KR20100083584A - 역전사된 단일가닥 ｄｎａ를 측정하는 방법, 역전사 효소의활성을 측정하는 방법, 및 그를 위한 키트 - Google Patents

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Abstract

하나이상의 구체예는, RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A를 사용하는 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법, 역전사 효소의 활성을 측정하는 방법, 및 그를 위한 키트를 제공한다.
RNaseH, RNaseT1, RNase A, 역전사

Description

역전사된 단일가닥 ＤＮＡ를 측정하는 방법, 역전사 효소의 활성을 측정하는 방법, 및 그를 위한 키트{Method of measuring reverse transcribed single stranded DNA, method of measuring reverse transcriptase activity and kit for same}
하나이상의 구체예는 RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법, 역전사 효소의 활성을 측정하는 방법, 및 그를 위한 키트에 관한 것이다.
역전사 반응은 생물학 분석 방법에 널리 시용되고 있다. 역전사 반응의 산물을 측정하는 방법의 예로는, 상기 산물을 주형으로 하여, PCR을 하고, PCR 산물로부터 역전사 산물의 농도를 추정하는 방법이 있다. 그러나, 이 방법은 역전사 반응의 산물을 간접적으로 측정하는 방법으로서, 시간이 오래 소요된다. 또한, 실시간-PCR을 이용하더라도, 반응을 수행한 Ct 값으로 환산하여야 하는 어려움이 있다. 또한, PCR을 위하여는 프라이머를 사용하여야 하며, 프라이머 서열의 종류에 따라서도, 그 측정의 정확도가 달라질 수 있다.
역전사 반응의 산물을 측정하는 방법의 다른 예로는, 역전사 산물을 마이크로어레이에 고정된 프로브와 혼성화시키고, 그 혼성화 결과로부터 상기 역전사 산 물을 측정하는 방법이 있다. 그러나, 방법에 의하더라도, 측정시간이 많이 소요되고, 복잡한 과정을 거치고, 역전사 산물을 직접적으로 측정하는 것이 아니라, 간접적으로 측정하는 것이다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도, 역전사 산물을 효율적으로 측정할 수 있는방법이 여전히 요구되고 있다.
일 구체예는 RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법을 제공한다.
다른 구체예는 역전사 효소의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
다른 구체예는 RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하기 위한 키트를 제공한다.
다른 구체예는 역전사 효소의 활성을 측정하기 위한 키트를 제공한다.
일 구체예는,
RNA 주형을 포함하는 시료와 프라이머를 배양하여 상기 프라이머를 상기 RNA 주형에 어닐링시키는 단계;
상기 어닐링된 산물을 역전사 효소 및 dNTP의 존재하에서 배양하여 상기 RNA로부터 DNA를 역전사하는 단계;
상기 역전사된 산물을 RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A의 존재하에서 배양하는 단계;
상기 배양 혼합물에 DNA 표지물질을 첨가하여, 단일가닥 DNA를 표지하는 단계; 및
상기 표지된 단일가닥 DNA로부터 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 RNA 주형을 포함하는 시료와 프라이머를 배양하여 상기 프라이머를 상기 RNA 주형에 어닐링시키는 단계를 포함한다. 상기 어닐링은 상기 RNA 주형를 변성시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 변성시키는 단계는 열 변성 예를 들면, 65℃ 내지 75℃에서 배양하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 변성된 RNA 주형에 프라이머를 어닐링시키는 것은 낮은 온도에서 유지하는 것, 예를 들면, 0℃ 내지 10℃에서 배양하는 것에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 시료는 주형 RNA 외의 다른 RNA가 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 시료는 예를 mRNA 및 rRNA를 포함하는 것, 또는 mRNA, rRNA 및 tRNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 시료는 세포로부터 분리된 전체 세포 RNA (total cellular RNA)인 것일 수 있다. 상기 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 세포로부터 전체 RNA를 분리하는 방법은 알려져 있다. 예를 들면, Trizol 시약 (예, TRizolTM Plus RNA Purification System: Invitrogen)을 하여 전체 RNA를 분리하는 것이 포함된다. 상기 RNA 주형은 mRNA일 수 있다.
상기 프라이머는 올리고 dT, 랜덤 프라이머, 및 유전자 특이적 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 방법은 또한, 상기 어닐링된 산물을 역전사 효소 및 dNTP의 존재하에서 배양하여 상기 RNA로부터 DNA를 역전사하는 단계를 포함한다. 상기 배양에는 RNase 저해제 및 역전사 효소 버퍼를 더 포함할 수 있다. 역전사 효소 반응에 적합한 조 건, 예를 들면, pH 및 온도 등은 알려져 있으며, 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 역전사하는 단계는 37℃ 내지 45℃의 온도, 예를 들면, 42℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
"역전사 효소"란 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 의미하는 것으로 단일가닥 RNA으로부터 DNA를 합성하는 DNA 폴리머라제 효소이다. 역전사 반응의 결과, RNA/DNA 이중가닥 (duplex)이 형성된다. 상기 역전사하는 단계에 있어서, 상기 역전사 효소는 M-MLV 역전사 효소, AMV 역전사 효소, HIV-1 역전사 효소 및 텔로머라제 역전사 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 역전사하는 단계 후에, 상기 역전사 효소를 불활성화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 효소의 불활성화는 예를 들면, 열 불활성화, 예를 들면, 70℃로 가열하는 것에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 방법은 또한, 상기 역전사된 산물을 RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A의 존재하에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기 RNase H는 RNA/DNA 이중가닥 중의 RNA의 3'-O-P 결합을 절단하여 3'-히드록시 및 5'-포스페이트 말단화된 산물을 생성하는 리보뉴클레아제이다. RNase H는 가수분해 기작에 의하여 RNA의 절단을 촉매하는 비특이적 엔도뉴클레아제이다. RNaseT1은 구아닌 후의 잔기, 즉 그의 3' 말단(end) 상의 단일가닥 RNA를 절단하는 곰팡이 유래 엔도뉴클레아제이다. 이 효소의 가장 많이 연구된 형태는 아스퍼길러스 오리자에서 발견되는 rntA 유전자에 의하여 코딩되는 것이다. RNase A는 단일가닥 RNA를 절단하는 엔도뉴클레아제이다. 예를 들면, 소 이자 RNase A일 수 있다. RNase A는 C 및 U 잔기에서 RNA를 절단한다. RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A의 촉매 반응을 위한 반응 조건은 알려져 있으며, 이들은 동일한 조건에서 호환성 있게 반응을 촉매할 수 있다. 예를 들면, 반응 온도는 20℃ 내지 40℃, 예를 들면, 25℃ 또는 37℃일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 반응 버퍼로는 상기 RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A 각각에 대하여 적합한 버퍼, 또는 역전사 효소 반응 버퍼 중에서 혼환성이 있다. 상기 배양은 예를 들면, RNase H 반응 버퍼 (75mM KCl, 50mM Tris-HCl, 3mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, pH 8.3, 25°C), RNase T1 반응 버퍼 (100-200mM 염 (NaCl 또는 KOAc)를 포함하는 버퍼, pH 7.0-8.8), RNase A 반응 버퍼, 및 역전사 반응 버퍼 중에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 배양의 일 예는 역전사 효소 반응 버퍼 중에서 배양되는 것 또는 버퍼 없이 배양되는 것이다. RNaseT1 및 RNase A는 RNaseT1/RNase A 혼합물의 형태로 제공되는 것, 예를 들면 RNase A/T1 Mix (Fermentas Inc. 미국)일 수 있다. 상기 배양의 결과, 배양물 중의 RNA/DNA 중의 RNA, 단일가닥 RNA, 예를 들면, rRNA 및 tRNA는 제거되는 것으로 여겨진다.
상기 방법은 또한, 상기 배양 혼합물에 DNA 표지물질을 첨가하여, 단일가닥 DNA를 표지하는 단계를 포함한다. DNA 표지물질은 DNA를 표지할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 표지물질은 DNA에 끼어들어가는 물질 (intercalator)일 수 있다. 또한, 상기 표지물질은 단일가닥 DNA 특이적 표지물질일 수 있다. 상기 표지물질의 예는 Oligogreen TM (Invitrogen), Cuproline blue, 에티듐 브로마이드 (EtBr) 및 Ribogreen TM이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것 은 아니다.
상기 방법은 또한, 상기 표지된 단일가닥 DNA로부터 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 신호의 측정은 선택되는 표지물질의 종류에 따라 당업자가 적절하게 이루어질 수 있다. 예를 들면, 표지물질이 Oligogreen TM (Invitrogen)인 경우, 약 480nm의 여기광을 조사하고,약 520nm에서 형광을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정된 신호 값은 역전사된 ssDNA의 존재 또는 그 양을 나타낸다.
상기 방법은 적절한 대조군 실험을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은, RNA 주형을 포함하는 시료를 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A의 존재하에서 배양하는 단계; 및
상기 배양 산물로부터 신호를 측정하고, 측정된 신호를 음성 대조군으로 사용하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.
RNaseH, RNaseT1 및 RNase A의 존재하에서 배양하는 단계는 상기한 바와 같다. 또한, 상기 음성 대조군으로 사용하는 단계는, 상기 음성 대조군 신호 값을 실험군 신호 값으로부터 감하는 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 방법은, 농도 또는 서열을 아는 ssDNA를 포함하는 시료에 DNA 표지물질, 예를 들면 단일가닥 DNA 특이적 표지물질을 첨가하여, 단일가닥 DNA를 표지하는 단계; 및
상기 표지된 단일가닥 DNA로부터 신호를 측정하여, 양성 대조군 신호 값으로 사용하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
다른 구체예는,
상기한 바와 같은 구체예에 따른 방법에 의하여 측정된 RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA의 양으로부터 단위 반응시간 당 상기 단일가닥 DNA의 생성량을 계산하는 단계를 포함하는, 역전사 효소의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
상기 반응시간은 역전사 효소 반응의 개시로부터 종료에 소용된 시간을 의미한다.
다른 구체예는, 프라이머, 역전사 효소, dNTP, RNaseH, RNaseT1, RNase A 및 DNA 표지 물질, 예를 들면, 단일가닥 DNA 특이적 표지물질을 포함하는, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하기 위한 키트를 제공한다. 프라이머, 역전사 효소, dNTP, RNaseH, RNaseT1, RNase A 및 DNA 표지물질에 대하여는 RNA 주형으로부터 "역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법"에 대하여 상기한 바와 같다.
상기 키트는 상기한 바와 같은, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법에 따라 상기 키트를 사용하는 과정을 기재한 사용 설명서를 포함할 수 있다.
다른 구체예는, 프라이머, 역전사 효소, dNTP, RNaseH, RNaseT1, RNase A 및 DNA 표지물질, 예를 들면 단일가닥 DNA 특이적 표지물질을 포함하는, 역전사 효소의 활성을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 프라이머, 역전사 효소, dNTP, RNaseH, RNaseT1, RNase A 및 DNA 표지물질에 대하여는 RNA 주형으로부터 "역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법"에 대하여 상기한 바와 같다.
상기 키트는 상기한 바와 같은, 역전사 효소의 활성을 측정하는 방법에 따라 상기 키트를 사용하는 과정을 기재한 사용 설명서를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법에 의하면, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 효율적으로 측정할 수 있다.
다른 구체예에 따른 방법에 의하면, 역전사 효소의 활성을 효율적으로 측정할 수 있다.
다른 구체예에 따른 기트에 의하면, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 효율적으로 측정하는 데 사용될 수 있다
다른 구체예에 따른 기트에 의하면, 역전사 효소의 활성을 효율적으로 측정하는 데 사용될 수 있다.
이하 하나이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A 처리가 역전사 산물에 미치는 영향
본 실시예에서는 범 인간 표준 RNA (Universal Human Reference RNA: UHRR)에 대하여 역전사 반응을 수행한 후, 반응을 정지시키고, RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A를 처리하여 RNA를 제거하고, ssDNA 특이적 형광 물질을 사용하여 역전사된 ssDNA를 측정하였다.
(1) RNA 시료
RNA 시료는 Stragene 사의 정제된 인간 전체 RNA (total RNA)인 범 인간 표준 RNA (Universal Human Reference RNA: UHRR) (카탈로그 번호 740000)를 이용하였다.
(2) 역전사 반응의 수행
상기 RNA 1㎕와 서열번호 1의 프라이머 50pmole을 혼합하고, 70℃에서 10분 동안 가열하고, 신속하게 얼음 상으로 옮겨 상기 프라이머를 RNA 주형에 어닐링하였다.
다음으로, Abion 사의 MessageAmpTM II-Biotin Enhanced Kit를 제조사의 지침에 따라 역전사 반응을 수행하였다. 구체적으로, RNA 및 프라이머를 혼합하고, 부피를 뉴클레아제 없는 물을 사용하여 12㎕로 맞추었다.다음으로, 70℃에서 10분 동안 배양하고 얼음 상으로 옮겼다. 다음으로, 실온에서 역전사 반응 마스터 믹스를 뉴클레아제 없는 중에서 준비하였다. 상기 믹스는 20㎕ 반응에 대하여, 2㎕ 10x 제1 가닥 버퍼, 4㎕dNTP 믹스, 1㎕ RNase 저해제, 및 1㎕ ArrayScript를 순서대로 조합하여 제조하였다. 상기 마스터 믹스 8㎕를 상기 시료에 첨가하고 42℃에 옮기고, 42℃에서 2시간 동안 배양하였다.
(3) RNase 및 ssDNA 특이적 표지 물질로 표지
상기 반응 산물에 RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A를 각각 10, 100, 10 유니트 씩 첨가하고, 25℃에서 15분 동안 배양하였다. 상기 RNase 처리된 혼합물에 Oligogreen TM (Invitrogen)을 첨가하여 상기 혼합물 중의 ssDNA를 표지하였다. 다 음으로, qubit 기기 (Invitrogen)를 사용하여, 480nm의 여기광을 조사하고 520nm에서 형광을 측정하였다.
비교군 실험으로써, 상기 RNase 처리된 혼합물에 RNA 특이적 형광물질인 Ribogreen TM RNA quantification kit (Molecular Probes, Inc)에 제조사의 설명에 따라 Ribogreen TM을 첨가하여 상기 혼합물 중의 RNA를 표지하였다. 다음으로, qubit 기기 (Invitrogen)를 사용하여, 480nm의 여기광을 조사하고 520nm에서 형광을 측정하였다.
도 1은 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A 처리 양을 달리하여 역전사 산물에 처리하고, ssDNA 특이적 형광물질인 Oligogreen TM로 표지하고, 형광을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 1에서 가로축은 처리된 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A의 농도를 % 단위 (전체 반응액의 부피 대비 효소의 처리 부피)로 나타낸 것이고, 세로축은 520nm에서 측정된 RNA의 양을 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 0.125%의 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A에 의하여, 형광강도가 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다. 이는 Oligogreen TM와 RNA의 반응의 산물로부터 유래되는 형광이 감소된 것으로 여겨진다. 따라서, 도 1에 의하면, 역전사 산물 중에는 RNA가 많은 양 존재하며, 이는 0.125% 내지 1%의 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A를 처리함으로써, 대부분 제거될 수 있다는 것을 나타낸다. 즉, ssDNA를 측정할 때 RNA에서 유래하는 형광량이 노이즈로 작용하고 있다는 것을 나타낸다.
도 2는 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A 처리 양을 달리하여 역전사 산물에 처리하고, RNA 특이적 형광물질인 Ribogreen TM로 표지하고, 형광을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에서 가로축은 처리된 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A의 농도를 % 단위 (체 반응액의 부피 대비 효소의 처리 부피)로 나타낸 것이고, 세로축은 520nm에서 측정된 RNA의 양을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 0.125%의 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A에 의하여, 형광강도가 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다. 이는 Ribogreen TM와 RNA의 반응의 산물로부터 유래되는 형광이 감소된 것으로 여겨진다. 따라서, 도 2에 의하면, 역전사 산물 중에는 RNA가 많은 양 존재하며, 이는 0.125% 내지 1%의 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A를 처리함으로써, 대부분 제거될 수 있다는 것을 나타낸다.
구체예에 따른 RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법에 의하면, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 정확하고, 높은 민감도로 신속하게 측정할 수 있다.
도 1은 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A 처리 양을 달리하여 역전사 산물에 처리하고, ssDNA 특이적 형광물질인 Oligogreen TM로 표지하고, 형광을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A 처리 양을 달리하여 역전사 산물에 처리하고, RNA 특이적 형광물질인 Ribogreen TM로 표지하고, 형광을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
<110> Samsung Electronics Co.Ltd. <120> Method of measuring reverse transcribed single stranded DNA, method of measuring reverse transcriptase activity and kit for same <130> PN081866 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 1 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt 60 ttt 63

Claims (14)

  1. RNA 주형을 포함하는 시료와 프라이머를 배양하여 상기 프라이머를 상기 RNA 주형에 어닐링시키는 단계;
    상기 어닐링된 산물을 역전사 효소 및 dNTP의 존재하에서 배양하여 상기 RNA로부터 DNA를 역전사하는 단계;
    상기 역전사된 산물을 RNaseH, RNaseT1, 및 RNase A의 존재하에서 배양하는 단계;
    상기 배양 혼합물에 DNA 표지물질을 첨가하여, 단일가닥 DNA를 표지하는 단계; 및
    상기 표지된 단일가닥 DNA로부터 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, RNA 주형을 포함하는 시료를 RNaseH, RNaseT1 및 RNase A의 존재하에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양 산물로부터 신호를 측정하고, 측정된 신호를 음성 대조군으로 사용하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시료는 mRNA, rRNA 및 tRNA를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 세포로부터 분리된 전체 세포 RNA (total cellular RNA)인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 RNA 주형은 mRNA인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 올리고dT, 랜덤 프라이머, 및 유전자 특이적 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 어닐링하는 단계는 65℃ 내지 75℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 어닐링하는 단계는 0℃ 내지 10℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 역전사하는 단계는 37℃ 내지 45℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 역전사하는 단계에 있어서, 상기 역전사 효소는 M-MLV 역전사 효소, AMV 역전사 효소, HIV-1 역전사 효소 및 텔로머라제 역전사 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표지하는 단계에 있어서, 상기 DNA 표지물질은 OligogreenTM, Cuproline blue, 에티듐 브로마이드 (EtBr) 및 RibogreenTM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 측정된 RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA의 양으로부터 단위 반응시간 당 상기 단일가닥 DNA의 생성량을 계산하는 단계를 포함하는, 역전사 효소의 활성을 측정하는 방법.
  13. 프라이머, 역전사 효소, dNTP, RNaseH, RNaseT1, RNase A 및 DNA 표지물질을 포함하는, RNA 주형으로부터 역전사된 단일가닥 DNA를 측정하기 위한 키트.
  14. 프라이머, 역전사 효소, dNTP, RNaseH, RNaseT1, RNase A 및 DNA 표지물질을 포함하는, 역전사 효소의 활성을 측정하기 위한 키트.
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