1536 zasadniczo identycznych oddalonych przestrzennie obszarów, a każdy z obszarów zawiera około 8 do około 100 różnych kotwic oligonukleotydowych.
Korzystnie w sposobie według wynalazku każda powierzchnia zawiera około 4, 8, 96, lub 384 zasadniczo identycznych oddalonych przestrzennie obszarów, a każdy obszar zawiera około 8 do około 100 różnych kotwic oligonukleotydowych.
Także korzystnie, każdy obszar zawiera około 30 do około 100 sond, z których każda jest specyficzna wobec różnych cząsteczek docelowych, ponadto każdy wspomniany obszar jest dodatkowo podzielony na mniejsze podobszary, które mogą być korzystnie studzienką na płytce do mikromianowania.
PL 193 762 B1
W sposobie według wynalazku wspomniane kotwice są oligonukleotydami o długości 30 do 50 nukleotydów. W jednym lub więcej obszarów znajdują się ponadto kontrole skuteczności, specyficzności hybrydyzacji lub kontrole pojemności miejsca wiążącego cząsteczkę docelową. Sposób według wynalazku obejmuje korzystnie, kontaktowanie wspomnianych kombinacji i każdego związanego fragmentu ochronny przed nukleazę ze znakowaną sondą detekcji i wykrywanie wspomnianej sondy detekcji. Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje ponadto:
a) poddanie próbki zawierającej cząsteczkę docelową związaną z fragmentami ochrony przed nukleazami obróbce za pomocą jednej lub większej liczby nukleaz skutecznych w trawieniu kwasu nukleinowego innego niż fragment ochrony przed nukleazą, który hybrydyzował z badanym kwasem nukleinowym i ewentualnie częścią tego kwasu i;
b) usuwanie materiału kwasu nukleinowego innego niż wspomniany fragment chroniony przed nukleazą, który hybrydyzował z badanym kwasem nukleinowym, w celu dostarczenia próby zawierającej chroniony przed nukleazą fragment.
Zgodnie ze sposobem według wynalazku identyfikuje się wzór ekspresji RNA, przy czym co najmniej dwa wspomniane chronione przed nukleazą fragmenty są specyficzne wobec różnych cząsteczek RNA.
Korzystnie także identyfikuje się czynnik modulujący wzór ekspresji RNA, obejmujący ponadto porównywanie wzoru ekspresji RNA wytworzonego w obecności tego czynnika ze wzorem ekspresji RNA wytwarzanym w innym zestawie warunków.
Również korzystnie, identyfikuje się czynnik modulujący interakcję wspomnianego fragmentu chronionego przed nukleazą ze wspomnianą sondą, przy czym fragmenty chronione przed nukleazą mogą stanowić korzystnie DNA.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, amplifikację DNA przeprowadza przed kontaktowaniem próbki zawierającej fragmenty chronione przed nukleazą z kombinacją, korzystnie w reakcji PCR. Docelowy kwas nukleinowy korzystnie zawiera polimorfizm. Kombinacja może zawierać dużą ilość wspomnianych obszarów, przy czym sposób według wynalazku jest sposobem wysokowydajnym.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje ponadto usuwanie bifunkcjonalnych łączników z kotwic oligonukleotydowych i zastąpienie ich zasadniczo identycznymi lub różnymi bifunkcjonalnymi łącznikami, reprogramowując wspomniane powierzchnie i powtarzanie sposobu wykrywania cząsteczki docelowej. Również korzystnie kotwice są oddysocjowywane z bifunkcjonalnych łączników posiadających różną specyficzność docelową.
Próbkę, w sposobie według wynalazku, generuje się przez inkubowanie lub hodowlę komórkową, która może zawierać wspomniane komórki docelowe i przez ekstrahowanie kwasu nukleinowego z tych komórek. Sposób według wynalazku jest stosowany do diagnozowania lub do przewidywania chorób, gdzie mierzy efekt działania leku, lub identyfikuje się czynnik posiadający efekt terapeutyczny lub który mierzy skuteczność, bezpieczeństwo lub metabolizm leku.
Korzystnie sposób ten obejmuje ponadto etap kontaktowana wspomnianej kombinacji i dowolnej związanej nukleazowej sondy zabezpieczającej ze znakowaną sondą detekcji, która wytwarza sygnał chemiluminyscencyjny i etap wykrywania tej sondy detekcji.
Korzystnie co najmniej jeden ze wspomnianych celi jest cząsteczką DNA i co najmniej jeden ze wspomnianych celi jest cząsteczką RNA. Co najmniej ze jeden wspomnianych fragmentów zabezpieczających przed nukleazą jest specyficzny dla cząsteczki DNA i co najmniej jeden ze wspomnianych fragmentów zabezpieczających przed nukleazą jest specyficzny dla cząsteczki RNA. Także korzystnie oba cele mogą być cząsteczkami DNA, a wspomniane kotwice mogą być kotwicami oligonukleotydowymi.
Przedmiotem wynalazku jest także, zestaw przydatny do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego w próbce, charakteryzujący się tym, że zawiera a) co najmniej jeden fragment chroniący przed nukleazą specyficzny dla wspomnianego kwasu nukleinowego, lecz nie specyficzny do żadnej z kotwic oligonukleotydowych w zestawie, b) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera co najmniej dwie różne kotwice oligonukleotydowe, i c) pojemnik zawierający co najmniej jedną bifunkcjonalną cząsteczkę łącznika, która ma pierwszą część specyficzną dla co najmniej jednej kotwicy oligonukleotydowej i drugą część która zawiera sondę, która jest specyficzna dla niej i wiąże się do co najmniej jednego wspomnianego fragmentu ochronnego przed nukleazą.
PL 193 762 B1
Zestaw ten może zawierać ponadto,
d) jedną lub większą ilość nukleaz skutecznych w trawieniu pojedynczej nici kwasu nukleinowego i/lub nici RNA dupleksu DNA/RNA.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw przydatny do wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego próbce, charakteryzujący się tym, że zawiera:
a) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera co najmniej dwie różne kotwice oligonukleotydowe, oraz
b) pojemnik zawierający co najmniej jedną cząsteczkę bifunkcjonalnego łącznika, którego pierwsza część jest specyficzna wobec co najmniej jednej kotwicy oligonukleotydowej, a druga część, obejmującą sondę, która jest specyficzna wobec co najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinowego, i
c) jedną lub więcej nukleaz skutecznych w trawieniu pojedynczej nici kwasu nukleinowego i/lub nici RNA dupleksu DNA/RNA.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw przydatny do wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego w próbce, charakteryzujący się tym, że zawiera,
a) powierzchnię zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera co najmniej dwie różne kotwice oligonukleotydowe, oraz
b) zestaw instrukcji do i) przeprowadzenia procedury zabezpieczenia pożądanego kwasu nukleinowego przed nukleazą, stosując chroniące przed nukleazą fragmenty specyficzne dla tego kwasu nukleinowego oraz, ii) przyłączenia do co najmniej jednej takiej kotwicy oligonukleotydowej bifunkcjonalnej cząsteczki łącznikowej, która ma pierwszą część specyficzną dla co najmniej jednej wspomnianej kotwicy oligonukleotydowej i druga część, która zawiera sondę specyficzną dla co najmniej jednego wspomnianego fragmentu ochronnego przed nukleazą.
W jednym z zastosowań, używając np. płytek DNA Bind z 96 studzienkami (Corning Costar) wykonanych z polistyrenu z powierzchnią przygotowaną do przyłączania pierwszorzędowych amin, takich jak aminokwasy lub modyfikowane oligonukleotydy, możliwe jest naniesienie zestawu 36 różnych oligonukleotydów na powierzchni każdej studzienki w ramach pojedynczej płytki, aby służyły jako kotwice. Takie kotwice mogą być związane kowalencyjnie do derywatyzowanego polistyrenu i te 36 kotwic może być wykorzystane w wielu testach. Przy każdym teście, można wykorzystać dany uporządkowany zestaw łączników dla zaprogramowania powierzchni każdej studzienki, aby uzyskać możliwość specyficznego wiązania dla 36 cząsteczek docelowych (ew. testów docelowych). Ponadto różne próbki mogą być zastosowane dla każdej z 96 studzienek na każdej płytce. Dodatkowo, każdy uporządkowany zestaw kotwic może być używany wiele razy po przeprogramowaniu powierzchni studzienki. Ponownie można go użyć w celu zbadania innych cząsteczek lub przeprowadzenia kolejnych testów. Uporządkowany zestaw kotwic może być ponownie użyty z tym samym zestawem łączników. Możliwość łatwej modyfikacji i ponownego użycia danego uporządkowanego zestawu, stanowi kolejną ważną zaletę omawianego wynalazku.
Wynalazek jest zilustrowany na następujących figurach: figura 1 i 2 ilustrują sposób wykrywania mRNA stanowiącego cel. Powierzchnia pokazana na fig. 1, zawiera 15 właściwie identycznych obszarów testowych; w tym korzystnym wykonaniu, każdy obszar testowy jest pojedynczą studzienką płytki mikrotitracyjnej. Każdy obszar testowy zawiera 6 różnych kotwic, tutaj zaznaczonych numerami 1-6. Figura 1 schematycznie ilustruje jedną z kotwic, kotwicę 1, będącą oligonukleotydem (najbardziej korzystne wykonanie wynalazku). Kotwica 1 jest połączona z łącznikiem 1, złożonym z dwóch części. Jedna z nich, specyficznie połączona z kotwicą, na rysunku jest to oligonukleotyd, hybrydyzujący z kotwicą. Drugą część, specyficzną do cząsteczki docelowej, tutaj docelowe mRNA 1, stanowi kolejny oligonukleotyd, hybrydyzujący z cząsteczką docelową. Pozostałe pięć kotwic może hybrydyzować z innymi, specyficznymi łącznikami poprzez sekwencje komplementarne, każdy z łączników zawiera część specyficzną do badanej cząsteczki (tu mRNA), takiej samej lub innej niż mRNA 1. Przedstawiona kombinacja może być użyta do jednoczesnego badania 15 różnych próbek pod względem występowania mRNA 1 (albo mRNA specyficznych do pięciu pozostałych prób uporządkowanego zestawu). W celu przeprowadzenia testu, każda próbka, która w tym przypadku może być ekstraktem mRNA z jednej z piętnastu różnych linii komórkowych, jest dodawana w małej objętości do jednego z obszarów testowych (studzienki) i inkubowana w warunkach umożliwiających hybrydyzację próby z cząsteczkami docelowymi. W celu stwierdzenia, czy mRNA 1 jest obecne w badanej próbce, wykorzystywane jest urządzenie do detekcji, które rozpoznaje odpowiedni wzór i/lub może rozpoznać specyficz6
PL 193 762 B1 ne położenie w każdym obszarze testowym na podstawie odpowiedniego sygnału. Jeżeli komórki były hodowane w warunkach pozwalających na znakowanie mRNA in vivo przy użyciu odpowiedniej etykiety, i jeżeli mRNA 1 jest obecne w próbce, urządzenie do detekcji rozpozna sygnał pochodzący od znakowanego mRNA w pozycji zdefiniowanej przez kompleks kotwica/łącznik 1. Innym sposobem detekcji może być znakowanie mRNA in vitro, przed lub po nałożeniu do obszarów testowych (studzienek). Dodatkowo, tak jak pokazano na fig. 1, mRNA może być znakowane niebezpośrednio, przed lub po hybrydyzacji do oligonukleotydu - próby np. przez inkubację RNA ze znakowanym „wykrywającym oligonukleotydem, komplementarnym do sekwencji innej niż tej, rozpoznawanej przez próbę kotwica/łącznik. W przedstawionym przykładzie 15 próbek może być analizowane jednocześnie. Ponieważ przynajmniej 20 lub więcej (np. 1536 lub więcej) próbek może być analizowana jednocześnie, opisywany wynalazek jest bardzo wysokowydajnym układem do przeprowadzania różnych testów.
Użyty tu termin „cząsteczka docelowa (ew. „cel lub „cząsteczka badana) dotyczy substancji, której obecność, aktywność i/lub ilość należy oznaczyć. Jednocześnie substancja ta musi mieć powinowactwo do danej próby (kompleksu kotwica/linker). Cząsteczkami docelowymi mogą być naturalne lub zsyntetyzowane substancje, występujące w niezmienionej (pierwotnej) postaci lub zagregowane z innymi cząsteczkami. Cząsteczki docelowe mogą być związane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z inną substancją bezpośrednio lub przez specyficzną substancję wiążącą. Przykładami substancji, które mogą być wykorzystane w omawianym wynalazku mogą być między innymi: receptory (na pęcherzykach, lipidach, błonach komórkowych i inne), ligandy, związki o charakterze agonistów i antagonistów, wiążących się specyficznie do receptorów, przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, surowice reagujące ze specyficznymi determinantami antygenowymi (wirusami, komórkami i innymi związkami), leki, kwasy nukleinowe i polinukleotydy (mRNA, tRNA, rRNA, oligonukleotydy, DNA, RNA lub DNA wirusów, EST, cDNA, produkty namnożone na matrycy RNA lub DNA w reakcji PCR oraz różne warianty lub modyfikacje (np. przez mutacje) wyżej wymienionych), białka (enzymy, np. te odpowiedzialne za cięcie neurotransmiterów, proteazy, kinazy i inne), substraty reakcji enzymatycznych, peptydy, kofaktory, lektyny, cukry, polisacharydy, komórki, błony komórkowe, organelle itp. Dodatkowo inne substancje, występujące w skompleksowanych lub kowalencyjnie związanych formach. Terminy: kwasy nukleinowe, polinukleotydy, kwasy polinukleotydowe, oligonukleotydy używane są zamiennie w niniejszym opracowaniu. Cząsteczki docelowe (zamiennie cele, cząsteczki badane) mogą być również nazywane „antypróbami.
Użyty tu termin „próba („kompleks kotwica-łącznik) dotyczy substancji np. cząsteczki, która może być rozpoznawana przez określoną cząsteczkę docelową. Do potencjalnych typów oddziaływań, próba/cel lub cel/próba, należą: receptor/ligand, ligand/antyligand, oddziaływania kwasów nukleinowych (DNA/DNA, DNA/RNA, PNA (ang. Peptide nucleic acid/kwas nukleinowy), dodatkowo oddziaływania enzymów i innych katalizatorów lub substancji z substratami, małymi cząsteczkami lub efektorami. Przykładami prób, które mogą mieć zastosowanie w omawianym wynalazku są między innymi: substancje organiczne i nieorganiczne lub polimery, włączając matale, chelatory oraz inne związki, mogące oddziaływać specyficznie z metalami, ponadto plastiki, związki o charakterze agonistów i antagonistów dla receptorów błon komórkowych, toksyny i jady, epitopy wirusowe, hormony (np. steroidy, opioidy, peptydy itp.) receptory hormonów, lipidy (również fosfolipidy), peptydy, enzymy (proteazy i kinazy), substraty enzymów, kofaktory, leki, lektyny, cukry, kwasy nukleinowe (DNA, RNA, PNA, oraz ich zmodyfikowane i podstawione wersje) oligosacharydy, białka, enzymy, monoklonalne i poliklonalne przeciwciała, przeciwciała złożone z pojedynczych łańcuchów lub ich fragmenty. Polimery wykorzystane jako próby mogą być liniowe lub cykliczne. Wykorzystywane próby można również podzielić na białka ufosforylowane lub nie, biorąc pod uwagę różną aktywność lub powinowactwo. Próby typu lektyn, można wyróżnić wśród glikozylowanych białek. Terminy: kwasy nukleinowe, polinukleotydy, kwasy polinukleotydowe, oligonukleotydy używane są zamiennie w niniejszym opracowaniu. Dowolna substancja opisywana tutaj jako próba może służyć za cząsteczkę docelową i vice-versa.
W zasadzie dowolna powierzchnia może być użyta do związania substancji w opisywanym wynalazku. Powierzchnia (zwykle o stanie skupienia stałym) może być dowolnym związkiem organicznym lub nieorganicznym (lub kombinacją obu wymienionych), włączając przykładowo: plastiki (polipropylen, polistyren), związki ceramiczne, silikon, krzem, kwarc, lub szkło. Powierzchnie mogą mieć grubość: mikroskopowego szkiełka podstawkowego lub nakrywkowego, papieru (bibuły filtracyjnej), dwuazowanej celulozy, filtrów nitrocelulozowych, błon nylonowych, lub podstawek do żeli poliakrylamidowych. Powierzchnie przezroczyste mogą być wykorzystywane, kiedy metoda przeprowadzenia testu wymaga optycznej detekcji. W korzystnym wykonaniu, powierzchnia zrobiona jest z plastiku,
PL 193 762 B1 jednocześnie będąc podzielona na szereg studzienek (np. 24, 96, 256, 384, 864, czy 1536studzienkowa płytka do hodowli tkankowych - np. zmodyfikowana płytka typu Corning Costar DNA Bind). Kotwice mogą być związane bezpośrednio z powierzchnią lub niebezpośrednio, przez związanie z innym typem powierzchni (np. szkłem), które kolejno jest dołączana do drugiej powierzchni (np. do plastikowych studzienek na płytce mikrotitracyjnej). Kształt powierzchni nie ma znaczenia, może to być przykładowo płaska powierzchnia (kwadrat, prostokąt lub elipsa), zakrzywiona powierzchnia lub powierzchnia trójwymiarowa (ziarno, cząsteczka, nić, osad, tuba, sfera).
Powierzchnia złożona jest z przestrzennie nieciągłych (dyskretnych), adresowalnych lub identyfikowalnych obszarów, zwanych „obszarami testowymi. Każdy z tych obszarów zawiera uporządkowany zestaw kotwic. Fizyczne parametry oraz względne położenie obszarów nie jest istotne. W jednym z wykonań obszary testowe są oddzielone od siebie barierą fizyczną, uniemożliwiającą przepływanie płynów. Przykładowo (w korzystnym wykonaniu) obszary stanowią studzienki na 24, 96, 256, 384, 864, czy 1536-studzienkowej płytce do hodowli tkankowych. Obszary testowe mogą być przygotowane również przez wytrawienie szklanej powierzchni w taki sposób, aby uzyskać np. 864 lub 1536 płytkich studzienek. Ewentualnie powierzchnia może zawierać obszary testowe bez podziału na pojedyncze studzienki, przykładowo płaska powierzchnia (kawałek plastiku, papieru lub szkła) a pojedyncze obszary są później zdefiniowane przez nałożenie innych struktur (np. kawałki plastiku lub szkła) opisujących oddzielne obszary. Opcjonalnie, powierzchnia może zawierać jeden lub więcej uporządkowanych zestawów kotwic lub kotwic związanych z łącznikami, zanim pojedyncze obszary testowe zostaną nakreślone. W innych wykonaniach, uporządkowane zestawy kotwic w pojedynczych obszarach mogą być oddzielone od siebie przez puste (pozbawione kotwic) miejsca na powierzchni lub przez granice chemiczne, zapobiegające rozprzestrzenianiu się kropel, takie jak wosk czy silikon. Jeszcze innym rozwiązaniem jest zdefiniowanie obszarów testowych jako tub lub kanałów, co może być wykorzystane do testów przepływowych (Beattie et al. (1995) Clin. Chem. 4, 700-706). Obszary w lub na powierzchni można również uzyskać przez modyfikacje samej powierzchni. Przykładowo plastikowe powierzchnie mogą zawierać fragmenty zmodyfikowanego plastiku lub jego pochodnych, mogących służyć za miejsca dołączania odpowiednich typów polimerów (np. PEG może być dołączany do polistyrenowych powierzchni, a następnie modyfikowane grupami karboksylowymi, aminowymi, podwójnymi wiązaniami, aldehydami lub podobnymi). Innym rozwiązaniem jest plastikowa powierzchnia, zawierająca odlane struktury (zagłębienia lub występy), mogące służyć jako „platformy do dołączania kotwic. Względna pozycja obszarów testowych nie ma znaczenia, obszary mogą być ułożone równolegle lub prostopadle na powierzchni w kształcie kwadratu, prostokąta lub innej, możliwe jest również ułożenie radialne na powierzchni o kształcie koła bądź ułożenie liniowe.
Rozdzielone przestrzennie obszary testowe omawianego wynalazku występują w wielu kopiach. Każda powierzchnia powinna zawierać przynajmniej dwa, ale korzystne jest przynajmniej dwadzieścia (np. 25, 50, 96, 864, 1536, 2025 lub więcej itd.) praktycznie identycznych, rozdzielonych obszarów. Zwiększenie liczby obszarów testowych pozwala na osiągnięcie wyższej wydajności w testach. Termin „praktycznie identyczne obszary, dotyczy obszarów testowych, zawierających takie same uporządkowane zestawy kotwic i/lub kompleksów kotwica/łącznik. Praktycznie identyczny znaczy także, że dwa uporządkowane zestawy prób lub obszary pełnią taką samą funkcję w analizie cząsteczek docelowych. Różnice nie dotyczące funkcji tj. dotyczące detekcji cząsteczek docelowych np. niedoskonałości nukleotydów (insercje, substytucje, pomięcia) niedoskonałości oligonukleotydów (słabe wiązanie do powierzchni) nie zmieniają znacznie wyników testów.
Biegły w danej dziedzinie zauważy, że nie wszystkie obszary testowe na powierzchni muszą być praktycznie identyczne. Przykładowo, w dwóch różnych uporządkowanych zestawach, które mają być testowane równolegle, korzystne jest umieszczenie ich na pojedynczej powierzchni. Dwa różne uporządkowane zestawy mogą być ułożone w postaci następujących po sobie pasków, dzięki czemu otrzymane wyniki testów mogą być łatwo porównywane. W innym wykonaniu, różne obszary testowe mogą być ułożone tak, aby mogły być wykrywane w pełni odróżnialny sposób, dzięki czemu zyskuje się tzw. „obszary rejestracyjne. Przykładowo, obszar rejestracyjny może zawierać oligonukleotydy lub peptydy, mogące dawać charakterystyczny wzór fluorescencyjny, rozpoznawany przez urządzenie detekcyjne jako punkt startu dla ustalania pozycji pozostałych obszarów na danej powierzchni.
Fizyczna wielkość obszarów testowych jest nieograniczona. Typowe obszary zajmują powie22 rzchnie do 1 do 700 mm2, ale korzystne są wielkości od 1 do 40 mm2, natomiast przerwy pomiędzy obszarami wahają się między 0,5 i 5 mm i są wybierane w zależności od zajmowanej powierzchni. W korzystnym wykonaniu, obszary są rozdzielone przerwami o szerokości 5 mm. Przykładowo, każdy
PL 193 762 B1 obszar może zawierać prostokątną siatkę z np. 8 wierszami i 6 kolumnami kotwic w kształcie koła o średnicy 100 m m, rozmieszczonych od siebie w odległości 500 m m. Taki obszar zajmuje kwadrat o powierzchni ok. 20 mm2.
Obszary mogą być dodatkowo podzielone w taki sposób, że kotwice w każdym obszarze są fizycznie oddzielone od siebie wycięciem lub dołkiem. Przykładowo, liczba podzielonych części w pojedynczym obszarze (subobszarów) może się wahać pomiędzy 10 a 100. W przykładowym wykonaniu, obszar, który jest pojedynczą studzienką na 1536-studzienkowej płytce, może być dodatkowo podzielony na mniejsze studzienki np. od 4 do 900 (korzystna liczba to od 16 do 36), tworząc tym samym uporządkowany zestaw studzienek w studzienkach (patrz fig. 4). Tak utworzona powierzchnia zmniejsza tolerancję potrzebną do fizycznego umiejscowienia pojedynczej kotwicy (lub grupy kotwic) w każdą „przegródkę, dodatkowo rozmiar obszaru zawierającego kotwice jest bardziej jednolity, co ułatwia wykrywanie cząsteczek docelowych, związanych z próbą.
Określenie „kotwica w niniejszym opracowaniu dotyczy bytu lub substancji tj. cząsteczki (lub grupy takich substancji, patrz fig. 7), które są związane (immobilizowane, połączone kowalencyjnie lub niekowalencyjnie) z powierzchnią, stanowią część takiej powierzchni (będąc pochodną plastikowej powierzchni) oraz mogące oddziaływać specyficznie lub asocjować z łącznikami lub innymi substancjami, tak jak opisano. Kompleks kotwica/łącznik powstaje w momencie, kiedy dojdzie do asocjacji kotwicy i łącznika w specyficzny sposób. Oddziaływanie z łącznikiem może być nieodwracalne, np. przez wiązanie kowalencyjne lub odwracalne np. przez hybrydyzacje kwasów nukleinowych. W korzystnym wykonaniu, kotwica jest kwasem nukleinowym dowolnej długości (np. oligonukleotyd) i typu (np. DNA, RNA, PNA, produkt reakcji PCR na matrycy DNA lub RNA). Kwas nukleinowy może być zmodyfikowany lub podstawiony (np. zawierać nukleotydy nie występujące naturalnie np. inozyna, połączony różnymi substancjami, takimi jak sulfonian, sulfamid, fosforotionian, metylofosfonian, karbanimian, lub stanowić półsyntetyczną cząsteczkę taką jak połączenie DNA-steptawidyna). Korzystne są jednoniciowe kwasy nukleinowe. Kotwica może być również białkiem lub peptydem. Przykładowo, monoklonalnym lub poliklonalnym przeciwciałem lub jego fragmentem, przeciwciałem zbudowanym z pojedynczego łańcucha lub jego fragmentem, które wiąże się specyficznie z częścią łącznika, która jest antygenem lub antyprzeciwciałem. Jednocześnie kotwica może być peptydem, zaś część łącznika, które się wiąże z kotwicą, może stanowić przeciwciało lub podobne cząsteczki. W innym wykonaniu, kotwicą może być lektyna (konkanawalina A lub aglutyniny z takich organizmów jak: Limulus, orzech ziemny, fasola mung, Phaseolus, ziarna pszenicy itp.), specyficzna do określonego węglowodanu. W innym wykonaniu, kotwica może być cząsteczką organiczną, będącą pochodną lub zmodyfikowanym polimerem plastiku, mogącym służyć np. jako podłoże dla chemicznej syntezy oligonukleotydów w fazie stałej. W tym przypadku, pochodne plastiku mogą być rozmieszczone jako zestaw oddzielonych miejsc, które są uformowane w powierzchni plastiku podczas procesu produkcji. W jeszcze innym wykonaniu, kotwice mogą wykorzystać właściwości specyficznego wiązania pomiędzy jonami metali np. Ni, Zn, Ca, Mg itp. i określonych białek lub chalatorów. Przykładowo, kotwica może być łańcuchem polihistydynowym, zaś częścią łącznika, specyficzną do kotwicy nikiel, dołączony do części specyficznej dla cząsteczki docelowej przez określony chelator. Ewentualnie, chelator może stanowić kotwicę, zaś łańcuch polihistydynowy częścią łącznika. W jeszcze innym wykonaniu, kotwica może być związkiem nieorganicznym, przykładowo metalem typu wapń lub magnez, zaś częścią łącznika, specyficzną do kotwicy chelator taki jak EDTA lub EGTA, dołączony do części specyficznej do cząsteczki docelowej. Biegły w tej dziedzinie zauważy, że wiele innych typów cząsteczek, dyskutowanych przy okazji omawiania połączeń próba/cząsteczka docelowa, może być wykorzystana jako kotwice.
Liczba kotwic w obszarze testowym musi wynosić co najmniej dwa, ale korzystny jest zakres 8-900 (włączając również niższe i wyższe wartości). Bardziej korzystnymi wartościami jest liczba obszarów w zakresie 8-300, lecz najodpowiedniejszą wartością, zakres 30-100 (np. ok. 64). W niektórych korzystnych wykonaniach, jest 16, 36, 45 lub 100 kotwic w pojedynczym obszarze testowym na powierzchni zawierającej 96 obszarów testowych (np. studzienek) lub 9, 16 lub 25 kotwic na obszar testowy na powierzchni zawierającej 384 obszarów testowych (np. studzienek). W najbardziej korzystnym wykonaniu, każda kotwica w obszarze testowym ma inną specyficzność w porównaniu z innymi kotwicami w uporządkowanym zestawie. Jednakże, dwie lub więcej kotwic może wykazywać tę sama specyficzność, a nawet wszystkie kotwice mogą być identyczne. W jednym wykonaniu, w którym kombinacja związana z wynalazkiem zawiera bardzo dużą liczbę obszarów testowych (np. 864, 1536 i więcej), co pozwala na testowanie wielu próbek jednocześnie, koPL 193 762 B1 nieczne może być testowanie wymienionych próbek tylko dla ograniczonej liczby parametrów (np. 2, 4, 6 lub 9). Innymi słowy, dla wysokiej liczby obszarów testowych, pomocne może być umieszczenie tylko 2 do 9 kotwic na pojedynczy obszar.
Rozmieszczenie oraz wzajemna orientacja kotwic w obszarze testowym nie ma znaczenia. Typowa odległość między kotwicami waha się pomiędzy 0,003 a 5 mm lub 0,03 a 1 mm (wartości mniej korzystne). Dopuszczalne są również mniejsze lub większe przerwy między kotwicami. Kotwice mogą być rozmieszczone w dowolnej orientacji względem siebie i względem granic obszaru testowego. Przykładowo mogą być rozmieszczone w orientacji dwuwymiarowej, na obszarze o kształcie kwadratowym, prostokątnym lub heksagonalnym lub w inny, uporządkowany sposób. Inną możliwością jest rozmieszczenie kotwic na obszarze o kształcie koła w sposób radialny lub współśrodkowy. Można je również umieszczać w postaci linii. Przykładowo, oligonukleotydy mogą hybrydyzować do specyficznych sekwencji DNA lub RNA, tworząc wielocząsteczkowy uporządkowany zestaw. Dodatkowo, kotwice mogą być ułożone tak jak wzory kodów kreskowych (patrz fig. 6). Przykładowo, kotwice mogą być ułożone w linie równoległe. Odległości między tymi liniami oraz ich szerokości mogą się różnić w pewien charakterystyczny sposób, tak aby tworzyć rozpoznawalny kod kreskowy np. pierwsza i trzecia linia każdego zestawu jest dwa razy szersza od pozostałych, niektóre linie mogą być pomijane itp. Ponadto, ostatnia linia może być pomijana, aby rozgraniczyć obszary testowe, a kod kreskowy może być powtarzany w następnych obszarach testowych.
Wzór rozmieszczenia kotwic nie musi być dokładnie skorelowany z rozmieszczeniem oddzielnych studzienek testowych (obszarów testowych). Określenie „pozycja testu będzie używane do określenia dokładnej pozycji nakładania próbek na powierzchni testowej (pozycja taka może być zdefiniowana miejscem pojedynczej kropli testowanej próbki lub miejscem występowania ścian lub separatorów określających pojedynczą studzienką na wielo-studzienkowej płytce). Rozmieszczenie kotwic wg określonego wzoru (np. rozmieszczenie oligonukleotydów na zasadzie kodu kreskowego) jest stosowane dla dokładnego określenia pozycji pojedynczej kotwicy i może być realizowane dzięki rozpoznaniu określonego wzoru (tak jak rozpoznawanie każdej linii w kodzie kreskowym dzięki określonej pozycji pozostałych linii). Dlatego też pierwsza kotwica powinna być na jednej z krawędzi lub rogu każdej pozycji testu. Pierwsza kotwica będzie odszukiwana raczej przez rozpoznanie określonego wzoru, niż odszukanie określonego miejsca względem pozycji testu. O ile obszar używany jako miejsce testu (powierzchnia kropli lub powierzchnia studzienki) jest dostatecznie duży, aby zmieścić co najmniej jeden cały zestaw powtarzającego się wzoru kotwic, wówczas każdy punkt testowy, będzie testował próbkę w tym punkcie testowym, pod kątem wszystkich cząsteczek docelowych, wyznaczonych wzorem kreskowym, wszędzie tam gdzie ten wzór znajduje się w obrębie obszaru gdzie jest przeprowadzany test.
Kotwice nie muszą być ułożone w ściśle określony, a nawet stały wzór na obszarze testowym. Przykładowo, każda kotwica może być przyłączona do cząstki, ziarna lub podobnej, co w rezultacie daje losową pozycję na obszarze testowym. Położenie każdej kotwicy może być określone np. dzięki zastosowaniu wykrywalnej etykiety. Przykładowo łącznik specyficzny do każdej z kotwic może być wyznakowaną etykietę fluorescencyjny lub luminescencyjny, dzięki czemu pozycja cząstki zawierającej parę kotwica/łącznik może być określona przez analizę sygnału emitowanego przez łącznik np. spektrum emisji lub wzbudzenia. Biegły w określonej dziedzinie, może przygotować zestaw łączników wyznakowanych różnymi etykietkami, z których każda będzie się charakteryzowała odróżnialnym spektrum. Ewentualnie kotwice mogą być wyznakowane bezpośrednio. Przykładowo, każdy typ kotwicy może być wyznakowany etykietą fluoryzującą różnym spektrum niż inne typy etykiet na innych kotwicach. Jeszcze innym sposobem jest wykorzystanie cząstek odróżnialnych od siebie, przykładowo ziaren o różnym kształcie i rozmiarze. Dowolna opisana tu metoda znakowania i detekcji może być użyta. Przykładowo, fluorescencja może być mierzona przy użyciu systemów wykorzystujących czujniki typu CCD, fluorescencyjną mikroskopie skaningową lub technikę FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter).
Kotwica może oddziaływać lub być zasocjowana z częścią łącznika specyficzną do kotwicy. Określenia „oddziaływać lub „być zasocjowanym oznaczają, że dwie substancje lub komponenty (np. kotwica i część łącznika specyficzna do kotwicy, próba z cząsteczką docelową, cząsteczka docelowa i specyficzna do niej cząsteczka reporterowa) są połączone (kowalencyjnie, na zasadzie hybrydyzacji, przyłączania (ang. anniling), przyłączone lub połączone w inny sposób) w taki sposób, że pożądany test może być przeprowadzony. Określenie „specyficzny lub „specyficznie oznacza, że dwa komponenty (np. kotwica i część łącznika specyficzna do kotwicy, próba z cząsteczką docelową, cząsteczka
PL 193 762 B1 docelowa i specyficzna do niej cząsteczka reporterowa) łączą się selektywnie ze sobą i, gdy nie stosowana jest żadna technika ochronna, nie łączą się z innymi niepożądanymi komponentami. Warunki potrzebne do osiągnięcia specyficznego oddziaływania mogą być ustalane rutynowo, przy zastosowaniu konwencjonalnych metod.
Dla kwasów nukleinowych, przykładowo, biegły w tej dziedzinie może ustalić eksperymentalnie pożądane parametry (takie jak długość, skład, temperatura hybrydyzacji), które będą pozwalały kwasom nukleinowym (np. kotwicom oligonukleinowym) na hybrydyzację z innym kwasem nukleinowym (np. częścią łącznika specyficzną do kotwicy) w odpowiednio ostrych warunkach, które zminimalizują niespecyficzną hybrydyzację i innymi substancjami i cząsteczkami (np. innym łącznikiem oligonukleotydowym). Normalnie sekwencja DNA lub innego kwasu nukleinowego kotwicy, części łącznika, lub oligonukleotydu wykrywającego ma wystarczającą komplementarność do cząsteczki, z którą ma hybrydyzować, aby doszło do hybrydyzacji w odpowiednich ostrych warunkach, a Tm będzie wynosić od 10 do 20°C powyżej temperatury pokojowej (np. 37°C). W typowych układach długość kotwicy oligonuklotydowej waha się pomiędzy 8 a 50 nukleotydów, korzystne długości to 15, 20, 25 lub 30 nukleotydów. Użyty tu termin „ostre warunki hybrydyzacji dotyczy warunków hybrydyzacji, podczas gdy istnieje 95% (korzystne od 97% do 100%) komplementarność (identyczność) między kwasami nukleinowymi. Jednakże, w zależności od przeznaczenia, warunki hybrydyzacji mogą być dobrane wtaki sposób, aby mogły hybrydyzować mniej komplementarne cząsteczki (np. 90%, 85%, 75%, 50% itp.). Wśród warunków hybrydyzacji, które mogą być zmieniane, należy wymienić; stężenie soli, skład buforu, pH, temperaturę, czas inkubacji, stężenie i typ czynnika denaturującego (np. formamidu) itp. (patrz np. Sambrook et al. (1989). Molecular cloning: A Laboratory Manual (2n ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, New York; Hames et al. (1985). Nucleic Acid Hybridization, IL Press; Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, lnc, New York). Przykładowo, kwas nukleinowy (np. oligonukleotyd łącznikowy) może być dodany do obszaru testowego (np. studzienki na płytce, w korzystnym wykonaniu płytka 96 lub 384 lub więcej studzienkowa) w objętości wahającej się między 0,1 a 100 lub więcej ml (w korzystnym wykonaniu 1 do 50, a najlepiej 40 ml) w stężeniu rzędu 0,01-50 m M (w korzystnym wykonaniu ok. 0,1 m ,M), w buforze takim jak np. 6xSSPET(0,9M NaCl, 60mM NaH2PO4, 6mM EDTA i 0,05% Triton X-100) i hybrydyzowany i odpowiednim kwasem nukleinowym (np. oligonukleotydową kotwicą na powierzchni) przez ok. 10 min do 3 godz. (korzystne przynajmniej 15 min) w temperaturze od 4 do 37°C (korzystna temperatura pokojowa). Warunki powinny być dobierane, aby uzyskać wysoką wydajność. W jednym z wykonań warunki są zbliżone do warunków fizjologicznych.
Dobór innych typów substancji lub cząsteczek (polipeptydów, lektyn itp.), mogących służyć jako np. kotwice lub określone części łączników oraz dobór warunków potrzebnych do osiągnięcia specyficznego oddziaływania z inną substancją lub cząsteczką jest techniką rutynową w określonej dziedzinie (np. opisaną w Niemayer et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22, 5530-5539; Fodor et al (1996). U.S. Patent No. 5,510,270); Pirrung et al. (1992), U.S. Patent No. 5,143,854). Do parametrów inkubacyjnych należą: skład buforu, stężenie soli, pH, temperatura, czas inkubacji, obecność substancji nośnikowych i/lub warunków zmniejszających niespecyficzne oddziaływania itp.). Przykładowo do obszaru testowego (np. studzienka na płytce, w korzystnym wykonaniu płytka 96 lub 384 lub więcej studzienkowa), zawierającego kotwice w postaci przeciwciał, anty-przeciwciała mogą być dodane (np. antygeny lub drugorzędowe przeciwciała), w objętości wahającej się między 0,1 a 100 lub więcej ml (w korzystnym wykonaniu 1do 50, a najlepiej 40 ml), w stężeniu rzędu 10pM-10nM (w korzystnym wykonaniu ok. 1nM), w buforze typu 6xSSPE, PBS lub roztworze soli fizjologicznej i inkubowane z kotwicami na powierzchni przez ok. 10 min do 3 godz. (korzystne przynajmniej 15 min) w temperaturze od 4°C do 45°C (korzystna temperatura 4°C). Dla kotwic w postaci peptydów korzystna jest długość od 5 do 20 aminokwasów.
W niektórych wykorzystaniach wynalazku, każda kotwica w uporządkowanym zestawie może oddziaływać z częścią odpowiedniego łącznika specyficzną do kotwicy z tą samą mocą co z innymi kotwicami w danym uporządkowanym zestawie w określonych warunkach reakcji. Fakt ten upewnia, że kotwice stanowią określony uporządkowany zestaw łączników, a tym samym prób.
Kotwice w obszarze testowym mogą być ogólnym zestawem, w którym każda kotwica może oddziaływać z jednym lub wieloma różnymi łącznikami. W każdym z łączników można wyróżnić dwie części, jedną specyficzną do kotwicy, a drugą, różniącą łączniki, specyficzną do cząsteczki badanej (docelowej). Zatem pojedynczy uporządkowany zestaw kotwic może być zaprogramowany, tak aby stanowić zróżnicowany zestaw prób. Łatwość modyfikacji takiego zestawu (elastyczność) kotwic
PL 193 762 B1 przedstawiono i opisano na fig. 1 i fig. 2. Figura 2 pokazuje powierzchnię, zawierającą 15 obszarów testowych, a każdy z nich uporządkowany zestaw 6 różnych kotwic, które w tym przepadku są oligonukleotydami. fig. 1 schematycznie ilustruje jedną z kotwic, kotwicę 1, będącą oligonukleotydem. Kotwica 1 jest połączona z łącznikiem 1, złożonym z dwóch części. Jedną specyficzną do kotwicy, zaś drugą, specyficzną do cząsteczki docelowej mRNA 1. Ewentualnie łącznik 1 może być zastąpiony łącznikiem 2, który zawiera jedną specyficzną do kotwicy, lecz drugą, specyficzną do innej cząsteczki docelowej -mRNA 2. Zatem kotwica 1może być użyta do określenia (zaprogramowania, zdefiniowania, zdeterminowania) prób dla dwóch lub większej liczby docelowych mRNA. Proces generowania uporządkowanych zestawów oligonukleotydów lub peptydów o wysokiej rozdzielczości może być drogi i czasochłonny i/lub trudny do wykonania. Natomiast możliwość użycia uporządkowanego zestawu kotwic do zaprogramowania uporządkowanego zestawu gotowych prób dużej różnorodności stanowi zaletę tego wynalazku.
Chociaż kotwice przedstawione na fig. 2 określają wzór prób oligonukleotydowych, identyczny uporządkowany zestaw kotwic mógłby być użyty do zaprogramowania zestawu innych prób np. białek receptorowych (patrz fig. 3). Istnieje wiele możliwości modulacji, efektem których mogą być różne typy układów kotwica/łącznik np. nawet bardziej złożone, warstwowe układy, będące kombinacjami zależności białko - przeciwciało. Zatem, sama powierzchnia kotwic, zaproponowana w tym wynalazku jest nowatorskim rozwiązaniem.
W jednym wykorzystaniu wynalazku, kotwice mogą oddziaływać odwracalnie z łącznikami, zatem zestaw kotwic może być wielokrotnie użyty dla zaprogramowania różnych zestawów prób. Przykładowo kotwica oligonukleotydowa, może być oddzielona od oligonukleotydowej części łącznika przez np. podgrzanie, powodujące dysocjację oligonukleotydów. Po oddysocjowaniu, kotwice mogą być wykorzystane do połączenia z innym łącznikiem.
Możliwość ponownego użycia uporządkowanych zestawów kotwic, których proces przygotowania może być drogi i czasochłonny i/lub trudny do wykonania, stanowi dodatkową zaletę opisywanego wynalazku.
Kotwica nie koniecznie musi być połączona z łącznikiem. Przykładowo, kotwica może być połączona (bezpośrednio lub pośrednio) do wykrywalnej cząsteczki, takiej jak fluorochrom i w ten sposób możliwe jest jej zlokalizowanie na obszarze testowym np. w celach ustalenia zależności między powierzchnią testową a detektorem. Ewentualnie, kotwica może być wyznakowana znaną ilością wykrywalnej substancji, aby móc służyć jako wewnętrzny marker ilości np. do kalibracji.
Stosowany tu termin łącznik oznacza bifunkcjonalny związek chemiczny, który zawiera jedną część (fragment, porcję), specyficzną względem wybranej (oznaczanej) kotwicy albo podzbioru kotwic („specyficzna wobec kotwicy) i drugą część, będącą sondą specyficzną dla cząsteczki docelowej („specyficzna względem cząsteczki docelowej). Dwie części łącznika mogą być połączone wiązaniami kowalencyjnymi lub niekowalencyjnymi, jak też mogą łączyć się bezpośrednio lub pośrednio.
Właściwości chemiczne części łącznika specyficznej wobec kotwicy zależą oczywiście od kotwicy lub kotwic, z którymi oddziałują. Przykładowo, jeśli kotwica jest oligonukleotydem, część łącznika, która z nią oddziałuje, może być na przykład białkiem wiążącym się specyficznie z oligonukleotydem albo kwasem nukleinowym, skutecznie i specyficzne hybrydyzującym z nim w wybranych warunkach hybrydyzacji. Kwas nukleinowy może być np. oligonukleotydem, DNA, RNA, PNA, produktem reakcji PCR lub podstawionym albo zmodyfikowanym kwasem nukleinowym (np. zawierającym nukleotydy nie występujące naturalnie, jak np. inozyna połączone przez rozmaite znane wiązania, takie jak siarczanowe, sulfamidowe, fosforosiarczanowe, metylosiarczanowe, karbaminianowe; lub częściowo syntetyczne cząsteczki, jak połączenie DNA-streptawidyna). Korzystne jest użycie cząsteczek jednoniciowych. Część łącznika specyficzna względem kotwicy oligonukleotydowej może mieć długość od około 8 do około 50 nukleotydów, najlepiej około 15, 20, 25 lub 30 nukleotydów. Jeśli kotwica jest przeciwciałem, część łącznika z nią oddziałująca może być np. anty-przeciwciałem, antygenem lub mniejszym fragmentem jednej z tych cząsteczek, specyficznie oddziałującym z kotwicą. Związki lub cząsteczki oddziałujące specyficznie z innymi rodzajami kotwic, opisanymi powyżej, i mogące służyć jako kotwico-specyficzna część łącznika są dobrze znane w dziedzinie i mogą być projektowane z zastosowaniem standardowych zasad (np. patrz wyżej).
Właściwości chemiczne części łącznika specyficznej względem cząsteczki docelowej zależą oczywiście od cząsteczki, dla której jest sondą i z którą oddziałuje. Przykładowo, jeśli obiektem jest szczególne mRNA, specyficzna względem cząsteczki docelowej część łącznika może być np. oligonukleotydem, wiążącym się specyficznie do celu, a nie wiążącym się z innymi cząsteczkami RNA lub
PL 193 762 B1
DNA w wybranych warunkach hybrydyzacji. Osoby biegłe w dziedzinie, przy użyciu znanych w dziedzinie metod, określają doświadczalnie cechy oligonukleotydu optymalnie hybrydyzującego z cząsteczką docelową i w minimalnym stopniu hybrydyzującego z niespecyficznym, innym DNA lub RNA (np. patrz wyżej). Na ogół długość sondy oligonukleotydowej stosowanej do rozróżnienia cząsteczki docelowego mRNA przy obecności tła składającego się z dużego nadmiaru różnych RNA, nie będących celem, może się wahać od około 8 do około 50 nukleotydów, najlepiej około 18, 20, 22 lub 30 nukleotydów. Sonda oligonukleotydowa do zastosowania w teście biochemicznym, w którym nie ma dużego tła współzawodniczącego z cząsteczką docelową, może być krótsza. Przy użyciu znanych w dziedzinie sposobów postępowania (np. program komputerowy BLAST) można wybrać sekwencje sond oligonukleotydowych w taki sposób, aby się wzajemnie nie wiązały i były niepodobne do znajdujących się w znanych bazach danych genetycznych sekwencji potencjalnie zakłócających wiązanie. Warunki hybrydyzacji pozwalające na specyficzną hybrydyzację sondy oligonukleotydowej do RNA można określić standardowo, posługując się metodami znanymi w dziedzinie (np. patrz wyżej). Przykładowo, będący cząsteczką docelową RNA [(np. całkowity RNA lub mRNA wyizolowany z tkanek lub wyhodowanych komórek (ewentualnie potraktowanych odpowiednim środkiem), w jakimś naczyniu, jak studzienka wielostudzienkowej płytki mikrotitracyjnej (np. 96, 384 lub więcej studzienek)] można umieścić na obszarze testowym zawierającym uporządkowany zestaw sond oligonukleotydowych (patrz powyżej) w buforze takim jak 6xSSPE-T lub innym, ewentualnie zawierającym środek zmniejszający niespecyficzne wiązanie (np. zdegradowane DNA ze spermy łososia czy śledzia w stężeniu około 0,5 mg/ml lub RNA z drożdży) i inkubowanym w doświadczalnie ustalonej temperaturze przez czas od około 10 minut do co najmniej 18 godzin (w korzystnym wykonaniu wynalazku około 3 godzin). Warunki hybrydyzacji mogą być równie ostre lub mniej ostre od warunków używanych do połączenia kotwic z częścią łączników specyficzną wobec kotwic.
Projektowanie i stosowanie innych rodzajów sond jest również standardowe w dziedzinie, np. jak omówiono powyżej.
Kotwico-specyficzna i specyficzna względem cząsteczki docelowej część łącznika mogą być połączone (przyłączone, dołączone) przez jakiekolwiek z różnorodnych kowalencyjnych czy niekowalencyjnych wiązań, których rodzaj nie jest istotny dla wynalazku. Dwie części mogą łączyć się bezpośrednio lub za pośrednictwem innej cząsteczki. W wykonaniu wynalazku, w którym obie części łącznika są oligonukleotydami, mogą się one łączyć przez wiązania kowalencyjne, jak wiązania fosfodiestrowe, tworząc pojedyncze liniowe cząsteczki kwasu nukleinowego. W innym wykonaniu, w którym kotwico-specyficzna część jest oligonukleotydem a część specyficzna względem celu jest receptorem, na przykład białkiem receptorowym, dwie części mogą się łączyć przez oddziaływanie cząsteczek biotyny i streptawidyny, czego przykład pokazano na fig. 8. Znane są liczne warianty takich połączeń (np. patrz Niemeyer et al. (1994) Nuc. Acids Res 22, 5530-5539. W innym wariancie dwie części mogą łączyć się bezpośrednio, np. oligonukleotyd może być amidowany, a następnie przyłączony bezpośrednio (np. związany poprzecznie) do peptydu lub białka poprzez wiązanie amidowe lub też połączony ze składnikiem błony przez wiązanie amidowe czy przyłączony lipid. Metody tworzenia takich wiązań kowalencyjnych lub niekowalencyjnych są standardowe i łatwo optymalizowane przez osoby biegłe w tej dziedzinie.
Po połączeniu dwóch związków (np. porzez inkubację dwóch kwasów nukleinowych, dwóch białek, białka i kwasu nukleinowego lub innych) w celu utworzenia ich kompleksu (jak np. kompleks kotwica/łącznik), powstały kompleks można ewentualnie traktować (np. przez przemywanie), aby usunąć niezwiązane związki (np. łączniki), stosując warunki określone doświadczalnie jako pozostawiające w nietkniętej formie oddziałuje na specyficzne, ale usuwające substancje związane niespecyficznie. Przykładowo, mieszaniny reakcyjne mogą być przemywane od jeden do dziesięciu lub więcej razy w takich samych lub nieco ostrzejszych warunkach niż zastosowane do wytworzenia kompleksu (np. kompleksu kotwica/łącznik).
Kombinacje według niniejszego wynalazku można wytwarzać standardowo, przy użyciu zwyczajowej technologii.
Niektóre z powierzchni, które mogą być użyte w niniejszym wynalazku, są łatwo dostępne u komercyjnych dostawców. W korzystnym wykonaniu wynalazku, powierzchnią jest 96-, 384- lub 1536 studzienkowa płytka mikrotitracyjna, taka jak zmodyfikowane płytki sprzedawane przez Corning Costar. W innym przypadku, powierzchnię zawierającą studzienki, które z kolei zawierają wgłębienia albo dołeczki można uformować przez mikroobróbkę substancji takiej jak aluminium lub stal w celu wytworzenia formy, a następnie mikrowstrzyknięcie do tej formy plastiku lub podobnego
PL 193 762 B1 materiału, tak aby powstała struktura podobna do pokazanej na fig. 4. Alternatywnie, struktura taka jak pokazana na fig. 4, składająca się ze szkła, plastiku, masy ceramicznej lub podobnych substancji, może zostać złożona, np. z trzech części, takich jak pokazane na fig. 5: pierwszej części, nazwanej separatorem studzienek (fig. 5a), tworzącej oddzielenie studzienek testowych; drugiej części nazwanej wtórnym separatorem (fig. 5b), która utworzy wtórne podziały, czy też dołeczki, wewnątrz każdej studzienki testowej; oraz trzeciej części, nazwanej podstawą (fig. 5c), która stanowi podstawę płytki i dolną powierzchnię studzienek testowych. Separator może być przykładowo kawałkiem tworzywa, np. silikonu, z otworami umieszczonymi w odstępach, w taki sposób, że po połączeniu trzech części każdy otwór stanie się ściankami studzienki testowej. Wtórny separator może być, przykładowo, cienkim kawałkiem tworzywa, np. silikonu, ukształtowanym w sito albo cienką siatkę. Podstawa może być płaskim kawałkiem materiału, np. szkła, w kształcie, na przykład, dolnej części typowej płytki mikrotitracyjnej stosowanej w oznaczeniach biochemicznych. Górna powierzchnia podstawy może być płaska, jak pokazana na fig. 5c, lub może być ukształtowana we wgłębienia, które ułożą się równo z wtórnym separatorem, tworząc pełne wtórne podziały, czy studzienki, wewnątrz każdej studzienki testowej. Trzy części można połączyć standardowymi sposobami, na przykład sposobami stosowanymi przy łączeniu płytek silikonowych.
Kotwice oligonukleotydowe, cząsteczki łącznika czy detektory można syntetyzować przy użyciu zwyczajowych technologii, np. komercyjnego urządzenia do syntezy oligonukleotydów i/lub przez łączenie mniejszych fragmentów w ten sposób wytworzonych. W jednym z wykonań wynalazku gotowe kotwice z kwasu nukleinowego, jak kotwice oligonukleotydowe, można umieścić na lub w powierzchni obszaru testowego przy pomocy jakiejkolwiek z różnorodnych zwyczajowych technik, obejmujących chemiczne przyłączenie przez fotolitografię lub sitodruk, umieszczenie przy pomocy technologii strumienia tuszu, kapilarnej, sita lub płynnych kanałów półprzewodnikowych, odwzorowanie elektrochemiczne przy użyciu matrycy elektrod, zetknięcie z igłą lub tuleją, lub denaturację, a następnie zapieczenie czy naświetlenie filtrów światłem UV (patrz np. Rava et al. (1996), patent USA nr 5 545 531; Fodor et al. (1996) patent USA nr 5 510 270; Zanzuchci et al. (1997), patent Stanów Zjednoczonych nr 5 643 738; Brennan (1995) patent USA nr 5 474 796; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070). Kotwice można umieścić na górnej powierzchni obszaru testowego lub też można, jak w przypadku podkładki z żelu poliakryloamidowego, mogą być osadzone w powierzchni w taki sposób, że niektóre kotwice wystają z powierzchni i są dostępne do oddziaływań z łącznikiem. W korzystnym wykonaniu wynalazku wytwarza się pochodne gotowych kotwic oligonukleotydowych, z wolnymi grupami aminowymi na końcach 5'; rozpuszcza się je w stężeniu standardowo wyznaczanym doświadczalnie (np. 1 mM) w buforze takim jak 50 mM bufor fosforanowy, pH 8,5 i 1 mM EDTA; następnie rozmieszcza przy pomocy nanostrumieniowego dozownika Pixus (Cartesian Technologies) w postaci 10,4 nanolitrowych kropelek w specyficznych położeniach wewnątrz studzienki testowej, której górna powierzchnia jest świeżą, suchą płytką wiążącą DNA (Corning Costar). W zależności od względnej szybkości przyczepiania oligonukleotydów i parowania, podczas przygotowywania może być potrzebna kontrola wilgotności w studzienkach. W innym wykonaniu wynalazku kotwice mogą być syntetyzowane bezpośrednio na powierzchni obszaru testowego, z zastosowaniem standardowych metod, takich jak np. aktywowane światłem odblokowywanie rosnących łańcuchów oligonukleotydowych (np. w połączeniu z kierującą w specyficzne miejsce maską) lub przez rozmieszczanie według odpowiedniego wzoru nanolitrowych kropelek związku dezaktywującego przy pomocy nanostrumieniowego dozownika. Można na przykład odblokować wszystkie rosnące sekwencje, do których ma zostać dołączony pojedynczy nukleotyd, po czym dodać nukleotyd na całą powierzchnię.
Peptydy, białka, lektyny, związki chelatowe, tworzywa sztuczne oraz inne rodzaje kotwic lub cząsteczek łącznika również można wytwarzać standardowo, a kotwice można umieszczać na lub wewnątrz powierzchni przy użyciu odpowiedniej dostępnej technologii (patrz np. Fodor et al. (1996), patent USA nr 5 510 270; Pirrung et al. 1992 patent USA nr 5 143 854; Zanzucchi et al. (1997) patent USA nr 5 643 728; Lowe et al. (1985) patent USA nr 4 562 157; Niemeyer et al. (1994) NAR 22, 5530-5539).
W niektórych wykonaniach wynalazku ujawnione połączenia są wykorzystywane do różnorodnych procedur przesiewowych i/lub do uzyskania informacji o stężeniu, aktywności lub strukturze sond albo cząsteczek docelowych. Takie analizy nazywa się metodą czy testem MAPS (Multi Array Plate Screen, analiza uporządkowanych zestawów na płytkach), a powierzchnie zawierające uporządkowane zestawy kotwic plus sondy stosowane do testów nazywa się uporządkowanymi zestawami MAPS lub płytkami MAPS.
PL 193 762 B1
Składniki mieszaniny reakcyjnej, testu czy procedury badawczej mogą być złożone w dowolnej kolejności. Przykładowo, kotwice, łączniki i cząsteczki docelowe można dołączać kolejno; lub też cząsteczki docelowe i łączniki, w obecności lub przy braku wskaźników, można połączyć w roztworze i następnie złączyć z kotwicami.
Jedno z wykonań wynalazku dotyczy sposobu wykrywania co najmniej jednej cząsteczki docelowej, obejmującego:
a) doprowadzenie do kontaktu próbki, która może zawierać cząsteczkę(-i) docelową(-e) z bifunkcjonalnym łącznikiem, którego pierwsza część jest specyficzna wobec kotwicy oligonukleotydowej, a druga część, która obejmuje sondę, jest specyficzna wobec tej cząsteczki(-ek) docelowej(-ych), w warunkach efektywnych dla otrzymania produktu pierwszej hybrydyzacji pomiędzy taką cząsteczką(-ami) docelową(-ymi) z takim łącznikiem,
b) doprowadzenie do kontaktu produktu pierwszej hybrydyzacji z kombinacją w warunkach efektywnych dla otrzymania produktu drugiej hybrydyzacji pomiędzy takim produktu pierwszej hybrydyzacji z taką kombinacją, gdzie taka kombinacja zawiera przed dodaniem produktu pierwszej hybrydyzacji,
1) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera
2) co najmniej 8 różnych kotwic oligonukleotydowych,
c) doprowadzenie do kontaktu produktu pierwszej hybrydyzacji z produktem drugiej hybrydyzacji z wyznakowaną wykrywalną sondą, oraz
d) wykrywanie takiej wykrywalnej sondy.
Każdy z testów i procedur opisanych poniżej można wykorzystać w wysokowydajnych procedurach, w których na każdej płytce testuje się dużą liczbę próbek (np. tak dużo jak 864, 1036, 1536, 2025 lub więcej, w zależności od liczby obszarów w kombinacji) na każdej płytce lub powierzchni, szybko i równocześnie. Co więcej, wiele płytek czy powierzchni można testować jednocześnie. Przykładowo, w metodach poszukiwania leków, duża liczba próbek, z których każda zawiera lek-kandydat (np. związek z chemicznej biblioteki kombinatorycznej, jak odmianę małych cząsteczek, peptydów, oligonukleotydów lub innych substancji), może zostać dodana do oddzielnych obszarów kombinacji według wynalazku tak jak opisano lub może zostać dodana do próbek biologicznych bądź biochemicznych, które następnie zostają dodane do oddzielnych regionów kombinacji i są inkubowane z uporządkowanymi zestawami sond umieszczonych w tych obszarach; testy można wykonać dla każdej z prób. Wobec ostatnich osiągnięć i postępującego rozwoju mikropłytek o wysokiej gęstości, narzędzi do nakraplania DNA i metod, takich jak laserowa technologia wytwarzania i zbierania danych z nawet najgęstszych mikropłytek, robotyki, ulepszonych dozowników, skomplikowanych systemów detekcji i oprogramowania do obróbki danych, metody według tego wynalazku mogą być stosowane do badania lub analizy tysięcy czy dziesiątek tysięcy lub więcej związków dziennie.
Na przykład, wykonanie wynalazku, w którym sondami są oligonukleotydy, może być też diagnostycznym badaniem kwasu nukleinowego lub polinukleotydu (np. wiązanie czy inny test) w dużej liczbie próbek pod kątem obecności zróżnicowania genetycznego lub wad genetycznych (np. polimorfizmów lub specyficznych mutacji związanych z chorobami, takimi jak mukowiscydoza, patrz np. Litia et al. (1992) Molecular and Cellular Probes 6, 505-512; organizmów patogennych (jak bakterie, wirusy i pierwotniaki, których gospodarzami są zwierzęta, łącznie z ludźmi, albo rośliny), lub wzory transkrypcji mRNA diagnostyczne dla szczególnych stanów fizjologicznych lub chorób. Uporządkowane zestawy sond z kwasów nukleinowych zawierające części sekwencji EST (włączając kopie pełnej długości) mogą być stosowane do oceny wzoru transkrypcji wytworzonego przez komórki, z których pochodziły sekwencje EST (lub innych). Sondy z kwasów nukleinowych mogą również wykrywać peptydy, białka lub domeny białek wiążące się specyficznie do szczególnych sekwencji kwasów nukleinowych (i odwrotnie).
W innym wykonaniu wynalazku kombinacje według wynalazku można zastosować do kontrolowania reakcji biochemicznych, takich jak np. oddziaływania białek, kwasów nukleinowych, małych cząsteczek lub tym podobnych, na przykład wydajności lub specyficzności oddziaływań między antygenami a przeciwciałami; lub receptorów (takich jak oczyszczone receptory lub receptory związane z błonami) i ich ligandów, agonistów lub antagonistów; lub też enzymów (jak proteinazy i kinazy) i ich substratów, lub wzrostu czy spadku ilości związku przekształcanego w produkt; jak również wielu innych. Takie testy biochemiczne mogą być używane w celu scharakteryzowania właściwości sondy lub cząsteczek będących celem, albo jako podstawa testu. Przykładowo, aby przebadać próbki pod kątem
PL 193 762 B1 obecności poszczególnych proteaz (np. proteaz biorących udział w krzepnięciu krwi, jak proteaza Xa i Vlla), próbki mogą być testowane w kombinacjach, w których sondami są fluorogenne substraty specyficzne dla każdej z badanych proteaz. Jeśli badana proteaza wiąże się z substratem i go rozcina, substrat fluoryzuje, zwykle w wyniku rozcięcia i rozdzielenia dwóch par przekazujących energię, zatem można wykryć sygnał. Jako inny przykład, aby przeszukać próbki pod kątem obecności specyficznej kinazy lub kinaz (np. kinazy Src, kinazy tyrozynowej, lub ZAP70), próbki zawierające jedną lub więcej badanych kinaz można testować w kombinacjach, w których sondy są peptydami, które mogą być wybiórczo fosforylowane przez jedną z badanych kinaz. Stosując znane w dziedzinie, standardowo określane warunki, próbki można inkubować z uporządkowanym zestawem substratów, w odpowiednim buforze i niezbędnymi kofaktorami, przez doświadczalnie określony czas (w niektórych testach, np. badaniach biochemicznych czynników regulujących aktywność badanych kinaz, stężenie każdej z kinaz można ustalić w ten sposób, aby każdy z substratów był ufosforylowany w podobnym stopniu). Po traktowaniu (np. przemywaniu) każdej reakcji w doświadczalnie ustalonych warunkach w celu usunięcia kinaz i (ewentualnie) niepożądanych składników reakcji, można wykrywać ufosforylowane substraty, np. inkubując je z wykrywalnymi odczynnikami, jak np. wyznakowane fluoresceiną przeciwciała przeciw fosfotyrozynie lub fosfoserynie (np. w stężeniu 10 nM, lub mniejszym czy większym). W innym wariancie można zbadać zdolność wiązania. Przykładowo, domeny SH2, takie jak GRB2 SH2 czy ZAP70 SH2 można testować na uporządkowanym zestawie sond z odpowiednich ufosforylowanych peptydów; można też na uporządkowanym zestawie sond dla poszczególnych receptorów przebadać osocza krwi na niedobory odporności. Również testy enzymatyczne można wykonywać w podobnym formacie uporządkowanego zestawu elementów. Kombinacje według wynalazku można również stosować do wykrywania zmutowanych form enzymów, która są mniej lub bardziej aktywne od ich prawidłowego odpowiednika, lub do badania przesiewowego na liczne środki, włączając herbicydy czy pestycydy.
Oczywiście, testy MAPS można stosować do oznaczania ilościowego (mierzenia) ilości aktywnej substancji docelowej w próbce, przy założeniu, że sonda nie jest całkowicie zajęta, to znaczy, że nie więcej niż 90% dostępnych miejsc sondy jest związanych (lub reaguje czy hybrydyzuje) z cząsteczką docelową. Pod tym warunkiem można oznaczyć ilościowo cząsteczką docelową, ponieważ obecność większej ilości substancji docelowej spowoduje związanie większej ilości sondy. Z drugiej strony, w warunkach, gdy więcej niż około 90% dostępnych miejsc sondy jest związana, obecność większej ilości cząsteczek docelowych nie zwiększy istotnie ich wiązania z sondą. Można w ten sposób oznaczać ilościowo każdy rodzaj z wymienionych substancji docelowych. Przykładowo, przykład 6 opisuje oznaczenie ilościowe cząsteczek docelowych-oligonukleotydów. Co więcej, pokazuje, że nawet w obecności znacznego nadmiaru cząsteczek docelowych (np. gdy jest obecny w tak dużej ilości, że wysyca sondy dostępne w uporządkowanym zestawie sond MAPS), przez dodanie znanej ilości niewyznakowanych cząsteczek docelowych do mieszaniny w której zachodzi wiązanie, można przesunąć czułość reakcji w sposób pozwalający na oznaczenie ilościowe nawet tak dużej ilości cząsteczek docelowych.
W innym wykonaniu tego wynalazku, kombinacje według wynalazku można zastosować do poszukiwania czynników zmieniających oddziaływanie między cząsteczką docelową a daną sondą. Czynnik może zmienić oddziaływanie substancji docelowej z sondą oddziałując bezpośrednio bądź pośrednio z sondą albo z cząsteczką docelową bądź kompleksem powstałym z sondy i cząsteczki docelowej. Modulowanie może przyjąć różne formy, obejmując między innymi, zwiększenie lub zmniejszenie powinowactwa wiązania cząsteczki docelowej lub sondy, zwiększenie lub zmniejszenie szybkości wiązania sondy do cząsteczki docelowej, kompetycyjnego lub niekompetycyjnego hamowania wiązania sondy do cząsteczki docelowej, czy zwiększenia lub zmniejszenia aktywności sondy lub cząsteczki docelowej, co w niektórych przypadkach może doprowadzić do wzrostu lub spadku oddziaływań sonda/cząsteczka docelowa. Takie czynniki mogą być substancjami wytworzonymi przez człowieka lub występującymi naturalnie w przyrodzie. Takie czynniki mogą być stosowane zarówno w postaci niezmodyfikowanej, jak i w połączeniach z innymi; mogą też być przyłączone, kowalencyjnie lub niekowalencyjnie, do elementu wiążącego, bezpośrednio lub przez specyficzną substancję wiążącą. Przykładowo, aby zidentyfikować potencjalne rozcieńczalnik krwi, lub czynniki oddziałujące z jedną z kaskady proteaz krzepnięcia krwi, koktail badanych proteaz można testować z licznymi czynnikami-kandydatami, a następnie badać ich aktywność tak, jak opisano powyżej. Inne przykłady czynników mogących mieć zastosowanie w tym wynalazku są bardzo rozmaite i obejmują pestycydy
PL 193 762 B1 i herbicydy. Przykłady 16 i 17 opisują wysokowydajny test na czynniki hamujące specyficzne kinazy, albo na wybiórcze inhibitory oddziaływań między domenami SH2 i ufosforylowanymi peptydami.
W innym wykonaniu tego wynalazku, kombinację według wynalazku można zastosować do poszukiwania czynników zmieniających wzór ekspresji genów. Przykładowo, można użyć uporządkowanego zestawu oligonukleotydów do określenia rodzajów mRNA, których wzór ekspresji dla danego zestawu genów koreluje ze szczególnym stanem fizjologicznym bądź etapem rozwoju, albo stanem chorobowym (geny skorelowane, RNA albo wzory ekspresji). Przez określenie koreluje albo skorelowany rozumie się, ze wzór ekspresji RNA związany jest ze stanem fizjologicznym komórki, ale nie jest konieczne, aby ekspresja danego RNA była odpowiedzialna albo powodowała szczególny stan fizjologiczny. Przykładowo, można zidentyfikować małą grupę cząsteczek mRNA, które ulegają zmniejszonej i/lub zwiększonej ekspresji w komórkach służących za model określonego stanu chorobowego; taki zmieniony w porównaniu do prawidłowej komórki wzór ekspresji może służyć jako wskaźnik stanu chorobowego (geny wskaźnikowe, RNA, lub wzory ekspresji). Terminy skorelowany i wskaźnik można stosować wymiennie. Przykładowo, komórki traktowane aktywatorem wzrostu guza, takim jak mirystynian forbolu, mogą mieć wzór ekspresji genów naśladujący wzór obserwowany we wczesnych stadiach rozwoju guza. W innym modelu nowotworu, mysie komórki gruczolaka wysepkowato-komórkowego (np. linia komórkowa TPG61), po zarażeniu adeno-wirusem, mają podwyższoną ekspresję np. c-Jun i MIP-2, podczas gdy ekspresja genów metabolizmu podstawowego komórki, takich jak GAPHD i L32, pozostaje zasadniczo nie zmieniona.
Czynniki, które po zetknięciu się z komórkami z modelu choroby w sposób pośredni bądź bezpośredni, zarówno in vivo jak i in vitro (np. w hodowli tkankowej), zmieniają wzór ekspresji wskaźnika, mogą działać jako środki lecznicze lub leki dla organizmów (np. ludzi, innych chorych zwierząt lub roślin) cierpiących na daną chorobę. Środki mogą również zmieniać wzory ekspresji działając bezpośrednio na kwasy nukleinowe, np. w systemie ekspresji in vitro (w probówce). Stosowane tu pojęcie zmienia oznacza: powoduje wzrost lub spadek ilości i/lub aktywności cząsteczki itp., biorącej udział w mierzalnej reakcji.
Warianty wynalazku mogą być użyte do poszukiwania takich środków. Przykładowo, można doprowadzić do kontaktu szeregu komórek (np. z modelu choroby) z szeregiem czynników (np. na okres wahający się od około 10 minut do około 48 godzin lub więcej) i przy użyciu standardowych, znanych w dziedzinie metod (np. komercyjnie dostępnych zestawów), można wyizolować całkowity RNA lub mRNA. Jeśli pożądana jest amplifikacja RNA, można zastosować standardowe procedury, jak amplifikacja RT-PCR (patrz np. lnniw et al. eds., (1996) PCR Protocols: A Guide to Methods in Amplification, Academic Press, New York). Umożliwia się kontakt ekstraktów (lub ich powielonych produktów) z licznymi zasadniczo identycznymi uporządkowanymi zestawami zawierającymi sondy dla odpowiednich wskaźnikowych RNA (np. przez inkubację z) i identyfikuje się te czynniki, które wiążą się ze zmianą wzoru ekspresji wskaźnikowych RNA. Przykład 15 opisuje wysokowydajny test poszukiwania związków mogących zmieniać ekspresję genów skorelowanych ze stanem chorobowym.
Podobnie, można identyfikować czynniki zmieniające wzory ekspresji związane ze szczególnymi stanami fizjologicznymi lub stadiami rozwojowymi. Takie czynniki mogą być wytworzone przez człowieka bądź naturalnie występować w przyrodzie, włączając czynniki środowiskowe takie, jak substancje zaangażowane w rozwój embrionalny lub regulację reakcji fizjologicznych, czy substancje istotne dla rolnictwa, jak pestycydy czy herbicydy. Takie czynniki mogą być stosowane zarówno w postaci niezmodyfikowanej, jak i w połączeniach z innymi ich rodzajami; i mogą być połączone kowalencyjnie lub niekowalencyjnie, z elementem wiążącym, bądź bezpośrednio, bądź za pośrednictwem specyficznej substancji wiążącej.
Inne wykonanie wynalazku to zestaw przydatny do wykrywania, co najmniej jednej cząsteczki docelowej w próbce, który zawiera:
a) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera co najmniej osiem różnych kotwic (oligonukleotydowych lub jednego z innych opisanych tu rodzajów), oraz
b) pojemnik zawierający co najmniej jedną cząsteczkę bifunkcjonalnego łącznika, którego pierwsza część jest specyficzna wobec co najmniej jednej kotwicy, a druga część, która obejmuje sondę, jest specyficzna wobec co najmniej jednej takiej cząsteczki docelowej.
W jednym z wykonań dostarczona jest powierzchnia, jak powyżej w punkcie a) i zestaw instrukcji do przyłączania do co najmniej jednej z takich kotwic cząsteczki bifunkcjonalnego łącznika, którego pierwsza część jest specyficzna wobec co najmniej jednej takiej kotwicy, a druga część obejmuje sonPL 193 762 B1 dę, która jest specyficzna wobec co najmniej jednej cząsteczki docelowej. Instrukcja może zawierać, przykładowo (ale nie ograniczając się do tego), a) opis każdej z kotwic na powierzchni i wskazanie, jak wiele kotwic tam się znajduje i gdzie na tej powierzchni są one zlokalizowane oraz protokół specyficznego przyłączania (łączenia, wiązania, itd.) łączników do kotwic. Przykładowo, jeżeli kotwicami są oligonukleotydy, instrukcja może obejmować sekwencję każdej kotwicy, na podstawie czego wykonujący może zaprojektować komplementarne specyficzne wobec kotwic cząsteczki łączników do specyficznego oddziaływania z (np. hybrydyzacji z) kotwicami; jeżeli kotwicami są peptydy, instrukcja może nieść informację np. o przeciwciałach, które oddziałują z peptydami. Instrukcje mogą również zawierać protokół łączenia się kotwic z łącznikami, np. warunki i odczynniki do hybrydyzacji (lub innych typów połączeń), takie jak temperatura i czas inkubacji, warunki i odczynniki do usuwania niepołączonych cząsteczek (np. płukania) i temu podobne. Ponadto, instrukcje mogą obejmować informacje o konstrukcji i zastosowaniu dowolnego z typów dyskutowanych tu łączników kontrolnych i sposobów np. do oznaczeń ilościowych, normalizacji, „dostrajania lub kalibrowania testów, które mają być przeprowadzone z kombinacjami. Instrukcje mogą obejmować dowolne parametry, warunki lub wykonania ujawnione w tym zgłoszeniu, z czego wszystkie można przeprowadzić rutynowo, konwencjonalnymi metodami przez biegłego w tej dziedzinie.
Jak dyskutowano gdzie indziej w tym zgłoszeniu, wykonawca może przyłączyć do powierzchni według wynalazku zawierającej dany uporządkowany zestaw (lub uporządkowane zestawy) kotwic, rozmaite rodzaje łączników, programując w ten sposób różnorodne uporządkowane zestawy sond. Ponadto, wykonawca może usunąć dany zestaw łączników z powierzchni według wynalazku i dodać do niej inny zastaw łączników (ten sam albo inny niż pierwszy zestaw), umożliwiając wielokrotne używanie danej powierzchni. Ta elastyczność i możliwość ponownego użycia stanowi dalszą korzyść wynalazku.
W innym wykonaniu, kombinacje według wynalazku mogą być zastosowane do mapowania sekwencji EST (etykietki sekwencji podlegających ekspresji, ang. Expressed Sequence Tags). To znaczy, testy MAPS można zastosować do określenia, które, jeżeli jakiekolwiek, grupy EST są wytwarzane z różnych (lub częściowo zachodzących na siebie) częściach tego samego genu (-ów), a które, jeżeli jakiekolwiek, są unikatowe). Figury 18, 19, 20 i 21 ilustrują taki test, w tym przykładzie test do określania, która, jeżeli jakakolwiek, z 16 sekwencji EST jest „sprzężona”, ze wspólnym genem. Pierwszym etapem tego testu (patrz fig. 18) jest stworzenie uporządkowanego zestawu, w którym każda z sekwencji EST, która ma być zmapowana jest reprezentowana przez co najmniej jedną odpowiadającą jej sondę oligonukleotydową. Uporządkowane zestawy, których liczba równa się lub jest większa niż liczba sekwencji EST, które mają być zmapowane, są rozmieszczone w oddzielnych obszarach (np. studzienkach) na powierzchni; w przytoczonym przykładzie powierzchnia kombinacji zawiera 16 studzienek, z których każda zawiera uporządkowane zestawy 16 różnych sond specyficznych wobec sekwencji EST, numerowanych 1-16. Oligonukleotyd, który „odpowiada sekwencji EST (jest specyficzny wobec EST) to ten, który jest dostatecznie komplementarny do sekwencji EST, tak, że w wybranych ostrych warunkach hybrydyzacji, oligonukleotyd będzie specyficznie hybrydyzował do tej sekwencji EST, a nie do innych, niespokrewnionych sekwencji EST. Oligonukleotyd odpowiadający EST tego typu może wiązać się specyficznie (w optymalnych warunkach) z nicią kodującą lub niekodującą cDNA syntetyzowanego z genu, z którego sekwencja EST została na wstępie wytworzona. Czynnikami, które należy uwzględnić przy projektowaniu oligonukleotydów i parametry hybrydyzacji, które należy zoptymalizować w celu uzyskania specyficznej hybrydyzacji, są dyskutowane gdzie indziej w tym zgłoszeniu. W celu przygotowania uporządkowanego zestawu wytwarza się cząsteczki łącznikowe, z których każda zawiera cząsteczkę specyficzną dla jednej z kotwic uporządkowanego zestawu rodzajowego plus cząsteczkę stanowiącą sondę oligonukleotydową, która odpowiada jednej z sekwencji EST, która ma być zmapowana; po czym łączniki przyłącza się do kotwic tak, jak opisano gdzie indziej w tym zgłoszeniu. W kolejnym etapie porcja próbki zawierającej mieszaninę kwasów nukleinowych (np. mRNA lub jednoniciowy albo zdenaturowany cDNA), który może zawierać sekwencje komplementarne do jednej lub większej liczny sond oligonukleotydowych, jest dodawana do każdego z obszarów (studzienek), które zawierają uporządkowany zestaw sond; mieszaninę inkubuje się następnie w rutynowo określonych, optymalnych warunkach, umożliwiając w ten sposób kwasom nukleinowym związanie się z komplementarnymi sondami. Jeżeli kilka sond specyficznych wobec sekwencji EST jest komplementarnych do różnych porcji pojedynczego kwasu nukleinowego, ten kwas nukleinowy będzie wiązał się do każdego z loci w uporządkowanym zestawie, w których zlokalizowana jest jedna z tych sond.
PL 193 762 B1
W kolejnym etapie, do każdego obszaru (studzienki) dodaje się różne wykrywające oligonukleotydy (w przedstawionym przykładzie, detektor # 1do 16) (patrz fig. 19). Wykrywający oligonukleotyd jest zaprojektowany dla każdej z sekwencji EST, która ma być mapowana. Każdy z detektorów specyficznych dla EST odpowiada odmiennym (co najmniej częściowo nie zachodzącym na siebie) częściom EST niż sonda oligonukleotydowa, tak, że sonda i wykrywające oligonukleotydy nie przeszkadzają sobie nawzajem. Weźmy jako przykład sekwencję EST przedstawioną na fig. 21, która odpowiada EST 1, 2, oraz 6 na fig. 1, 2 i 6 z fig. 18-20. Fig. 21 pokazuje, że obydwie sekwencje, EST #1 i#2, zostały otrzymane z genu X (są one „sprzężone), podczas gdy EST #6 została otrzymana z innego, niespokrewnionego genu. Jeżeli porcje próbki, zawierające mieszaninę mRNA, włączając w to mRNA utworzony z genu X, inkubuje się z uporządkowanym zestawem sond pokazanym na fig. 1820, mRNA genu X będzie w optymalnych warunkach hybrydyzować w loci z sondami 1i 2, ale nie tam gdzie jest sonda 6. (Oczywiście, każdy mRNA musi być dodawany w molowym nadmiarze w stosunku do sumy sond, które hybrydyzują). Jeżeli wykrywający oligonukleotyd 2 jest dodawany do obszaru (studzienki), będzie hybrydyzował z mRNA genu X, który jest związany w loci 1 i 2 w uporządkowanym zestawie sond, ale nie w lokus 6. Podobnie, jeżeli wykrywający oligonukleotyd 2 dodawany jest do innej studzienki - powiedzmy studzienki #2 - zwiąże się również w loci 1 i 2, ale nie 6. W ten sposób, można określić w wysokowydajny sposób, które z sekwencji EST są sprzężone tj. kodują części tego samego genu, a która z sekwencji EST jest unikatowa. W przypadku hipotetycznego przykładu pokazanego na fig. 20, pierwsze 3 sekwencje EST kodują części tego samego genu, ostatnie 5 sekwencji EST koduje części innego genu, a pozostałe EST wydają się nie być sprzężone. Warunki hybrydyzacji, ewentualne etapy płukania, sposoby wykrywania i temu podobne są dyskutowane gdzie indziej wtym zgłoszeniu w odniesieniu do testów MAPS. W celu potwierdzenia danych o sprzężeniu otrzymanych w testach MAPS, można przeprowadzić reakcje PCR używając pary sond oligonukleotydowych specyficznych dla sekwencji EST jako starterów sensownych i antysensownych. Każda z pary sprzężonych EST powinna dawać produkt reakcji PCR. Należy zauważyć, że takie wykonywane parami reakcje PCR można by przeprowadzić w celu określenia sprzężenia bezpośrednio, bez stosowania testu Sprzężenia MAPS; jednakże wymaganych byłoby wiele reakcji, a każdy starter EST musiałby być syntetyzowany zarówno jako nić sensowna, jak i antysensowna. W przedstawionym przykładzie, wymaganych byłoby 180 takich reakcji.
W jednym z aspektów wynalazek dotyczy sposobu określania, która z wielu sekwencji EST jest komplementarna do danego kwasu nukleinowego, obejmując
a) inkubowanie unieruchomionego uporządkowanego zestawu sond oligonukleotydowych, z których co najmniej jedna odpowiada każdej z sekwencji EST, z próbką testową, która może zawierać dany kwas nukleinowy, w celu otrzymania produktu hybrydyzacji pomiędzy sondami oligonukleotydowymi i takim kwasem nukleinowym,
b) inkubowanie produktu hybrydyzacji z oligonukleotydem wykrywającym, który odpowiada sekwencji EST, której odpowiada jedna z takich sond oligonukleotydowych, ale który jest specyficzny wobec innej części sekwencji EST niż sonda oligonukleotydowa, oraz
c) wykrywanie, które sondy oligonukleotydowe z takiego uporządkowanego zestawu są znakowane przez taki wykrywający oligonukleotyd, gdzie taki zestaw uporządkowanych sond jest unieruchomiony w danym obszarze kombinacji, przy czym ta kombinacja zawiera
1) powierzchnię, zawierającą oddzielone od siebie przestrzennie, zasadniczo identyczne obszary, w liczbie równej liczbie badanych sekwencji EST, przy czym każdy obszar zawiera
2) różne kotwice w liczbie równiej liczbie sekwencji EST, które mają być badane, każda kotwica w połączeniu z
3) bifunkcjonalnym łącznikiem, którego pierwsza część jest specyficzna wobec kotwicy, a druga część obejmuje sondę oligonukleotydową, która odpowiada co najmniej jednej takiej sekwencji EST.
W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu jak wyżej, gdzie jedna lub więcej takich sekwencji EST zawiera dwie różne sekwencje oligonukleotydowe, przy czym pierwsza definiuje sondę oligonukleotydową odpowiadającą tej sekwencji EST, a druga z nich definiuje sondę oligonukleotydową odpowiadającą tej sekwencji, obejmującego
a) doprowadzenie do kontaktu próbki, która zawiera cząsteczki kwasu nukleinowego z co najmniej jednym zestawem z kombinacji, gdzie taki obszar zawiera uporządkowany zestaw sond oligonukleotydowych, z których co najmniej jedna odpowiada każdej z sekwencji EST,
PL 193 762 B1
b) inkubowanie takiej próbki z takim obszarem, umożliwiając w ten sposób cząsteczkom tego kwasu nukleinowego wiązanie się z sondami oligonukleotydowymi odpowiadającymi sekwencjom EST, które są komplementarne do części tych kwasów nukleinowych,
c) inkubowanie takiego obszaru zawierającego cząsteczki kwasu nukleinowego związane z jedną lub więcej takich sond oligonukleotydowych odpowiadających sekwencjom EST z oligonukleotydem wykrywającym, który odpowiada sekwencji EST, której odpowiada dana sonda oligonukleotydowa z tego uporządkowanego zestawu, wiążąc w ten sposób oligonukleotydy wykrywające z cząsteczkami kwasu nukleinowego, które związały się z daną sondą oligonukleotydową lub z innymi sondami oligonukleotydowymi, które są komplementarne do tego kwasu nukleinowego,
d) wykrywanie obecności takich wykrywających oligonukleotydów, ustalając w ten sposób, która z sond oligonukleotydowych odpowiadających sekwencjom EST z tego uporządkowanego zestawu jest komplementarna do części kwasu nukleinowego, która wiąże się z daną sondą oligonukleotydową odpowiadającą sekwencjom EST, identyfikując wten sposób sekwencje EST, które są komplementarne do tego kwasu nukleinowego, gdzie taki uporządkowany zestaw sond oligonukleotydowych jest unieruchomiony w obszarze kombinacji, przy czym ta kombinacja zawiera
1) powierzchnię, zawierającą oddzielone od siebie przestrzennie, zasadniczo identyczne obszary, w liczbie równej liczbie badanych EST, przy czym każdy obszar zawiera
2) różne kotwice w liczbie równiej liczbie sekwencji EST, które mają być badane, każda kotwica w połączeniu z
3) bifunkcjonalnym łącznikiem, którego pierwsza część jest specyficzna wobec kotwicy, a druga część, obejmuje sondę oligonukleotydową, która odpowiada co najmniej jednej takiej sekwencji EST.
Składniki testu mapowania sekwencji EST mogą być łączone w dowolnej kolejności. Przykładowo, kotwice, łączniki i sekwencje EST mogą być łączone kolejno; albo łączniki i sekwencje EST w obecności lub nieobecności wskaźników, mogą być łączone w roztworze, a następnie dodawane do kotwic.
W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu określania, która z wielu sekwencji EST jest komplementarna do danego kwasu nukleinowego, obejmując
a) inkubowanie kolekcji cząsteczek bifunkcjonalnych łączników oligonukleotydowych, z których każdy zawiera pierwszą część, która jest sondą odpowiadającą co najmniej jednej takiej sekwencji EST, oraz drugą część, która jest specyficzna wobec kotwicy oligonukleotydowej, z próbką testową, która może zawierać dany kwas nukleinowy, w celu otrzymania pierwszego produktu hybrydyzacji pomiędzy sondami oligonykleotydowymi i takim kwasem nukleinowym,
b) inkubowanie pierwszego produktu hybrydyzacji z unieruchomionym uporządkowanym zestawem kotwic oligonukleotydowych, przy czym każda kotwica oligonukleotydowa odpowiada specyficznej wobec kotwicy części co najmniej jednej z takich cząsteczek łącznikowych w celu wytworzenia drugiego produktu hybrydyzacji zawierającego takie kotwice, sondy oligonukleotydowe i kwasy nukleinowe, oraz,
c) inkubowanie pierwszego albo drugiego produktu hybrydyzacji z oligonukleotydem wykrywającym, który odpowiada sekwencji EST, której odpowiada dana sonda oligonukleotydowa, ale który jest specyficzny wobec innej części sekwencji EST niż ta sonda oligonukleotydowa, oraz
d) wykrywanie, które sondy oligonukleotydowe z takiego uporządkowanego zestawu są znakowane przez taki wykrywający oligonukleotyd, gdzie taki zestaw uporządkowanych sond jest unieruchomiony w danym obszarze kombinacji, przy czym ta kombinacja zawiera
1) powierzchnię, zawierającą oddzielone od siebie przestrzennie, zasadniczo identyczne obszary, w liczbie równej liczbie badanych EST, przy czym każdy obszar zawiera
2) różne kotwice w liczbie równiej liczbie sekwencji EST, które mają być badane.
Oczywiście, wspomniane powyżej metody mapowania EST można zastosować do mapowania sekwencji testowych ( np. polinukleotydów) do dowolnego kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania. Przykładowo, można określać, czy dwa lub więcej sklonowanych fragmentów DNA lub cDNA mapuje się w tym samym obszarze genomowego DNA. Taka procedura może pomóc na przykład w ustaleniu struktury długich, złożonych genów. W podobny sposób można ustalić, czy jedna lub więcej sekwencji usuwanych w czasie wycinania intronów lub sekwencji kodujących mapuje się w tym samym obszarze genomowego DNA. Takie ustalanie może mieć zastosowanie na przykład w testach diagnostycznych do rozróżnienia pomiędzy stanami normalnymi a chorobowymi, które cha20
PL 193 762 B1 rakteryzują się odmiennymi wzorami wycinania intronów. Wiele innych zastosowań metod mapowania będzie ewidentnych dla biegłego w tej dziedzinie.
W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu ustalania, który z wielu polinukleotydów jest komplementarny do danego kwasu nukleinowego, gdzie jeden lub więcej takich polinukleotydów może być komplementarnych do takiego kwasu nukleinowego i gdzie każdy z takich polinukleotydów zawiera dwie różne sekwencje oligonukleotydowe, przy czym pierwsza definiuje sondę oligonukleotydową odpowiadającą tej sekwencji EST, a druga z nich definiuje oligonukleotyd wykrywający odpowiadający temu polipeptydowi, obejmując
a) doprowadzenie do kontaktu próbki, która zawiera cząsteczki kwasu nukleinowego z co najmniej jednym obszarem z kombinacji, gdzie taki obszar zawiera uporządkowany zestaw sond oligonukleotydowych, z których co najmniej jedna odpowiada każdemu z polipeptydów,
b) inkubowanie takiej próbki z takim obszarem, umożliwiając w ten sposób cząsteczkom tego kwasu nukleinowego wiązanie się z sondami oligonukleotydowymi odpowiadającymi polinukleotydom, które są komplementarne do części tych kwasów nukleinowych
c) inkubowanie takiego obszaru zawierającego cząsteczki kwasu nukleinowego związane z jedną lub więcej takich sond oligonukleotydowych odpowiadających polinukleotydowi z oligonukleotydem wykrywającym, który odpowiada polinukleotydowi, któremu odpowiada dana sonda oligonukleotydowa z tego uporządkowanego zestawu, wiążąc w ten sposób oligonukleotydy wykrywające z cząsteczkami kwasu nukleinowego, które związały się z daną sondą oligonukleotydową lub z innymi sondami oligonukleotydowymi, które są komplementarne do tego kwasu nukleinowego,
d) wykrywanie obecności takich wykrywających oligonukleotydów, identyfikując w ten sposób, która z sond oligonukleotydowych odpowiadających polinukleotydowi z tego uporządkowanego zestawu jest komplementarna do części kwasu nukleinowego, która wiąże się z daną sondą oligonukleotydową odpowiadającą polinukleotydowi, identyfikując w ten sposób polinukleotydy, które są komplementarne do tego kwasu nukleinowego, gdzie taki uporządkowany zestaw sond oligonukleotydowych jest unieruchomiony w obszarze kombinacji, przy czym ta kombinacja zawiera
1) powierzchnię, zawierającą oddzielone od siebie przestrzennie, zasadniczo identyczne obszary, w liczbie równej liczbie badanych polinukleotydów, przy czym każdy obszar zawiera
2) różne kotwice w liczbie równiej liczbie polinukleotydów, które mają być badane, każda kotwica w połączeniu z
3) bifunkcjonalnym łącznikiem, którego pierwsza część jest specyficzna wobec kotwicy, a druga część obejmuje sondę oligonukleotydową, która odpowiada co najmniej jednemu takie mu polinukleotydowi.
W innym aspekcie wynalazku, powyższe sposoby mapowania sekwencji EST lub innych polinukleotydów obejmują ponadto usunięcie niezwiązanej części próbki między jednym lub większą liczbą etapów.
W innym wykonaniu wynalazku, jedna lub więcej cząsteczek docelowego RNA będących przedmiotem zainteresowania (np. mRNA lub inne rodzaje RNA) jest przekształcana w cDNA przez odwrotną transkryptazę i te cDNA są następnie hybrydyzowane do uporządkowanego zestawu sond. Ten typ testu jest zilustrowany schematycznie na fig. 8. Ekstrakty RNA lub oczyszczony mRNA przygotowuje się z komórek lub tkanek tak, jak tu opisano. Następnie do próbki RNA dodaje się odwrotną transkryptazę i startery oligonukleotydowe, które są specyficzne dla RNA będących przedmiotem zainteresowania i przy zastosowaniu znanych w tej dziedzinie warunków i procedur, które można rutynowo określić i zoptymalizować, wytwarzane są pierwsze nici cDNA. Termin starter „specyficzny' odnosi się do takiego, który jest dostatecznie komplementarny do mRNA będącego przedmiotem zainteresowania aby wiązać się do niego w wybranych ostrych warunkach hybrydyzacji, oraz który jest rozpoznawany przez odwrotną transkryptazę, lecz który nie wiąże się z niepożądanym kwasem nukleinowym (patrz powyżej na omówienie odpowiednich warunków reakcji dla osiągnięcia specyficznej hybrydyzacji). Resztę cząsteczek RNA - mRNA, które nie zostały rozpoznane przez specyficzne startery i/lub inne typy zanieczyszczających RNA w ekstrakcie RNA, takich jak tRNA lub rRNA -można usunąć przez użycie różnorodnych rybo-nukleaz lub metodami chemicznymi, takimi jak działanie czynnikami alkalicznymi, które pozostawiają pojedynczą nić cDNA, kontaktowaną następnie z zestawem sond MAPS. Użycie odwrotnej transkryptazy jest metodą minimalizującą potrzebę intensywnego manipulowania RNA, który jest podatny na degradację przez nukleazy i tym samym trudny do pracy. Ponadto dodatkowa specyficzność nadana specyficznymi starterami dla odwrotnej transkryptazy podnosi doPL 193 762 B1 datkowo poziom specyficzności testu. Fakultatywnie, opisany powyżej cDNA można amplifikować przed hybrydyzacją z uporządkowanym zestawem sond celem wzmocnienia siły sygnału. Oligonukleotydowe startery dla odwrotnej transkryptazy, opisane powyżej mogą obejmować, na końcach 5', sekwencje (o długości około 22-27 nukleotydów), które wyznaczają miejsca inicjacji dla polimerazy RNA (np. polimerazy T7, T3 lub SP2 i im podobnym). W przykładzie przedstawionym na fig.8 do startera dla odwrotnej transkryptazy dodano sekwencję promotora T7. Miejsce rozpoznawane przez polimerazę zostaje wprowadzone do cDNA, a następnie służy jako miejsce rozpoznawane przez odpowiednią polimerazę RNA podczas wielokrotnych rund transkrypcji (transkrypcja in vitro lub lVT). Fakultatywnie, wytworzony mRNA można następnie amplifikować przy użyciu reakcji PCR i odpowiednich starterów, lub można amplifikować sam cDNA. Procedury transkrypcji i PCR są rutynowe i dobrze znane specjalistom.
Opisaną powyżej metodę, w której cząsteczki docelowego mRNA są przekształcane w cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy przed badaniem na płytkach MAPS, można zastosować zamiast w procedurze standardowego testu MAPS w innych opartych na RNA testach opisanych powyżej.
W innym wykonaniu wynalazku, jeden lub więcej docelowych kwasów nukleinowych jest hybrydyzowany ze specyficznymi polinukleotydowymi fragmentami chroniącymi i poddawany procedurom ochrony przed nukleazą, a te fragmenty chroniące, które hybrydyzują z interesującą(-ymi) cząsteczką docelową są testowane na płytkach MAPS. Jeśli cząsteczką docelową jest RNA a fragmentem chroniącym jest DNA, test typu ochrony przed nukleazą/MAPS (NPA-MAPS) ogranicza potrzebę intensywnego manipulowania RNA, który jest podatny na degradację przez zanieczyszczające endonukleazy i tym samym trudny w pracy. W takim teście NPA-MAPS, sondy w zestawie sond są oligonukleotydami o tej samym rodzaju nici jak interesujące docelowe cząsteczki kwasu nukleinowego zamiast komplementarnych do nich, jak w standardowym teście MAPS. Przykład testu NPA-MAPS schematycznie przedstawiono na fig. 9. W teście NPA-MAPS interesującą cząsteczką docelową może być dowolny kwas nukleinowy, np. genomowy DNA, cDNA, wirusowy DNA lub RNA, rRNA, tRNA, mRNA, oligonukleotydy, fragmenty kwasów nukleinowych, zmodyfikowane kwasy nukleinowe, syntetyczne kwasy nukleinowe i im podobne. W korzystnym wykonaniu wynalazku procedura stosowana jest do testowania jednego lub więcej docelowych mRNA obecnych w tkance lub komórkowym ekstrakcie RNA. Próbka zawierająca interesującą cząsteczkę (cząsteczki) jest najpierw hybrydyzowana w wybranych warunkach ostrości (patrz powyżej na omówienie odpowiednich warunków reakcji dla osiągnięcia specyficznej hybrydyzacji) do jednego lub większej liczby specyficznych fragmentów chroniących. Fragment chroniący jest polinukleotydem, który może być np. RNA, DNA (włączając produkt PCR), PNA lub zmodyfikowanym lub podstawionym kwasem nukleinowym, który jest specyficzny do części interesującego docelowego kwasu nukleinowego. Przez „specyficzny fragment chroniący rozumie się polinukleotyd, który jest wystarczająco komplementarny do przeznaczonego do związania partnera tak, że wiąże się w wybranych warunkach ostrości, lecz nie będzie się wiązać do innych nie przeznaczonych kwasów nukleinowych. Fragment chroniący może mieć długość co najmniej 10 nukleotydów, korzystnie 50 do 100, lub może mieć długość całego cDNA. W korzystnym wykonaniu, fragmenty chroniące są oligonukleotydami jednoniciowego DNA. Fragmenty chroniące, specyficzne do 100 cząsteczek docelowych i więcej mogą być wprowadzone do jednej reakcji hybrydyzacji. Po hybrydyzacji próbka jest poddawana działaniu koktajlu z jednej lub większej ilości nukleaz w celu zniszczenia zasadniczo całego kwasu nukleinowego z wyjątkiem fragmentu(-ów) protegujących, które hybrydyzują z interesującym kwasem (kwasami) nukleinowym i (fakultatywnie) częścią (częściami) docelowego kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje i jest chroniona przed trawieniem przez nukleazę w czasie procedury chronienia przed nukleazą (są w hybrydzie dupleksowej). Przykładowo, jeśli próbka zawiera ekstrakt komórkowy, niepotrzebne kwasy nukleinowe, takie jak genomowy DNA, tRNA, rRNA i mRNA, inne niż interesujące, można zasadniczo niszczyć w tym etapie. Można zastosować różnorodne nukleazy, włączając np. RNazę z trzustki, nukleazę mung bean, nukleazę S1, RNazę A, Rybonukleazę T1, Egzonukleazę IIIi im podobne w zależności od natury hybrydyzujących kompleksów i od obecności niepożądanych kwasów nukleinowych w próbce. RNa-za H jest częściowo przydatna dla trawienia resztek RNA związanego z fragmentem chroniącym DNA. Warunki reakcji dla tych enzymów są dobrze znane specjalistom i można je doświadczalnie optymalizować. Można również wykorzystać procedury chemiczne np. alkaliczną hydrolizę RNA. Jeśli jest to wymagane, próbki można traktować dalej różnymi procedurami dobrze znanymi specjalistom celem usunięcia niezhybrydyzowanego materiału i/lub inaktywacji lub usunięcia resztek enzymów (np. ekstrakcją fenolową, wytrącaniem, filtracją na kolumnie itd.). Proces hybrydyzacji, po którym następuje trawienie nukleazą i (fa22
PL 193 762 B1 kultatywnie) degradacja chemiczna nazywany jest procedurą ochrony przed nukleazą; opisano szereg procedur ochrony przed nukleazą (patrz np. Lee et al. (1987), Meth. Enzymol. 152, 633-648. Zinn et al. (1983), Cell 34, 865-879).
Próbki poddawane działaniu testu ochrony przed nukleazą, po którym następuje (fakultatywnie) procedura inaktywacji nukleazy, są umieszczane w uporządkowanym zestawie sond MAPS i prowadzone są etapy stosowane zazwyczaj w teście MAPS. Związane fragmenty chroniące można wykrywać poprzez hybrydyzację wyznakowanych specyficznych dla cząsteczki docelowej reporterów, jak opisano tu dla standardowych testów MAPS lub fragmenty chroniące mogą same być wyznakowane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie związanymi cząsteczkami, które można wykrywać.
W korzystnym wykonaniu, fragmenty chroniące są bezpośrednio związane np. a nie są znakowane poprzez hybrydyzację ze specyficznym dla cząsteczki docelowej reporterem. Przykładowo reporter związany jest z fragmentem chroniącym za pomocą oddziaływania ligand-antyligand np. kompleks streptawidyny jest dodawany do biotynylowanego oligonukleotydu chroniącego. W innym przykładzie fragment chroniący jest chemicznie zmodyfikowany (np. przez bezpośrednie sprzężenie peroksydazy z chrzanu (HPR) lub barwnik fluorescencyjny) i wykrywa się tę chemiczną modyfikację, lub z częścią kwasu nukleinowego fragmentu chroniącego lub bez (np. po odcięciu modyfikacji przez, przykładowo, działanie enzymatyczne lub chemiczne). W każdej z powyższych metod fragment chroniący można wyznakować przed lub po jego zhybrydyzowaniu z odpowiadającą cząsteczką łącznika.
W celu kontrolowania czy procedura ochrony przed nukleazą przebiega prawidłowo, tzn. że niehybrydyzujący kwas nukleinowy jest trawiony jak pożądane, można zaprojektować jeden lub więcej fragmentów chroniących zawierających zwisające (niehybrydyzujące) segmenty, które powinny być trawione przez nukleazy o ile procedura działa prawidłowo. Obecność lub brak fragmentów zwisających można określać poprzez hybrydyzację z komplementarną, wyznakowaną sondą wykrywającą, lub samą zwisającą część fragmentu chroniącego można wyznakować kowalencyjnie lub niekowalencyjnie cząsteczką, którą można wykryć. Kontrolę taką można prowadzić przed umieszczeniem próbki w zestawie sond lub jako część testu MAPS. Przykład takiego testu kontrolnego opisano w przykładzie 15. Oczywiście, ponieważ różne znaczniki można z łatwością rozróżniać (np. fluoryty z różnymi widmami absorpcji), szereg różnie wyznakowanych oligonukleotydów można umieścić w pojedynczym teście. Dalej, w czasie trwania testu można stosować analizę standardowego testu ochrony przed nukleazą za pomocą elektroforezy w żelu dla sprawdzania czy fragmenty chroniące są procesowane tak jak oczekiwano.
Testy NPA-MAPS można stosować do określania ilości cząsteczki docelowej w próbce. Jeśli fragment chroniący jest dodawany w wystarczającym nadmiarze molarnym w stosunku do cząsteczki docelowej do kierowania całkowitą reakcją hybrydyzacji, ilość fragmentu chroniącego, pozostającego po etapie testu ochrony przed nukleazą będzie odzwierciedlać ile docelowych cząsteczek było obecnych w próbce. Przykład takiej reakcji ilościowej opisano w przykładach 12 i 13.
Testy NPA-MAPS można stosować jako uzupełnienie metod opisanych powyżej, wykorzystujących standardowe testy MAPS.
W korzystnym wykonaniu, polinukleotydowe fragmenty chroniące są mierzone spektrometrem mas a nie na płytkach MAPS. W bardziej korzystnym wykonaniu żaden z polinukleotydów nie jest związany (przyłączony) do stałego podłoża podczas hybrydyzacji lub w etapach trawienia nukleazą. Po hybrydyzacji, hybrydyzującą cząsteczkę docelową można degradować np. poprzez działanie nukleazą lub chemicznie, pozostawiając fragment chroniący w bezpośredniej proporcji w jakiej fragment ten hybrydyzował z cząsteczką docelową. Alternatywnie próbkę można tak traktować, aby do dalszej analizy pozostawić (pojedynczą nić) hybrydyzującej części cząsteczki docelowej, lub dupleks utworzony z hybrydyzującej cząsteczki docelowej i fragmentu chroniącego. Próbki do analizy oddziela się od reszty mieszaniny hybrydyzującej i nukleazy (na przykład przez wytrącenie etanolem lub chromatografię adsorpcyjną lub powinowactwa), eluuje lub rozpuszcza, wstrzykuje do spektrometru mas przez automatyczne wstrzyknięcie w celu wysokiej wydajności. W korzystnym wykonaniu próbki do analizy (np. fragmenty chroniące) są adsorbowane na powierzchni i analizowane za pomocą desorpcji laserowej, metody dobrze znanej specjalistom. Dla wyższej czułości można zastosować spektroskopię mas z transformacją Furier'a (FTMS) (lub inną podobnie zaawansowaną technikę) tak, że wykrywa się femtomole i mniejsze ilości fragmentów chroniących.
Fragmenty chroniące wykryte w jednej (lub większej liczbie) próbce można tak zaprojektować, aby dawały unikalny sygnał pozwalający na zastosowanie spektrometru mas. W jednym z wykonań
PL 193 762 B1 każdy z fragmentów chroniących ma unikalną masę cząsteczkową po hybrydyzacji i działaniu nukleazą i te masy cząsteczkowe oraz charakterystyczna jonizacja i wzór fragmentacji wystarczają do pomiaru ich stężenia. Dla uzyskania wyższej czułości lub dla ułatwienia analizy złożonych mieszanin, fragmenty chroniące można modyfikować (np. derywatyzować) cząstkami chemicznymi zaprojektowanymi tak, aby dawały jasne unikalne sygnały. Przykładowo każdy fragment chroniący może być derywatyzowany różnymi naturalnymi lub nie naturalnymi aminokwasami połączonymi przez wiązanie amidowe z nicią oligonukleotydową w jednym lub kilku miejscach w hybrydyzującej części nici. Przy odpowiedniej energii spektrometru mas pojawia się fragmentacja w wiązaniach amidowych uwalniająca charakterystyczną ilość aminokwasów. Pożądany jest taki rodzaj podejścia, w którym stosowane są cząstki chemiczne średniej wielości (w przybliżeniu o masie cząsteczkowej 80 do 200) jako znaczniki dla spektrometrii mas, ponieważ cząsteczki o takim rozmiarze są zasadniczo łatwiejsze do wykrycia. W innym przykładzie, chemiczną modyfikację stanowi cząsteczka organiczna o zdefiniowanym sygnale w spektrometrze mas, taka jak grupa tetraalkiloamonowa, która może, przykładowo, derywatyzować inną cząsteczkę taką jak np. aminokwas. W innym przykładzie, dodatnie lub ujemne jonowe sygnały są wzmacniane poprzez reakcję z dowolnym z wielu czynników. Przykładowo, dla wzmocnienia wykrywania dodatnich jonów może on reagować z solą piryliową (taką jak np. tetrafluoroboran 2-4-ditenylo, 6-etylo piryliowy, lub wiele innych) z aminą, tworząc sól pirydyniową; można stosować wiele innych czynników wzmacniających celem tworzenia innych dodatnio naładowanych grup funkcyjnych (patrz np. Quirke et al. (1994), Analytical Chemistry 66, 1302-1315). Podobnie można stosować szereg czynników, znanych specjalistom, dla tworzenia wzmocnienia ujemnych rodzajów jonów. Modyfikację chemiczną można wykryć oczywiście, albo po odcięciu od kwasu nukleinowego albo, kiedy jest połączona z kwasem nukleinowym. Dzięki istnieniu sposobów rozróżnienia każdego fragmentu chroniącego możliwe jest testowanie (np. dla przeszukiwania) dużej liczby różnych cząsteczek docelowych (np. dla 2, 6, 10, 16 lub większej liczby różnych cząsteczek docelowych) w pojedynczym teście. Wiele takich testów można przeprowadzić szybko i z łatwością. Test taki lub zestaw testów można prowadzić, z wysoką wydajnością jak tu określono.
Bez względu na to czy oligonukletydy są wykrywane bezpośrednio dzięki swojej masie czy użyte są unikalne znaczniki, sygnały dla każdej cząsteczki, która ma być wykryta powinny być w pełni scharakteryzowane w czystych preparatach, o znanym stężeniu. Pozwoli to na dokładny pomiar sygnału (określenie wielkości lub ilości). Intensywność oraz profil detekcji jakiejkolwiek cząsteczki uzyskiwany za pomocą spektrometrii mas nie może być przewidziany dokładnie. Skłonność cząsteczki do jonizowania, podatność wszystkich wiązań chemiczne w cząsteczce na fragmentację, stopień w którym każdy fragment jest wielokrotnie lub pojedynczo naładowany są zbyt złożone aby można je było przewidzieć. Chociaż, dla danego urządzenia z ustaloną energią i charakterystyką podawanej próbki intensywność i profil sygnału jest bardzo powtarzalny. Stąd dla każdej próbki sygnał można charakteryzować w stosunku do czystego standardu a sygnały uzyskane z pomiaru można dokładnie, ilościowo interpretować.
W jednym aspekcie, wynalazek odnosi się do sposobu wykrywania jednego lub więcej interesujących kwasów nukleinowych, obejmującego poddanie próbki, zawierającej interesujący kwas (kwasy) nukleinowy testowi ochrony przed nukleazą z jednym lub większą liczbą fragmentów chroniących i wykrycie zhybrydyzowanych cząsteczek dupleksowych lub chronionego kwasu nukleotydowego lub fragmentu chroniącego za pomocą spektrometrii mas.
Sposoby analizowania kwasów nukleinowych za pomocą spektrometrii mas są dobrze znane specjalistom. Patrz np., Alper et al. (1998), Science 279, 2044-2045 i Koster, patent USA nr 5605798.
Dodatkowo, do opisanych powyżej testów o wysokiej wydajności, istnieje wiele innych testów ewidentnych dla specjalistów.
Zaletą stosowania testów z wieloma sondami jest możliwość włączenia szeregu sond „kontrolnych do każdego uporządkowanego zestawu sond, które są poddawane tym samym warunkom reakcji co aktualnie stosowane sondy. Przykładowo, każdy region w uporządkowanym zestawie może zawierać kontrole pozytywne i/lub negatywne. Termin „sonda dla kontroli pozytywnej jest tu użyty w znaczeniu sondy kontrolnej, o której wiadomo, że np. oddziałuje istotnie z cząsteczką docelową lub oddziałuje w znany sposób ilościowy lub jakościowy, stanowiąc tym samym (wewnętrzny) standard dla oddziaływań sonda/cząsteczka docelowa. Sonda taka może przykładowo kontrolować wydajność hybrydyzacji. Termin „sonda dla kontroli negatywnej jest tu użyty w znaczeniu sondy kontrolnej, o której wiadomo, że nie oddziałuje istotnie z cząsteczką docelową. Sonda taka może przykładowo kontrolować specyficzność hybrydyzacji. Jako przykłady wykorzystania tego typu kontroli rozpatruje
PL 193 762 B1 się taki test, w którym uporządkowany zestaw sond oligonukleotydowych jest wykorzystywany do poszukiwania czynników modulujących ekspresję szeregu współzależnych genów warunkujących daną chorobę. Jako wewnętrzną sondę normalizującą zmienne takich jak liczba zlizowanych komórek w każdej próbce, odzyskanie mRNA lub wydajność hybrydyzacji, uporządkowany zestaw sond zawiera sondy specyficzne do jednego lub kilku genów typu house-keeping, ulegających ekspresji na podstawowym poziomie lub konstytutywnym, takich jak geny strukturalne (np. aktyny, tubuliny lub inne) lub białek wiążących DNA (np. czynników regulujących transkrypcję lub innych), dla których uważa się że ekspresja nie jest modulowana przez testowane czynniki. Ponadto, celem określenia czy testowany czynnik daje niepożądane skutki uboczne, takie jak śmierć komórki lub toksyczność, uporządkowany zestaw sond może zawierać sondy będące specyficznymi genami, o których wiadomo, że ulegają indukcji jako część procesu apoptozy (zaprogramowana śmierć komórki) lub które są indukowane w warunkach urazu (np. białka szoku cieplnego) lub są toksyczne dla komórek (np. geny p450).
Inne sondy kontrolne mogą znajdować się w uporządkowanym zestawie w celu „dostrojenia czułości testu. Przykładowo, można rozpatrzyć test dla czynnika modulującego wytwarzanie cząsteczek mRNA związanych z określonym etapem choroby. Jeśli wcześniejsze analizy wykazały, że jedna ze współzależnych cząsteczek (powiedzmy, mRNA-A) w tym zestawie jest wytwarzana w tak dużej ilości, w porównaniu z innymi, że jej sygnał przesłania inne cząsteczki mRNA można dostosować łączniki do „dostrojenia testu tak, aby wyrównać siłę sygnałów. „Blokujące łączniki, które obejmują sekwencję oligonukleotydową specyficzną do kotwicy zaprojektowaną do docelowego mRNA-A, która jednak nie ma sekwencji specyficznej do sondy można dodać dla rozcieńczenia puli łączników specyficznych do cząsteczki docelowej i tym samym zmniejszyć czułość testu na ten mRNA. Stosowne proporcje łączników blokujących i nie blokujących specjaliści mogą określać rutynowymi, klasycznymi metodami.
Próbki do analizy w teście według wynalazku mogą obejmować dowolne cząsteczki docelowe opisane powyżej lub inne. Płynne próbki do analizy mogą posiadać dowolną objętość stosowną do rozmiaru testu, w zakresie od około 100 nanolitrów do około 100 mikrolitrów. W korzystnym wykonaniu krople płynu o około 1 mikrolitrze są dodawane do każdej studzienki płytki mikrotitracyjnej o 1536 studzienkach. Próbki są tak umieszczane, aby kontaktowały się z uszeregowanym zestawem sond, za pomocą jednej z różnorodnych metod, właściwą dla analizy o wysokiej wydajności np. przez pipetowanie, nakraplanie dyspenserem, replikację. Próbki są inkubowane w warunkach (np. stężenie soli, pH, temperatura, czas inkubacji itd. patrz powyżej) wydajnych dla osiągnięcia wiązania lub innych stałych oddziaływań sondy i cząsteczki docelowej. Warunki te są określane rutynowo. Po inkubacji próbki można fakultatywnie traktować (np. płukać) w celu usunięcia niezwiązanej cząsteczki docelowej w warunkach, które są ustalone empirycznie tak aby specyficzne oddziaływania nie zostały uszkodzone, lecz aby usunąć niespecyficznie związany materiał. Przykładowo próbki można płukać pomiędzy jeden do około dziesięciu razy lub więcej w tych samych lub nieco bardziej ostrych warunkach niż te stosowane do osiągnięcia wiązania sonda/cząsteczka docelowa.
Próbki zawierające docelowy RNA, np. mRNA, rRNA, tRNA, wirusowy RNA lub całkowity RNA można pozyskać stosując dowolną z wielu procedur. Przykładowo kultury tkankowe in vitro, z których pozyskuje się mRNA można wysiać w obszarach, takich jak pojedyncze studzienki płytek mikrotitracyjnych. Fakultatywnie, komórki takie po osiągnięciu odpowiedniej gęstości komórkowej można poddać działaniu interesującego czynnika, takiego jak czynnik stymulujący lub potencjalny czynnik terapeutyczny, który można dodać do komórek dowolnym z różnych sposobów, np. replikatorem (takim jak replikator z 96 lub 384 końcówkami dostępny w firmie Beckman), poprzez pipetowanie, lub nakroplenie dyspenserem i inkubować z komórkami przez odpowiedni okres czasu np. pomiędzy około 15 min. i około 48 godz. Ekstrakty całkowitego RNA, mRNA itp. z tkanek lub komórek ze źródeł in vitro i in vivo można wytwarzać rutynowymi metodami znanymi specjalistom (np. handlowo dostępne zestawy).
Fakultatywnie kwas nukleinowy, który ma współzawodniczyć z interesującym RNA o hybrydyzację do specyficznej sondy (tzn. genomowy DNA, rRNA, tRNA lub mRNA, który niesie co najmniej część homologi sekwencji z interesującym RNA) można przynajmniej częściowo odrzucić z próbki RNA przez wstępne poddanie próbki procedurze ochrony przed nukleazą (NP) przed dodaniem jej do hybrydyzacji. Kwas nukleinowy („fragment croniący, którym może być np. RNA, DNA lub PNA), komplementarny do co najmniej części interesującego RNA a którego sekwencja częściowo lub całkowicie pokrywa sekwencję sondy, która jest specyficzna do interesującego RNA jest wprowadzany w nadmiarze do próbki i inkubowany z nią w wybranych warunkach ostrości hybrydyzacji, w których fragPL 193 762 B1 ment chroniący hybrydyzuje specyficznie z interesującym RNA (patrz powyżej, omówienie odpowiednich warunkach reakcji). W tym etapie, dodaje się fragmenty chroniące (np. 100 lub więcej) specyficzne do dowolnego lub każdego interesującego RNA w próbce. Po hybrydyzacji próbki poddaje się działaniu koktajlu z jednej lub większej liczby nukleaz w celu zniszczenia zasadniczo całego kwasu nukleinowego z wyjątkiem części tego interesującego RNA, który jest komplementarny do fragmentu(-ów) chroniącego, lub z wyjątkiem dupleksów utworzonych pomiędzy fragmentem(-tami) chroniącym i chronionym RNA. W następnym etapie, fragment (ty) chroniący można usuwać z takich dupleksów poprzez denaturację dupleksów i trawienie odpowiednim enzymem, który będzie degradować fragment(ty) chroniący pozostawiając zasadniczo nie uszkodzony chroniony RNA. Można użyć dowolną z różnych nukleaz do omówionych powyżej etapów trawienia włączając, np. RNazę z trzustki, nukleazę mung bean, RNazę H, nukleazę S1 (w warunkach z wysoką lub niską solą), RNazę A, Rybonukleazę T1, Egzonukleazę lll, Egzonukleazę VII, RNazę CL3, RNazę PhyM, RNazę U2 i im podobne w zależności od natury i hybrydyzującego kompleksu i niepożądanych kwasów nukleinowych obecnych w próbce. Warunki reakcji dla tych enzymów są dobrze znane specjalistom i można je optymalizować eksperymentalnie. Jeśli jest to konieczne, próbki można poddawać działaniu procedur dobrze znanych specjalistom celem usunięcia niehybrydyzujacego materiału i/lub inaktywujących czy usuwających resztki enzymów (np. ekstrakcja fenolowa, wytrącanie, filtracja na kolumnach). Traktowane tak próbki są następnie umieszczane w kontakcie z uporządkowanym zestawem sond. W celu kontrolowania czy specyficzna hybrydyzacja i następujący test ochrony przed nukleazą zachodzi prawidłowo, do mieszaniny reakcyjnej można dołączyć wyznakowane fragmenty chroniące. W celu kontrolowania czy procedura ochrony przed nukleazą działa prawidłowo, tzn. że niehybrydyzujące kwasy nukleinowe są właściwie trawione, można zaprojektować jeden lub więcej fragmentów chroniących, które zawierają segmenty zwisające (niehybrydyzujące), które powinny być odcinane przez nukleazy jeśli test pracuje prawidłowo. Obecność lub brak fragmentów zwisających można ustalić poprzez hybrydyzację z komplementarnymi, wyznakowanymi sondami, lub samą część zwisającą z fragmentu można wyznakować wykrywalną cząsteczką.
Dla wszystkich sposobów według niniejszego wynalazku, cząsteczki docelowe można wyznakować (dodać znacznik) za pomocą dowolnej z różnorodnych procedur dobrze znanych specjalistom i/lub które są tu opisane (np. dla wykrywania fragmentów w teście ochrony przed nukleazą). Przykładowo, docelowe cząsteczki można sprzęgać bezpośrednio lub pośrednio z grupami chemicznymi dostarczającymi sygnał dla wykrywania, takimi jak cząsteczki chemiluminescencyjne lub enzymy katalizujące wytwarzanie chemiluminescencyjnych cząsteczek, lub cząsteczki fluorescencyjne jak fluoresceina lub Cy5 lub cząsteczka rozwijająca w czasie fluorescencję jak jeden z chelatowanych metali ziem rzadkich lub związek radioaktywny. Alternatywnie, można znakować cząsteczki docelowe po ich reakcji z sondą za pomocą jednego lub kilku specyficznych do cząsteczki docelowej reporterów (np. przeciwciała, oligonukleotydy jak pokazano na fig. 1 lub inny powszechny typ cząsteczek omawiany powyżej w połączeniu z sondami i cząsteczkami docelowymi). Można wykorzystać także różnorodne bardziej złożone procedury wykrywania typu kanapek. Przykładowo, cząsteczkę docelową można hybrydyzować z bifunkcjonalną cząsteczką zawierającą pierwszorzędową cząstkę, która jest specyficzna do cząsteczki docelowej i drugorzędową cząstkę, która jest rozpoznawana przez wspólny (tzn. ten sam) reagent reporterowy, np. wyznakowany polinukleotyd, przeciwciało i im podobne. Bifunkcjonalne cząsteczki można projektować tak, żeby dowolna ilość wspólnych reporterów mogła być użyta wkażdym teście.
Sposoby inkubacji, cząsteczek docelowych z reporterem(-ami) specyficznym dla cząsteczki docelowej, w warunkach skutecznych dla osiągnięcia wiązania lub stabilnego oddziaływania są określane rutynowo (patrz powyżej). Przykładowo, fluorescencyjny reporter oligonukleotydowy (w stężeniu około 10 nM do około 1mM lub więcej, korzystnie 30nM, w buforze jak 6xSSPE-T lub innych) można inkubować ze związanymi cząsteczkami docelowymi przez około 15 min. do 2 godz. lub dłużej (korzystnie około 30 do 60 min.) w temperaturze pomiędzy 15°C i około 45°C (korzystnie w przybliżeniu temperatura pokojowa). Po inkubacji próbki można fakultatywnie traktować (np. płukać) celem usunięcia niezwiązanego reportera specyficznego do cząsteczki docelowej, stosując ustalone empirycznie warunki pozwalające na nieuszkodzenie specyficznych oddziaływań, lecz usuwające materiał związany niespecyficznie. Przykładowo, próbki można płukać pomiędzy jeden a około dziesięć razy lub więcej w tych samych lub nieco bardziej ostrych warunkach niż te stosowane do osiągnięcia wiązania cząsteczka docelowa/reporter.
PL 193 762 B1
Znakowanie reporterem(-ami) specyficznym do cząsteczki docelowej może dostarczyć dodatkowej warstwy specyficzności dla początkowej reakcji hybrydyzacji, np. w przypadku, w którym oligonukleotydowy reporter specyficzny do cząsteczki docelowej jest cząsteczką docelową dla innej części sekwencji docelowej kwasu nukleinowego niż jest sonda oligonukleotydowa, lub w którym sonda i reporterowe przeciwciała rozpoznają różne epitopy docelowego antygenu. Ponadto, znakowanie reporterami specyficznymi do cząsteczki docelowej może pozwolić na „dostrojenie czułości reakcji. Przykładowo, jeśli docelowy mRNA będący częścią wspólnego wzoru ekspresji jest wytwarzany na bardzo niskich poziomach, poziom sygnału można wzmocnić (amplifikacja sygnału) poprzez hybrydyzację związanej cząsteczki docelowej z wieloma (np. około dwa do około pięciu lub więcej) oligonukleotydowymi reporterami specyficznymi do cząsteczki docelowej, z których każdy hybrydyzuje specyficznie z różnymi częściami docelowego mRNA.
Zdolność wykrywania dwóch typów znaczników niezależnie pozwala na dodatkowy typ kontroli testów MASP. Niektóre (np. około 10 do około 100%) z łączników zaprojektowanych do określonego locus kotwicy (fig. 7 przedstawia 3 typowe loci kotwicy, każde obejmujące większość zasadniczo identycznych kotwic (A, B lub C)) mogą mieć znacznik (np. fluoryt) przyłączony do jednego końca. Przykładowo, rodamina lub fluoryt Cy5 można przyłączyć na końcu 5' łącznika. Tak zmodyfikowane łączniki nazwane są „łącznikami kontrolnymi. Po związaniu mieszaniny łączników i łączników kontrolnych z kotwicami i inkubacji próbki posiadającej cząsteczkę docelową z wytworzonym uporządkowanym zestawem sond, reporter specyficzny do cząsteczki docelowej niosący inny fluoryt (np. fluoresceinę lub inny wykrywalny znacznik taki jak chemiluminescencyjny) można użyć (lub cząsteczka docelowa może być bezpośrednio wyznakowana fluorytem lub innym wykrywalnym znacznikiem); i można określać stosunek tych dwóch sygnałów. Obecność łączników kontrolnych pozwala na kalibrację szeregu funkcjonalnych (np. zdolnych do oddziaływania z łącznikami) kotwic w lub pomiędzy testowanymi obszarami (np. testujących pojemność wiązania cząsteczki docelowej każdego locus z uporządkowanego zestawu w celu normalizacji sygnałów), służy jako podstawa dla ustalenia ilości związanej cząsteczki docelowej, pomaga w lokalizacji loci kotwicy i/lub dostarcza kontroli pozytywnej, np. w przypadkach, w których nie ma sygnału w wyniku braku cząsteczki docelowej w próbce. W jednym z wykonań według wynalazku można stosować dwa różne znaczniki (np. fluorofory) dla wykrycia dwóch różnych populacji cząsteczek docelowych; chociaż zdolność rozpoznawania obecności cząsteczki docelowej, dzięki przestrzennemu rozdziałowi sygnałów, pozwala na użycie pojedynczego typu znacznika dla różnych cząsteczek docelowych.
W innym wykonaniu według wynalazku „kotwice, które są specyficzne do interesującej cząsteczki(-ek) docelowej nie są złączone z łącznikami, lecz raczej z są złączone bezpośrednio z cząsteczką(-ami) docelową; cząsteczka(-ki) docelowa, z kolei, może oddziaływać fakultatywnie z reporterem(-ami) specyficznym do cząsteczki docelowej.
Cząsteczki docelowe, wyznakowane lub niewyznakowane można wykrywać jakąkolwiek procedurą, jest rutynową i klasyczną dla specjalistów (patrz, np. Fodor et al. (1996), patent USA nr 5510270; Pirrung et al. (1992) patent USA nr 5143854; Koster (1997) patent USA nr 5605798; Hollis et al. (1997) patent USA nr 5653939; Heller (1996) patent USA nr 5565322; Eggers et al. (1997) patent USA nr 5670322; Lipshutz et al. (1995), BioTechniques 19, 442-447; Southern (1996), Trends in Genetics 12, 110-115). Metody wykrywania obejmują wykrywanie oparte na enzymach, metody kolorymetryczne, SPA, autoradiografię, spektrometrię mas, metody elektryczne, wykrywanie absorbancji i luminescencji (włączając chemiluminescencję lub elektroluminescencję) i wykrywanie rozproszenia światła przez np. cząsteczki mikroskopowe użyte jako znaczniki. Także znaczniki fluorescencyjne można wykrywać np. przez przyrząd o sprzężeniu ładunkowym (CCD) lub mikroskopię fluorescencyjną (np. skaningową lub konfokalną mikroskopię fluorescencyjną) lub przez sprzęgnięcie systemu skaningowego z zestawem CCD lub fotopowielającą lampą elektronową lub użycie technologii detekcji opartych na uporządkowanym zestawie (np. można wykrywać potencjał powierzchni na każdym 10 mikronowym odcinku testowanego obszaru lub można zastosować rezonans plazmonowy powierzchni, jeśli będzie wystarczająco wysoka zdolność rozdzielcza). Alternatywnie zestaw może zawierać znacznik (np. jedna z pary sond przekazujących energię zawiera fluoresceinę lub rodaminę), który można wykrywać dzięki przekazaniu energii na (lub modulowaniu) łącznik, cząsteczkę docelową lub reporterową. Wśród systemów detekcji opartych na fluorescencji są wzmocnienie fluorescencyjne, polaryzacja fluorescencyjna (FP), fluorescencja rozdzielona w czasie, przeniesienie energii rezonansu fluorescencyjnego oraz homogenna fluorescencja rozdzielona w czasie (HTRF). Analizę powtarzających się wzorów typu kodu kreskowego można osiągnąć przy pomocy rozpoznania wzoru (znajdując
PL 193 762 B1 odpowiednie plamki lub linie dla każdej specyficznie wyznakowanej cząsteczki docelowej dzięki ich położeniu względem innych plamek i linii) a następnie można określić intensywność znaczników. Urządzenia rozpoznające kod kreskowy i oprogramowanie komputerowe do analizy jedno lub dwu kierunkowych uporządkowanych zestawów są rutynowo wytwarzane i/lub dostępne handlowo (np. patrz Rava et al. (1996) patent USA 5545531).
Sposoby wytwarzania i użycia uporządkowanych zestawów, włączając wytwarzanie powierzchni i obszarów takich jak tu opisano, syntetyzowanie lub oczyszczanie i przyłączanie lub łączenie substancji takich jak kotwice, łączniki, sondy i sondy wykrywające tu opisane, oraz wykrywanie i analiza substancji wyznakowanych czy naznaczonych jak tu przedstawiono są dobrze znanymi i klasycznymi technologiami. Dodatkowo do ujawnionych metod w referencjach cytowanych poniżej patrz np. patenty przeniesione do Affymax, Affymetrix, Nanogen, Protogene, Spectragen, Millipore i Beckman (w których dostępne są produkty przydatne w niniejszym wynalazku); standardowe podręczniki biologii molekularnej i białek obejmujące te cytowane powyżej oraz Cozette et al. (1991) patent USA 5063081; Southern (1996) Current Opinion in Biotechnology 7, 85-88; Chee et al. (1996), Science 274, 610-614 oraz Fodor et al. (1993), Nature 364, 555-556.
Figura 1 ilustruje schemat łączenia się oligonukleotydów, w którym łącznik 1 zawiera fragment specyficzny do kotwicy 1 i kolejny fragment (sondę), który jest specyficzny w stosunku do docelowego mRNA1, w stosunku do którego specyficzna jest znakowana wykrywająca sonda 1. Łącznik i sonda są specyficzne w stosunku do innych fragmentów docelowego mRNA.
Figura 2 przedstawia powierzchnię z 15 rejonami testowymi, z których każdy zawiera zestaw 6 zakotwiczonych oligonukleotydów.
Figura 3 przedstawia sposób dopasowania łącznika w teście łączenia receptora, w którym komplementarny do kotwicy fragment łącznika jest związany z resztą sondy ( białko receptorowe) poprzez cząsteczki biotyny i streptawidyny, w których ligand specyficzny dla receptora jest wyznakowany fluorescencyjną cząsteczką. B: biotyna, SA: streptawidyna, rec: białko receptorowe, Ligand: naturalny lub syntetyczny ligand dla receptora, *: fluorescencyjny znacznik dołączony do liganda.
Figura 4 przedstawia powierzchnię obejmującą 21 obszarów testowych, każdy z nich jest podzielony na 16 podobszarów (wcięcia, wgłębienia).
Figura 5a, 5b, 5c przedstawiają trzy części składające się na powierzchnię przedstawioną na fig. 4.
Figura 5a przedstawia separator studzienek, fig. 5b rozdział na mniejsze fragmenty, fig. 5c podstawę.
Figura 6 przedstawia dwa rejony testowe, każdy z nich zawiera liniowy układ próbek (lub kotwic) uszeregowanych podobnie do „kodu paskowego.
Figura 7 schematycznie przedstawia region testowy zawierający trzy kotwice (A, B, C), z których każda reprezentuje wiele kopii („grupa). Umiejscowienie każdej grupy nazywane jest „locus.
Figura 8 ilustruje powstawanie cDNA w wyniku specyficznej reakcji odwrotnej transkrypcji na płytkach MAPS.
Figura 9 ilustruje test, który wykorzystuje procedurę protekcji przed nukleazami (test NPAMAPS). Przykładowy RNA jest izolowany z komórek lub tkanek, przedstawiony tu jako cienkie, fałdowane linie. Do RNA dodawane są polinukleotydowe fragmenty zabezpieczające, przedstawione jako grube jasne i ciemne linie. Ciemna część zabezpieczającego fragmentu reprezentuje część komplementarną do specyficznego docelowego RNA i hybrydyzującą do niego. Jasna część reprezentuje zwieszające się fragmenty: sekwencje sąsiadujące z komplementarną sekwencją, ale nie komplementarne do docelowej cząsteczki. Zabezpieczające fragmenty dodane są w nadmiarze. Po hybrydyzacji wszystkich dostępnych cząsteczek z zabezpieczającymi fragmentami, próbki traktowane są odpowiednią mieszaniną nukleaz i chemikaliów, które niszczą niepożądany niezhybrydyzowany RNA i niezhybrydyzowane polinukleotydy. Na przykład, nukleaza S1 jest w stanie zdegradować każdą jednoniciową cząsteczkę DNA. W związku z tym, nadmiar zabezpieczających fragmentów jest hydrolizowany, jak również zwieszające się, niezhybrydyzowane fragmenty związanych zabezpieczających cząsteczek. RNA może zostać zhydrolizowany poprzez rybonukleazy takie jak np. rybonukleaza H lub poprzez ogrzanie próbek w zasadzie. Pozostałości to zbiór pociętych fragmentów zabezpieczających, który odzwierciedla ilość docelowego RNA obecnego w próbce. Ilość pozostałych fragmentów zabezpieczających jest mierzona w teście hybrydyzacyjnym MAPS.
Figura 10 przedstawia specyficzność hybrydyzacyjną w teście MAPS.
Figura 11 przedstawia kinetykę wiązania kotwicy do łącznika.
Figura 12 przedstawia test MAPS dla dwu docelowych nukleotydów.
PL 193 762 B1
Figura 13 przedstawia kwantyfikację przesunięcia czułości.
Figura 14 przedstawia wyznaczenie temperatury topnienia dla czterech kombinacji łącznik/kotwica.
Figura 15 przedstawia oznaczenie mRNA przy pomocy NPA-MAPS.
Figura 16 przedstawia krzywą rozcieńczeń przy NPA-MAPS.
Figura 17 przedstawia test na wykrywanie peptydów zawierających reszty fosfotyrozynowe.
Figura 18 przedstawia pierwszy etap próby na mapowanie sekwencji EST: gromadzenie łączników odpowiadających każdej sekwencji EST dla mapowania ich na szeregu oligonukleotydów kotwiczących na płytce MAPS. Do powierzchni każdej z 16 studzienek mikropłytki dołączone są łączniki zawierające 16 różnych sond oligonukleotydowych, ustawionych na matrycy 4 x 4. Pierwsze lokus ma oligo 1, który jest komplementarny to części pierwszej sekwencji EST i tak dalej dla 16 testowanych sekwencji EST.
cDNA lub mRNA utworzone z genów, z których otrzymano sekwencje EST jest dodane do wszystkich 16 studzienek i zostawione do hybrydyzacji w odpowiednich warunkach. W ten sposób każde cDNA lub mRNA, które zawiera jedną z 16 sekwencji EST będzie zgromadzone w miejscu, gdzie umieszczona jest komplementarna do niego sonda.
Figura 19 przedstawia następny etap próby na mapowanie sekwencji EST: dodawanie detektorów oligonukleotydowych do płytek MAPS. Każda studzienka płytki otrzymuje oligonukleotyd wykrywający, który odpowiada jednej mapowanej sekwencji EST. Każdy oligonukleotyd wykrywający jest oligonukleotydem połączonym z cząsteczką używaną dla detekcji, n.p. z fluorescyną, jeśli obraz fluorescencyjny jest metodą detekcji. Każdy oligonukleotyd wykrywający jest komplementarny do jednej z sekwencji EST, ale inny od sondy EST-specyficznej, tak że sonda i oligonukleotyd wykrywający, które są komplementarne do jednej sekwencji EST mogą się z nim łączyć w tym samym czasie.
Po przemyciu, pojedynczy oligonukleotyd wykrywający jest dodawany do każdej studzienki, jak ponumerowano na fig. 18. To jest, oligonukleotyd wykrywający z sekwencją komplementarną do pierwszej sekwencji EST dodany jest do pierwszej studzienki itd.
Figura 20a i b przedstawia wyniki próby mapowania sekwencji EST pokazanego na fig. 18 i 19. Po hybrydyzacji oligonukleotydu detekcyjnego i przemyciu w odpowiednich ścisłych warunkach, 16 studzienek mikropłytki zobrazowane jest np. przy użyciu fluoroimagera opartego na układzie CCD. Figura 20a przedstawia modelowe wyniki. Oczekuje się, że każdy EST-specyficzny oligonukleotyd wykrywający powinien znakować mRNA lub cDNA przytrzymane przez odpowiednią EST-specyficzną sondę. Na przykład, sonda 5 gromadzi cDNA lub mRNA zawierające piątą sekwencję EST w lokus, tak że piąty oligonukleotyd wykrywający powinien również hybrydyzować do cDNA lub mRNA w tym samym lokus. Tak jest w przypadku tych modelowych danych, w których każdy oligonukleotyd wykrywający znakuje pasującą sondę. Dodatkowo, trzy pierwsze oligonukleotydy detekcyjne znakują cDNA lub mRNA przytrzymane przez trzy pierwsze sondy, wskazując, że sekwencje leżą wzdłuż tego samego genu. Podobnie, ostatnie pięć sekwencji EST wydają się być związane. Wiązanie wyznaczone z tego badania przedstawione jest graficznie na fig. 20b.
Figura 21 przedstawia związek pomiędzy sondami, oligonukleotydami detekcyjnymi i sekwencjami EST #1, 2 i 6 pokazane na fig. 18-20.
Figura 22 przedstawia wysokowydajny test.
Przykłady
P r zyk ł a d 1 Specyficzność hybrydyzacji (patrz fig. 10)
Płytki rodzajowe MAPS przygotowano przy użyciu nakraplającego dyspensera, systemu Pixus (Cartesian Technologies, Inc., Irvine, CA), aby otrzymać identyczną siatkę DNA w obrębie każdej studzienki płytki mikrotitracyjnej. Wszystkie oligonukleotydy zostały zakupione w Biosource International (Camarillo, CA) Na płytki nakraplano siedem różnych oligonukleotydowych kotwic w każdej studzience, które układały się we wzór nazwany Klucz (lewa strona fig.). Każdy oligonukleotyd był nanoszony w kroplach po 10 nanolitrów w dwa miejsca, z 2uM roztworu zawierającego 500 mM fosforan sodu pH 8.5 i 1 mM EDTA, do studzienek płytek wiążących DNA (Corning Costar) i pozostawiany do wyschnięcia. Po związaniu, studzienki były blokowane 50 mM Tris pH 8, a następnie oligonukleotydy nie związane kowalencyjnie do powierzchni były odmywane 0.1% SDS w buforze 5xSSP.
Do wypłukanych płytek dodawany był znakowany fluorescencyjnie łącznikowy oligonukleotyd i hybrydyzowany w 6xSSPE z 0.1% Tritonem X-100 w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Jest to zalecana procedura przyłączania łącznika. Łącznikowe oligonukleotydy były modyfikowane Cy5 podPL 193 762 B1 czas syntezy i były komplementarne do 25 zasadowego segmentu specyficznego oligonukleotydu kotwicy. Sekwencje siedmiu kotwic i łączników są następujące (wszystkie pokazane od 5' do 3'):
#1 Kotwica*:
TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC SEQ ID: 1
Łącznik** SEQ ID: 2
GTCGTTTCCATCTTTGCAGTCATAGGATACTGAGTGGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGA RNA udający (mysi c-jun) SEQ ID: 3
CTATGACTGCAAAGATGGAAACGACGATACTGAGTTGGACCTAACATTCGATCTCATTCA Oligonukleotyd wykrywający*** SEQ ID: 4
TGAATGAGATCGAATGTTAGGTCCA #2 Kotwica*: SEQ ID: 5
CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC
Łącznik** SEQ ID: 6
CTAGGCTGAAGTGTGGCTGGAGTCTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTG
RNA udający (mysi MIP-2) SEQ ID: 7
AGACTCCAGCCACACTTCAGCCTAGGATACTGAGTCTGAACAAAGGCAAGGCTAACTGAC Oligonukleotyd wykrywający*** SEQ ID: 8
GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG #3 Kotwica*: SEQ ID: 9
GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG
Łącznik** SEQ ID: 10
ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG
RNA udający (mysi GAPDH): SEQ ID: 11
CCTTCATTGACCTCAACTACATGGTGATACTGAGTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC Oligonukleotyd wykrywający*** SEQ ID: 12
GTCATCATACTTGGCAGGTTTCTCC #4 Kotwica*: SEQ ID: 13
GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA
Łącznik** SEQ ID: 14
CTACCGAGCAAACTGGAAATGAAATTGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTC
RNA udający (mysie białko L32): SEQ ID: 15
ATTTCATTTCCAGTTTGCTCGGTAGGATACTGAGTGAGTCACCAATCCCAACGCCAGGCT
Oligonukleotyd wykrywający***
AGCCTGGCGTTGGGATTGGTGACTC #5 Kotwica*:
CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG
Łącznik**
CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG #6 Kotwica*: .
CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC
Łącznik**
GCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG #7 Kotwica*:
GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG
Łącznik**
CGAAGAGATGCATAACGCGGCGCCG
SEQ ID: 16
SEQ ID: 17
SEQ ID: 18
SEQ ID: 19
SEQ ID: 20
SEQ ID: 21
SEQ ID: 22 *Kotwice były syntetyzowane z odstępem C12 z amidem na 5' końcu.
**Łączniki były syntetyzowane z Cy5 dołączonym na 5' końcu.
***Wykrywające oligonukleotydy były syntetyzowane z biotyną dołączoną na 5' końcu.
Do każdej studzienki zarówno pojedyncze łączniki, jak i mieszaniny łączników dodawane były w dużej ilości. (Do kieszonek oznaczonych jako „wszystko, dodawana była mieszanina wszystkich siedmiu łączników). Po inkubacji i trzykrotnym przemywaniu 5xSSP, zbierano fluorescencyjny obraz, widoczny po prawej stronie, przy użyciu aparatu Tundra (INRI, St. Catherines, Ontario). Jak można
PL 193 762 B1 zauważyć, łączniki połączyły się z powierzchnią poprzez specyficzne oddziaływanie z ich komplementarnymi kotwicami.
Procedura jest powtarzana, z wyjątkiem tego, że osiem różnych kotwic jest rozprowadzone w każdej studzience i następnie łączniki preferencyjnie z nimi asocjują. Cały proces jest powtarzany z36, 64 itd. różnymi kotwicami w każdej studzience 24, 96, 384, 864 lub 1536 dołkowej płytki.
Przykła d 2 Kinetyka wiązania (patrz fig. 11)
Poziom hybrydyzacji derywatyzowanego cy5 łącznika numer 1 do jego komplementarnej kotwicy jest pokazany dla różnych stężeń łącznika. Płytki różnicujące MAPS były przygotowane jak dla fig. 1 z wyjątkiem tego, że kotwica 1 była dołączona w 4 punktach studzienki. Inkubację przeprowadzano w temperaturze pokojowej w 5xSSP z 0.1% tween-20, studzienki były płukane 3 razy przed pomiarem związanej fluorescencji. Obraz fluorescencji płytki był wykonany przy użyciu aparatu Tundra, oprogramowanie Tundra posłużyło do odjęcia tła i intensyfikacji każdej plamy w studzience. Wykres przedstawia średnią z odchyleniami standardowymi dla integrowanej intensywności czterech plamek w każdej z dwu zduplikowanych studzienek.
Przykład 3 Fluorescencyjny łącznik
Płytka różnicująca MAPS jest produkowana z jednym kotwiczącym oligonukleotydem umiejscowionym zarówno jako jedna kropka na studzienkę (górne dwa rzędy), 4 kropki na studzienkę (następne cztery rzędy) lub 16 kropek na studzienkę (niższe dwa rzędy), jak to zostało przedyskutowane powyżej. Do każdej studzienki dołączony jest, w preferencyjnej procedurze opisanej w przykładzie 1, komplementarny, wyznakowany fluorescencyjnie łącznik. Po płukaniach, fluorescencyjny obraz płytki uzyskiwany był przy użyciu aparatu Tundra. Intensywność fluorescencji każdej plamki mówi ile funkcjonalnego łącznika jest dostępne w hybrydyzacji z docelową cząsteczką. Intensywność wykrywanego sygnału w powtarzających się plamkach jest wysoko powtarzalna.
Przykła d 4 Krzywe wiązania
Do płytki przygotowanej jak w przykładzie 3 dodawane są różne stężenia docelowego oligonukleotydu. Związany łącznik zawiera 25 nukleotydową sekwencję komplementarną do fragmentu docelowej cząsteczki. Cząsteczka docelowa dodawana jest w 5xSSC z 0.05% SDS w końcowej objętości 30 lub 100 mikrolitrów, następnie płytka jest przykrywana i inkubowana w 50°C przez noc. Po hybrydyzacji docelowa cząsteczka jest przyłączona do łącznika i uwidoczniana przy użyciu chemiluminescencji i zalecanej procedury. Biotynylowany oligonukleotyd wykrywający, zawierający 25 nukleotydową sekwencję komplementarną do kolejnego fragmentu cząsteczki docelowej (inny fragment niż ten komplementarny do łącznika) jest dodawany do 30 nM. Biotynylowany detektor może być dodany 30 minut po odmyciu nadmiaru niezwiązanej cząsteczki docelowej, lub może być dodany razem z cząsteczką docelową do całonocnej hybrydyzacji. Po dołączeniu cząsteczki wykrywającej, powierzchnia przemywana jest dwukrotnie 5xSSC, raz 1xSSP zawierającym 0.1% Tween-20 i 1% PEG (SSPTP), a następnie dodawane jest rozcieńczenie 1:50000 roztworu zawierającego 250 m g/ml peroksydazy chrzanowej na 5 godzin w SSPTP w temperaturze pokojowej. Studzienki płukane są następnie cztery razy SSPTP, potem raz i inkubowane z odczynnikiem Super Signal Ultra (Pierce). Po kilku minutach, obraz luminescencji zbierany jest przy użyciu aparatu Tundra, tzn. zdjęcia są zbierane przez kamerę CCD przez pięć minut. Niskie poziomy cząsteczki docelowej mogą być wizualizowane w niektórych studzienkach przy stężeniu tak niskim jak ~5x10-13M; ilość sygnału zwykle jest wysycona przy stężeniu -10 cząsteczki docelowej ~10-10M. Ilość wykrywanego sygnału w powtórzonych plamkach jest wysoce powtarzalny.
Przykła d 5 Test dwóch oligonukleotydów (patrz fig. 12)
Krzywa wiązania przedstawia test hybrydyzacyjny MAPS dla dwóch różnych oligonukleotydów docelowych przy użyciu zalecanej metody, przedyskutowanej powyżej. Płytki różnicujące MAPS były przygotowywane przy użyciu czterech różnych oligonukleotydów kotwiczących, każdy nakroplony cztery razy w każdej studzience. Dla drugiej i czwartej kotwicy, komplementarne oligonukleotydy łącznikowe były samo-dołączane na powierzchni jak to opisano. Dwie cząsteczki docelowe dodawane były w objętości 40 mikrolitrów w stężeniu jak opisano powyżej i inkubowane w 50°C przez noc. Ilość dołączonej cząsteczki docelowej była wizualizowana przez dołączenie biotynylowanego specyficznego oligonukleotydu wykrywającego a następnie HRP:SA i zebraniu danych o chemiluminescencji jak to opisano powyżej. Dolna część obrazu przedstawia kwantyfikację intensywności. Do skanowania intensywności obrazu wzdłuż linii pomiędzy strzałkami, użyte zostało oprogramowanie z pakietu dołączonego do aparatu Tundra Imager. Przy najniższym stężeniu cząsteczki docelowej, 1.1 pM, skanowany obraz przedstawia dobrze zdefiniowane krzywe Gaussa dla każdej plamki, podczas gdy na wyPL 193 762 B1 kresie z lewej strony odpowiadającym zerowemu stężeniu cząsteczki docelowej nie daje się wyróżnić żadnych szczytów tła.
Przykład 6 Przesunięcia czułości (patrz fig. 13)
Test hybrydyzacyjny MAPS może być użyty do mierzenia stężenia zestawu oligonukleotydów, poprzez wiązanie ich na powierzchni i ich znakowanie. Metoda ta pracuje wydajnie dla oligonukleotydów w średnim lub niskim stężeniu. Dwie próbki mogą być rozróżnione w takich warunkach, ponieważ jeżeli jedna z próbek zawiera więcej oligonukleotydu, tym więcej może związać. Z drugiej strony, jeżeli stężenie oligonukleotydu jest wystarczające do wysycenia powierzchni (tzn. jeżeli jest wystarczające do zajęcia wszystkich możliwych do związania miejsc), to jeżeli nawet wzrośnie stężenie nie można już związać większej ilości cząsteczek, ich stężenie jest niemierzalne. Jakkolwiek, krzywa wiązania cząsteczki docelowej może być przesunięta poprzez dodanie niewyznakowanego kompetytorowego liganda.
Dane dotyczące wiązania otrzymane dla czterech różnych oligonukleotydów docelowych, z których wszystkie wysycają powierzchnię (tzn. osiągają maksymalny stopień związania) przy około 3 nM. Przez dodanie niewyznakowanej kompetytorowej cząsteczki docelowej do wszystkich studzienek, następuje przesuniecie wiązania znakowanego oligonukleotydu, tak więc wiąże się mniej przy niższym stężeniu, przesuwa się również poziom przy którym pojawia się wysycenie. Można dodać kompetytorowego oligonukleotydu do, powiedzmy, cząsteczek docelowych 1i 3, ale nie do 2 i 4. Pozwoli to na przesunięcie czułości oznaczenia tylko dla cząsteczek docelowych 1 i 3. W ten sposób oligonukleotyd docelowy występujący w szerokim spektrum stężeń może być mierzony w jednym teście, jeżeli znane są oczekiwane relacje w ilości oligonukleotydów.
Dane mogą być uzyskiwane tak jak to wyjaśniono powyżej dla wiązania jednego docelowego nukleotydu. Figura 13 pokazuje ilościowo, że dodając kompetytorowy oligonukleotyd w teście, powodujemy przesunięcie krzywej wiązania co umożliwia mierzenie wyższych stężeń docelowej cząsteczki.
Przykład 7 Temperatura topnienia czterech próbek (patrz fig. 14)
Ilość czterech różnych znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów specyficznie hybrydyzujących z kotwiczącymi oligonukleotydami w teście MAPS, jest wykreślone jako funkcja wzrostu temperatury. Cztery oligonukleotydy były najpierw hybrydyzowane w 50°C przez 1 godzinę przy 300 nM. Następnie studzienki były płukane SSC bez sond, a następnie związana ilość była mierzona przy użyciu fluorescencji jak to było opisane powyżej (punkt 50°C). Następnie powierzchnia była inkubowana w55°C przez 30 minut, po czym mierzono ilość związanej fluorescencji, i tak kolejno dla wszystkich wymienionych temperatur.
Przykład 8 Sposoby detekcji
Porównywano dwie metody detekcji. Do płytek MAPS z czterema dołączonymi oligonukleotydowymi kotwicami, każda w ilości czterech plamek na studzienkę, dodawano dwa oligonukleotydy na każda studzienkę. Obydwa oligonukleotydy zawierały kowalencyjnie związaną grupę Cy5 lub tez obydwie zawierały reszty biotyny. Pomiar epi-fluorescencji wykonywany był w taki sam sposób jak to opisano dla fluorescencyjnych łączników. Pomiar chemiluminescencji wykonywano tak jak w teście MAPS, przy użyciu kolejno dodawanych HRP:SA i substratu do chemiluminescencji. Generowany sygnał był z grubsza tego samego rzędu. Jakkolwiek, ze względu na geometrię mikropłytek zawierających ścianki oddzielające od siebie studzienki i czasami pojawiające się pęcherzyki w roztworze, menisk płynu-odbicia w obrazach epi-fluorescencji mogą wpływać na interpretację wyników.
Przykład 9 Produkty używane do chemiluminescencji
Dwa produkty dostępne jako chemiluminescencyjne substraty dla peroksydazy chrzanowej mogą być porównane w procedurze testu MAPS. Płytki MAPS przygotowano tak jak w przykładzie 8 i inkubowano z biotynylowanym oligonukleotydem łącznikowym. Następnie dodawano alkaliczną fosfatazę dołączoną do streptawidyny (AlkPhos:SA) lub HRP:SA i po płukaniu odpowiedni substrat- CDPStar(Tropix) do studzienek z AlkPhos:SA lub ECL-Plus do studzienek z HRP:SA. Znakowanie enzymami związanymi z SA i użycie substratów zgodnie z zaleceniami ich producentów, co do znakowania w technice „western. Użyte substraty mogą być używane (również inne dostępne substraty) do oceny hybrydyzacji na płytkach MAPS.
Przykład 10 Rozdzielczość przy 0,6 mm
Rozdzielczość opisywanego systemu testów MAPS jest oznaczana przez przygotowanie płytek MAPS dla czterech różnych kotwic oligonukleotydowych na studzienkę, nakroplonych po cztery razy w studzience w odległości (środek do środka) 0.6 mm. Następnie wykonuje się hybrydyzację łączników związanych z Cy5 lub biotynylowanych oraz detekcje i skanowanie tak jak to opisywano.
PL 193 762 B1
Dla epi-fluorescencji mierzona rozdzielczość jest wyższa (odległość może zostać zredukowana). Dla procedury wykorzystującej chemiluminescencję sąsiadujące plamki nie są kompletnie oddzielone, przy takich odległościach indywidualne szczyty mogą być jednoznacznie rozróżnione przez program komputerowy.
P r zyk ł a d 11 Protokół testu protekcji przed nukleazami
W celu wyznaczenia optymalnych warunków dla hybrydyzacji i traktowania nukleazami w teście protekcji przed nukleazami używano zestawu Nuclease Protection Assay Kit firmy Ambion (Austin, Texas), który zapewniał odpowiednie warunki, bufory i enzymy. Przygotowano osiem próbek w jednym z trzech buforów. Hyb Buff1 jest 100% buforem do hybrydyzacji (Ambion), Hyb Buff2 jest 75% buforem do hybrydyzacji zmieszanym z 25% buforem do rozcieńczeń (Ambion); Hyb Buff3 jest 50% mieszaniną każdego z buforów. Oligonukleotyd o długości 70 zasad, zawierający 60 reszt komplementarnych do testowego mRNA (zsyntetyzowany w Biosource International, Camarillo, CA) został wyznakowany Psoralen-fluoresceiną (Schleicher i Schuell, Keene, NH) w odpowiedniej procedurze zalecanej przez firmę Ambion dla znakowania Psoralen-biotyną. Ujmując rzecz krótko, chroniący fragment został rozcieńczony do stężenia 50ug/ml w 20 ml buforu TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8), gotowany przez 10 minut i gwałtownie schłodzony w mieszaninie lodu i wody. Następnie dodano cztery ml z 130ug/ml Psoralen-fluoresceiny w DMF i oświetlono próbkę ręcznym źródłem UV o długiej fali, przez 45 minut w 40°C. Niezwiązana Psoralen-fluoresceina została usunięta przez ekstrakcję nasyconym butanolem. Użytym mRNA był antysensowny GAPDH mRNA, przygotowany z antysensownego plazmidu (pTRI-GAPDH-Mouse antysensowna matryca kontrolna firmy Ambion) przy użyciu promotora T7 i zestawu MaxiScript (Ambion). Krótki fragment chroniący zawiera 60 komplementarnych nukleotydów syntetyzowanych i znakowanych niezależnie. Sekwencja chroniących fragmentów jest następująca:
Fragment chroniący o pełnej długości: SEQ ID: 23
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT
GCTTGTCTAA
Krótki fragment chroniący: SEQ ID: 24
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT
Hybrydyzację wykonano poprzez zmieszanie chroniących fragmentów do stężenia 20 nM i mRNA GAPDH do stężenia 60 nM w 10ml końcowej objętości i przeprowadzano reakcję przez 2 godziny w 22°C lub 37°C. Po hybrydyzacji dodawano 200ml mieszaniny nukleaz zgodnie z zaleceniami producenta (Ambion Nuclease Protection Kit, rozcieńczenie mieszaniny nukleaz 1:200) i inkubowano powtórnie przez 30 minut. Hydrolizę przerywano poprzez dodanie buforu hamującego hybrydyzację (Hybridization Inhibition Buffer firmy Ambion), a oligonukleotydy były wytrącane i przemywane etanolem. Próbki były następnie nanoszone w 10ml barwnika do nakładania próbek (Gel Loading Buffer firmy Ambion) i rozdzielane w 15% żelu z mocznikiem w buforze TBE. Po rozdziale żel płukano 30 minut zmieszaniem w buforze do elektroforezy, a następnie żel umieszczany był na plastikowej płytce i dokumentowany przy użyciu aparatu Tundra z filtrami dla fluorescein, dokonujących selekcji odpowiednich długości fali dla wzbudzenia i emisji. Obraz był zbierany przez kamerę CCD w ciągu 2 minut. Najlepsze rezultaty obserwowano dla próbek inkubowanych w Hyb Buff2 w 37°C i Hyb Buff3 w 22°C. W powyższych próbach nie wykrywano chroniących fragmentów o pełnej długości, oraz obserwowano znaczące ilości części fragmentu pełnej długości odpowiadających długością krótkiemu fragmentowi chroniącemu.
P r zyk ł a d 12 Oznaczenie mRNA w teście NPA-MAPS (patrz fig.15)
Kompletna procedura NPA-MSP została wykonana przy zastosowaniu warunków hybrydyzacji i trawienia nukleazami ustalonymi tak jak to opisano w przykładzie 11. Następnie próbki zostały użyte do testu. Wszystkie zawierały taką sama ilość 70 nukleotydowej cząsteczki protegującej i różne ilości mRNA GAPDH. Próbki hybrydyzacyjne były ogrzewane do 90°C przez 6 minut, w 10ml mieszaniny 50% buforu do hybrydyzacji z 50% buforu do rozcieńczeń, zawierającej drożdżowy RNA (Ambion) o stężeniu 0.08 mg/ml, a następnie szybko zwirowywane, ogrzewane przez 5 minut w 70°C, pozostawione do osiągnięcia temperatury 19°C i inkubowane 19 godzin. Do każdej z próbek dodano po 200ml mieszaniny nukleaz i inkubowano przez 30 minut w 19°C. Z każdej próbki pobrano po 60 ml do testu MAPS. Dodano 2 ml 10 N NaOH i 2 ml 0.5 M EDTA a następnie grzano próbki przez 15 minut w 90°C, 15 minut w 37°C i pozostawiano je na 20 minut do osiągnięcia temperatury pokojowej. Następnie
PL 193 762 B1 próbki neutralizowano 2 ml 10 M HCl, po czym dodawano 12 ml 20xSSC zawierającego 2M HEPES pH 7.5 i 200 nM biotynylowanego oligonukleotydu wykrywającego specyficznego w stosunku do protegowanego fragmentu, razem z 1 ml 10% SDS. Próbki mieszano, ogrzewano do 80°C przez 5 minut, a następnie pobierano dwie porcje po 35 m l do dwóch studzienek płytki MAPS (każda próbka została rozdzielona na dwie części w celu wykonania dwóch powtórzeń na płytce MAPS). Płytki zostały przygotowane przy użyciu standardowego protokołu MAPS, ze związanymi specyficznymi łącznikami, połączonymi z Cy5, dla protekcji dołączonych już fragmentów. Płytki MAPS były przykrywane i inkubowane w 50°C przez noc, detekcja luminescencji była wykonana w opisywany sposób. Do ostatniej próbki nie była podczas testu dodawana nukleaza, w celu kontroli jak jest uwidaczniany przez MAPS sam fragment. W niższej części fig. 15 prezentowany jest skan intensywności ( tak jak jest analizowany przez urządzenie) dla górnych studzienek. Ilość mRNA GAPDH obecnego w próbce (to jest ilość w każdej ze zduplikowanych próbek po rozporcjowaniu na płytce MAPS) jest wymieniona na fig.
Oligonukleotydy użyte do płytek MAPS
Kotwica*: SEQ ID: 25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
Łącznik** SEQ ID: 26
CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG
Fragment chroniący (komplementarny do mysiego antysensownego mRNA dla GAPDH) SEQ ID: 27
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT GCTTGTCTAA
Oligonukleotyd wykrywający***- znakowany biotyną na 5' końcu SEQ ID: 28
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT *Kotwice były syntetyzowane ze odstępem C12 z amidem na 5' końcu **Łączniki były syntetyzowane z Cy5 dołączonym na5' końcu ***Wykrywające oligonukleotydy były syntetyzowane z biotyną dołączoną na 5' końcu
P r zyk ł a d 13 Krzywa rozcieńczeń, NPA-MAPS (patrz fig. 16)
Dane dyskutowane w przykładzie 12 i pokazane na fig. 15 zostały skwantyfikowane i przedstawione na wykresie jako krzywa rozcieńczeń. Średnie i odchylenia standardowe dla wszystkich ośmiu plamek każdego z dwu powtórzonych studzienek zostały wykreślone dla każdego stężenia mRNA. Krzywa jest wykreślona zgodnie z równaniem.
Frakcja związana = Maksymalne wiązanie*1/(1+IC50/L)
Gdzie Maksymalne wiązanie jest maksymalnym wiązaniem przy wysyceniu, Frakcja związana jest ilością związaną przy określonym stężeniu liganda, L, IC50 to stężenie liganda przy którym Frakcja związana wynosi połowę Maksymalnego wiązania. Krzywa widoczna jest w postaci czerwonych kropek, narysowanych z najlepiej dobraną wartością IC50=4.2 femtomola jak to zaznaczono na fig.
P r zyk ł a d 14 Test NPA-MAPS dla mRNA GAPDH w totalnym ekstrakcie z mysiej wątroby
W totalnym ekstrakcie z mysiego RNA oznaczany jest mRNA dla GAPDH przy użyciu testu NPA-MPS i krzywej rozcieńczeń. Totalny RNA z mysiej wątroby przygotowano przy użyciu zestawu Qiagen. RNA został wytrącony 70% etanolem z 0.5M octanem magnezu i zawieszony w 10ml 5xSSC z 0.05% SDS i 1.8nM fragmentem chroniącym. Dodany fragment chroniący ma długość 70 nukleotydów, z których 60 jest komplementarne do mysiego GAPDH. Użyto fragmentu komplementarnego do mysiego mRNA dla GAPDH (fragment chroniący) lub dopełnienia sekwencji jako kontrola negatywna (fragment antysensowny).
Próbki RNA z fragmentami chroniącymi były ogrzewane przez 5 minut w 90°C, hybrydyzacje przeprowadzano poprzez przeniesienie ich do 70°C i pozostawienie przez noc do powolnego ochłodzenia aż do temperatury pokojowej. Następnie dodawano 30 ml nukleazy S1 (Promega) w rozcieńczeniu 1:10 w 1 x buforze dla nukleazy (Nuclease Buffer, Promega), i inkubowano 30 minut w 19°C, a następnie reakcję stopowano poprzez dodanie 1.6 m l 10 N NaOH i 2.7 m l 0.5 M EDTA. Próbki ogrzewano przez 15 minut w 90°C, a następnie 15 minut w 37°C, aby zdenaturować i zniszczyć RNA, neutralizowano 1.6 ml 10 M HCl i inkubowano na płytkach MAPS przez noc w 5xSSC z 0.05% SDS uzupełnionym 200 mM HEPES o pH 7.5 do którego dodano 30 nM biotynylowanego oligonukleotydu. Płukania i wizualizację przy użyciu SA-HRP wykonano jak to opisano uprzednio. Intensywność sygna34
PL 193 762 B1 łu spada wraz ze zmniejszającą się zawartością mysiego RNA w próbce (próbki zawierały 500, 170, 50, 5 lub 0.5 mg totalnego mysiego RNA. Dwie kontrolne próbki nie zawierały nukleazy S1. Sygnał obserwowany jest tylko dla komplementarnego fragmentu protegującego.
Użyte oligonukleotydy:
Dla kontroli antysensownej (takie same oligonukleotydy jak w przykładzie 12):
Kotwica*: SEQ ID: 25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
Łącznik** SEQ ID: 26
CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG Fragment chroniący (komplementarny do mysiego antysensownego mRNA dla GAPDH) SEQ ID: 27
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT GCTTGTCTAA
Oligonukleotyd wykrywający*** SEQ ID: 28
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT
Dla sensownych próbek mRNA dla GAPDH
Kotwica*: SEQ ID: 25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
Łącznik** SEQ ID: 29
ATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG
Fragment chroniący (komplementarny do mysiego mRNA dla GAPDH) SEQ ID: 30
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGACAATCTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCG
GCTTGTCTAA
Oligonukleotyd wykrywający*** SEQ ID: 31 CGAGAAATATGACAACTCACTCAAG *Kotwice były syntetyzowane z odstępem C12 z amidem na końcu 5' **Łączniki były syntetyzowane z Cy5 dołączonym na końcu 5' ***Wykrywające oligonukleotydy były syntetyzowane z biotyną dołączoną na końcu 5'
Przykład 15 Test MAPS ochrony przed nukleazą z kontrolami mRNA jest ekstrahowany z wątroby myszy i ochrona przed nukleazą jest wykonywana zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 14, z wyjątkiem tego, że fragment specyficznej ochrony GAPDH zawiera 60 nukleotydów, które są komplementarne do mysiego GAPDH, a następnie 15 „zwisających nukleotydów z 3' końca tego fragmentu, które nie są komplementarne do cząsteczek docelowych. Po hybrydyzacji i trawieniu nukleazą pozostający chroniący fragment jest hybrydyzowany do płytki MAPS jak pokazano w przykładzie 14, z wyjątkiem tego, że dwa różne oligonukleotydowe fragmenty wykrywające użyte są do wykrycia unieruchomionego fragmentu chroniącego. Jeden fragment wykrywający jest komplementarny do części GAPDH-specyficznej fragmentu chroniącego i drugi, kontrolny, jest komplementarny do 15 zasadowej zwisającej części fragmentu chroniącego. Każdy fragment wykrywający jest używany na innej próbie (to jest w innej studzience) tak, że oba fragmenty wykrywające mogą być wyznakowane tą samą cząsteczką wykrywającą. W obecnym przykładzie oba fragmenty są znakowane za pomocą HRP. Bez dodania nukleazy sygnały z obu fragmentów chroniących są widoczne; natomiast, gdy zachodzi trawienie nukleazą jedynie sygnał odpowiadający sekwencji GAPDH może być wykryty. Wielkość sygnału specyficznego dla GAPDH jest odpowiednio zmniejszana do wartości obserwowanej przy braku trawienia nukleazą, ponieważ fragment chroniący jest dodawany w nadmiarze odpowiednio do ilości obecnego GAPDH mRNA. To pozwala na to, by ilość GAPDH mRNA była wielkością ograniczającą dla hybrydyzacji ochrony, tak, że ilość tworzonego dwuniciowego hybrydu (a zatem i ilość fragmentu chroniącego, który jest chroniony przed nuleazą) jest odbiciem ilości mRNA. Jeżeli mieszanina reakcyjna nie zawiera żadnego mRNA, żaden sygnał nie może być wykryty po dodaniu nukleaz. Powyższy wynik pokazuje, że etapy hybrydyzacji i trawienia przebiegały jak należy.
Kiedy chroniące fragmenty odpowiadające różnorodnym cząsteczkom docelowym są zawarte w danej próbie, każdy fragment chroniący może zawierać ten sam kawałek 15 zwisających nukleotyPL 193 762 B1 dów. To pozwala na użycie jednego fragmentu wykrywającego, aby sprawdzić pozostałe zwisające nukleotydy we wszystkich próbkach.
P r z y k ł a d 16 Test transkrypcyjny poszukujący związków, które mogą zmienić ekspresję genów korelujących ze stanami chorobowymi
Użyta jest linia komórkowa pochodząca z ludzkiego nowotworu. Wykryto dla 30 genów wyższy poziom ekspresji niż w komórkach normalnych. (To znaczy, że 30 genów jest używane bardziej niż w komórkach normalnych, po to by wyprodukować mRNA, a następnie białka, dla których geny są instrukcją. Próba transkrypcyjna mierzy jak bardzo geny są używane poprzez pomiar ilości mRNA obecnego dla każdego genu.) Używając test ochrony przed nukleazami na płytkach MAPS (NPAMAPS), testowanych jest 8800 związków chemicznych, aby zobaczyć, czy hodowanie komórek w obecności tych związków może zmniejszyć ekspresję kilku z 30 współzależnych genów bez wpływania na ekspresję sześciu normalnych (konstytutywnych, metabolizmu podstawowego, ang. houskeeping) genów. Każdy związek mający ten efekt może być przydatny dla przyszłego rozwoju lekarstw do leczenia tego rodzaju nowotworu.
Około 10000 do 100000 komórek dodane jest do każdej studzienki ze 100 96-studzienkowej polistyrenowej płytki i komórki rosną przez 2 dni aż pokryją powierzchnię każdej studzienki. Dla każdych 8 studzienek każdej płytki, komórki pozostawione są do wzrostu bez żadnych dodatków. Do pozostałych 88 studzienek każdej płytki, dodany jest inny związek chemiczny tak, że wpływ każdego z nich z osobna może być testowany. Dla 100 płytek użytych w tym samym czasie, 8800 związków może być przetestowanych lub przeszukanych. Komórki rosną przez 24 godziny w obecności związków, a następnie są zbierane dla wykonania próby. Komórki na każdej płytce są traktowane zgodnie z instrukcją preparatyki RNA w próbach z płytek 96-studzienkowych (na przykład zgodnie z „Quiagen RNeasy 96 kit). Po przygotowaniu RNA, ilość każdego z 36 różnych rodzajów mRNA jest ustalana poprzez test NPA-MAPS zawierający 30 współzależnych genów i 6 normalnych genów metabolizmu podstawowego. 36 oligonukleotydowych, chroniących fragmentów DNA, z których każdy odpowiada jednemu interesującemu nas genowi, dodane jest do każdej studzienki i pozostawione do hybrydyzacji z docelowymi sekwencjami mRNA w ściśle wybranych warunkach. Następnie nukleaza S1 jest dodana, aby zniszczyć nadmiar niezhybrydyzowanego DNA i próby są również traktowane chemikaliami w celu rozłożenia RNA. Pozostaje oligonukleotydowy fragment chroniący dla każdego z 36 genów proporcjonalnie do ilości mRNA obecnego w badanych komórkach z każdej próby.
Sto 96-studzienkowych płytek, z których każda zawiera mnogość z 36 różnych oligonukleotydów kotwiczących w każdej studzience, jest przygotowana przez dodanie do każdej studzienki 36 różnych oligonukleotydow łącznikowych. Łączniki gromadzą się na powierzchni każdej studzienki, zmieniając zwykłe płytki w płytki MAPS stanowiące specyficzne sondy dla każdego z 36 chroniących fragmentów oligonukleotydowych. Każdy łącznik ma część specyficzną dla jednego z 36 oligonukleotydów kotwiczących i część specyficzną dla segmentu jednego z 36 oligonukleotydów chroniących. Próbka oligonukleotydu z każdej studzienki 100-próbkowej płytki jest dodana do odpowiedniej studzienki płytki 100 MAPS. Po hybrydyzacji w ściśle wybranych warunkach, dodany jest oligonukleotyd wykrywający dla każdej cząsteczki docelowej z doczepionym enzymem chemiluminescencyjnym tak, że każdy specyficzny punkt każdej studzienki świeci w proporcji do ilości mRNA obecnego w próbie. Każda studzienka, która wykazuje obniżoną ilość współzależnych genów bez wpływu na 6 genów metabolizmu podstawowego jest interesująca. Związki dodane do komórek z tych próbek są prawdopodobnymi punktami startu dla rozwoju odczynników przeciwrakowych.
P r z y k ł a d 17 Indukowana i konstytutywna ekspresja genów
RNA było zasadniczo przygotowane jak opisano w przykładzie 14, z wątroby myszy albo nie zainfekowanej („Kontrola) albo godzinę po infekcji adenowirusem („Zainfekowany). 60 mg RNA z wątroby użyto w każdej próbie i próby przygotowano podwójnie. Każda studzienka zawierała trzy zestawy zduplikowanych pozycji, odpowiadających trzem genom opisanym wyżej. Każda pozycja zawierała oligonukleotyd kotwiczący związany z łącznikiem zawierającym sondę komplementarną do fragmentu protegującego odpowiadającego jednemu z trzech genów. Test MAPS ochrony przed nukleazami był zasadniczo przeprowadzony tak jak opisano na fig. 12, a obrazy zostały zebrane i zeskanowane jak to było opisane. Widoczne są surowe wyniki obrazów i skany intensywności dla duplikatów studzienek dla każdego z trzech docelowych mRNA. Liczby ponad liniami skanów są zintegrowanymi wartościami intensywności i odchyleniami standardowymi dla każdych warunków (n=4). Gen metabolizmu podstawowego, GAPDH, dla którego nie oczekiwano zmian, wykazał niewielki wzrost, 1.3-krotny w zainfekowanej próbie, który nie był statystycznie znaczący. Transkrypcja MIP-2 i c-jun wzrosła odpowiednio
PL 193 762 B1 i 6 razy. Wyniki te pokazują, że dwa geny, MlP-2 i c-jun, wykazują podwyższoną ekspresję w odpowiedzi na infekcję adenowirusem, w porównaniu z kontrolnym, genem GAPDH podlegającym konstytutywnej ekspresji.
P r z yk ł a d 18 Próba enzymatyczna wykrywania związków, które selektywnie hamują kinazę tyrozynową lub serynową (patrz fig. 17)
Kinazy są enzymami, które przyłączają fosforan do białek. Dla wielu z nich wykazano, że stymulują normalny i neoplastyczny wzrost komórek. Stąd też, związki, które hamują specyficzne kinazy (ale nie wszystkie kinazy) mogą być używane do testowania czy kinazy są włączone w patologię i jeśli tak, służyć jako punkty startu dla rozwoju farmacji. Na przykład pięć kinaz tyrozynowych zaangażowanych w stymulowanie wzrostu komórek lub w regulację odpowiedzi na zapalenie to src, lck, fyn, Zap70 i yes. Każda kinaza ma substraty częściowo zidentyfikowane jako krótkie peptydy, które zawierają tyrozynę. Niektóre ze specyficzności kinaz nakładają się tak, że różne kinazy mogą fosforylować niektóre peptydy jednakowo, ale inne preferencyjnie. Dla pięciu kinaz wybrano 36 substratów peptydowych tak, że stanowią one spektrum specyficznych i nakładających się specyficzności.
Użyto sto 96-studzienkowych płytek; każda studzienka zawiera 36 ogólnych oligonukleotydów kotwiczących. Przygotowano 36 łączników, aby zmienić zwykły szereg oligonukleotydów (jedynie z kotwicami) w szereg zawierający substraty peptydowe. Syntetyzowane jest 36 substratów peptydowych i każdy przyłączany jest kowalencyjnie poprzez mostek amidowy, na przykład, do oligonukleotydu zawierającego grupę aminową w pozycji 5'. Oligonukleotydy zawierają sekwencje, które hybrydyzują specyficznie z oligonukleotydami kotwiczącymi. Oligopeptydowe łączniki układają się na powierzchni przez dodanie ich do studzienek płytek MAPS.
W celu przeszukania, pięć kinaz w odpowiednich stężeniach (tak żeby stopień fosforylacji substratów był zrównoważony jak to jest tylko możliwe) dadaje się do każdej kolejnej studzienki z jednym z 8800 różnych testowanych związków. Związki są testowane na ich zdolność do bezpośredniego hamowania wyizolowanych enzymów. Wartość fosforylacji każdego uszeregowanego peptydu jest wykrywana przez dodanie znakowanych przeciwciał, które wiążą się tylko z peptydami, które mają ufosforylowaną tyrozynę. Każda studzienka, która wykazuje zmniejszenie plamek fosfotyrozyny, ale nie wszystkich plamek, jest interesująca. Związki, które były dodane do tych studzienek mogą być później testowane jako możliwe wybiórcze inhibitory niektórych badanych kinaz.
Schemat próby jest pokazany w górnej części fig. 17. Przygotowano chimeryczną cząsteczkę łącznika, w której oligonukleotyd o długości 25 par zasad komplementarnych do jednego z oligonukleotydów kotwiczących jest związany z substratem peptydowym enzymu fosfokinazy tyrozynowej. Chimeryczny substrat oligopeptydowy sam układa się na szeregu oligonukleotydów kotwiczących, enzym kinaza jest użyty do fosforylowania części peptydowej chimery i po tym jak zajdzie reakcja enzymatyczna, wielkość fosforylacji peptydu jest wyznaczana przez przeciwciała anty-fosfotyrozynowe lub anty-fosfoserynowe z przyłączonym fluoroforem lub enzymem wykrywającym.
Wyniki próby pokazane są w dolnej części fig. Homobifunkcjonalny związek krzyżowy (ang. crosslinker), DSS (Pierce),użyty był do związania grupy 5' aminowej łącznika oligonukleotydowego z N końcem peptydu zsyntetyzowanego z fosforylowaną tyrozyną. Sekwencja peptydu w jedno-literowym kodzie była: TSEPQpYQPGENL (SEQ ID: 32), gdzie pY oznacza fosfotyrozynę. Chimera była użyta bezpośrednio albo najpierw doprowadzona do pH 14 przez 60 minut w celu częściowej hydrolizy grup fosforanowych z tyrozyny. Fosforylowane lub częściowo defosforylowane cząsteczki chimeryczne rozmieszczały się na komplementarnych cząsteczkach kotwiczących na płytkach MAPS we wskazanych stężeniach przez jedną godzinę. Po przemyciu i utrwaleniu studzienek 0.3% BSA w SSPTP przeciwciało antyfosfotyrozynowe związane krzyżowo z HRP (przeciwciało 4G10 z Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) było dodane w rozcieńczeniu 1:3000 w SSPTP w ciągu jednej godziny i ilość związanego przeciwciała zmierzona z substratem chemiluminescencyjnym, Super Signal Blaze. Pokazany obraz był zbierany na matrycy CCD przez 1 minutę.
Jak się spodziewano, była widoczna różnica w ilości fosforanu związanego z oligopeptydem. Ta różnica jest podstawą testu mierzącego jak aktywne są serie kinaz po potraktowaniu różnymi możliwymi inhibitorami.
P r z y k ł a d 19 Próba wiązania dla wykrycia selektywnych inhibitorów oddziaływania pomiędzy domenami SH2 i fosforylowanymi peptydami
Domeny SH2 służą jako podjednostki wiązania niektórych białkowych regulatorów wzrostu. Domeny te wiążą się z białkami lub peptydami zawierającymi fosfotyrozynę z niecałkowitą specyficzPL 193 762 B1 nością. To jest, niektóre fosfotyrozynowe peptydy wiążą się specyficznie z jednym lub kilkoma białkami SH2, podczas gdy inne wiążą sięz wieloma białkami SH2.
W tej próbie łącznikami są fosforylowane peptydy kowalencyjnie związane z oligonukleotydami. Części peptydowe są dobierane według ich zdolności wiązania się z grupą wybranych białek SH2. Łączniki zmieniają zwykłe płytki MAPS w płytki z ligandami specyficznymi dla grupy białek SH2. Utworzono 100 96-studzienkowych płytek MAPS posiadających ligandy. Białka są izolowane i znakowane na przykład z użyciem fluorescencyjnych cząsteczek Cy5.
W celu wyszukania inhibitorów oddziaływań domeny SH2/fosfopeptydy, grupa znakowanych białek SH2 dodawana jest do każdej studzienki 100 96-studzienkowych płytek MAPS i do każdej studzienki dodany jest inny testowany związek. W ten sposób testowany jest oddzielnie wpływ każdego związku na oddziaływania białek SH2 z ich fosfopeptydowymi ligandami. Próbą jest pomiar fluorescencji związanego białka SH2 przyłączonego do każdego łącznika peptydowego związanego z powierzchnią. Dla każdej studzienki wykazującej obniżoną fluorescencję w niektórych, ale nie we wszystkich punktach, dodany związek może być później testowany jako przypuszczalny wybiórczy inhibitor wiązania SH2.
Przykład 20 Wysokowydajny test (patrz fig. 22)
Widoczna jest wysokowydajna płytka MAPS pokazująca detekcję sygnału z 96 studzienek w pojedynczym doświadczeniu. Hybrydyzacja do tego samego oligonukleotydu była mierzona w 16 powtórzeniach w 80 studzienkach. Jak pokazano, powtarzalność 1280 prób hybrydyzacji była bardzo wysoka. Kolumny najbardziej po lewej i najbardziej po prawej stronie służyły jako kontrole do standaryzacji sygnału dla różnych stężeń oligonukleotydu.
W podobny sposób, 16 różnych oligonukleotydów może być testowanych w każdej studzience itest może być powtórzony w 80 różnych studzienkach na płytce. Oczywiście nawet większa liczba różnych oligonukleotydów lub innych sond (np. 100 sond nukleotydowych) może być próbowana w każdej studzience i wiele płytek może być testowanych równocześnie (np. 100 płytek takich jak 96studzienkowe płytki microtitracyjne). Duża liczba prób, która może być przeprowadzona dla każdej próbki (np. w ostatnim przypadku ok. 100 różnych prób) i duża liczba próbek, które mogą być testowane jednocześnie (np. w ostatnim przypadku, ok. 96x100, lub 9600 różnych próbek) pozwala na bardzo wysoką przepustowość.
Z powyższego opisu, specjalista może łatwo stwierdzić istotne cechy charakterystyczne dla tego wynalazku i bez odbiegania od jego ducha i zakresu, może dokonywać zmian i modyfikacji wynalazku, aby przystosować go do różnych zastosowań i warunków.
Bez dalszego rozważania, należy sądzić, że specjalista, używając powyższy opis, zastosuje niniejszy wynalazek w pełnej rozciągłości.
Poprzednie korzystne specyficzne wykonania są zatem jedynie przybliżoną ilustracją i nie ograniczają pozostałych ujawnień w żaden sposób.
Całkowite ujawnienie wszystkich zgłoszeń, patentów i publikacji cytowanych powyżej i na fig. są włączone jako odniesienie referencji.

Claims (34)

1. Sposób wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę, która może zawierać docelowy kwas nukleinowy ze specyficznym dla tego kwasu nukleinowego fragmentem ochrony przed nukleazą wiążącym się ze wspomnianym docelowym kwasem nukleinowym, poddaje się tą próbkę działaniu nukleazy skutecznej w trawieniu pozostałego jednoniciowego kwasu nukleinowego i następnie kontaktuje się otrzymaną próbkę z kombinacją, która przed dodaniem tej wspomnianej próbki, zawiera:
i) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar obejmuje;
ii) co najmniej dwie różne kotwice, każda w połączeniu z;
iii) bifunkcjonalnym łącznikiem, który ma pierwszą część specyficzną dla kotwicy, i drugą część, która obejmuje sondę specyficzną dla fragmentu ochrony przed nukleazami, w warunkach skutecznych dla wiązania się tej kombinacji z fragmentem ochrony przed nukleazami i wykrywa się związany fragment ochrony.
PL 193 762 B1
2. Sposób wykrywania, co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę, która może zawierać docelowy kwas nukleinowy ze specyficznym dla tego kwasu nukleinowego fragmentem ochrony przed nukleazą wiążącym się ze wspomnianym docelowym kwasem nukleinowym, tworząc w ten sposób dupleks fragment ochrony przed nukleazą/docelowy kwas nukleinowy, poddaje się tą próbkę działaniu nukleazy skutecznej w trawieniu pozostałego jednoniciowego kwasu nukleinowego i następnie kontaktuje się otrzymaną próbkę z kombinacją, która przed dodaniem tej wspomnianej próbki, zawiera:
i) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar obejmuje;
ii) co najmniej dwie różne kotwice, każda w połączeniu z;
iii) bifunkcjonalnym łącznikiem, który ma pierwszą część specyficzną dla kotwicy, i drugą część, która obejmuje sondę specyficzną dla części wspomnianego dupleksu w warunkach skutecznych dla hybrydyzacji i wykrywa się każdy związany fragment ochrony.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy obszar zawiera co najmniej cztery różne kotwice oligonkleotydowe.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy obszar zawiera co najmniej osiem różnych kotwic oligonkleotydowych.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy obszar zawiera co najmniej około 64 różnych kotwic oligonukleotydowych.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy obszarów zawiera co najmniej około 96 do około 1536 zasadniczo identycznych oddalonych przestrzennie obszarów.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy obszar zawiera około 4-1536 zasadniczo identycznych oddalonych przestrzennie obszarów, każdy obszar zawierający około 8 do około 100 różnych kotwic oligonukleotydowych.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każda powierzchnia zawiera około 4, 8, 96, lub 384 zasadniczo identycznych oddalonych przestrzennie obszarów, każdy obszar zawierający około 8 do około 100 różnych kotwic oligonukleotydowych.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy obszar zawiera co najmniej około 30 do około 100 sond, każda specyficzna wobec różnych cząsteczek docelowych.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdy wspomniany obszar jest ponadto podzielony na mniejsze podobszary, korzystnie studzienkę na płytce do mikromianowania.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane kotwice są oligonukleotydami o długości około 30 do 50 nukleotydów.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jeden lub więcej obszarów zawiera ponadto kontrole skuteczności, specyficzności hybrydyzacji lub kontrole pojemności miejsca wiążącego cząsteczkę docelową.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto kontaktowanie wspomnianych kombinacji i każdego związanego fragmentu ochronny przed nukleazę ze znakowaną sondą detekcji i wykrywanie wspomnianej sondy detekcji.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto:
a) poddanie próbki zawierającej cząsteczkę docelową związaną z fragmentami ochrony przed nukleazami obróbce za pomocą jednej lub większej liczby nukleaz skutecznych w trawieniu kwasu nukleinowego innego niż fragment ochrony przed nukleazą, który hybrydyzował z badanym kwasem nukleinowymi i ewentualnie częścią tego kwasu i;
b) usuwanie materiału kwasu nukleinowego innego niż wspomniany fragment chroniony przed nukleazą, który hybrydyzował z badanym kwasem nukleinowym, w celu dostarczenia próby zawierającej chroniony przed nukleazą fragment.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że identyfikuje wzór ekspresji RNA, przy czym co najmniej dwa wspomniane chronione przed nukleazą fragmenty są specyficzne wobec różnych cząsteczek RNA.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że identyfikuje się czynnik modulujący wzór ekspresji RNA, obejmujący ponadto porównywanie wzoru ekspresji RNA wytworzonego w obecności tego czynnika ze wzorem ekspresji RNA wytwarzanym w innym zestawie warunków.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że identyfikuje się czynnik modulujący interakcję wspomnianego fragmentu chronionego przed nukleazą ze wspomnianą sondą.
PL 193 762 B1
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fragmenty chronione przed nukleazą stanowią DNA.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że amplifikację DNA przeprowadza przed kontaktowaniem próbki zawierającej fragmenty chronione przed nukleazą z kombinacją, korzystnie w reakcji PCR.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że docelowy kwas nukleinowy zawiera polimorfizm.
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kombinacja zawiera dużą ilość wspomnianych obszarów i przy czym sposób ten jest sposobem wysokowydajnym.
22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto usuwanie bifunkcjonalnych łączników z kotwic oligonukleotydowych i zastąpienie ich zasadniczo identycznymi lub różnymi bifunkcjonalnymi łącznikami, reprogramowując wspomniane powierzchnie i powtarzanie sposobu wykrywania cząsteczki docelowej.
23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kotwice są oddysocjowywane z bifunkcjonalnych łączników posiadających różną specyficzność docelową.
24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę generuje się przez inkubowanie lub hodowlę komórkową, która może zawierać wspomniane komórki docelowe i ekstrahowanie kwasu nukleinowego z tych komórek.
25. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jest stosowany do diagnozowania lub do przewidywania chorób, który mierzy efekt działania leku, lub który identyfikuje czynnik posiadający efekt terapeutyczny lub który mierzy skuteczność, bezpieczeństwo lub metabolizm leku.
26. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto kontaktowanie wspomnianej kombinacji i dowolnej związanej nukleazowej sondy zabezpieczającej ze znakowaną sondą detekcji, która wytwarza sygnał chemiluminyscencyjny i wykrywanie tej sondy detekcji.
27. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden ze wspomnianych celi jest cząsteczką DNA i co najmniej jeden ze wspomnianych celi jest cząsteczką RNA.
28. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden ze wspomnianych fragmentów zabezpieczających przed nukleazą jest specyficzny dla cząsteczki DNA i co najmniej jeden ze wspomnianych fragmentów zabezpieczających przed nukleazą jest specyficzny dla cząsteczki RNA.
29. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane cele są cząsteczkami DNA.
30. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane kotwice są kotwicami oligonukleotydowymi.
31. Zestaw przydatny do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego w próbce, znamienny tym, że zawiera a) co najmniej jeden fragment chroniący przed nukleazą specyficzny dla wspomnianego kwasu nukleinowego, lecz nie specyficzny dla żadnej z kotwic oligonukleotydowych w zestawie, b) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera co najmniej dwie różne kotwice oligonukleotydowe, i c) pojemnik zawierający co najmniej jedną bifunkcjonalną cząsteczkę łącznika, która ma pierwszą część specyficzną dla co najmniej jednej kotwicy oligonukleotydowej i drugą część która zawiera sondę, która jest specyficzna dla niej i wiąże się do co najmniej jednego wspomnianego fragmentu ochronnego przed nukleazą.
32. Zestaw według zastrz. 33, znamienny tym, że zawiera ponadto,
d) jedną lub większą ilość nukleaz skutecznych w trawieniu pojedynczej nici kwasu nukleinowego i/lub nici RNA dupleksu DNA/RNA.
33. Zestaw przydatny do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego w próbce, znamienny tym, że zawiera:
a) powierzchnię, zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera co najmniej dwie różne kotwice oligonukleotydowe, oraz
b) pojemnik zawierający co najmniej jedną cząsteczkę bifunkcjonalnego łącznika, którego pierwsza część jest specyficzna wobec co najmniej jednej kotwicy oligonukleotydowej, a druga część, obejmującą sondę, która jest specyficzna wobec co najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinowego, i
c) jedną lub więcej nukleaz skutecznych w trawieniu pojedynczej nici kwasu nukleinowego i/lub nici RNA dupleksu DNA/RNA.
34. Zestaw przydatny do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego w próbce, znamienny tym, że zawiera,
PL 193 762 B1
a) powierzchnię zawierającą wiele oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów, z których co najmniej dwa są zasadniczo identyczne, a każdy obszar zawiera co najmniej dwie różne kotwice oligonukleotydowe, oraz
b) zestaw instrukcji do i) przeprowadzenia procedury zabezpieczenia pożądanego kwasu nukleinowego przed nukleazą, stosując chroniące przed nukleazą fragmenty specyficzne dla tego kwasu nukleinowego oraz, ii) przyłączenia do co najmniej jednej takiej kotwicy oligonukleotydowej bifunkcjonalnej cząsteczki łącznikowej, która ma pierwszą część specyficzną dla co najmniej jednej wspomnianej kotwicy oligonukleotydowej i druga część, która zawiera sondę specyficzną dla co najmniej jednego wspomnianego fragmentu ochronnego przed nukleazą.
PL98342898A 1997-12-19 1998-12-21 Sposób wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego i zestaw do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego PL193762B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6829197P 1997-12-19 1997-12-19
US09/109,076 US6232066B1 (en) 1997-12-19 1998-07-02 High throughput assay system
PCT/US1998/027191 WO1999032663A2 (en) 1997-12-19 1998-12-21 High throughput assay system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL342898A1 PL342898A1 (en) 2001-07-16
PL193762B1 true PL193762B1 (pl) 2007-03-30

Family

ID=26748811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL98342898A PL193762B1 (pl) 1997-12-19 1998-12-21 Sposób wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego i zestaw do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6232066B1 (pl)
EP (1) EP1038033B1 (pl)
JP (5) JP2001526904A (pl)
KR (1) KR100708782B1 (pl)
CN (1) CN1292076C (pl)
AT (1) ATE392485T1 (pl)
AU (2) AU1936699A (pl)
CA (1) CA2315776C (pl)
CZ (1) CZ302381B6 (pl)
DE (1) DE69839373T2 (pl)
DK (1) DK1038033T3 (pl)
EA (1) EA006425B1 (pl)
ES (1) ES2306484T3 (pl)
IL (2) IL136862A0 (pl)
MX (1) MXPA00006058A (pl)
NO (1) NO329977B1 (pl)
NZ (1) NZ505319A (pl)
PL (1) PL193762B1 (pl)
WO (1) WO1999032663A2 (pl)

Families Citing this family (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6720149B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
US7041510B2 (en) * 1996-04-25 2006-05-09 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
CA2255599C (en) 1996-04-25 2006-09-05 Bioarray Solutions, Llc Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
EP0990142A4 (en) * 1996-12-31 2000-09-27 Genometrix Genomics Inc MULTIPLEXED MOLECULAR ANALYSIS METHOD AND DEVICE
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US6232066B1 (en) 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
US6238869B1 (en) * 1997-12-19 2001-05-29 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
US20030039967A1 (en) * 1997-12-19 2003-02-27 Kris Richard M. High throughput assay system using mass spectrometry
EP2189791A3 (en) 1998-02-04 2011-03-09 Life Technologies Corporation Microarrays and uses therefor
EP2360271A1 (en) 1998-06-24 2011-08-24 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
US20030138973A1 (en) * 1998-07-14 2003-07-24 Peter Wagner Microdevices for screening biomolecules
US6576478B1 (en) * 1998-07-14 2003-06-10 Zyomyx, Inc. Microdevices for high-throughput screening of biomolecules
US6780582B1 (en) * 1998-07-14 2004-08-24 Zyomyx, Inc. Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof
US20020119579A1 (en) * 1998-07-14 2002-08-29 Peter Wagner Arrays devices and methods of use thereof
US6406921B1 (en) * 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
US6908770B1 (en) * 1998-07-16 2005-06-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array
US6950752B1 (en) * 1998-10-27 2005-09-27 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for removing artifact from biological profiles
US6468476B1 (en) * 1998-10-27 2002-10-22 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods for using-co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns
AU2375600A (en) * 1998-12-22 2000-07-12 Stephen Felder High throughput assay system using mass spectrometry
US7612020B2 (en) * 1998-12-28 2009-11-03 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres with a hybridization chamber
AU4058100A (en) * 1999-04-09 2000-11-14 Arcturus Engineering, Inc. Generic cdna or protein array for customized assays
US6221653B1 (en) * 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6395483B1 (en) * 1999-09-02 2002-05-28 3M Innovative Properties Company Arrays with mask layers
US6358557B1 (en) * 1999-09-10 2002-03-19 Sts Biopolymers, Inc. Graft polymerization of substrate surfaces
US7244559B2 (en) * 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
EP2343128A1 (en) * 1999-09-17 2011-07-13 BioArray Solutions Ltd. Substrate and chip for conducting bioassays
US20030036070A1 (en) * 1999-10-21 2003-02-20 Shukti Chakravarti Gene expression profiling of inflammatory bowel disease
US6656432B1 (en) * 1999-10-22 2003-12-02 Ngk Insulators, Ltd. Micropipette and dividedly injectable apparatus
US6428957B1 (en) * 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
JP4873812B2 (ja) * 1999-11-15 2012-02-08 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド マイクロアレイ上のｒｎａ：ｄｎａハイブリッドの免疫検出
MXPA02006095A (es) * 1999-12-21 2002-12-13 Johnson & Johnson Deteccion de acidos nucleicos.
EP1257664A4 (en) * 2000-01-28 2006-04-05 Althea Technologies Inc METHOD FOR THE ANALYSIS OF GENE EXPRESSION
EP1257805B1 (en) * 2000-02-10 2015-10-14 Illumina, Inc. Composition comprising a substrate with multiple assay locations for bead-based simultaneous processing of multiple samples, apparatus comprising the composition, and manufacturing method for the composition
US6770441B2 (en) * 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
US20040014644A1 (en) * 2000-03-14 2004-01-22 Vladimir Efimov Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression
CA2402319A1 (en) 2000-03-14 2001-09-20 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US6962906B2 (en) 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
CA2302827A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-12 Michelle Furtado Oligonucleotide and dna de-hybridization on surfaces
US7338773B2 (en) * 2000-04-14 2008-03-04 Millipore Corporation Multiplexed assays of cell migration
WO2001083826A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods and reagents for assembling molecules on solid supports
TWI220927B (en) * 2000-05-12 2004-09-11 Rong-Seng Chang Method for producing a micro-carrier
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
AU2001272993B2 (en) 2000-06-21 2005-03-10 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
CN1137999C (zh) * 2000-07-04 2004-02-11 清华大学 集成式微阵列装置
US6913879B1 (en) * 2000-07-10 2005-07-05 Telechem International Inc. Microarray method of genotyping multiple samples at multiple LOCI
AU2001278968A1 (en) * 2000-07-19 2002-01-30 Pointilliste, Inc. Nested sorting and high throughput screening
US7678539B2 (en) * 2000-08-10 2010-03-16 Corning Incorporated Arrays of biological membranes and methods and use thereof
CA2419544A1 (en) * 2000-08-14 2002-02-21 Surface Logix, Inc. Pathways arrays
EP1387894A4 (en) * 2000-08-24 2006-10-11 Aviva Biosciences Corp METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING NUCLEIC ACID MOLECULES USING NUCLEOLYTIC ACTIVITIES AND HYBRIDIZATION
US6900013B1 (en) * 2000-08-25 2005-05-31 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization
US20040185464A1 (en) * 2000-09-15 2004-09-23 Kris Richard M. High throughput assay system
US20020081589A1 (en) * 2000-10-12 2002-06-27 Jing-Shan Hu Gene expression monitoring using universal arrays
AU2001297830A1 (en) * 2000-10-25 2002-12-09 Exiqon A/S Closed substrate platforms suitable for analysis of biomolecules
US20020081617A1 (en) * 2000-11-08 2002-06-27 Tione Buranda Fluorescence and FRET based assays for biomolecules on beads
US6699665B1 (en) * 2000-11-08 2004-03-02 Surface Logix, Inc. Multiple array system for integrating bioarrays
US7351575B2 (en) * 2000-11-08 2008-04-01 Surface Logix, Inc. Methods for processing biological materials using peelable and resealable devices
US6937323B2 (en) 2000-11-08 2005-08-30 Burstein Technologies, Inc. Interactive system for analyzing biological samples and processing related information and the use thereof
US6905881B2 (en) 2000-11-30 2005-06-14 Paul Sammak Microbead-based test plates and test methods for fluorescence imaging systems
US7054258B2 (en) 2000-12-08 2006-05-30 Nagaoka & Co., Ltd. Optical disc assemblies for performing assays
WO2002046762A2 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Burstein Technologies, Inc. Optical disc assemblies for performing assays
US7079468B2 (en) 2000-12-08 2006-07-18 Burstein Technologies, Inc. Optical discs for measuring analytes
US6760298B2 (en) 2000-12-08 2004-07-06 Nagaoka & Co., Ltd. Multiple data layer optical discs for detecting analytes
US7776571B2 (en) * 2000-12-12 2010-08-17 Autogenomics, Inc. Multi-substrate biochip unit
US6869766B2 (en) * 2000-12-22 2005-03-22 The Regents Of The University Of California Gene associated with regulation of adiposity and insulin response
WO2002051537A2 (en) * 2000-12-22 2002-07-04 Burstein Technologies, Inc. Optical bio-discs and methods relating thereto
US20090137416A1 (en) 2001-01-16 2009-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating Cells Expressing Secreted Proteins
US6949638B2 (en) * 2001-01-29 2005-09-27 Affymetrix, Inc. Photolithographic method and system for efficient mask usage in manufacturing DNA arrays
AU2002255515A1 (en) * 2001-02-05 2002-08-19 Board Of Regents, The University Of Texas System The use of mesoscale self-assembly and recognition to effect delivery of sensing reagent for arrayed sensors
JP2002251091A (ja) * 2001-02-27 2002-09-06 Konica Corp 画像定着装置および画像形成装置
AU2002307090A1 (en) * 2001-04-03 2002-10-21 Surromed, Inc. Methods and reagents for multiplexed analyte capture, surface array self-assembly, and analysis of complex biological samples
US20030170623A1 (en) * 2001-04-13 2003-09-11 Jingwen Chen Multiplexed gene analysis on a mobile solid support
US7572642B2 (en) * 2001-04-18 2009-08-11 Ambrigen, Llc Assay based on particles, which specifically bind with targets in spatially distributed characteristic patterns
KR20020089746A (ko) * 2001-05-24 2002-11-30 주식회사 커벡스 크기변형유도 앵커 시발체, 이를 이용한 알티-피씨알 방법및 이를 이용한 진단 방법
US20030096264A1 (en) * 2001-06-18 2003-05-22 Psychiatric Genomics, Inc. Multi-parameter high throughput screening assays (MPHTS)
US20060234231A1 (en) * 2001-06-20 2006-10-19 Nuevolution A/S Microarrays displaying encoded molecules
WO2002102820A1 (en) * 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
WO2003004993A2 (en) * 2001-07-06 2003-01-16 Millipore Corporation Satterned composite membrane and stenciling method for the manufacture thereof
US7141416B2 (en) 2001-07-12 2006-11-28 Burstein Technologies, Inc. Multi-purpose optical analysis optical bio-disc for conducting assays and various reporting agents for use therewith
AU2002367825A1 (en) * 2001-07-30 2003-10-13 Sts Biopolymers, Inc. Graft polymer matrices
US20050048566A1 (en) * 2001-08-27 2005-03-03 Delisi Charles Apparatus, composition and method for proteome profiling
US20030044320A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-06 Shun Luo High throughput screening micro array platform
GB0124338D0 (en) * 2001-10-10 2001-11-28 Randox Lab Ltd Biochips
CA2741049C (en) 2001-10-15 2019-02-05 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
AU2002363076A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-06 Virtual Arrays, Inc. Assay systems with adjustable fluid communication
US7381375B2 (en) * 2001-10-26 2008-06-03 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
US20080187949A1 (en) * 2001-10-26 2008-08-07 Millipore Corporation Multiplexed assays of cell migration
AU2002360361A1 (en) 2001-11-09 2003-06-10 Biomicroarrays, Inc. High surface area substrates for microarrays and methods to make same
EP2196544A1 (en) * 2001-11-21 2010-06-16 Applied Biosystems, LLC Kit for ligation detection assays using codeable labels
KR20030049802A (ko) * 2001-12-17 2003-06-25 권윤정 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법
US20060228723A1 (en) * 2002-01-16 2006-10-12 Keith Bradley System and method for electronic sensing of biomolecules
US20070178477A1 (en) * 2002-01-16 2007-08-02 Nanomix, Inc. Nanotube sensor devices for DNA detection
US6989235B2 (en) * 2002-02-13 2006-01-24 Motorola, Inc. Single molecule detection of bio-agents using the F1-ATPase biomolecular motor
EP2186897B1 (en) * 2002-03-15 2016-02-17 Nuevolution A/S An improved method for synthesising templated molecules
AU2003228711C1 (en) * 2002-04-26 2010-01-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and system for the detection of cardiac risk factors
US20040005612A1 (en) * 2002-05-14 2004-01-08 Giudice Linda C. Endometrial genes in endometrial disorders
US6841379B2 (en) 2002-05-15 2005-01-11 Beckman Coulter, Inc. Conductive microplate
JP4544989B2 (ja) * 2002-05-24 2010-09-15 ニンブルゲン システムズ インコーポレイテッド 単一マイクロアレイ上で多数の試料のハイブリダイゼーション反応を行うマイクロアレイ及びその方法
US20030232384A1 (en) * 2002-06-13 2003-12-18 Eastman Kodak Company Microarray system utilizing microtiter plates
US9388459B2 (en) * 2002-06-17 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US7108976B2 (en) * 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
US20040053399A1 (en) * 2002-07-17 2004-03-18 Rudolf Gilmanshin Methods and compositions for analyzing polymers using chimeric tags
EP1539980B1 (en) * 2002-08-01 2016-02-17 Nuevolution A/S Library of complexes comprising small non-peptide molecules and double-stranded oligonucleotides identifying the molecules
WO2004028682A2 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Carlsberg A/S Spatially encoded polymer matrix
US7459273B2 (en) * 2002-10-04 2008-12-02 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
US20080207465A1 (en) * 2002-10-28 2008-08-28 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
ES2368215T3 (es) 2002-10-30 2011-11-15 Nuevolution A/S Codificación enzimática.
ATE536548T1 (de) * 2002-11-14 2011-12-15 Vivalis Mikrowell-array-chip zum nachweis eines antigenspezifischen lymphozyten, verfahren zum nachweis eines antigenspezifischen lymphozyten und verfahren zur klonierung eines antigenrezeptorgens eines antigenspezifischen lymphozyten
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
AU2003293511A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-30 Arizona Board Of Regents, Acting For And On Behalf Of, Arizona State University Polarization-enhanced detector with gold nanorods for detecting nanoscale rotational motion and method therefor
EP2175019A3 (en) 2002-12-19 2011-04-06 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods
EP1597577A4 (en) * 2003-02-10 2007-02-21 Pointilliste Inc SELF-ARRANGING ARRAYS AND ITS APPLICATION
US20070026397A1 (en) 2003-02-21 2007-02-01 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
US20040185499A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Jolley Michael E. Method of epitope scanning using fluorescence polarization
US20050064452A1 (en) * 2003-04-25 2005-03-24 Schmid Matthew J. System and method for the detection of analytes
US20050009066A1 (en) * 2003-05-15 2005-01-13 Connolly Dennis M. Methods for localizing target molecules in a flowing fluid sample
WO2004104922A2 (en) * 2003-05-16 2004-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Image and part recognition technology
US9317922B2 (en) 2003-05-16 2016-04-19 Board Of Regents The University Of Texas System Image and part recognition technology
CA2529016A1 (en) * 2003-06-12 2004-12-23 Accupath Diagnostic Laboratories, Inc. Method and system for the analysis of high density cells samples
US20040265883A1 (en) * 2003-06-27 2004-12-30 Biocept, Inc. mRNA expression analysis
US8114978B2 (en) 2003-08-05 2012-02-14 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
CA2536565A1 (en) * 2003-09-10 2005-05-12 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
DE602004023960D1 (de) 2003-09-18 2009-12-17 Nuevolution As Methode zur Gewinnung struktureller Informationen kodierter Moleküle und zur Selektion von Verbindungen
US7927796B2 (en) 2003-09-18 2011-04-19 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
AU2004276761B2 (en) 2003-09-22 2009-12-24 Bioarray Solutions, Ltd. Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
WO2005069001A1 (ja) * 2003-09-25 2005-07-28 Toyama Prefecture マイクロウェルアレイチップ及びその製造方法
JP2007521017A (ja) 2003-10-28 2007-08-02 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 固定化捕捉プローブを用いる遺伝子発現分析法の最適化
WO2005045060A2 (en) 2003-10-29 2005-05-19 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna
WO2005050170A2 (en) * 2003-11-17 2005-06-02 Auburn University Methods and compositions for inhibiting intracellular aggregate formation
AU2004300168A1 (en) * 2003-12-11 2005-06-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and system for the analysis of saliva using a sensor array
US7419820B2 (en) * 2003-12-16 2008-09-02 Canon Kabushiki Kaisha Transfer sheet for transferring biologically active substance to culture plate
JP2007518107A (ja) * 2004-01-13 2007-07-05 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド ポリマーを使用する溶液中の分析物の検出および定量化
WO2005078122A2 (en) * 2004-02-17 2005-08-25 Nuevolution A/S Method for enrichment involving elimination by mismatch hybridisation
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
US8105849B2 (en) 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
JP2007529758A (ja) * 2004-03-19 2007-10-25 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド 単一分子の検出のための組成物および方法
JP5435864B2 (ja) * 2004-05-28 2014-03-05 アシュラジェン インコーポレイテッド マイクロｒｎａに関与する方法および組成物
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
CN100352937C (zh) * 2004-08-06 2007-12-05 中国海洋大学 对藻类进行定性与定量分析的方法
JP2008511008A (ja) * 2004-08-24 2008-04-10 ナノミックス・インコーポレーテッド Ｄｎａ検出用ナノチューブセンサー装置
US20060078894A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Winkler Matthew M Methods and compositions for analyzing nucleic acids
DK2302055T3 (da) 2004-11-12 2014-10-13 Asuragen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger involverende miRNA og miRNA-inhibitormolekyler
US20060246576A1 (en) 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
US7452671B2 (en) 2005-04-29 2008-11-18 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping with selective adaptor ligation
EP1883710A4 (en) * 2005-05-03 2009-07-08 Althea Technologies Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANALYZING DEGRADED NUCLEIC ACIDS
EP1910824A4 (en) 2005-05-31 2012-11-21 Labnow Inc METHOD AND COMPOSITIONS RELATED TO THE PREPARATION AND USE OF A WHITE BLOOD IMAGE
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20070081163A1 (en) * 2005-06-03 2007-04-12 Minhua Liang Method and apparatus for scanned beam microarray assay
AU2006261953B2 (en) * 2005-06-24 2012-02-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Systems and methods including self-contained cartridges with detection systems and fluid delivery systems
WO2007056250A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 U.S. Genomics, Inc. Heterogeneous assay of analytes in solution using polymers
US7889347B2 (en) * 2005-11-21 2011-02-15 Plexera Llc Surface plasmon resonance spectrometer with an actuator driven angle scanning mechanism
DE602006018648D1 (de) 2005-12-01 2011-01-13 Nuevolution As Enzymvermittelnde kodierungsmethoden für eine effiziente synthese von grossen bibliotheken
US7463358B2 (en) * 2005-12-06 2008-12-09 Lumera Corporation Highly stable surface plasmon resonance plates, microarrays, and methods
US11306351B2 (en) 2005-12-21 2022-04-19 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US20110027890A1 (en) * 2005-12-26 2011-02-03 Kuraray Co., Ltd. Material for cell culture
US20090176208A1 (en) * 2006-01-04 2009-07-09 Simon Brodie Methods for detecting, identifying and reporting the presence of animal pathological agents
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
EP2636755A1 (en) * 2006-05-26 2013-09-11 AltheaDx Incorporated Biochemical analysis of partitioned cells
US9957157B2 (en) * 2006-09-19 2018-05-01 University of Houtson System Fabrication of self assembling nano-structures
CA2663962A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir-31,mir-145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216, mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
EP2104737B1 (en) * 2006-12-08 2013-04-10 Asuragen, INC. Functions and targets of let-7 micro rnas
EP2104734A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CN101627121A (zh) * 2006-12-08 2010-01-13 奥斯瑞根公司 作为治疗干预的靶标的miRNA调控基因和路径
AU2007333107A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CA2671270A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-17 Asuragen, Inc. Mir-16 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090232893A1 (en) * 2007-05-22 2009-09-17 Bader Andreas G miR-143 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US20080293589A1 (en) * 2007-05-24 2008-11-27 Affymetrix, Inc. Multiplex locus specific amplification
US20090227533A1 (en) * 2007-06-08 2009-09-10 Bader Andreas G miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention
US20100294665A1 (en) * 2007-07-12 2010-11-25 Richard Allen Method and system for transferring and/or concentrating a sample
JP4148367B1 (ja) 2007-08-02 2008-09-10 富山県 細胞のスクリーニング方法
US20090060786A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-05 Gibum Kim Microfluidic apparatus for wide area microarrays
EP2198050A1 (en) * 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US9388457B2 (en) * 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
WO2009052386A1 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in lung diseases and uses thereof
US8071562B2 (en) * 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US8004669B1 (en) 2007-12-18 2011-08-23 Plexera Llc SPR apparatus with a high performance fluid delivery system
WO2009086156A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Asuragen, Inc. Mir-10 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2260110B1 (en) * 2008-02-08 2014-11-12 Asuragen, INC. miRNAs DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN LYMPH NODES FROM CANCER PATIENTS
US9074244B2 (en) 2008-03-11 2015-07-07 Affymetrix, Inc. Array-based translocation and rearrangement assays
WO2009154835A2 (en) * 2008-03-26 2009-12-23 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mir-16 and therapy of prostate cancer
WO2009123748A1 (en) * 2008-04-05 2009-10-08 Single Cell Technology, Inc. Method of obtaining antibodies of interest and nucleotides encoding same
WO2009126726A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-15 Asuragen, Inc Methods and compositions for diagnosing and modulating human papillomavirus (hpv)
EP2285960B1 (en) 2008-05-08 2015-07-08 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mir-184 modulation of neovascularization or angiogenesis
US20110159492A1 (en) * 2008-06-04 2011-06-30 Rimsza Lisa M Diffuse Large B-Cell Lymphoma Markers and Uses Therefore
ES2721173T3 (es) * 2008-11-07 2019-07-29 Hoffmann La Roche Sustancias de relleno de grano fino para películas de reacción fotométricas
US20100179213A1 (en) * 2008-11-11 2010-07-15 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and Compositions Involving miRNAs In Cancer Stem Cells
JP5745752B2 (ja) * 2009-05-21 2015-07-08 オリンパス株式会社 細胞スクリーニング方法、その方法に用いる制御ソフトウェア、細胞スクリーニング装置、及び画像解析装置、並びに細胞スクリーニングシステム
JP2013509863A (ja) 2009-11-03 2013-03-21 エイチティージー モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）
DK2558577T3 (en) 2010-04-16 2019-04-01 Nuevolution As Bi-functional complexes and methods for the preparation and use of such complexes
JP5951755B2 (ja) 2011-05-04 2016-07-13 エイチティージー モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）法および定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法の改善
ES2578370T3 (es) 2011-07-01 2016-07-26 HTG Molecular Diagnostics, Inc Métodos para detectar fusiones génicas
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
MY157586A (en) * 2011-09-14 2016-06-16 Ngk Insulators Ltd Method for detecting target nucleic acid
US20140198314A1 (en) * 2011-10-18 2014-07-17 Zhiyong Li Molecular sensing device
CN104603291B (zh) 2012-06-22 2018-04-06 Htg分子诊断有限公司 黑素细胞病变中的分子恶性肿瘤
EP2867373B1 (en) 2012-06-29 2018-12-19 HTG Molecular Diagnostics, Inc. Nuclease protection methods for detection of nucleotide variants
EP2917715B1 (en) 2012-11-06 2019-04-03 Biodot, Inc. Controlled printing of a cell sample for karyotyping
TWI745610B (zh) 2012-11-14 2021-11-11 美商再生元醫藥公司 重組細胞表面捕捉蛋白質
WO2014150853A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Inanovate, Inc. Analyte measurement using longitudinal assay
WO2016089588A1 (en) 2014-12-06 2016-06-09 Children's Medical Center Corporation Nucleic acid-based linkers for detecting and measuring interactions
US11396650B2 (en) 2015-06-02 2022-07-26 Children's Medical Center Corporation Nucleic acid complexes for screening barcoded compounds
US12077807B2 (en) * 2015-06-27 2024-09-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for analyte detection using nanoswitches
US11384399B2 (en) 2015-09-29 2022-07-12 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Methods for subtyping diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)
US11713483B2 (en) 2016-02-09 2023-08-01 Children's Medical Center Corporation Method for detection of analytes via polymer complexes
AU2017336153B2 (en) * 2016-09-30 2023-07-13 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
WO2019014185A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-17 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. APPARATUS FOR STORING HIGH-DENSITY INFORMATION IN MOLECULAR CHAINS
WO2019069372A1 (ja) * 2017-10-03 2019-04-11 株式会社ニコン 検出対象の測定方法、捕捉プローブ固定化担体、検出キット、及び流体デバイス
WO2019100080A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Children's Medical Center Corporation Force-controlled nanoswitch assays for single-molecule detection in complex biological fluids
US11995558B2 (en) 2018-05-17 2024-05-28 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Apparatus for high density information storage in molecular chains
GB2599709A (en) * 2020-10-09 2022-04-13 Qbd Qs Ip Ltd Analysis system and method

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228237A (en) 1978-09-21 1980-10-14 Calbiochem-Behring Corp. Methods for the detection and determination of ligands
FI63596C (fi) 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US5288609A (en) 1984-04-27 1994-02-22 Enzo Diagnostics, Inc. Capture sandwich hybridization method and composition
US4751177A (en) 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4925785A (en) 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5374524A (en) 1988-05-10 1994-12-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Solution sandwich hybridization, capture and detection of amplified nucleic acids
ATE173508T1 (de) 1988-05-20 1998-12-15 Hoffmann La Roche Befestigung von sequenzspezifischen proben
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5252743A (en) 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
JPH05502585A (ja) * 1989-12-04 1993-05-13 ベクトン　ディッキンソン　アンド　カンパニー ポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドの利用により向上される標的核酸の捕獲
AU7762091A (en) 1990-03-30 1991-10-30 City Of Hope Detection of minimal residual disease in lymphoid malignancies
US5556748A (en) 1991-07-30 1996-09-17 Xenopore Corporation Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides
EP0534640B1 (en) 1991-09-23 1996-10-02 Pfizer Inc. Process for detecting specific mRNA and DNA in cells
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
US5985583A (en) * 1992-06-23 1999-11-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of gonadotropin-releasing hormone receptor
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
CA2162568C (en) 1993-05-10 2001-10-30 Yuichi Oku Method and reagent for simultaneously assaying one or more ligands in a group of preselected ligands
JPH079468A (ja) * 1993-06-24 1995-01-13 Sekisui Chem Co Ltd 熱可塑性樹脂成型体の製造方法
DE19518217A1 (de) 1994-05-11 1995-11-30 Imtec Immundiagnostika Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) auf festen Phasen
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
ZA956776B (en) * 1994-08-25 1996-03-20 Akzo Nobel Nv A process for making the product of a nucleic acid amplification reaction incapable of being a target for further amplification a diagnostic assay employing said process a kit and a container suitable for carrying out said process for assay
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
DE19516196A1 (de) 1995-05-08 1996-11-14 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum quantitativen Nachweis von Nukleinsäuren
WO1996035778A1 (en) * 1995-05-11 1996-11-14 Human Genome Sciences, Inc. Human uridine diphosphate galactose-4-epimerase
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
FR2737502B1 (fr) 1995-07-31 1997-10-24 Genset Sa Procede de detection d'acides nucleiques utilisant des sondes nucleotidiques permettant a la fois une capture specifique et une detection
WO1997007245A1 (en) 1995-08-14 1997-02-27 Ely Michael Rabani Methods and devices for parallel multiplex polynucleotide sequencing
US5661028A (en) 1995-09-29 1997-08-26 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Large scale DNA microsequencing device
JP2002515738A (ja) 1996-01-23 2002-05-28 アフィメトリックス，インコーポレイティド 核酸分析法
CA2216227A1 (en) * 1996-01-24 1997-07-31 Synaptic Pharmaceutical Corporation Dna encoding galanin galr2 receptors and uses thereof
EP2368897B1 (en) 1996-02-09 2016-10-19 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP0886681A1 (en) 1996-03-04 1998-12-30 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
US5770370A (en) 1996-06-14 1998-06-23 David Sarnoff Research Center, Inc. Nuclease protection assays
EP0990142A4 (en) 1996-12-31 2000-09-27 Genometrix Genomics Inc MULTIPLEXED MOLECULAR ANALYSIS METHOD AND DEVICE
US6232066B1 (en) 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
KR100709468B1 (ko) * 2004-11-09 2007-04-18 주식회사 하이닉스반도체 플래시 메모리 소자의 플로팅 게이트 형성방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009183286A (ja) 2009-08-20
DK1038033T3 (da) 2008-08-18
ATE392485T1 (de) 2008-05-15
NZ505319A (en) 2002-11-26
EP1038033A2 (en) 2000-09-27
EP1038033B1 (en) 2008-04-16
JP2001526904A (ja) 2001-12-25
CA2315776C (en) 2011-11-29
NO329977B1 (no) 2011-01-31
WO1999032663A2 (en) 1999-07-01
CN1290306A (zh) 2001-04-04
US6232066B1 (en) 2001-05-15
CN1292076C (zh) 2006-12-27
DE69839373T2 (de) 2009-06-04
KR100708782B1 (ko) 2007-04-18
MXPA00006058A (es) 2004-09-10
CZ302381B6 (cs) 2011-04-27
CA2315776A1 (en) 1999-07-01
JP2011135884A (ja) 2011-07-14
IL136862A (en) 2006-07-05
EA006425B1 (ru) 2005-12-29
DE69839373D1 (de) 2008-05-29
PL342898A1 (en) 2001-07-16
CZ20002259A3 (cs) 2001-07-11
KR20010033324A (ko) 2001-04-25
AU1936699A (en) 1999-07-12
JP2010046072A (ja) 2010-03-04
JP5049395B2 (ja) 2012-10-17
ES2306484T3 (es) 2008-11-01
AU2003234756A1 (en) 2003-09-11
NO20003115L (no) 2000-08-21
IL136862A0 (en) 2001-06-14
WO1999032663A3 (en) 2000-02-17
EA200000684A1 (ru) 2001-02-26
NO20003115D0 (no) 2000-06-16
JP2012090644A (ja) 2012-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL193762B1 (pl) Sposób wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego i zestaw do wykrywania co najmniej jednego docelowego kwasu nukleinowego
US6458533B1 (en) High throughput assay system for monitoring ESTs
CA2377567C (en) High throughput assay system
CA2452819C (en) High throughput assay system
WO2000037684A1 (en) High throughput assay system using mass spectrometry
US20030039967A1 (en) High throughput assay system using mass spectrometry
AU2006201464B2 (en) High Throughput Assay System
US20040185464A1 (en) High throughput assay system
AU2007231625B2 (en) High Throughput Assay System

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20081221