CN103080338A - 核酸捕获和测序方法 - Google Patents

核酸捕获和测序方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103080338A
CN103080338A CN2011800416596A CN201180041659A CN103080338A CN 103080338 A CN103080338 A CN 103080338A CN 2011800416596 A CN2011800416596 A CN 2011800416596A CN 201180041659 A CN201180041659 A CN 201180041659A CN 103080338 A CN103080338 A CN 103080338A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
genomic dna
polysaccharase
nucleotide
dna fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800416596A
Other languages
English (en)
Inventor
S·塞沙基里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN103080338A publication Critical patent/CN103080338A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1072—Differential gene expression library synthesis, e.g. subtracted libraries, differential screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了捕获和测序靶核酸分子的方法。并提供了测定基因组DNA的甲基化状态的方法。

Description

核酸捕获和测序方法
相关申请
本申请根据35USC119(e)要求2010年8月27日提交的美国临时申请号61/402,350的优先权，其内容引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及从核酸混合物中分离靶核酸分子和测定这些分子的序列。
背景
自全部人基因组序列完成后，基因组研究已转向“再测序（resequencing）”研究，其中在基因组中和基因组间鉴定变异，例如疾病相关突变。富含特定目的区域（例如外显子)的“分区”基因组的再测序需要涉及“捕获”和测序这些区域的若干步骤。例如，在某些基于微阵列的方法中，基因组DNA被剪切为特定大小范围的片段；末端修复所述片段，与独特的接头（adaptor）连接，并扩增；然后使用包含与参考目的基因组序列互补的探针的微阵列捕获扩增的片段；洗脱和扩增捕获的（杂交的）片段；测序扩增的片段，例如使用“下一代（next generation）”测序技术或再测序阵列。见，例如WO2008/115185;Okou等人(2007)NatureMethods4:907-909;Hodges等人(2007)Nature Genetics39:1522-1527。减少分离和测序目的核酸所需的步骤将提高效率和准确性，且可能降低成本。本发明满足了此要求并提供了额外的益处。
一般在基因组中的CpG二核苷酸处出现的胞嘧啶甲基化在基因调控和表观遗传（epigenetic inheritance）中起重要作用。测定基因组区域的甲基化状态的某些现有方法利用亚硫酸氢盐（bisulfite）处理。在这些方法中，将变性的基因组DNA暴露于亚硫酸氢根离子导致胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶受保护免于此转化。可例如通过下一代测序方法或通过使用探针阵列检测转化事件的存在与否。见，例如，WO2010/085343。这样的方法经常需要若干步骤，例如扩增、捕获、洗脱和测序亚硫酸氢盐处理的DNA，或者备选地需要设计探针，以检测每个目的基因组区域处的转化事件的存在与否，这可能是昂贵和费力的。此外，这样的方法不能在个体DNA分子水平上评估甲基化状态，而是检查对应特定目的基因组区域的核酸分子群。本发明提供了更有效和准确的评估基因组DNA的甲基化状态的方法，因此满足了本领域的需要并提供了其他益处。
概述
在一个方面，本发明提供了捕获和测序靶核酸分子的方法，所述方法包括(a)在杂交条件下将固相支持物暴露于包含靶核酸分子的核酸混合物，其中靶核酸分子与固定在固相支持物上的处于能够引发延伸
（priming-competent）的构型中的引物形成特异性杂交复合物；(b)从固相支持物上分离未结合的和非特异性结合的核酸；(c)在聚合条件下将固相支持物暴露于聚合酶和核苷酸；和(d)通过检测使用靶核酸分子作为模板，通过聚合酶从固定引物起始的核酸聚合，测定靶核酸分子的核酸序列。
在一个实施方案中，靶核酸分子来自基因组DNA区域。在一个这样的实施方案中，靶核酸包含外显子的全部或部分。在另一个实施方案中，靶核酸分子是RNA，聚合酶是逆转录酶，引物包含3’多聚T序列。在另一个实施方案中，靶核酸分子是DNA，聚合酶是DNA聚合酶。在另一个实施方案中，在核苷酸的末端磷酸上标记核苷酸。在一个这样的实施方案中，用FRET供体标记聚合酶，用FRET受体标记核苷酸。在一个这样的实施方案中，FRET供体是荧光纳米颗粒。
在另一个方面，提供了测定基因组DNA片段的甲基化状态的方法，所述方法包括(a)在固相支持物上固定基因组DNA片段；(b)通过检测使用固定的基因组DNA片段作为模板，通过聚合酶的核酸聚合，测定固相支持物上固定的基因组DNA片段的核酸序列；(c)对固定的基因组DNA片段进行亚硫酸氢盐处理；(d)通过检测使用固定的亚硫酸氢盐处理的基因组DNA片段作为模板，通过聚合酶的核酸聚合，测定固相支持物上固定的亚硫酸氢盐处理的基因组DNA片段的核酸序列；(e)比较在(b)中测定的核酸序列和在(d)中测定的序列，其中在基因组DNA片段中胞嘧啶残基的转化指示这些残基在亚硫酸氢盐处理前在基因组DNA片段中是未甲基化的，且其中在基因组DNA片段中不存在胞嘧啶残基转化指示这些残基在亚硫酸氢盐处理前在基因组DNA片段中是甲基化的。
在一个实施方案中，通过接头将基因组DNA片段固定在固相支持物上。在一个这样的实施方案中，接头包含引物结合位点，且在引物结合位点中的胞嘧啶是受保护的。在一个这样的实施方案中，(b)和/或(d)的聚合酶从与引物结合位点退火的引物起始聚合核酸链。在另一个实施方案中，通过检测标记核苷酸的掺入，检测(b)和/或(d)中的核酸聚合。在一个这样的实施方案中，标记核苷酸在其末端磷酸上被标记。在一个这样的实施方案中，(b)和/或(d)的聚合酶用FRET供体标记，核苷酸用FRET受体标记。在一个这样的实施方案中，FRET供体是荧光纳米颗粒。
附图简述
图1描述了使用互补的寡核苷酸在寡核苷酸阵列上直接捕获剪切的DNA的选定区域，和通过使用用于捕获DNA的寡核苷酸的游离3’末端、允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP直接测序捕获的DNA。
图2描述了使用用互补的寡核苷酸包被的小珠直接捕获剪切的DNA的选定区域，随后阵列小珠和通过使用用于捕获DNA的寡核苷酸的游离3’末端、允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP测序捕获的DNA。
图3描述了在多聚dT寡核苷酸阵列上直接捕获RNA，和通过使用多聚dT寡核苷酸的游离3’末端和逆转录酶将其转化为cDNA测序捕获的RNA。在cDNA转化后，使用多聚A引物，允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP测序cDNA。备选地，可使用允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和逆转录酶的标记的逆转录酶和标记的dNTP直接测序捕获的RNA以得到序列。
图4描述了使用固定在小珠上的多聚dT寡核苷酸直接捕获RNA，在表面上阵列小珠，然后通过使用多聚dT寡核苷酸的游离3’末端和逆转录酶将其转化为cDNA测序捕获的RNA。在cDNA转化后，使用多聚A引物，允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和逆转录酶的标记的聚合酶和标记的dNTP测序cDNA。备选地，可使用允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和逆转录酶的标记的逆转录酶和标记的dNTP直接测序捕获的RNA以得到序列。
图5描述了通过测序在连续反应中在阵列上的相同的DNA分子，测定核酸甲基化状态，其中第二轮测序在亚硫酸氢盐处理后进行，以允许甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。合适的引物、标记的聚合酶和标记的dNTP允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和聚合酶。
图6描述了通过测序在连续反应中在小珠上的相同的DNA分子，测定核酸甲基化状态，其中第二轮测序在亚硫酸氢盐处理后进行，以允许甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。合适的引物、标记的聚合酶和标记的dNTP允许在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基（序列）和聚合酶。
发明实施方案详述
I.定义
“亚硫酸氢盐处理”指将核酸暴露于足以将未受保护的胞嘧啶转化为尿嘧啶的浓度的亚硫酸氢根离子(例如，亚硫酸氢镁或亚硫酸氢钠)。“亚硫酸氢盐处理”也指将核酸暴露于合适浓度的可用于将未受保护的胞嘧啶转化为尿嘧啶的其他试剂，例如亚硫酸氢盐（disulfite和hydrogensulfite）。在暴露于亚硫酸氢根离子或其他试剂之后，“亚硫酸氢盐处理”一般包括将核酸暴露于碱，例如NaOH。
“胞嘧啶残基的转化”指由于亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶残基至尿嘧啶残基的转化。
“外显子”指基因组的编码区。
“杂交条件”指允许互补核酸链杂交的条件。
“测定核酸序列”指测定靶核酸分子的至少一个核苷酸的身份（identity），在一些实施方案中，测定靶核酸分子的多个核苷酸的身份。
“固定的”和“固定”指通过互补碱基配对以外的方式将核酸直接或间接连接至固相支持物。如果在特异性杂交复合物中的两条核酸链的至少一条如上面定义的“固定”在固相支持物上，则认为特异性杂交复合物固定在固相支持物上。
“标记物”指可直接或间接检测的任意部分。
“核酸”指任意长度的核苷酸聚合物。
“核苷酸”指能够通过聚合酶掺入延伸的核酸链的核苷酸及其类似物。核苷酸包括但不限于通常掺入DNA的4种核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)；通常掺入RNA的4种核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶)；具有修饰的碱基的核苷酸，例如肌苷；和标记的或修饰的核苷酸。
“聚合酶”指能够在聚合条件下将核苷酸掺入延伸的核酸链的天然或非天然存在的酶，或其酶活性片段，包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。
“聚合条件”指允许聚合酶将核苷酸掺入延伸的核酸链的条件。
“引物”指可通过聚合酶添加核苷酸的核酸。“添加”指通过聚合酶直接对引物添加核苷酸，以及随后对从引物起始的延伸的核酸链添加核苷酸。
“能够引发延伸的构型”指引物具有可用的反应基，聚合酶可对其添加核苷酸。
“固相支持物”指任意固相基质。
“特异性杂交复合物”指在严格杂交条件和/或严格洗涤条件下能够形成或基本维持的杂交复合物。
“靶核酸分子”指任意目的核酸分子。
“模板”指可被聚合酶利用以合成互补核酸链的单链核酸，或双链核酸的变性区。
II.靶核酸分子的捕获和测序
在一个方面，本发明涉及使用固定在固相支持物上的互补核酸，例如引物捕获靶核酸分子的方法。在某些实施方案中，然后通过检测通过使用靶核酸分子作为模板的聚合酶从引物起始的核酸聚合，测定靶核酸分子的核酸序列。检测在单分子水平上实时或近似实时进行。
靶核酸分子
在多个实施方案中，靶核酸分子是DNA。在一个实施方案中，靶核酸分子可对应基因组，例如人基因组或来自任意其他生物的基因组的任意区域(“靶区域”)。靶区域可为几百万碱基（megabase）的一个或多个连续的区块，或若干较小的连续或不连续的区域，例如来自一个或多个染色体的所有外显子，或已知包含SNP的位点。包含靶区域的基因组可为部分或完整的。基因组可源自任意生物来源，例如患者样品或合并的患者样品；细胞系或细胞培养物；活检材料；正常组织样品或来自肿瘤或其他患病组织的样品；和本领域技术人员会考虑的其他生物来源。在一个实施方案中，通过例如超声处理或水动力将包含靶核酸的基因组DNA剪切为一般约200-600碱基对的片段，从片段或其分级部分中捕获靶核酸分子。在另一个实施方案中，靶核酸分子可为编码或非编码序列。在一个这样的实施方案中，靶核酸分子是外显子或其部分。
在多个实施方案中，靶核酸分子是RNA。在一个实施方案中，靶核酸是mRNA转录物或其部分。在一个这样的实施方案中，靶核酸是具有多聚A尾巴的mRNA转录物或其部分。多聚A尾巴的存在可允许与包含足够长度的多聚T序列（一般在引物的3’末端）的探针或引物杂交。在另一个实施方案中，靶核酸分子是来自mRNA的cDNA，例如通过使用逆转录酶产生。
捕获
在多个实施方案中，从例如RNA、DNA(例如基因组DNA)或cDNA分子的核酸混合物中捕获靶核酸分子。在一个实施方案中，在捕获靶核酸分子前扩增混合物中的核酸。这可通过例如将包含通用引发位点的接头连接至混合物中的核酸分子的末端实现，其中所述末端可任选地在连接前进行末端修复。从而通用引物可用于扩增混合物中的核酸。
在多个实施方案中，使用固定在固相支持物上的互补核酸捕获靶核酸分子。互补核酸不需要与靶核酸分子完全互补，而是可包含错配，只要靶核酸分子和互补核酸能够形成特异性杂交复合物即可。在一个实施方案中，互补核酸是引物。在一个这样的实施方案中，引物以能够引发延伸的构型固定在固相支持物上。例如，在固相支持物上固定具有3’-OH的引物，其中所述3’-OH可被聚合酶利用，用于在引物的3’末端添加核苷酸。这可例如通过引物的5’末端或通过引物的内部区域将引物固定在固相支持物上实现，只要引物是能够引发延伸的即可。引物可为任意长度，只要其能够与靶核酸分子形成特异性杂交复合物，在某些实施方案中，引物长度为至少10,15,20,25,50,75,100,200,300,400或500碱基对。
本领域熟知将核酸固定在固相支持物上的方法。例如，可通过共价或非共价连接将核酸，例如上面提供的互补核酸固定在固相支持物上。合适的化学接头和其他连接是本领域技术人员公知的。例如，在一个实施方案中，待固定的核酸是生物素化的(例如，包含一个或多个生物素化核苷酸)，固相支持物在其表面上具有链霉抗生物素，其中核酸的生物素部分与链霉抗生物素结合，从而固定核酸。在另一个实施方案中，通过在固相支持物上合成核酸实现上述实施方案中提供的固定。例如，可通过从5’至3’的方向聚合核苷酸在固相支持物上合成引物，在远离固相支持物的引物末端留下可用的3’-OH。在固相支持物（例如高密度微阵列）上从5’至3’的方向合成寡核苷酸的化学方法是本领域公知的，并可用于本文描述的目的。见，例如Albert等人(2003)“Light directed5’→3’synthesisof complex oligonucleotide microarrays,”Nucleic Acids Res.31(7):e35，以其整体引入本文作为参考。
在多个实施方案中，固相支持物是可固定核酸的任意基质。这样的基质包括但不限于玻璃(例如,玻璃显微镜载玻片)、金属、陶瓷、聚合小珠和其他基质。在某些实施方案中，固相支持物为阵列的形式，例如，微阵列。在某些实施方案中，可将核酸固定在固相支持物（例如小珠）上，所述固相支持物进而被捕获或固定在另一种固相支持物（例如，载玻片或微阵列）上。
在某些实施方案中，在杂交条件下将其上固定了互补核酸的固相支持物暴露于包含靶核酸分子的核酸混合物。靶核酸分子从而与互补核酸形成特异性杂交复合物。在其他实施方案中，洗涤固相支持物以去除未结合的和非特异性结合的核酸，因此从混合物中的其他核酸中分离靶核酸分子(包含在特异性杂交复合物中)。在某些实施方案中，分别在严格杂交条件和/或严格洗涤条件下将固相支持物暴露于核酸混合物和/或洗涤固相支持物。
如本文使用的，“杂交”指互补核酸链的配对。杂交和杂交强度（即核酸链之间结合的强度）受这些因素的影响，例如核酸之间的互补程度，条件的严格性，杂交复合物的Tm，和核酸的G:C比。尽管本发明不限于特定杂交条件的集合，但可应用严格杂交条件。本领域技术人员可使用常规方法经验性确定严格杂交条件。严格杂交条件是序列依赖的，并且也依赖于环境因素，例如盐浓度和有机溶剂的存在。一般地，选择严格杂交条件使得在确定的离子强度和pH下比特定核酸序列的热熔点(Tm)低约5℃至20℃。在某些实施方案中，严格杂交条件比与互补核酸结合的特定核酸的热熔点低约5℃至10℃。Tm是50%的核酸(例如，靶核酸分子)与完全匹配的引物杂交的温度（在确定的离子强度和pH下）。
类似地，本领域技术人员可使用常规方法经验性确定严格洗涤条件。例如，可确定允许非特异性结合的核酸与固相支持物（例如阵列）上固定的特异性杂交复合物分离的严格洗涤条件。在一个实施方案中，使阵列暴露于杂交条件(例如，严格杂交条件)，然后用包含连续降低的盐浓度，和/或升高的洗涤剂浓度，和/或处于渐增的温度的缓冲液洗涤，直到特异性与非特异性杂交的信噪比足够高，以便于检测特异性杂交，例如共有完全互补性或基本完全的互补性的核酸链之间的杂交。在某些实施方案中，严格洗涤条件将包括约30℃,37℃,42℃,45℃,50℃或55℃的温度。在某些实施方案中，严格洗涤条件将包括≤1M,≤500mM,≤250mM,≤100mM,≤50mM或≤25mM,但≥10mM的盐浓度。严格杂交条件的实例如下：50%甲酰胺,5x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH6.8),0.1%焦磷酸钠,5x Denhardt溶液,超声处理的鲑精DNA(50μg/ml),0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖，在42℃下。严格洗涤条件的实例如下：包含EDTA的0.1x SSC，在55℃下。
序列测定
在靶核酸分子(包含在特异性杂交复合物中)从混合物的其他核酸中分离后，可对靶核酸分子测序。在多个实施方案中，此步骤一般被称为“再测序”，其中来自参考基因组的靶区域的序列是已知的。再测序的现有方法要求从特异性杂交复合物中洗脱靶核酸分子，之后扩增靶核酸分子，然后使用“下一代”测序技术(例如，能够平行、高通量测序的测序平台)或再测序阵列(包含特异性检测在核酸的离散区段中存在突变与否的探针的微阵列)对扩增的靶核酸分子测序。对洗脱和扩增步骤的要求是费时费力的，且其可能导致样品的损失，或偏向展示靶核酸分子群中的个体靶核酸分子。
因此，在多个实施方案中，进行靶核酸分子的再测序而无需将其从特异性杂交复合物中洗脱。在一个实施方案中，这可如下实现，其中包含在特异性杂交复合物中的互补核酸是以能够引发延伸的构型固定在固相基质上的引物。例如，引物可与靶核酸分子的特定区域杂交，靶核酸分子的其余部分为单链形式。因此，聚合酶将能够使用靶核酸分子的单链（未杂交）部分作为模板对引物的可用3’-OH添加核苷酸。使用通过聚合酶合成的核酸链测定靶核酸分子的序列。
因此，可将通过引物在其上固定特异性杂交复合物的固相支持物暴露于聚合反应混合物。在一个实施方案中，聚合反应混合物包含聚合酶和核苷酸。聚合酶可为DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。当靶核酸分子为RNA时，聚合酶可为逆转录酶。在其他实施方案中，当靶核酸分子为DNA时，聚合酶为DNA聚合酶。某些示例性DNA聚合酶包括但不限于，细菌DNA聚合酶(例如，大肠杆菌DNA pol I,II,III,IV和V，和DNA pol I的Klenow片段)；病毒DNA聚合酶(例如，T4和T7DNA聚合酶)；古细菌DNA聚合酶(例如，栖热水生菌（Thermus aquaticus）(Taq)DNA聚合酶，强烈火球菌（Pyrococcus furiosus）(Pfu)DNA聚合酶，“Deep Vent”DNA聚合酶(New England BioLabs))；真核DNA聚合酶；及其改造或修饰的变体。某些示例性RNA聚合酶包括但不限于，T7,T3和SP6RNA聚合酶，及其改造或修饰的变体。某些示例性逆转录酶包括但不限于，来自HIV,MMLV和AMV的逆转录酶，以及市售的逆转录酶，例如SUPERSCRIPT(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
在某些实施方案中，标记聚合反应混合物中的核苷酸和/或聚合酶。在一个实施方案中，差异标记1、2、3或4种核苷酸。在一个这样的实施方案中，用4种不同的标记物标记4种不同的核苷酸。例如，在dNTP的情况下，用不同的标记物，例如不同的荧光团分别标记腺嘌呤(或其功能等同类似物),鸟嘌呤(或其功能等同类似物),胞嘧啶(或其功能等同类似物)和胸腺嘧啶(或其功能等同类似物)。类似地，在rNTP的情况下，用不同的标记物，例如不同的荧光团分别标记腺嘌呤(或其功能等同类似物),鸟嘌呤(或其功能等同类似物),胞嘧啶(或其功能等同类似物)和尿嘧啶(或其功能等同类似物)。合适的标记物包括但不限于，发光、光致发光（photoluminescent）、电致发光、生物发光、化学发光、荧光和/或磷光标记物。荧光标记物包括但不限于，黄嘌呤染料、荧光素、青色素、罗丹明、香豆素、吖啶、德克萨斯红染料、BODIPY、ALEXA、GFP，及其修饰物。标记物可直接连接至核苷酸，或可通过合适的接头连接。标记物可在不显著干预聚合酶将核苷酸掺入延伸的核酸链的能力的任意位置连接至核苷酸。在一个实施方案中，标记物连接至核苷酸的磷酸上，例如，核苷酸的末端磷酸上，其中，核苷酸的磷酸链连带着标记物在核苷酸掺入延伸的核酸链时被切割。标记的核苷酸和/或聚合酶可允许检测聚合酶合成的核酸链。
在某些实施方案中，通过鉴定经由聚合酶掺入延伸的核酸链中的核苷酸，测定靶核酸分子的序列。一个实施方案包含直接或间接依掺入的顺序检测掺入延伸的核酸链中的核苷酸的标记物，将检测的标记物与核苷酸的身份相联系，由此确定延伸的核酸链的序列。这样测定靶核酸分子(或其互补物，取决于引物是与靶核酸分子的正义链还是反义链杂交)的序列。在这样的实施方案中，标记物的检测、和原则上靶核酸分子的测序实时地在“单分子”水平上进行。上文提到且将在下文进一步例证，可在核苷酸掺入延伸的核酸链时同时去除标记物，使得到的核酸链不被标记。
在WO2010/002939中描述了在核苷酸掺入延伸的核酸链时检测标记的核苷酸的某些方法。这样的方法依赖于当分子彼此足够接近时，“供体”分子（FRET供体）和“受体”分子（FRET受体）之间的Forster共振能量转移(Forster Resonance Energy Transfer，FRET)。在特定的实施方案中，用FRET供体荧光团标记聚合酶，用FRET受体荧光团标记核苷酸。当聚合酶将核苷酸掺入延伸的核酸链时，使FRET供体和受体荧光团靠近，允许能量从FRET供体荧光团至FRET受体荧光团转移。能量转移减少FRET供体荧光团的发射强度，增加FRET受体荧光团的发射强度。检测FRET受体的发射光谱指示掺入的核苷酸的身份。在一个实施方案中，连接至聚合酶的FRET供体是荧光纳米颗粒，例如，纳米晶体，更具体地，如在WO2010/002939中描述的量子点（quantum dot）。可用激发源例如激光使FRET供体发光，其中产生供体发射。在其他实施方案中，将不同的FRET受体分别连接至一种或多种核苷酸，特别地分别连接至3种或4种核苷酸。FRET受体可为上述任意荧光标记物。
可使用任意合适方法或装置检测标记物，包括但不限于电荷耦合装置（charge couple device）和全内反射显微镜法。
在某些实施方案中，靶核酸分子是多聚A-RNA，使用含多聚T序列的引物捕获靶核酸分子。使用逆转录酶从引物合成cDNA（但不测序）。然后在固相支持物上变性（分离）特异性杂交复合物中的靶核酸分子，留下新合成的cDNA链，其通过引物固定在固相支持物上。然后将固相支持物暴露于包含多聚A的引物，所述引物与新合成的cDNA杂交。通过将固相支持物暴露于如上提供的聚合反应混合物对新合成的cDNA测序，其中DNA聚合酶从多聚A引物合成核酸链。
使用上述方法，通过选择特异性针对各个目的靶核酸分子的引物，和在固相支持物的分立区域，例如微阵列上固定引物，可分离和测序多个靶核酸分子。这样，可以高通量方式分离和测序目的靶核酸分子。
III.甲基化状态的测定
在另一个方面，本发明涉及测定基因组DNA片段中CpG二核苷酸的甲基化状态的方法，所述方法通过将基因组DNA片段固定于固相支持物；通过检测使用基因组DNA片段作为模板，通过聚合酶的核苷酸聚合，测定固定的基因组DNA片段的核酸序列；从新合成的核酸链中变性固定的基因组DNA片段；将固相支持物暴露于亚硫酸氢盐；和通过检测使用靶核酸分子作为模板，通过聚合酶的核苷酸聚合，测定基因组DNA片段的核酸序列。
基因组DNA片段
可从任意基因组，例如人基因组或来自任何其他生物的基因组获得基因组DNA片段。基因组可为部分或完整的。基因组可源自任意生物来源，例如患者样品或合并的患者样品；细胞系或细胞培养物；活检材料；正常组织样品或来自肿瘤或其他患病组织的样品；和本领域技术人员会考虑的其他生物来源。在一个实施方案中，通过例如超声处理或水动力将基因组DNA剪切为一般约200-600碱基对的片段。在其他实施方案中，通过酶消化片段化基因组DNA。
基因组DNA片段的固定
可通过任意不同方法将基因组DNA片段固定至固相支持物。可通过共价或非共价连接将基因组DNA片段直接或间接固定至固相支持物。合适的化学接头和其他连接是本领域技术人员公知的。在特定的实施方案中，基因组DNA片段是变性的，其以单链形式固定至固相支持物。通过连接核酸，或接头将基因组DNA片段，例如单链基因组DNA片段固定至固相支持物。例如，接头可与基因组DNA片段的一端或两端连接，接头固定至固相支持物。接头可为单链的，例如寡核苷酸。在某些实施方案中，接头首先与基因组DNA片段连接，然后将接头固定至固相支持物，或备选地，首先将接头固定至固相支持物，然后将基因组片段与固相支持物上的接头连接。在某些其他实施方案中，接头是生物素化的(例如，包含一个或多个生物素化核苷酸)，固相支持物在其表面上具有链霉抗生物素，其中生物素部分与链霉抗生物素结合，从而固定接头。
固定的基因组DNA片段的方向可为从固相支持物起5’→3’，或从固相支持物起3’→5’。在一个实施方案中，固定的基因组DNA片段的方向为从固相支持物起3’→5’。在其他实施方案中，固定的基因组DNA片段是单链的。在另一个实施方案中，单链基因组片段通过接头，例如寡核苷酸固定至固相支持物。在特定实施方案中，基因组DNA片段是单链的并与固定至固相支持物的接头连接，其中接头和基因组DNA片段的方向为从固相支持物起3’→5’。
测序
在固相支持物上测序固定的基因组DNA片段。在某些实施方案中，基因组DNA片段以单链形式固定在固相支持物上，或以双链形式固定在固相支持物上，其中所述双链形式能够全部或部分转化为保持固定至固相支持物的单链形式。
在某些实施方案中，在杂交条件下将固相支持物暴露于引物，其中引物和基因组DNA片段形成特异性杂交复合物。在某些其他实施方案中，在杂交条件下将固相支持物暴露于引物，其中引物和接头形成特异性杂交复合物。在一个这样的实施方案中，接头是连接基因组DNA片段的寡核苷酸，其中接头固定至固相支持物。在前述实施方案中，引物结合的基因组DNA片段或接头中的核酸序列中的胞嘧啶例如通过具有保护基受到保护，而免于由亚硫酸氢盐处理导致的脱氨。保护基可为甲基，例如，受保护的胞嘧啶可为5-甲基胞嘧啶。
在其他实施方案中，将固相支持物暴露于聚合反应混合物。在一个实施方案中，聚合反应混合物包含DNA聚合酶和核苷酸，其中DNA聚合酶使用基因组DNA片段作为模板，从引物开始合成核酸链。在一个这样的实施方案中，DNA聚合酶从与接头形成特异性杂交复合物的引物开始合成核酸链，其中使用接头（任选地）和基因组DNA片段作为模板。例如，如果接头连接基因组DNA片段与固相支持物，其中接头和基因组DNA片段的方向为以从固相支持物起3’→5’，那么引物可以从固相支持物起5’→3’的方向与接头杂交，从而通过聚合酶以5’→3’的方向引发合成，（任选地）使用接头作为模板和使用基因组DNA片段作为模板。在另一个这样的实施方案中，DNA聚合酶从与基因组DNA片段形成特异性杂交复合物的引物开始合成核酸链，其中使用基因组DNA片段作为模板。
合适的DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶(例如，大肠杆菌DNApol I,II,III,IV和V，和DNA pol I的Klenow片段)；病毒DNA聚合酶(例如，T4和T7DNA聚合酶)；古细菌DNA聚合酶(例如，栖热水生菌（Thermus aquaticus）(Taq)DNA聚合酶，强烈火球菌（Pyrococcusfuriosus）(Pfu)DNA聚合酶，“Deep Vent”DNA聚合酶(New EnglandBioLabs))；真核DNA聚合酶；及其改造或修饰的变体。
在某些实施方案中，标记聚合反应混合物中的核苷酸和/或聚合酶。在一个实施方案中，差异标记1、2、3或4种核苷酸。在一个这样的实施方案中，用4种不同的标记物标记4种不同的核苷酸。例如，在dNTP的情况下，用不同的标记物，例如不同的荧光团分别标记腺嘌呤(或其功能等同类似物),鸟嘌呤(或其功能等同类似物),胞嘧啶(或其功能等同类似物)和胸腺嘧啶(或其功能等同类似物)。合适的标记物包括但不限于，发光、光致发光、电致发光、生物发光、化学发光、荧光和/或磷光标记物。荧光标记物包括但不限于，黄嘌呤染料、荧光素、青色素、罗丹明、香豆素、吖啶、德克萨斯红染料、BODIPY、ALEXA、GFP，及其修饰物。标记物可直接连接至核苷酸，或可通过合适的接头连接。标记物可在不显著干预聚合酶将核苷酸掺入延伸的核酸链的能力的任意位置连接至核苷酸。在一个实施方案中，标记物连接至核苷酸的磷酸上，例如，核苷酸的末端磷酸上，其中，核苷酸的磷酸链连带标记物在核苷酸掺入延伸的核酸链时被切割。标记的核苷酸和/或聚合酶可允许检测聚合酶合成的核酸链。
在某些实施方案中，通过依掺入的顺序鉴定经聚合酶掺入延伸的核酸链中的核苷酸，测定基因组DNA片段的序列。一个实施方案包含依掺入的顺序直接或间接检测掺入延伸的核酸链中的核苷酸的标记物，将检测的标记物与核苷酸的身份相联系，由此确定延伸的核酸链的序列。这样确定基因组DNA片段(或其互补物，取决于固定的是基因组DNA片段的正义还是反义链)的序列。在这样的实施方案中，标记物的检测，和原则上基因组DNA片段的测序实时地在“单分子”水平上进行。上文提到且将在下文进一步例证，可在核苷酸掺入延伸的核酸链的同时去除标记物，使新合成的核酸链不被标记。
在WO2010/002939中描述了在核苷酸掺入延伸的核酸链时检测标记的核苷酸的某些方法。这样的方法依赖于当分子彼此足够接近时，“供体”分子（FRET供体）和“受体”分子（FRET受体）之间的Forster共振能量转移(FRET)。在特定的实施方案中，用FRET供体荧光团标记聚合酶，用FRET受体荧光团标记核苷酸。当聚合酶将核苷酸掺入延伸的核酸链时，使FRET供体和受体荧光团靠近，允许能量从FRET供体荧光团转移至FRET受体荧光团。能量转移减少FRET供体荧光团的发射强度，增加FRET受体荧光团的发射强度。检测FRET受体的发射光谱指示掺入的核苷酸的身份。在一个实施方案中，连接至聚合酶的FRET供体是荧光纳米颗粒，例如，纳米晶体，更具体地，如在WO2010/002939中描述的量子点。可用激发源例如激光激发FRET供体，其中产生供体发射。在其他实施方案中，将不同的FRET受体分别连接至一种或多种核苷酸，特别地分别连接至3种或4种核苷酸。FRET受体可为上述任意荧光标记物。
可使用任意合适方法或装置检测标记物，包括但不限于电荷耦合装置和全内反射显微镜法。
使用上述方法，通过在固相支持物的分立区域，例如微阵列上固定基因组DNA片段，可分离和测序多个基因组DNA片段。这样，可以高通量方式固定和测序目的基因组DNA片段。
亚硫酸氢盐处理和处理后测序
在基因组DNA片段的测序后，变性（例如，通过热或碱变性）由新合成的DNA链和基因组DNA片段组成的特异性杂交复合物，分离新合成的DNA链和基因组DNA片段。对固相支持物上的基因组DNA片段进行亚硫酸氢盐处理。进行亚硫酸氢盐处理的方法是本领域已知的，在例如Herman等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9821-9826中描述。在基因组DNA片段中未受保护（未甲基化）的胞嘧啶因此被转化为尿嘧啶。然后对基因组DNA片段进行如上文概述的测序步骤。将得到的序列与亚硫酸氢盐处理前得到的序列比较，以鉴定在基因组DNA片段中已转化为尿嘧啶残基的胞嘧啶残基，例如，通过在测序步骤中产生的新合成链中替换鸟嘌呤的胸腺嘧啶的存在指示。转化的残基指示基因组DNA片段中的未甲基化状态，而未转化的残基指示基因组DNA片段中的受保护，即甲基化状态。这样确定基因组DNA片段的甲基化状态。
实施例
[a]DNA分子的直接捕获和实时测序
将包含目的靶核酸分子的DNA(例如，具有目的蛋白质编码区的基因组DNA)剪切为合适大小，如在图1B和2B中所示。使用包含与目的区域互补的寡核苷酸的基质，例如，阵列(如图1A中所示)或小珠(如图2A中所示)。目的区域可为，例如外显子。通过与寡核苷酸的杂交在基质上捕获包含来自剪切的DNA的相关区域的核酸。在图1中，通过在阵列上与互补寡核苷酸的杂交捕获包含来自剪切的DNA的相关区域的核酸。在图2中，于溶液中在小珠上捕获包含来自剪切的DNA的相关区域的核酸。洗掉未结合的和非特异结合的DNA。在图2C中，将小珠置于另一种基质，例如有序或无序的阵列上。对捕获的DNA进行直接测序，如在图1C和2C中所示。这是通过使用寡核苷酸(其作为引物)的游离3’端，允许在单分子水平上在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP实现的。
[b]RNA分子的直接捕获和实时测序
可使用包含多聚A尾巴的RNA，如在图3B和4B中所示。同时使用包含含有多聚dT的寡核苷酸的基质，例如，阵列(如图3A中所示)或小珠(如图4A中所示)。通过多聚A尾巴与含有多聚dT的寡核苷酸的杂交在基质上捕获RNA，如图3C和4C中所示。洗掉未结合的和非特异结合的RNA，使用多聚dT的游离3’端和逆转录酶将捕获的RNA转化为cDNA。RNA转化为cDNA后，测序cDNA。在测序cDNA的一个实施方案中，将寡核苷酸接头与新合成的cDNA的游离3’端连接，然后使引物与接头退火。使用引物，允许在单分子水平上在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP对cDNA测序。可选地，可使用允许在单分子水平上在cDNA的实时合成期间直接监测加入的碱基和逆转录酶的标记的逆转录酶和标记的dNTP对捕获的RNA直接测序。(见图3C和4C。)
[c]通过相同模板的循环测序测定甲基化状态
为测定DNA(例如，基因组DNA)的甲基化状态，首先将其剪切为合适大小，并优选地转化为单链，如在图5B和6B中所示。使用包含甲基化寡核苷酸(即含有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸)的基质，例如，阵列(如图5A中所示)或小珠(如图6A中所示)。将剪切的DNA与甲基化寡核苷酸连接，如在图5C和6C中所示。然后使用与阵列或小珠上的甲基化寡核苷酸互补的引物，允许在单分子水平上在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP对连接的DNA测序。在对连接的DNA测序后，去除新合成的链，用亚硫酸氢盐处理原始DNA以允许将甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，如在图5D和6D中所示。使用引物，允许在单分子水平上在DNA的实时合成期间直接监测加入的碱基和聚合酶的标记的聚合酶和标记的dNTP对处理的DNA测序。比较相同分子在用亚硫酸氢盐处理前和后得到的序列将允许测定DNA的甲基化状态。
引入本文引用的所有专利和出版物作为参考。

Claims (16)

1.捕获和测序靶核酸分子的方法，其包括：
(a)在杂交条件下将固相支持物暴露于包含靶核酸分子的核酸混合物，其中靶核酸分子与固定在固相支持物上的处于能够引发延伸的构型中的引物形成特异性杂交复合物；
(b)从固相支持物上分离未结合的和非特异性结合的核酸；
(c)在聚合条件下将固相支持物暴露于聚合酶和核苷酸；和
(d)通过检测使用靶核酸分子作为模板，通过聚合酶从固定引物起始的核酸聚合，测定靶核酸分子的核酸序列。
2.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子来自基因组DNA区域。
3.权利要求2的方法，其中所述靶核酸包含外显子的全部或部分。
4.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子是RNA，所述聚合酶是逆转录酶，且所述引物包含3’多聚T序列。
5.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子是DNA，且所述聚合酶是DNA聚合酶.
6.权利要求1的方法，其中所述核苷酸在其末端磷酸上被标记。
7.权利要求6的方法，其中所述聚合酶用FRET供体标记，所述核苷酸用FRET受体标记。
8.权利要求7的方法，其中所述FRET供体是荧光纳米颗粒。
9.测定基因组DNA片段的甲基化状态的方法，所述方法包括：
(a)在固相支持物上固定基因组DNA片段；
(b)通过检测使用固定的基因组DNA片段作为模板，经由聚合酶的核酸聚合，测定固相支持物上固定的基因组DNA片段的核酸序列；
(c)对固定的基因组DNA片段进行亚硫酸氢盐处理；
(d)通过检测使用固定的经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA片段作为模板，经由聚合酶的核酸聚合，测定固相支持物上固定的经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA片段的核酸序列；
(e)比较在(b)中测定的核酸序列和在(d)中测定的序列，其中在基因组DNA片段中胞嘧啶残基的转化指示，这些残基在亚硫酸氢盐处理前在基因组DNA片段中是未甲基化的，其中在基因组DNA片段中不存在胞嘧啶残基转化指示这些残基在亚硫酸氢盐处理前在基因组DNA片段中是甲基化的。
10.权利要求9的方法，其中所述基因组DNA片段通过接头固定至固相支持物。
11.权利要求10的方法，其中所述接头包含引物结合位点，且在引物结合位点中的胞嘧啶是受保护的。
12.权利要求11的方法，其中所述(b)和/或(d)的聚合酶从与引物结合位点退火的引物起始聚合核酸链。
13.权利要求9的方法，其中通过检测标记核苷酸的掺入，检测(b)和/或(d)中的核酸聚合。
14.权利要求13的方法，其中所述标记的核苷酸在其末端磷酸上被标记。
15.权利要求14的方法，其中所述(b)和/或(d)的聚合酶用FRET供体标记，所述核苷酸用FRET受体标记。
16.权利要求15的方法，其中所述FRET供体是荧光纳米颗粒。
CN2011800416596A 2010-08-27 2011-08-25 核酸捕获和测序方法 Pending CN103080338A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40235010P 2010-08-27 2010-08-27
US61/402,350 2010-08-27
PCT/US2011/049151 WO2012027572A2 (en) 2010-08-27 2011-08-25 Methods for nucleic acid capture and sequencing

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103080338A true CN103080338A (zh) 2013-05-01

Family

ID=44545975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800416596A Pending CN103080338A (zh) 2010-08-27 2011-08-25 核酸捕获和测序方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20130324419A1 (zh)
EP (1) EP2609214A2 (zh)
JP (1) JP2013535986A (zh)
KR (1) KR20130101031A (zh)
CN (1) CN103080338A (zh)
BR (1) BR112013002299A2 (zh)
CA (1) CA2803693A1 (zh)
MX (1) MX2013001799A (zh)
RU (1) RU2013113407A (zh)
WO (1) WO2012027572A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166795A (zh) * 2018-11-07 2021-07-23 西门子医疗有限公司 用于检测特定核酸的方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
CA2826131C (en) 2011-02-02 2019-11-05 Jay Ashok Shendure Massively parallel continguity mapping
NO2694769T3 (zh) 2012-03-06 2018-03-03
ES2637538T3 (es) * 2012-07-17 2017-10-13 Counsyl, Inc. Sistema y métodos para la detección de una variación genética
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
EP3919617A1 (en) 2013-03-13 2021-12-08 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
AU2014364926B2 (en) 2013-12-20 2017-12-14 Illumina, Inc. Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic DNA samples
AU2015331739B2 (en) * 2014-10-17 2021-12-02 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
CN107969137B (zh) * 2014-10-17 2021-10-26 伊卢米纳剑桥有限公司 接近性保留性转座
US10006910B2 (en) 2014-12-18 2018-06-26 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same
US9618474B2 (en) 2014-12-18 2017-04-11 Edico Genome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10020300B2 (en) 2014-12-18 2018-07-10 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US9859394B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US9857328B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same
CA2971589C (en) 2014-12-18 2021-09-28 Edico Genome Corporation Chemically-sensitive field effect transistor
US10395759B2 (en) * 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
WO2017201081A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Agilome, Inc. Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
WO2008096146A1 (en) * 2007-02-07 2008-08-14 Solexa Limited Preparation of templates for methylation analysis

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO165894C (no) * 1988-05-24 1991-04-24 Gunnar Paulsen Analysemetode for gener.
WO2008115185A2 (en) 2006-04-24 2008-09-25 Nimblegen Systems, Inc. Use of microarrays for genomic representation selection
WO2008103848A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Invitrogen Corporation Materials and methods for single molecule nucleic acid sequencing
CN101802223A (zh) * 2007-08-15 2010-08-11 香港大学 用于高通量亚硫酸氢盐dna-测序的方法和组合物及其用途
US20110281740A1 (en) 2008-06-30 2011-11-17 Joseph Beechem Methods for Real Time Single Molecule Sequencing
US8795961B2 (en) * 2008-09-05 2014-08-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Preparations, compositions, and methods for nucleic acid sequencing
US20120149593A1 (en) 2009-01-23 2012-06-14 Hicks James B Methods and arrays for profiling dna methylation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
WO2008096146A1 (en) * 2007-02-07 2008-08-14 Solexa Limited Preparation of templates for methylation analysis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
詹绍康等: "《实用医学统计方法》", 30 November 1999, 上海科学技术文献出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166795A (zh) * 2018-11-07 2021-07-23 西门子医疗有限公司 用于检测特定核酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012027572A2 (en) 2012-03-01
WO2012027572A3 (en) 2012-06-07
JP2013535986A (ja) 2013-09-19
BR112013002299A2 (pt) 2016-05-24
EP2609214A2 (en) 2013-07-03
US20130324419A1 (en) 2013-12-05
MX2013001799A (es) 2013-05-20
CA2803693A1 (en) 2012-03-01
RU2013113407A (ru) 2014-10-10
KR20130101031A (ko) 2013-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103080338A (zh) 核酸捕获和测序方法
JP7137595B2 (ja) 化学組成物とそれを利用する方法
US20220042090A1 (en) PROGRAMMABLE RNA-TEMPLATED SEQUENCING BY LIGATION (rSBL)
JP6571895B1 (ja) 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法
CN113557306A (zh) 检测rna的方法
JP2021503969A (ja) 出現（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ）による核酸のシーケンシング
WO2022226057A1 (en) Methods for assessing sample quality prior to spatial analysis using templated ligation
EP2633067B1 (en) Luminophore-labeled molecules coupled with particles for microarray-based assays
KR20190012184A (ko) 샘플 중 표적 핵산을 검출하는 방법
ES2940071T3 (es) Componentes y procedimientos de amplificación isotérmica
JP2017516487A5 (zh)
CA2892646A1 (en) Methods for targeted genomic analysis
EP4372102A2 (en) Target reporter constructs and uses thereof
WO2009029742A1 (en) A universal ligation array for analyzing gene expression or genomic variations
CZ20023749A3 (cs) Způsob detekce a pár sond tvořených nukleovou kyselinou
CN104726549A (zh) 一种基于切刻酶的双链核酸等温扩增检测新方法
CN111849965A (zh) 用于减少偏向性的多核苷酸衔接子设计
CN113528628A (zh) 用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法
JP2022534920A (ja) 出現による配列決定
CN105002285A (zh) 微小rna的液态芯片恒温检测方法
JP2009225759A (ja) メチル化されたｄｎａの含量を測定する方法
JP2022534440A (ja) 生体分子のデジタルマルチプレックス検出および／または定量化の方法ならびにその使用
US20240167088A1 (en) Methods and devices of generating clusters of amplicons
WO2015193483A1 (en) Restriction mediated quantitative polymerase chain reactions

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1184831

Country of ref document: HK

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130501

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1184831

Country of ref document: HK