CN113557306A - 检测rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测样品中靶标RNA的方法，该方法包括使用发夹探针，所述探针在与其靶标RNA序列结合时解折叠露出3’端区域，所述3’端区域首先能够结合环形或可环化探针并在必要时作为可环化探针连接从而令探针环化的模板，并且能够引发后续环化/环形探针的RCA反应。然后，对环化或环形探针进行RCA并检测RCA产物，由此检测靶标RNA。还提供了用于实施这种方法的探针和试剂盒。

Description

检测RNA的方法
本发明涉及细胞样品中RNA尤其是mRNA的检测。更具体地，本发明涉及RNA尤其是mRNA的原位(in situ)定位检测。本发明将用杂交探针检测靶标RNA与滚环扩增(RCA)信号放大相组合，并依赖于如下所述的发夹探针：所述探针在与其靶标RNA杂交后解折叠从而露出一段序列，该序列可以作为环形或可环化探针(例如挂锁探针)的结合位点并可作为所述环形或可环化探针滚环扩增(RCA)的引物。
通常希望能够灵敏地、特异性地、定性地和/或定量地检测样品(包括例如固定化的或新鲜的细胞或组织)中的RNA，特别是mRNA。这具有多领域的实用性，不仅包括受人关注的临床诊断性和预后性检测，而且包括检查不同类型细胞中的RNA表达来进行不同细胞亚类的识别和分类，特别是在脑中。因此，特别希望能够实现单细胞mRNA检测。例如，在对众多细胞进行分析的群检测中，稀有细胞中的分子会漏检。而且，这样的检测无法提供测得分子的细胞来源信息。单细胞内的表达会与异质细胞群的测得平均表达显著不同。还希望能够进行单分子灵敏度的单细胞研究从而能够研究表达转录本的序列变化和波动。已有人用荧光原位杂交(FISH)来进行mRNA单分子原位检测。该技术虽然可以确定单细胞中的转录本拷贝数，但不能分辨高度相似的序列，因此不能用于研究例如等位基因失活或剪接变异，不能实现基因家族成员之间的区分。
尽管如此，FISH已被用来定量检测肿瘤样本中的临床相关生物标志物。尤其，单分子RNA FISH(smFISH)是一种多功能分析，能够高度特异性地检测单个RNA分子。smFISH中，一组各自直接偶联了单个荧光团的寡核苷酸(通常为30-50个长度为20个核苷酸的寡核苷酸)先与互补RNA靶标杂交。然后用宽视野荧光显微镜将各个转录本可视化为有限衍射点，并量化(Raj等，2008，Nat Methods，5，877-879)。或者，smFISH探针可以不直接偶联荧光标记物而携带一段10-30核苷酸长度的通用突出端序列，该通用突出端序列可用通用荧光偶联检测探针来杂交检测。最近，smFISH技术被用于定量检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品中两种显性乳腺癌生物标志物和药物靶点即表皮生长因子受体2(HER2)和雌激素受体1(ER)的表达和局部解剖学分布。另一项研究中，对小鼠脑切片进行smFISH来进行细胞类型特异性标志基因的基因表达定量。为了分析同一组织切片中的数个标志基因，如下依序进行smFISH：首先添加针对3个基因的smFISH探针组，所述探针各自以不同的荧光报道子标记，然后进行smFISH信号荧光成像，去除smFISH探针或荧光标记，然后用针对另3个基因的不同的另一组smFISH探针或探针标记进行杂交并进行smFISH信号成像。然而，这种方法的一个主要限制是FFPE样品的smFISH信号很弱而背景荧光很高(根据组织类型、样品年龄和固定情况差异很大)。因此，需要在高放大比(60X-100X)下成像。结果，通常样品只有很小区域成像(通常为40-50个视野)，由此限制了测定样品内基因表达差异的能力。这对于可能存在表达异质性(例如不同细胞或组织区域之间表达异质性)的情况例如肿瘤的分析是不利的，越来越发现大多数癌症类型具有高度的瘤内异质性，生物标志物表达细胞的空间分布也可能代表着某种预后或预测因素。因此希望开发一种方法不仅能够定量测定样品中RNA分子的表达从而提供丰度指标，并且能够反映出样品内RNA的空间分布和异质性。
与smFISH相比，其他方法如RNAscope(Wang F等，2012，JMD 14，22-29)、挂锁探针滚环扩增(RCA)(Nilsson M等，2002，Human mutation 19，410-415)和单分子杂交链反应(smHCR)(Crosetto等，2015，Nature reviews Genetics，16，57-66)包括一个或多个信号放大步骤，产生更亮的荧光信号和更高的信噪比(SNR)。然而，这些方法都有一些缺陷限制了它们对于评估原位样品中基因表达差异的应用。smFISH和RNAscope针对每个靶标需要大量的探针，并且RNAscope探针的设计不是开源的。另外，RNAscope的灵敏度比smFISH低。基于挂锁探针的RCA在特异性和灵敏度方面具有优势，可用于提供原位定位(localised)检测。虽然用于DNA靶标运行良好，挂锁探针直接用于RNA靶标却存在问题。已记载有这样的技术，其中，首先将RNA靶标转化为cDNA，然后用挂锁探针靶向所述cDNA，再用RCA原位扩增(Larsson等，2010，Nat Methods)。原位测序(ISS)中，挂锁探针带有条码或者挂锁探针以cDNA为模板缺口填平，然后通过RCA原位扩增，随后对带RCA产物的组织切片用下一代测序化学进行直接原位测序(Ke等，2013，Nat Methods)。但是，RNA转化成cDNA和cDNA后定靶限制了该方法的灵敏度，是主要缺点；最近有研究报道了基于RCA在单细胞内直接检测mRNA，但检测效率仍然很低(Deng等，2017，Chemical science 8，3668-3675)。荧光原位测序(FISSEQ)是另一种原位测序方法，其中，RCA产物(RCP)由自环化cDNA以非靶向方式产生，然后用SOLiD技术原位测序(Lee JH等，2014，Science，343，1360-1363)。然而，FISSEQ的灵敏度也低，且有高丰度转录本偏性。最后，smHCR受限于低特异性，这是由于smHCR发夹会在样品内非特异性结合继而扩增。为了破坏非-特异性结合的稳定性，smHCR通常在非常严谨杂交条件下进行，但这限制了可有效检测的RNA分子的数量(Choi HM，Beck VA，Pierce NA，2014，ACS nano，8，4284-4294)。
因此需要更好的方法通过高灵敏度、尤其原位高灵敏度检测RNA并能够确定空间分布的方式来定量检测基因表达。本发明旨在解决这种需要，并克服前述方法的缺陷。
开发了一种方法，它结合了smFISH的多功能性和灵敏度以及RCA的信号放大功能。如本领域众所周知的，RCA产生长多联核酸产物，其中包含环形RCA模板例如环化挂锁探针或其它环形探针的多个串联重复互补拷贝。这样的RCA产物(RCP)缠绕成容易检测的DNA束或DNA“团(blob)”，例如通过加标检测探针与RCP杂交后显微镜或流式细胞术可视化来检测。尤其，利用RCA的信号生成和放大机制，本发明方法能够实现对全组织切片的单细胞分辨率的RNA靶标可视化和量化，样品面积远远大于目前标准smFISH之所及，同时，使用的探针数量则显著低于标准smFISH。此外，通过使用结合靶标RNA时打开然后能用挂锁探针(或其他探针，例如环形探针)靶向的发夹探针，首先不再需要将RNA转化成cDNA，其次显著降低挂锁探针或其他探针非特异性结合触发RCA反应的频率，因为发夹探针只有在特异性结合其靶序列并解折叠时才可能结合挂锁探针或其他探针。
根据本发明的方法，首先用一个或多个如下所述发夹探针靶向RNA，所述探针在结合其靶标RNA序列时解折叠露出3’端区域，该区域首先能够结合挂锁探针或其他环形或可环化探针并在必要时作为其连接的模板来使探针环化，其次能够随后引发环化/环形探针的RCA反应。然后，用挂锁(或其他)探针靶向结合靶标后露出的发夹探针3’端区域。可环化探针例如挂锁探针与发夹探针杂交使得探针能够通过探针末端的连接而环化。然后，对环化的挂锁探针或其他探针或其他环形探针进行RCA并检测RCP。RCP定位于靶标RNA，因为它是发夹探针的延伸，发夹探针仍与靶标RNA保持杂交。虽然特别适合原位(in situ)应用，该方法可以有更普遍的应用，包括均质模式或“溶液中(in soluion)”模式。
因此，可以看出，在第一个方面，本公开和本发明提供一种检测样品(包括例如细胞样品)中靶标RNA的方法，包括：
(a)将所述样品与至少一种靶标特异性发夹探针接触，所述探针包括：
(i)第一结构域，其包含与所述靶标RNA中的靶序列互补的第一区域并且能够与所述靶标RNA杂交；
(ii)第二结构域，其不能与所述靶标RNA杂交，其包含与同源环形或可环化探针互补的第二区域，并且能够作为RCA反应的引物；
其中，所述第二结构域至少部分包含在所述探针的发夹结构之内，从而使得所述第二结构域在从所述发夹结构中释出之前不能结合所述同源环形或可环化探针和/或引发RCA反应，以及让所述发夹探针与所述靶标RNA杂交，其中所述第一结构域与所述靶序列杂交引起所述发夹结构打开并释出所述第二结构域；
(b)令所述样品接触与所述发夹探针同源的环形或可环化探针，其中，所述环形或可环化探针包含一个或多个与所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的区域，并将所述环形或可环化探针与所述发夹探针在所述第二结构域杂交，其中，如果所述探针是可环化探针，它包含与所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的3’端和5’端区域从而所述末端并排杂交以实现直接或间接地彼此连接；
(c)如果所述探针是可环化探针，令所述可环化探针的末端直接或间接连接来环化可环化探针，由此提供RCA反应模板；
(d)用(b)中所述环形探针或(c)中所述RCA模板进行RCA反应，其中，由所述第二结构域引发所述RCA反应；以及
(e)检测所述RCA反应的产物。
实施方式之一中，步骤(a)中可以使用一组发夹探针，所述探针组包含两个或更多发夹探针，各个发夹探针特异性针对所述靶标RNA中的不同靶序列，组内各个发夹探针的第一结构域包含与不同靶序列互补的区域。这因此允许多个环形或可环化探针通过多个发夹探针间接结合靶标RNA，因此对于要进行的多个RCA反应而言，增加了来自RCA产物的信号。
实施方式之一中，环形或可环化探针是可环化探针，尤其，是挂锁探针。可环化探针例如挂锁探针可以一个或多个部件的形式提供，可以以这种方式与所述第二结构域杂交：所述探针或探针部件的各个末端并排以便彼此连接从而令探针环化。
具体实施方案之一中，所述方法用于样品中靶标RNA的定位原位检测。
本公开和本发明的另一方面提供一种用于检测靶标RNA分子的发夹探针，所述探针包含：
(i)第一结构域，其包含与所述靶标RNA中的靶序列互补的第一区域并且能够与所述靶标RNA杂交；
(ii)第二结构域，其不能与所述靶标RNA杂交，其包含与同源环形或可环化探针(例如挂锁探针)互补的第二区域，并且能够作为RCA反应的引物；
其中，所述第二结构域至少部分包含在所述探针的发夹结构之内，从而使得所述第二结构域在从所述发夹结构中释出之前不能结合所述同源环形或可环化探针和/或引发RCA反应，其中所述发夹结构使得所述第一结构域与所述靶序列杂交引起所述发夹结构打开并释出所述第二结构域。
本公开和发明还提供一种探针组，包含两个或更多如上所述的发夹探针，各探针对同一靶标RNA内不同的靶序列具有特异性，组中各发夹探针的所述第一结构域具有与所述靶标RNA内不同靶序列互补的区域。
本公开和发明还提供一种试剂盒，其包括：
(i)本文所定义的靶标特异性发夹探针或探针组；和
(ii)与所述发夹探针同源的环形或可环化探针(例如挂锁探针)，或与所述探针组中多个发夹探针同源的多个环形或可环化探针(例如挂锁探针)，各环形或可环化探针包含一个或多个与所述发夹探针的所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的区域，如果所述探针是可环化探针，它包含与所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的3’端和5’端区域从两端并排杂交以实现直接或间接地彼此连接。
本发明的方法依赖于滚环扩增产物(RCP)的检测来检测靶标RNA。RCP的产生是环形或可环化探针(例如挂锁探针)间接识别靶标RNA引起的；环形或可环化探针不与靶标RNA本身结合，而是与中间的发夹探针结合，发夹探针本身与靶标RNA结合并且在结合靶标时解折叠而释出(例如暴露)可环化(如挂锁探针)探针的结合位点及适当情形下的连接模板。对环形探针或连接环化所得环化探针进行RCA。通过提供各自靶向靶标RNA分子内不同序列的多个(即两个或更多)发夹探针，可有多个环形或可环化探针与靶标RNA间接杂交，由此发生多个RCA反应，产生都定位于靶标RNA分子的多个RCP。RCP易于检测和可视化，由此可以方便地将样品中的靶标RNA可视化。
本发明的方法中，发夹探针包含这样的结构域(第二结构域)：它既是环形或可环化探针的结合位点并且因此在适当时还是其连接模板，而且是RCA反应的引物。然而，在发夹探针与靶标RNA分子相互作用即杂交之前，包含引物序列的发夹探针3’端被保护在发夹探针的发夹结构内部因而不能与环形或可环化探针杂交或引发RCA反应。“能够作为引物”表示所述结构域具有3’端并且在与模板分子(此处即环形或环化探针)杂交时能够被聚合酶延伸。
在能令发夹探针与其靶标RNA分子杂交的条件下与样品接触后，发夹结构能够被打开，即解折叠，从而释放出第二结构域，所述第二结构域包含环形或可环化探针的结合位点和作为RCA引物的序列。本文中，“释(放)出”广义地表示所述第二结构域从发夹结构中释放出来，即探针构象改变使得第二结构域不再被包在发夹结构之内。更具体地，即使得第二结构域能够发挥功能。尤其，这包括使探针的3’端能够作为环形或环化探针(可环化探针连接而成)RCA的引物。释放可包括第二结构域就结合环形或可环化探针而言变得可及，或者促进了与环形或环形探针的结合。由此可以发现，发夹探针的打开可产生一个突出端或单链区，即未与靶标RNA杂交的探针区域。
环形或可环化探针之于RCA反应的应用是本领域熟知的。因此，可用预先形成的核酸环作为基于RCA的信号产生过程的一部分。因此，实施方式之一中，环形探针可以是简单的预先形成的环。可环化探针包含一段或多段线性寡核苷酸，它们可以连接在一起而成环。可环化探针的典型例子是挂锁探针，实际上，可环化探针可视为或另称为挂锁探针。挂锁探针公知且常用，在现有技术中多有记载和描述。挂锁探针的原理因此是清楚的，其设计和使用在本领域中是已知的、有记载的。挂锁探针通常为线性可环化寡核苷酸，有游离的5’端和3’端可用于连接从而形成环形构象。可以理解，为了发生环化(连接)，挂锁探针有游离的5’磷酸基团。为了让挂锁探针的末端并排以便连接，将挂锁探针设计成在其5’端和3’端具有与其靶序列(在此即发夹探针第二结构域中所述互补性的第二区域)互补的区域。于是，这些互补性区域允许挂锁探针通过与靶标内的特定序列杂交而特异性地与其靶序列结合，并且，通过所述杂交，挂锁探针的末端得以并排以便连接。连接可以是直接的或是间接的。换言之，挂锁探针的末端可以直接彼此连接，也可以与居间核酸分子/核苷酸序列连接。因此，挂锁探针的末端区域可以与第二结构域中的相邻或相连区域互补，或者，它们也可以与第二结构域的非相邻(非相连)区域互补(这种情形下，为了发生连接，杂交挂锁探针两端之间的“缺口”由居间分子/序列填平)。这可以根据本领域众所周知的原理来实施，或者通过用聚合酶进行挂锁探针杂交3’端的延伸(以第二结构域作为延伸反应的模板)，或者通过将一个或多个缺口(gap)寡核苷酸杂交在杂交的3’端和5’端之间。因此，挂锁探针可以以2个以上部件的形式来提供，并且可以有不止一个连接反应来使其环化(例如，缺口寡核苷酸的末端各有一个连接接头，分别使它与挂锁探针的第一“骨架”寡核苷酸连接，后者因此有两个杂交末端)。
具体实施方式中，挂锁探针不具有二级结构，尤其，不含分子内双链区和茎环结构。然而，哑铃探针是可环化探针的具有二级结构的替代类型。可将哑铃探针视为挂锁探针的特定亚型。哑铃探针的记载可见Zhou等，Nucleic Acids Research，2010，38(15)，e156。哑铃探针有两个茎环结构，茎与茎相合，“环”中之一不闭合，有游离的5’端和3’端供彼此连接之用。这种“开口环”的作用是作为探针的靶标结合域。闭合环的作用简单，即作为间隔序列令双链体(茎区)的末端相连。换言之，可将其视为具有挂锁内互补序列(区域)之间形成的双链体区的挂锁探针。该双链体区的功能是作为信号传导结构域，嵌入剂会结合于此。因此，哑铃探针的“开口环”可包含多个与发夹探针第二结构域互补的区域，换言之，它可以包含与第二结构域中所述互补性的第二区域互补的5’端和3’端区域。
可环化(如挂锁探针)探针的对应5’端和3’端或其部分以解折叠的发夹探针为连接模板彼此连接，从而形成RCA反应的环形模板。
“可环化”表示构成可环化探针的寡核苷酸呈线性分子的形式，具有可连接末端，该线性分子可通过末端直接或间接连在一起即彼此相连而环化，或者通过末端分别与居间(“缺口”)寡核苷酸的对应末端相连或与可环化寡核苷酸的延伸3’端相连而环化。
与发夹探针同源的环形或可环化探针表示其对所述发夹探针有特异性，或者换言之，它能够特异性地结合该(同源)发夹探针尤其是其第二结构域。因此同源环形探针具有与发夹探针第二结构域中对应同源互补区(或结合位点)互补的区域。同源可环化探针在其3’和5’端分别具有与作为连接模板的发夹探针的第二结构域中相应的同源互补区(或结合位点)互补的区域。因此，在探针可环化的情况下，发夹探针第二结构域中所述互补性的第二区域至少有两个子区域分别与可环化探针(例如挂锁探针)的3’端和5’端区域互补，所述子区域可以是相邻的，此时可环化探针的末端直接彼此相连，也可以是非相邻的，存在有居间“缺口”序列，此时发生的是间接连接。换言之，互补的第二区域可划分。
由于本方法需要环形或可环化探针与解折叠的发夹探针结合并且在适当情形下在该探针上连接形成RCA模板，除非环形或可环化探针已与解折叠的发夹探针杂交即除非发夹探针已与其靶标杂交并打开，不会发生RCA反应。因此，RCA反应取决于发夹探针的结构，因此取决于RNA靶序列的存在。这样可以提高方法的特异性。
方法的步骤可以依次进行，或者某些步骤可以同时进行。例如，步骤(a)和(b)的接触可以同时进行，即发夹探针和环形或可环化探针可同时加入样品，但可以看出，各种杂交将依次发生，即发夹探针先与其靶序列杂交，发夹打开，然后环形或可环化探针与打开的发夹杂交。类似地，连接试剂与可环化探针可以一起加入样品。这样，步骤(b)和(c)可以同时进行，尽管可以看出，可环化探针(挂锁探针)先与发夹探针释出的第二结构域杂交，然后发生连接。然而，在实践中可能希望在上述的一个或多个步骤之间包括一个或多个洗涤步骤。例如，在发夹探针杂交之后，样品可以洗涤一次或多次，然后再与环形或可环化探针以及适当情形下会有的连接试剂接触，并孵育以进行连接。
可用洗涤步骤来提高特异性，例如在发夹探针杂交之后，和/或在环形或可环化探针杂交和/或连接步骤之后包括一个或多个洗涤步骤。这在固相或固定化模式下通过洗去所有未结合和/或未连接的反应物即可实现。因此，没有RNA靶标的情形下，环形或可环化探针没有“结合性靶标”(即没有解折叠的发夹探针)，于是不会通过与其靶标结合而固定化，于是被洗掉。如此，如果RNA靶标不存在就没有可用于RCA反应的RCA模板。
因此，实施所述方法时可以在步骤(d)的RCA反应之前去除未结合的环形或可环化探针。这很容易，例如以固相模式实施所述方法并在添加环形或可环化探针及杂交步骤(步骤(b))之后进行洗涤。作为替代或在此之外，可以在连接步骤(c)之后进行洗涤例如严谨性洗涤，从而除去所有未连接的探针。
本发明的方法是用于检测RNA的。尽管特别适用于mRNA，但所述方法可用于检测细胞中存在的任何RNA分子，包括但不限于病毒RNA、tRNA、rRNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、反义RNA和非编码RNA。
为了检测miRNA或其他小RNA分子，可以对每个靶标RNA分子只使用一个发夹探针。对于较长的RNA分子，特别是mRNA，较好的是使用包含多个发夹探针的探针组，其中每个发夹探针各自靶向靶标RNA分子内不同的靶序列。尤其，不同的靶序列不重叠。如上所述，“多”表示数量为二或更多，尤其是3或4或更多，例如2-50、2-40、2-30、2-20、2-10、2-8、2-6、或2-5。代表性实施方式之一中，可采用每个靶标RNA分子3-6个发夹探针。另一代表性实施方式中，可采用20-50个发夹探针。数值可以是以上任何下上限整数之间的值，这些仅是举例。
因此，靶标RNA即要检测的RNA分子，或者换言之即检测中的分析物。本发明方法可以复式(in multiplex)运行以检测两种或更多种不同的靶标RNA。对于各个不同的靶标RNA使用不同的发夹探针或探针组。因此，样品可以与多个不同的发夹探针或探针组接触，各个发夹探针或探针组具有针对不同靶标RNA的特异性。在这样的复式实施方式中，各个靶标特异性探针组内的发夹探针各自具有对相应靶标RNA内不同靶序列的特异性。靶序列是靶标RNA内发夹探针所结合的序列。如后文所详细描述的，使用发夹探针探针组靶向多个不同靶序列的情形下，环形或可环化探针可设计成报道靶标RNA或报道靶标RNA内的靶序列。换言之，环形或可环化探针产生的信号可以是唯一针对特定靶序列的，或者可以是探针组中所有探针共同的信号，这样即探针组内发夹探针所结合的所有靶序列共同的信号，但针对不同靶标RNA的不同探针组之间是可区分的。(这样，用于给定探针组的环形或可环化探针可以是该组发夹探针共同的或是各发夹探针独有的)。因此，在某些实施方式中，举例来说，如果要检测靶分子中的特定靶序列，例如检测剪接变体或同种型，则靶序列本身可以是检测的分析物。
本文中，术语“检测”广义地用来包括测定靶标RNA存在情况(即它是否存在)或靶标RNA任何形式量度指标的任何手段。因此，“检测”可包括以任何方式确定、测量、评估或分析靶标RNA的存在或不存在或数量或位置。包括定量和定性的测定、测量或评估，包括半定量。此类测定、测量或评估可能是相对的，例如检测样品中两个或更多不同靶标RNA时，或者是绝对的。因此，就样品中靶标RNA的定量而言，术语“定量”可以指绝对定量或相对定量。绝对定量可通过纳入一种或多种已知浓度的对照RNA并且/或者将靶标RNA的测得水平与已知对照RNA相比照(例如通过产生标准曲线)来实现。或者，相对定量可通过将两种或更多不同RNA的测得水平或测得量彼此比较从而得出两种或更多不同RNA各自的相对量，即相对于彼此的相对定量。
实施方式之一中，所述方法可用于靶标RNA的定位检测。“定位(localised)”检测表示引起RNA检测的信号定位于该RNA，在此，RCP定位于靶标RNA。因此，RNA可以在样品中其所在位置或区域内被检测。换言之，可以测定(或“检测”)样品中RNA的空间位置(或定位)。这表示，可将RNA定位到表达该RNA的细胞或细胞内定位，或定位到细胞或组织样品内的位置。因此，“定位检测”可包括以任何方式测定、测量、评估或分析RNA的存在或数量和位置或不存在。具体实施方式之一中，所述方法和探针可用于定位尤其是原位检测mRNA。更为特定的，所述方法和探针可用于细胞样品中mRNA的定位检测，特别是原位定位检测。
本文中，术语“原位(in situ)”指原生状态靶标RNA的检测，即在其通常所在的细胞或组织内。因此，这可以指天然或原生的靶标RNA定位。换言之，可以检测在其原生环境中或情形下的RNA。因此，RNA未离开其常规位置，即未被分离或纯化或转移到其他位置或介质等等。通常，该术语指出现于细胞内或出现于细胞或组织样品内的RNA，例如，其在细胞或组织内的原生位置和/或其常规或原生细胞环境内的原生位置。尤其，原位检测包括检测组织样品例如组织切片中的靶标RNA。其他实施方式中，所述方法可对分离的细胞样品实施，此时细胞本身不在原位。
其他实施方式中，检测不是定位的，或者，不是原位的。另一些实施方式中，实施方法可以在溶液中进行。尤其，RNA可以包含于溶液中。这样，举例来说，可以对包含分离RNA的样品实施所述方法。
所述样品可以是任何含RNA样品。它可以包含细胞来源的RNA。实施方式之一中，样品可以是细胞样品，或是含细胞物质的样品，或是源自细胞样品的样品。所有生物样品和临床样品都包括在内，例如生物体的任何细胞或组织样品，或其任何体液或其体液的制备物，以及细胞培养物、细胞制备物、细胞裂解物等样品。还包括环境样品，例如土壤和水体样品或食物样品。样品可以是新鲜制备的，也可以经任何方便的方式预先处理过(例如为了储存)。
样品可以是生物样品，其可以包含任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。此类生物样品因此可以包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类(包括蓝绿藻)、真菌、细菌、原生动物等等。细胞可以是例如人类细胞、禽类细胞、爬行动物细胞等，没有限制。样品可以是为了用于本发明的方法而经任何方便或期望的方式预处理过的。样品可以进一步包含分离的核酸或分离的RNA，或实际上合成的RNA。
就定位原位检测而言，样品可以是其中可能存在RNA分子的任何细胞样品，只要这种样品适合进行定位原位检测。通常，样品可以是任何可能存在RNA的生物、临床或环境样品，特别是其中RNA在其中存在于固定、可检测或能够可视化的位置的样品。因此，样品将是反映常规或原生(“原位”)RNA定位的任何样品，即RNA通常或天然存在于其中的任何样品。较好的是，此类样品是或包含细胞或细胞组，例如组织。特别优选的是例如培养的或收获的或活检细胞或组织样品之类的样品，其中可以检测RNA来揭示RNA的定性性质，即它是否存在，或RNA的核苷酸序列或RNA内一个或多个核苷酸的存在情况和/或鉴定信息，以及相对于细胞其他特征的定位。细胞样品可以是新鲜制备的或经任何方便的方式预处理过的，例如固定或冷冻。因此，可以使用新鲜、冷冻或固定的细胞或组织，例如FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)组织。样品可以包含任何含RNA的细胞类型，包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类(包括蓝绿藻)、真菌、细菌、原生动物等等。
因此，代表性样品包括临床样品，例如全血和血液衍生品、血细胞、组织、组织活检，以及其他样品，例如细胞培养物和细胞悬液等。
原位检测的代表性样品可包括固定组织切片、新鲜冷冻组织或包含一个或多个细胞的细胞学制备物。可对样品进行透化以令RNA可及。细胞透化的适宜手段是本领域公知的，包括例如采用除垢剂，例如适当稀释的Triton X-100溶液，例如0.1％Triton X-100，或Tween，0/1％Tween，或酸处理(例如用0.1M HCl)。组织样品的透化还包括用一种或多种酶来处理样品，例如胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶原或链霉蛋白酶等。此外，可如本领域中所记载对样品进行微波处理。
还可以对样品进行处理从而令细胞中所含的RNA固定于样品，例如令其固定于细胞基质。此类过程是本领域已知的，有记载的。例如，在原位杂交领域，将mRNA固定于细胞的试剂是已知的。特别是，RNA的5’磷酸基团可通过EDC介导的偶联(EDC：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)与细胞基质中蛋白质上的胺相连，由此协助保持RNA相对于其他细胞组分的定位。这种技术先前被记载用于微小RNA及其原位杂交检测(Pena等，(2009)，Nat.Methods，6(2):139-141)。
发夹探针具有发夹结构，其至少部分包含了探针的第二结构域。尤其，第二结构域可以完全包含在发夹结构内。发夹结构也可以被称为发夹-环或茎-环结构，这些术语可以互换。发夹探针具有至少一个发夹结构，通常它可以具有单个发夹结构。当同一条链的两个区域，通常是反向阅读时核苷酸序列互补的两个区域，碱基配对形成双链体并最后形成未配对的单链环时形成发夹。因此，发夹探针包含两个相互互补的区域，它们彼此杂交形成茎环结构。
相互互补的区域分别位于或趋近发夹探针的5’端和3’端。实施方式之一中，第一相互互补区域位于探针5’端的内部，而第二相互互补区域位于探针的3’端，由此形成探针5’端有单链区的发夹结构。另一实施方式中，两个相互互补区域都位于探针的5’端和3’端，这样两个末端区域都形成茎区的一部分。
因此，根据本文所述的方法和探针，发夹探针可以是寡核苷酸，至少其5’端区域的部分能够与所述寡核苷酸3’端的区域杂交使得所述寡核苷酸形成发夹结构。
因此，实施方式之一中，发夹结构从5’至3’包含：
(i)5’端的单链区；
(ii)第一茎链区；
(iii)单链环区；和
(iv)3’端的第二茎链区。
另一实施方式中，可以没有5’单链区。
发夹探针可以不同方式构造从而让使得第一和第二结构域可以完全或部分位于发夹结构的环区或茎区或两者之内。在这方面可以理解的是，第一和第二结构域在探针内是隔开的，不重叠，因此不会同时位于发夹探针的同一区域中。
具体实施方式之一中，结合靶标的第一结构域可以部分位于5’单链区。
因此，实施方式之一中，探针组每个成员的第二结构域包含能够与第一结构域中靶序列互补区域至少一部分杂交的序列，由此使得所述第一和第二结构域各自有部分包含在发夹结构的茎区中。发夹探针的此类代表性实施方式之一中，第二结构域可以部分位于茎区、部分位于环区。第一结构域可部分位于5’单链区、部分位于茎区。这样，茎区的第一链可包含部分第一结构域，第二链可包含部分第二结构域。
此类实施方式中，包含与靶序列互补的第一区域的第一结构域可包含发夹探针5’单链区的全部或部分以及第一茎链区的至少一部分。单链区或其部分可作为结合靶标RNA的立足点(toehold)。这样的构造如图2和图3中所示。第一结构域可以包含至少一部分5’单链区和第一茎链区。因此，该实施方式中，靶标RNA首先结合到探针的立足点。这导致发夹的茎区打开，露出第一结构域的其余部分，使得探针能够结合第一结构域。这打开露出环结构和第二茎链中的第二个结构域。由于第二结构域既在茎区又在环区，在发夹打开之前，互补性的第二区域对于环形或可环化探针的结合而言不可及。在这方面，本领域技术人员知道如何设计互补区域以利一种杂交优先于另一种杂交，例如基于茎区长度、茎区和/或环区等的GC含量、结合位点(互补区域)中的错配等。因此，发夹探针及其同源环形或可环化探针可以被设计成在发夹通过结合靶标而打开之前环形或可环化探针无法杂交。作为替代或者在此之外，该实施方式中，可在添加环形或可环化探针之前进行洗涤步骤来去除未与靶标RNA杂交的发夹探针。
可以理解的是，这样的构造中，第二结构域与包含靶标结合位点的第一结构域至少部分互补。这样，可以看出，第二结构域包含与靶序列具有同源性(或序列同一性)的区域。与发夹探针同源的环形或可环化探针因此反映发夹探针的靶序列(更具体地，环形或可环化探针中与第二结构域互补的互补区域也与靶标RNA中的靶序列互补)。实际上，环形或可环化探针中与第二结构域(更具体地，第二结构域中与第一结构域中的靶标结合位点互补的区域)互补的该区域可作为所述环形或可环化探针的报道域，因为它反映同源发夹的靶序列。报道域将在后文进一步说明。
适当设计试剂和/或反应条件，例如利用分子内杂交与分子间杂交的稳定性差异、杂交长度差异和可能引入的使得非期望杂交失稳的错配，可以尽可能减少各种不期望发生的环形或可环化探针与靶标RNA的杂交。
此类实施方式的变换之一中，第二结构域可以仅位于发夹结构的环区内。因此，发夹探针的第二种代表性实施方式中，第一结构域包括5’单链区的全部或一部分以及发夹探针第一茎链区的至少一部分(例如整个第一茎链区)。单链区或其部分可以如上所述作为结合靶标RNA的立足点，而靶标RNA与第一结构域的结合令发夹打开。第二结构域包含全部环区，或更好的是包含环区的一部分。发夹的打开可以促进环形或可环化探针与第二结构域的结合。虽然在某些情况下探针可能与未打开的发夹探针的环区结合(例如，没有靶标的情况下，或与未杂交的发夹探针)，这种环形或环化探针的RCA不会发生，因为发夹探针的3’端无法与环形或环形探针杂交，无法引发RCA。这种探针设计如图6A所示。
发夹探针另一个即第三种代表性实施方式中，第一结构域可以位于发夹结构的环区，探针可以设计成使得发夹探针与其靶序列的杂交导致发夹探针打开，令茎区从双链体中释放出来。这种构造中，发夹探针可以采用没有单链末端区的茎环结构形式，即探针的5’和3’端区域都在茎区中杂交在一起。因此，实施方式之一中，发夹结构从5’至3’包含：
(i)5’端的第一茎链区；
(ii)单链环区；和
(iii)3’端的第二茎链区域。
第二结构域可以位于发夹探针的3’端区域，形成发夹探针的茎区双链体。这样，发夹探针的第二结构域可以在发夹探针结合时被释放，由此可被环形或可环化探针结合。这样的构造如图4和6B所示。
这样的设计中，以及图6A所示第二种代表性实施方式中，第二结构域可以设计成与靶标RNA没有序列同源性(即同一性)，也不与第一结构域互补，即它独立于探针的靶标RNA或第一结构域(换言之，它与靶标RNA没有序列关系(即与其正交)，与第一结构域也没有序列关系)。相应地，在发夹探针组中，探针组中各个发夹探针的第二结构域可以是相同的(即，发夹探针组各个成员的第二结构域可以是相同的)。好处在于，这意味着对于发夹探针组的每个成员可采用相同的环形或可环化探针。换言之，一个环形或可环化探针可以与发夹探针组的全体成员同源。这亦如图6A所示。如后文所述，这意味着可以使用共同的环形或可环化探针，并可产共同的信号。这样的实施方式中，共同信号是累积信号，来自与靶标RNA中不同靶序列结合的所有发夹/环形或可环化探针。在检测多个RNA靶标的复式实施方式中，不同的发夹探针组各自对不同的靶标具有特异性，各探针组有其自己的可识别的同源环形或可环化探针。
或者，如后文所述，发夹探针组的各成员的第二结构域可以各不相同。图2和图3以及图5中所示第一种代表性设计的探针将是这样，并且图6A和图6B所示第二和第三种代表性实施方式也可以是这样。因此，探针组的各个成员可以有自己的、不同的、同源的环形或可环化探针(第二结构域的互补性区域不同)，允许每个成员各自报道。这样可以分别检测各个靶序列。这样的实施方式中，环形或可环化探针可视为“独特(独有)的”，产生特定发夹探针的独特信号，因此也是特定靶序列的独特信号。
有利的是，在所述方法中，环形或可环化探针不能同时与发夹探针和靶标RNA杂交。虽然在某些实施方式中，环形或可环化探针可以包含与靶标RNA互补的区域而该区域又与发夹探针互补，相应的探针和/或反应条件的设计使得环形或可环化探针不与靶标RNA杂交。此外，相应探针可以设计成令三通(3-way junction)RCA反应无法发生。某些其他实施方式中，环形或可环化探针不能与靶标RNA杂交。具体地说，它不含与靶标RNA互补的区域。
本文中，术语“杂交”指充分互补以至能够通过沃森-克里克碱基配对形成双链体的核苷酸序列之间形成双链体或任何类似的碱基对相互作用。两个核苷酸序列分子有碱基对组织同源性时，称该两核苷酸彼此“互补”。因此，探针结构域中有互补性的区域指该结构域中能够形成分子内或分子间双链体的部分，所述分子内或分子间双链体即同一分子内部的双链体(发夹结构)或与不同分子(例如靶标RNA或不同(同源)探针)形成的双链体。杂交不需要序列之间100％互补，因此彼此互补的区域不要求序列完全互补，但也不排除完全互补。因此，互补的区域可以包含一处或多处错配。因此，本文中，“互补”指“功能性互补”，即足以介导有效杂交的互补性水平，包括小于100％的互补程度。错配容忍度可以通过适当调整杂交条件来控制。核酸技术领域的技术人员能够按照本领域的指导、兼顾诸多变量凭经验确定双链稳定性，这些变量包括例如相应分子或探针寡核苷酸的长度和碱基对组成、离子强度和错配碱基对概率。设计合适的探针及其结构域以及它们与各自靶标的杂交条件属于本领域技术人员的常规技能。
具有互补性的区域，例如发夹探针第一结构域中与靶序列互补的区域或位于可环化探针3’或5’端与第二结构域互补的区域，可以是至少6个核苷酸的长度以确保结合特异性，尤其至少7、8、9或10个核苷酸长。该区域的长度上限不重要，可以例如长达50、40、35、30、25、20或15个核苷酸。因此，互补区的长度可以是上述长度上下限任意组合所得范围。就具有与第二结构域中区域互补的5’和3’端区域的可环化探针而言，各互补末端区域的长度可以在低值区间，由此使得与第二结构域杂交时两个末端区域的总长度在高值区间。例如，各5’或3’端区域可以是8-15个例如10-12个核苷酸，这样，总杂交长度为16-30个核苷酸长，例如20-24。较好的可能是在探针构象、结构域间隔和所需或有利杂交等要求允许的范围内将环形或可环化探针的总长度最小化，从而令RCA环最小化，由此尽可能减少互补区域的长度。
如上所述，就可环化探针而言，与发夹探针第二结构域杂交的总杂交区域在一些实施方式中可能不仅由与靶标互补的探针3’和5’端区域构成，还包括缺口寡核苷酸或其他缺口填平序列(例如探针3’端延伸产生的缺口序列)。在缺口填平实施方式中，缺口可以长1-20个核苷酸，例如1-19、1-18、1-15、1-12、1-10、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4或2、3、4、5或6至任一上述范围的上限。
类似地，可以基于探针的特定性质、其构象(例如发夹结构)和期望的或有利的杂交等(例如发夹探针茎区双链体的相对稳定性等)来选择探针其他区域或结构域的长度。探针的设计可以基于本领域众所周知的原理。发夹探针第一和第二结构域可以由间隔序列隔开，例如在环中。发夹探针立足点区域(5’单链区)的长度是可变的，这取决于例如靶序列和/或探针设计，例如可以是10-30个核苷酸长，例如12-20个。
发夹探针茎区和环区的长度可以根据本领域公知的此类探针设计原理来设计或选择。这也可能取决于第一和第二结构域在发夹探针中的位置。因此，仅作为举例，茎区的长度可以是至少8个核苷酸，例如至少9或10个，直至例如长度为30、25或20个核苷酸。环区可以是例如至少8个核苷酸，例如至少9、10、11、12、15、20、25或30个核苷酸。
如上所述，互补区域内可以有错配，例如用来获得或控制不同区域或结构域之间的相对杂交强度。尤其，发夹探针发夹结构的茎区可以包含一处或多处错配。这样，发夹可设计成确保它在与靶标RNA结合时打开。这将取决于茎区的长度，但可以是例如1-5例如1-4、1-3或1-2处错配。
提供或形成RCA模板的所述环形或可环化探针可以包含报道域，即能够用来检测和/或鉴别RCA产物(即基于RCA模板的引物延伸产物)的探针区域或序列。这在本发明的复式实施方式中特别有利，复式实施方式中在单个检测中检测不止一种不同的RNA靶标。它还可用来区分靶标RNA内的不同靶序列。报道域可以是一个独立的结构域，例如包括在挂锁探针或其他可环化探针的“骨架”区域，位于可环化探针的3’和5’端区域(与第二结构域互补)，或是哑铃探针的双链区。另一些实施方式中，报道域可以如上所述是环形或可环化探针中具有与第二结构域(更具体地说是第二结构域中与第一结构域中靶标结合位点互补的区域)互补性的区域。因此，报道域可以包含环形或可环化探针中与发夹探针第二个结构域中互补性第二区域互补的区域的全部或部分或与之重叠。
因此，报道域可以是环形或可环化探针中的标志或标识序列。换言之，它可以是标签或条形码序列，使得探针能被检测和识别。实施方式之一中，报道域可以将环形或可环化探针因此也能够将由其产生的PCA产物彼此区分，即与其他环形或可环化探针区分开来。从前文关于独特和共同环形或可环化探针的论述可以清楚地看出，报道域可以是各个环形或可环化探针(既包括与不同RNA靶标特异性的发夹探针或探针组同源的探针，也包括与发夹探针组不同成员同源的探针)独有的，或者它可以是与发夹探针组不同成员同源的环形或可环化探针共有的。如前所述，这意味着由环形或可环化探针中共同报道域产生的信号是相同的(即RCA产物将包含相同报道域的互补拷贝)并且可以用相同方式检测，由此提供探针组中全体发夹探针发出的累积信号。亦如前所述，某些实施方式中，发夹探针组的全体成员可采用同一环形或可环化探针，因此，各发夹探针的报道域也不势必相同。然而，也可能不同的环形或可环化探针与不同的发夹同源，即组中各个发夹探针各有自己同源的环形或可环化探针。发夹探针组不同成员的第二结构域不同时会是这样，即前文所述第一种代表性发夹实施方式。这种情况下，对于给定的发夹探针组，与发夹探针组不同成员同源的环形或可环化的探针可以具有相同的报道域，尽管与第二结构域的结合位点不同。这样，在针对特定探针组的报道域是共同的这一意义上，与特定发夹探针组同源的环形或可环化探针就该发夹探针组而言可以是共同的。
另一实施方式中，对于给定的发夹探针组，每个同源环形或可环化探针中的报道域可以不同，从而允许针对该组中的各个发夹探针产生不同且可区分的信号。由此可以分别检测靶标RNA中的各个靶序列。如果需要，可以由发夹探针组产生的各单独信号测定靶标RNA的组合、累积值。
环形或可环化探针的报道域可以包含用于检测RCA产物的特定检测探针的序列(检测寡核苷酸)。RCA产物与RCA模板互补，因此，与RCA产物杂交的检测探针包含与部分RCA模板相同的序列。
因此，在复式检测中，与针对不同RNA靶标的发夹探针或探针组联用或为其形成的RCA模板可以包含不同的报道域。类似地或另外地，在想要分别检测靶标RNA内各个不同靶序列时，发夹探针组各个成员的RCA模板可以包含不同的报道域。RCA产物的检测可以并行进行(即同时，对于同一样品)，例如采用不同荧光团标记的检测探针，这些探针与RCA产物中报道域的互补序列杂交。或者，可以用连续可视化反应检测各个报道域(并由此检测各个靶标RNA和/或靶序列)，各个反应彼此间隔，例如间以洗提或清洗步骤。适合实施本发明方法的连续可视化反应的方法是本领域已知的，例如
Figure BDA0003156321300000181
等，2009(“用于数字化靶向分子分析的单分子阵列(A single molecule array for digital targeted molecularanalyses)”，Nucleic Acids Res.2009Jan；37(1):e7)，
Figure BDA0003156321300000182
等，2002(“用于单细胞核内大量抗原检测的连续荧光染色和图像分析(Sequential immunofluorescence stainingand image analysis for detection of large numbers of antigens in individualcell nuclei)”，Cytometry，47(1):32-41,2002)。本发明的一些代表性实施方式中，可以并行检测多个RNA靶标。本发明的另一些代表性实施方式中，可以依次连续检测多个RNA靶标。
某些其他实施方式中，报道域可不依赖于序列。例如，它可以是双链体结构中某个嵌入剂可结合的区域，例如在哑铃探针的情况下。哑铃探针可以用于miRNA的检测。
RCA产物可用任何方便的方案来检测，其中，所用特定方案可非特异性或特异性地检测RCA产物，见后文详细说明。例如，RCA产物可以直接检测，例如，可将串联体切割成单体，用凝胶电泳来检测单体，或者，更好的是，通过杂交加标的检测寡核苷酸，所述检测寡核苷酸与RCA产物中的报道域互补序列杂交。后者尤其适用于原位方法。然而，检测探针不需要直接标记。例如，检测探针可以是非标记的探针，其作用是作为夹心探针。夹心探针(sandwich probes)的概念是本领域公知的，可按照任何方便的方案来使用。夹心探针可结合RCA产物但其自身不直接标记，它们包含可被加标的二级寡核苷酸结合的序列，由此形成RCA产物和加标二级寡核苷酸之间的“夹心”。RCA产物还可以用非序列特异性核酸加标方法来检测，例如DNA结合染色，或用加标核苷酸掺入RCP。或者，可间接检测RCA产物，例如，可PCR扩增该产物，然后检测扩增产物。
使用本发明的方法和探针可以提高同一反应中用多个不同发夹探针或探针组(复式运行)同时分析多个RNA靶标和/或靶序列的灵敏度，某些实施方式中还能提高特异性。各个探针或探针组可以设计成产生RCA产物而该RCA产物能用来确定最终询问的RNA靶标或靶序列存在还是不存在、数量和/或位置。RCA产物可用文献记载的任何用于核酸分子分析的成熟方法来检测，包括液相色谱、电泳、质谱法(包括CyTOF)、显微镜、实时PCR、荧光探针、微阵列、比色法分析(例如ELISA)、流式细胞术、质谱法，或通过基于比浊法、磁性、粒子计数、电性、表面传感、称重的检测技术。一般而言，这些技术与溶液检测相关。
对于定位原位检测方法，RCA产物通常可以用加标检测探针来检测，所述探针可以用任何可检测的直接或间接地发出信号的标记进行标记。例如，标记可以是可光谱或显微镜检测的，例如，它可以是荧光或比色标记、颗粒或酶标记。可以使用免疫组化技术中使用的任何标记。
在检测不同RNA靶标和/或靶序列的复式程序中，可通过原位测序来检测和区分不同RCA模板(即不同的环形或可环化探针，或其不同的报道域)产生的不同RCA产物(例如Ke等，2013，Nat Methods)，包括例如合成测序和连接测序，下一代测序和/或通过加标检测探针杂交连续和/或组合加标，可按照本领域公知技术操作。发夹探针向样品中的加量可选择为在反应混合物中提供足够低的发夹探针浓度来尽可能减少非靶标特异性反应，即确保发夹探针不会随机结合样品中的非靶标分子到严重或显著的程度。例如，按照预期，只有当发夹探针与其靶标RNA结合时，引物序列才被释出，才有RCA产物产生。代表性实施方式中，与样品组合后反应混合物中各发夹探针的浓度范围为约1fM至1μM，例如约1pM至约500nM，例如1、2、5、10、20、50、60、70、80、90或100nM。因此，发夹的使用可以是靶标RNA过量。然而，另一些实施方式中，发夹探针可以相比靶标RNA过量。
可向样品中添加多种不同的发夹探针或探针组来进行复式检测，以便在同一反应混合物中并行检测多个RNA靶标。复式检测可检测样品中数十、数百、数千甚至数万种RNA序列。因此，复式检测可包括至少2种不同的发夹探针，即能与不同RNA靶标或靶序列杂交的探针。例如，多重检测可采用至少3、4、5、10、20、30、40或50种探针，例如100、200、500、1000或更多种探针。
样品和发夹探针(一种或多种)混合后，反应混合物可孵育一段时间，时长足以使发夹探针(一种或多种)与样品中的其靶标(如果存在)结合。类似地，一旦所述环形或可环化探针已经添加到样品中，反应混合物可孵育以令环形或可环化探针与解折叠的发夹探针结合。如上所述，可环化探针与解折叠的发夹探针结合后即连接生成RCA模板。发夹探针的第二结构域充当连接模板。
如本领域所知，在模板引导的连接反应中，当两个相邻核酸退火或杂交到它们与之互补的第三核酸序列(即连接模板)上时，由连接酶催化，在该两核酸并排的3'-羟基和5'-磷酸末端之间形成磷酸二酯键。可以使用任何方便的连接酶，其中感兴趣的代表性连接酶包括但不限于：温敏型和热稳定的连接酶。温敏型连接酶包括但不限于噬菌体T4 DNA连接酶、噬菌体T7连接酶和大肠杆菌连接酶。热稳定连接酶包括但不限于Taq连接酶、Tth连接酶、
Figure BDA0003156321300000201
和Pfu连接酶。热稳定连接酶可来自嗜热或超嗜热生物，包括但不限于原核生物、真核生物或古生物。某些RNA连接酶也可用于本发明方法。
合适的连接酶和任何必要和/或期望的试剂可以与反应混合物合并并维持在足以发生杂交寡核苷酸连接的条件下。连接反应条件是本领域技术人员公知的。某些实施方式中，连接期间，反应混合物可在约4℃至约105℃、约4至约80℃的温度(例如约10至约70℃、约15至约60℃，一般例如约20℃至约37℃)保持约5秒至约16小时，例如约1分钟至约1小时。另一些实施方式中，反应混合物可在约35℃至约45℃的温度(例如约37℃至约42℃，例如38℃、39℃、40℃或41℃、或约38℃、39℃、40℃或41℃)保持约5秒至约16小时，例如约1分钟至约1小时，包括约2分钟至约8小时。
显然，连接条件会取决于本发明方法采用的连接酶。因此，上述连接条件仅是代表性举例，参数可以根据众所周知方法来调整。
方法中连接步骤的下一个步骤是生成RCA产物。RCA反应由发夹探针的第二结构域引发。因此，第二结构域可以位于发夹探针的3’端，并且一旦发夹打开即可与环形或已环化探针以能够引发RCA的方式杂交。然而，第二结构域的可延伸3’端可以由发夹探针的3’端经外切核酸酶消化而产生(见下文)。
进行RCA反应的程序是本领域众所周知的。上述核酸成分之外，RCA反应混合物还包括聚合酶(例如phi29 DNA聚合酶)和后文DNA聚合酶反应所需的其他成分。所需聚合酶活性可由一种或多种不同的聚合酶提供。一些实施方式中，聚合酶具有外切核酸酶活性，例如5’和/或3’外切核酸酶活性。较好的或许是采用具有3’外切核酸酶活性的聚合酶，例如phi29或基于phi29的聚合酶，因为这种外切核酸酶活性可以在必要时消化发夹探针的3’端以产生杂交的3’端来作为RCA反应的引物。
在本方法该步骤反应混合物的制备中，各种组成成分可以以任何方便的顺序合并。例如，所有的各种组成成分可以同时合并以生成反应混合物。
RCA反应的扩增产物可以使用任何方便的方案进行检测，如前所述。感兴趣的代表性非特异性检测方案包括采用信号产生系统的方案，此类系统选择性地检测单链或双链DNA产物，例如通过嵌入(intercalation)。可用于此类实施方式的代表性可检测分子包括荧光核酸染料，例如菲啶(phenanthridinium)染料，包括其单体或同二聚体或异二聚体，它们与核酸复合时产生增强的荧光。菲啶染料的例子包括乙锭同二聚体、溴化乙锭、碘化丙啶，以及其他烷基取代的菲啶染料。另一实施方式中，核酸染料是或掺有吖啶染料或其同二聚体或异二聚体，例如吖啶橙、吖啶同二聚体、乙锭-吖啶异二聚体或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。另一实施方式中，核酸染料是吲哚或咪唑染料，例如Hoechst 33258、Hoechst33342、Hoechst 34580(BIOPROBES 34，分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)，俄勒冈州尤金市(May 2000))DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其他可用的核酸染料包括但不限于7-氨基放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751、选择补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯型染料、金属络合物如钌络合物和过渡金属络合物(例如，掺入Tb3+和Eu3+)。某些实施方式中，核酸染料是花青染料或花青染料的同二聚体或异二聚体，它们与核酸结合时发出增强荧光。以下文献中所述的各种染料均可使用：Lee的美国专利号4,883,867(1989)，Yue等的美国专利号5,582,977(1996)，Yue等的美国专利号5,321,130(1994)和Yue等的美国专利号5,410,030(1995)，包括分子探针公司(俄勒冈州尤金市)以下商标的市售核酸染料：TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、PO-PRO和YO-PRO。以下文献中所述的各种染料均可使用：Haugland等的美国专利号5,436,134(1995)，Yue等的美国专利号5,658,751(1997)和Haugland等的美国专利号5,863,753(1999)，包括分子探针公司(俄勒冈州尤金市)以下商标的市售核酸染料：SYBR Green、EvaGreen、SYTO、SYTOX、PICOGREEN、OLIGREEN和RIBOGREEN。另一些实施方式中，核酸染料是掺入了氮杂-或多氮杂苄烷铵(polyazabenzazolium)杂环的单体、同二聚或异二聚花青染料，例如氮杂苯并噁唑、氮杂苯并咪唑或氮杂苯并噻唑，它们与核酸结合时产生增强荧光，包括分子探针公司(俄勒冈州尤金市)以下商标的市售核酸染料：SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、LO-PRO。
另一些实施方式中，可用对RCA产物而非普遍核酸分子具有特异性的信号产生系统来检测RCA产物。这些实施方式中，信号产生系统可包括特异性结合RCA产物中序列(即报道域序列)的检测探针核酸或寡核苷酸(检测探针)，其中，检测探针可以用可直接或间接检测的标记物标记。可直接检测的标记可直接检测而不用其他反应试剂，可间接检测的标记用一种或多种其他试剂而可检测，例如，标记是由两种或更多组分组成的信号产生系统的成员。许多实施方式中，标记是可直接检测的标记，感兴趣的可直接检测的标记包括但不限于：荧光标记、放射性同位素标记、化学发光标记等。许多实施方式中，标记是荧光标记，用于此类实施方式的标记试剂是带荧光标签的核苷酸，例如荧光标记的CTP(例如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可用于标记核苷酸以产生加标探针核酸(即检测探针)的荧光组分包括但不限于：荧光素、花青染料，例如Cy3、Cy5、Alexa 555、Bodipy 630/650等。如本领域所知，也可以使用其他标记，例如前文所述。
本发明和本公开的产品包括如前定义和论述的发夹探针、探针组和试剂盒。前文列出的组件之外，试剂盒还可以包含一种或多种其他组件，例如实施方法中一个或多个步骤的试剂。此类组分可以包括用于RCA反应(和/或适当情形下用于缺口填平延伸反应)的聚合酶、连接酶、和用于检测RCA产物的工具或试剂，包括例如检测探针。
试剂盒还可任选地包括核苷酸和/或缓冲液和/或反应溶液，用于实施方法中一个或多个步骤。试剂盒还可包括实施方法的说明。这可以是例如印刷形式的，或是计算机可读介质，或是网址。
以上论述了本文公开和描述的方法和探针的优点。这些优点对于定位原位检测特别有益。
优点包括可以简化用于RNA检测的探针设计和制备。结合靶标RNA的靶标特异性探针(发夹探针)不需要标记。因为该方法提供信号的放大，与smFISH相比，所需发夹探针的数量减少。所述方法还能够以低放大倍数(例如X20物镜)在组织切片的宽阔区域上检测mRNA，从而实现基因表达成像，并适用于存档FFPE组织切片和成化FFPE样品，这些切片和样品中smFISH和其他RNA荧光检测策略众所周知得难。所述方法还适用于组织微阵列高通量筛选潜在的有用生物标志物。采用发夹探针而不是线性靶标特异性探针产生的背景信号和非特异性信号较低，提高了方法的特异性。
这些特点使得本发明方法成为一种强大的工具，可以集成到常规病理诊断中，即本发明方法适用于临床诊断实验室。而且，它还可以是有用的研究工具，例如用来研究或定量表达水平和考察基因表达的空间分布。这可能在神经科学中特别有用，可用来绘制脑样品中的基因空间形态，或用来根据基因表达模式识别细胞亚型。本发明方法可用于检测一组基于其特异性而成为给定细胞亚型特异性标志物的转录本来识别低表达和新预测的细胞亚型的空间位置。已采用高通量空间转录组学技术，包括连续smFISH、空间转录组学和MERFISH来对人脑和小鼠脑中的细胞多样性作图。然而，这些方法有技术难度，并且仍然需要通过低通量检测(如smFISH)进行后验验证。就此而言，可证明本发明方法非常有价值，尤其在需要分析以高水平组织自发荧光为特征的样品时(例如老化的大脑)。
最后，由于所述方法能够用4-5个发夹探针检测强信号，该方法能够用于检测短RNA或区分不同剪接变体，这些用smFISH是不可能的。概括地说，本发明方法是一种多功能、可扩展且高成本效益的方法，可用于个体RNA分子定量，包括在难处理的FFPE样品中，具有从研究到常规诊断的广泛应用。
尽管在此参照环形或可环化探针和RCA进行描述，但本发明方法的原理具有更广泛地应用，本发明方法可以适用性调整用于其他扩增方法，其中，发夹探针的第二结构域不是携带RCA反应的引物而是含有用于不同扩增反应的其他组分。因此，以前文所述相似的方式，发夹探针可以在与其靶序列结合后打开从而释放出这些组分，使其能够以启动或允许扩增反应发生的方式与同源的扩增反应组分结合。
因此，在另一更广泛的方面，可以看出，本公开提供一种用于检测样品中靶标RNA的方法，包括：
(a)将所述样品与至少一种靶标特异性发夹探针接触，所述探针包括：
(i)第一结构域，其包含与所述靶标RNA中的靶序列互补的第一区域并且能够与所述靶标RNA杂交；
(ii)第二结构域，其不能与所述靶标RNA杂交，其包含与同源扩增反应组分互补的第二区域，并且能够作为启动扩增反应的激活剂；
其中，所述第二结构域至少部分包含在所述探针的发夹结构之内，从而使得所述第二结构域在从所述发夹结构中释出之前不能结合所述同源扩增反应组分和/或引发扩增反应，以及让所述发夹探针与所述靶标RNA杂交，其中所述第一结构域与所述靶标杂交引起所述发夹结构打开并释出所述第二结构域；
(b)将所述样品与所述发夹探针的同源扩增反应组分接触，所述扩增反应组分包含一个或多个与第二结构域中的互补性第二区域互补的区域，并且令扩增反应组分与所述发夹探针在第二结构域杂交；
(c)用(b)中所述扩增反应组分进行扩增反应；和
(e)检测所述扩增反应的产物。
本文中，术语“激活剂”广义地包括任何扩增反应组分。尤其，激活剂可以是引发扩增反应的组分，或是扩增反应发生所必需的组分。激活剂可以与另一个扩增反应组分相互作用例如杂交来让扩增反应发生。
例如，第二结构域或其部分或区域能够作为扩增反应的引物，包括基于聚合酶的扩增反应。这样的引物可以与扩增模板杂交，类似前文所述与环形或可环化探针杂交。这样，同源扩增反应组分可以是模板分子，其中包含至少一个与发夹探针第二结构域中互补性第二区域互补的区域。
另一个实施方式中，第二结构域能够充当或可以包含杂交链反应的引发剂。同源扩增反应组分可以是能够与所述引发剂杂交的HCR单体。因此，HCR单体可包含与发夹探针第二结构域中互补性第二区域互补的区域。更具体地，第一HCR单体的立足点区域可包含与所述互补性第二区域或其部分互补的区域。
HCR反应是众所周知并有文献记载的，包括例如Dirks和Pierce，2004，PNAS，101(43)，15275-15278，以及US 7,632,641和US 7,721,721，以上通过引用全文纳入本文(另见US 2006/00234261，US 2018/0066303；Chemeris等，2008Doklady Biochemistry andBiophysics，419，53-55；Niu等，2010，46，3089-3091；Choi等，2010，Nat.Biotechnol.28(11)，1208-1212；以及Song等，2012，Analyst，137，1396-1401，以上全部通过引用全文纳入本文)。
步骤(c)的扩增反应因此可以照本领域所知的方式进行，并且可以包括添加一种或多种用于扩增反应的其他反应组分。例如，在HCR的情况下，反应在发夹探针第二结构域提供的引发剂和第一HCR单体作为同源扩增反应组分之外还需要第二HCR单体，第二HCR单体与第一HCR单体反应组装成HCR聚合反应产物。其他扩增反应可能需要其他组分，例如第二或许更多扩增引物，或其他寡核苷酸成分等。
发夹探针和反应方法可以如前所述。
这些其他扩增产物可根据本领域熟知的技术和原理进行检测，类似前文就RCA产物所述，那些在此同样适用。因此，举例来说，HCR单体可以包含报道域，如前所述，可以采用能够与HCR产物中的报道域杂交的检测探针，或者可以对HCR单体进行标记，等等。
本公开和本发明这一更广泛的方面还提供了一种用于检测靶标RNA分子的发夹探针，所述探针包含：
(i)第一结构域，其包含与所述靶标RNA中的靶序列互补的第一区域并且能够与所述靶标RNA杂交；
(ii)第二结构域，其不能与所述靶标RNA杂交，其包含与同源扩增反应组分互补的第二区域，并且能够作为启动扩增反应的激活剂；
其中，所述第二结构域至少部分包含在所述探针的发夹结构之内，从而使得所述第二结构域在从所述发夹结构中释出之前不能结合所述同源扩增反应组分和/或引发扩增反应，其中所述发夹结构使得所述第一结构域与所述靶序列杂交引起所述发夹结构打开并释出所述第二结构域。
探针组可包含两个或更多如前所述的靶标特异性发夹探针，各探针对同一靶标RNA内不同的靶序列具有特异性，组中各发夹探针的第一结构域具有与靶标RNA内不同靶序列互补的区域。
一种试剂盒，包括：
(i)如前所述的靶标特异性发夹探针或探针组；和
(ⅱ)与所述发夹探针同源的扩增反应组分，或与探针组内多个发夹探针同源的多个扩增反应组分，各个扩增反应组分包括一个或多个与发夹探针(一个或多个)第二结构域中的互补性第二区域互补的区域。
这样的试剂盒可以包括(i)一组扩增反应组分，扩增反应组分探针组的各个成员与不同的发夹探针同源，或者(ii)一个或多个扩增反应组分，各组分与给定发夹探针组的全体成员同源。
这些方面的具体实施方式中，第二结构域可作为或者包含HCR引发剂，同源反应组分可以是HCR单体。
现在将结合以下非限制性实施例来更详细的阐述本发明的方法。
图1显示四种发夹探针结构(错配发夹探针)，每个长度为72个核苷酸，包括位于5’端的12个核苷酸的立足点、20个核苷酸的茎区和环区。这些探针在茎区有不同数量的错配。
(A)显示一无错配探针(SEQ ID NO:1)，其中，(a)是5’末端，12nt的立足点，(b)是20nt茎区，0错配，(c)是20nt环区，有6nt的间隔序列和10nt的PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端。dG＝-22.19。
(B)显示距环区第5核苷酸处有1处错配的探针(SEQ ID NO:2)，其中，(a)是5’末端，12nt的立足点，(b)是20nt茎区，在20nt茎区的第16nt处有1处错配，(c)是20nt环区，有6nt的间隔序列和10nt的PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端，以X标示错配。dG＝-17.72。
(C)显示距环区第5和第6核苷酸处有2个相邻错配的探针(SEQ ID NO:3)，其中，(a)是5’末端，12nt的立足点，(b)是20nt茎区，在20nt茎区的第15nt和第16nt处有相邻的2处错配，(c)是20nt环区，有6nt的间隔序列和10nt的PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端，以X标示错配。dG＝-15.23。
(D)显示距环区第6和第14核苷酸处有2个错配的探针(SEQ ID NO:4)，其中，(a)是5’末端，12nt的立足点，(b)是20nt茎区，在20nt茎区的第7nt和第15nt处有隔开的2处错配，(c)是20nt环区，有6nt的间隔序列和10nt的PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端，以X标示错配。dG＝-12.63。
图2显示另一探针设计(无错配发夹探针)一般性结构。
(A)显示一探针，具有5’端12核苷酸的立足点以及类似的20核苷酸的茎区和环区(SEQ ID NO:5)，其中，(a)是5’末端，12nt的立足点，(b)是20nt茎区，(c)是20nt环区，有3nt的间隔序列和10nt的PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端。dG＝-20.38。
(B)显示立足点更长(20核苷酸)的类似探针(SEQ ID NO:6)，其中，(a)是5’末端，20nt的立足点，(b)是20nt茎区，(c)是20nt环区，有3nt的间隔序列和10nt的PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端。dG＝-20.38。
图3显示茎区较短的另一替代性探针设计(短发夹探针)的一般性结构。这些探针同样具有5’末端的立足点、茎区和环区。探针(A)具有12个核苷酸的立足点(SEQ ID NO:7)，其中，(a)是5’末端，12nt的立足点，(b)是10nt茎区，G-C含量>60％，(c)是环区，有3nt间隔序列，更高的A-T含量和PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端。dG＝-11.09。
探针(B)具有20个核苷酸的立足点(SEQ ID NO:8)，其中，(a)是5’末端，20nt的立足点，(b)是10nt茎区，G-C含量>60％，(c)是环区，有3nt间隔序列，更高的A-T含量和PLP连接位点，(d)是延续的PLP连接位点和3’末端。dG＝-11.09。
图4显示第四种替代性探针设计(环型靶标发夹探针)的一般性结构，包含以5’端为起点以3’端为终点的茎区，没有立足点(SEQ ID NO:9)，其中，(a)是5’端，16nt茎区，(b)是24nt的长环，有3nt间隔序列，(c)是16nt的PLP连接位点和3’末端。该探针的环区由RNA靶标的互补序列构成。dG＝-14.29。
图5显示根据展示性实施方式之一的方案，其中的方法采用“独特”挂锁探针。该方案中，发夹探针的挂锁探针结合位点包含环区和部分茎区。相应地，挂锁探针结合位点的一部分与杂交靶标RNA的序列互补，因此每个靶序列的挂锁探针必须不同。本例中，一个含有4个靶序列的靶标RNA被4个发夹探针结合，每个发夹探针又各自被其同源挂锁探针结合。
图6显示采用“共同”挂锁探针的展示性实施方式。方案(A)中，发夹探针的挂锁探针结合位点完全位于环区内，因此不受靶标RNA序列的影响。类似地，方案(B)中，挂锁探针结合位点完全位于茎区内，而RNA靶向序列完全位于环区内。相应的，这些例子中，一个含有4个靶序列的靶标RNA被4个发夹探针结合，每个发夹探针又各自被同一锁探针的拷贝结合。
图7显示体外(in vitro)实验结果确认在存在靶序列的情况下，发夹探针能够成功解折叠而露出挂锁探针结合位点，并由此引发RCA。在加入挂锁探针和含TTH连接酶的连接混合物之前，允许发夹探针与它们的mRNA靶序列在溶液中杂交。然后将样品加入含Phi29聚合酶和dNTP的扩增混合物中，孵育1小时进行扩增。然后用荧光计观察所得RCP。重复实验；(i)使用相比发夹探针过量的模板靶序列(测试)；(ii)使用相比模板靶序列过量的发夹探针(+ve)；和(iii)完全没有模板序列(-ve)。图7A中的结果来自采用4种错配发夹探针的实验：HP2、HP2A、HP2B和HP2C，分别对应于图1A-D所示探针。图7B中的结果来自采用图3A和3B所示第三种探针设计(短发夹探针)的实验。
图8显示对小鼠脑切片进行的原位(in situ)实验结果，采用了本发明的发夹探针和作为对照的另一种探针设计。所用对照探针是线性的，具有与靶标互补的区域和不与靶标互补但有挂锁探针结合位点的3’末端。首先对样品进行固定和清洗，然后加入发夹探针或对照探针，让其杂交。然后加入挂锁探针和连接酶，接着加入含Phi29聚合酶和dNTP的扩增混合物。最后，加入检测寡核苷酸，通过荧光成像检测RCP。(A)中的图像是用本发明发夹探针产生的，显示预期高表达靶基因的组织区域(左)和预期低水平表达区域(右)的结果。(B)中显示用对照探针产生的图像，同样，左图为预期高表达区域，右图为预期低表达区域。
实施例1-探针设计与合成
茎区错配设计
将集成DNA技术公司(Integrated DNA Technology，IDT)的端粒72-核苷酸(nt)探针设计成具有12-nt的立足点、20nt长的茎区，茎区内有不同数量的错配：
1.无错配
2.1处错配，距环区第5nt
3.2处错配，距环区第5和第6nt，相邻
4.2处错配，距环区第7和第15nt，隔开
这些探针分别如图1A–1D所示。
挂锁探针结合位点设计成30nt长，该结合位点与茎区之间有6nt的间隔序列。
发夹探针茎区内的错配设计成破坏结构稳定性，让茎区在其靶序列存在的情况下较易“打开”。
短茎区设计
此外，将集成DNA技术公司(IDT)的端粒47-核苷酸(nt)(短立足点)/55-nt(长立足点)探针设计成具有5’端的12-nt(短立足点)/20-nt(长立足点)靶向序列、22nt的挂锁探针杂交和连接序列，以及两者之间的3-nt间隔序列。
发夹探针的茎区设计成10-nt长，GC含量至少为60％。发夹探针的环区设计成AT含量高于GC含量。发夹探针的立足点设计成12-nt(短立足点)和20-nt(长立足点)。这些探针的结构如图3所示。
实施例2–溶液中的方法
作为概念的验证，为了证明发夹探针在与靶序列结合后能够成功解折叠露出挂锁探针结合位点以引发RCA，进行了体外(in vitro)检测。
用小鼠脑内的NeuroD6基因设计发夹探针和挂锁探针。具体地说，选择5个不同的、不重叠的NeuroD6 mRNA序列。发夹探针设计成靶向NeuroD6基因的1个位点。上述mRNA的相应序列从IDT订购并随后在溶液中测试。
为了定量测定设计的发夹探针是否与靶序列杂交并完全打开形成用于挂锁探针结合和扩增的“L”突出端，测评了两种不同试验条件。首先，用相比模板过量的发夹探针进行反应；接着，用相比发夹探针过量的模板重复反应。
此外，阴性对照仅由发夹探针和挂锁探针的混合物组成，在没有靶序列的情况下进行杂交，用来评估发夹探针的稳定性和特异性。
步骤1：杂交
设计好的发夹探针首先在5X SSC、0.01％Tween杂交缓冲液(5X SSCT)中与NeuroD6基因的mRNA靶标的靶序列杂交。
阳性试验：
1.发夹探针相比模板过量
400nM发夹探针与100nM模板在2.5X SSC、0.005Tween缓冲液中37℃
杂交3小时。
2.模板相比发夹探针过量
400nM模板与100nM发夹探针在2.5X SSC、0.005Tween缓冲液中37℃
杂交3小时。
阴性对照：
1.100nM发夹探针在2.5X SSC、0.005Tween缓冲液中37℃孵育3小时。
步骤2：连接
然后，将“步骤1：杂交”中的反应混合物加入连接混合物，用于形成10倍稀释的杂交混合物。连接混合物由1x TTH缓冲液、0.05M KCl、20％甲酰胺、0.2μg/μl BSA、10.0nM挂锁探针和0.25u/μl TTH连接酶组成。然后，样品于45℃孵育30分钟。
步骤3：扩增与定量
然后，将“步骤2：连接”中的反应混合物加入扩增混合物，用于形成10倍稀释的连接混合物。扩增混合物由1x Phi29缓冲液、0.25mM各种dNTP、0.2μg/μl BSA、5％甘油、0.2u/μl Phi29聚合酶组成。然后，样品于37℃孵育1小时。
用Qubit荧光计对扩增步骤产生的RCP进行定量。将5.0μl扩增混合物与195.0μlQubit工作溶液混合，后者含有与DNA结合的荧光团用于荧光定量。
阳性试验和阴性对照试验并行进行，由此验证阳性试验产生的信号不是因为挂锁探针“打开”了发夹探针从而发生结合、连接和随后的RCA。这验证了在没有靶标模板的情况下发夹探针将保持与其自身杂交而不会打开让挂锁探针结合，由此避免了RCA启动。
阳性试验的结果验证了信号可由以下事实解释：即发夹探针“打开”而与模板杂交，露出挂锁探针结合位点让挂锁探针结合、环化然后进行RCA，产生RCP。
这些实验的结果如图7所示。
实施例3–原位方法
用C57BL/6J小鼠的10μm小鼠脑切片进行原位实验。该实验在本发明的发夹探针之外还使用了另一种探针设计作为对照。对照系统采用线性(非发夹)探针，这些探针具有与靶标互补的区域和不与靶标互补但有挂锁探针结合位点的3’末端。与本发明的发夹探针一样，挂锁探针能够结合、通过连接环化并启动RCA。然而，既便没有靶标模板的情况下，这些线性探针(对照探针或对照引物)也会被挂锁探针结合并引发RCA，由此在体外(in vitro)或在组织切片内产生非特异性的背景信号，其中，线性探针非特异性地结合和/或附着于组织基质。
步骤1：固定
所有样品先固定并在含有3.7％PFA的DEPC-PBS溶液的固定溶液中室温下孵育5分钟。样品然后在含有DEPC-PBS的洗涤缓冲液1(WB1)溶液中孵育1分钟，接着在含有(含0.1MHCl的DEPC H2O)的透化溶液(PS)中再室温下孵育5分钟。接着，样品在WB1中洗涤两次，然后分别在70％和100％乙醇中孵育2分钟。最后，将50ul的SecureSeal杂交池(SecureSealChamber，格雷斯生物实验室公司(Grace Bio-Labs))安装在玻片上用于步骤2的杂交。
步骤2：探针杂交
将含有DEPC-PBS-Tween 0.05％的洗涤缓冲液2(WB2)加到SecureSeal杂交池中，同时制备包含2X SSC、10％甲酰胺、10mM MgCl2和50nM发夹探针或对照探针的探针混合物。然后，将探针混合物加入杂交池，37℃孵育3小时。
步骤3：探针连接
然后，样品先在WB2中洗涤两次，再加入连接混合物，连接混合物含1x TTH缓冲液、0.2μg/μl BSA、0.05M KCl、100nM挂锁探针、20％甲酰胺和0.5μg/μl TTH连接酶。然后，玻片于37℃孵育1小时。
步骤4：扩增和荧光标记
样品在WB2中洗涤两次，然后加入含有1x Phi 29缓冲液、0.25mM dNTP、0.2μg/μlBSA、10％甘油和1μg/μl Phi29聚合酶的扩增混合物。样品然后30℃孵育过夜或37℃孵育3小时。从杂交池中去除扩增混合物，用WB2洗涤两次，让最后一次的洗涤缓冲液留在杂交池中。样品在2x SSC、20％甲酰胺和100nM检测寡核苷酸中避光室温孵育30分钟。WB2洗涤三次去除未结合的检测寡核苷酸。
实验产生的量化团通过成像和CellProfiler管线图像分析来验证。在Nikon Ti2显微镜下摄取图像，运行NIS Elements AR软件。根据艾伦细胞图谱(Allen Cell Atlas)上的公开数据，选择样品高表达区和低表达区的2×2×2片区为选定区域内的基因表达图像。然后用20倍(20X)物镜、Cy3和DAPI发光反应，对选定的目标区域进行成像。对位于非同焦Z平面的RCP成像得到一叠不同焦深的图像，然后用“NIS Elements AR”软件中的“创建Z向最大强度投影(MIP)图像(Create Maximum Intensity Projection(MIP)Image in Z”功能合并成单张图像。
然后在CellProfiler上的定制管线上分析Z向MIP图像，基于形状描述符和与鉴定出的每个细胞核的距离来识别、分离和定量细胞核和RCP。管线在CellProfiler 2.1.2上运行，所有团点和细胞核计数以及强度信息的定量都保存为.csv文件。
图8A显示脑组织切片内两个不同区域的图像。在高表达区，估计Neurod6为中高表达(根据艾伦脑图谱(Allen Brain atlas)原位杂交数据)。相比之下，在低表达区，估计Neurod6表达水平较低。
图8B显示使用对照探针而非本发明发夹探针进行的对等实验的相应结果。
鉴于低表达区和高表达区之间几乎没有差异，对照实验中的大多数信号应该是非特异性的。而且，还发现有许多细胞外信号，这很可能是由于对照引物非特异性地附着在组织切片上并在所有其附着之处产生了RCA产物。发夹探针产生的信号较少，但最大可能这些信号是特异性的，因为我们可以看到组织的低表达区和高表达区有明显的差异(符合预期)。而且，非特异性的细胞外信号很少。
序列表
<110> 迦太纳公司（CartaNA AB）
<120> 检测RNA的方法
<130> 27.11.140731/01
<150> GB 1818742.7
<151> 2018-11-16
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 1
tcattctgca ctgatcatct ggcatccctg taagtgtctt ctgttattgt gatacaggga 60
tgccagatga tc 72
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 2
tcattctgca ctgatcatct ggcatccctg taagtgtctt ctgttattgt gatacatgga 60
tgccagatga tc 72
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 3
tcattctgca ctgatcatct ggcatccctg taagtgtctt ctgttattgt gatacattga 60
tgccagatga tc 72
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 4
tcattctgca ctgatcatct ggcatccctg taagtgtctt ctgttattgt gatacagtga 60
tgccatatga tc 72
<210> 5
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 5
agcacttgtt ttgtattgtt caggattttt ctgtacaggt tctttgggac atcagaaaaa 60
tcctgaacaa tac 73
<210> 6
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 6
aaaatattag cacttgtttt gtattgttca ggatttttct gtacaggttc tttgggacat 60
cagaaaaatc ctgaacaata c 81
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 7
gacattgaag tatgctgtgt gctctgttgt tgttattgca cacagca 47
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 8
ctgaaataga cattgaagta tgctgtgtgc tctgttgttg ttattgcaca cagca 55
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹探针
<400> 9
attctcatag cctggttcct gaacaataca aaacaagtgc ttctaccagg ctatgagaat 60

Claims (24)

1.一种检测样品中靶标RNA的方法，包括：
(a)将所述样品与至少一种靶标特异性发夹探针接触，所述探针包括：
(i)第一结构域，其包含与所述靶标RNA中的靶序列互补的第一区域并且能够与所述靶标RNA杂交；
(ii)第二结构域，其不能与所述靶标RNA杂交，其包含与同源环形或可环化探针互补的第二区域，并且能够作为RCA反应的引物；
其中，所述第二结构域至少部分包含在所述探针的发夹结构之内，从而使得所述第二结构域在从所述发夹结构中释出之前不能结合所述同源环形或可环化探针和/或引发RCA反应，以及让所述发夹探针与所述靶标RNA杂交，其中所述第一结构域与所述靶序列杂交引起所述发夹结构打开并释出所述第二结构域；
(b)令所述样品接触与所述发夹探针同源的环形或可环化探针，其中，所述环形或可环化探针包含一个或多个与所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的区域，并将所述挂锁探针与所述发夹探针在所述第二结构域杂交，其中，如果所述探针是可环化探针，它包含与所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的3’端和5’端区域从而所述两端并排杂交以实现直接或间接地彼此连接；
(c)如果所述探针是可环化探针，令所述挂锁探针的末端直接或间接连接来环化可环化探针，由此提供RCA反应模板；
(d)用(b)中所述环形探针或(c)中所述RCA模板进行RCA反应，其中，由所述第二结构域引发所述RCA反应；以及
(e)检测所述RCA反应的产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)包括将所述样品与包括两个或更多发夹探针的探针组接触，各发夹探针各自对所述靶标RNA中不同的靶序列具有特异性，其中，组中各发夹探针的所述第一结构域包含各自与不同靶序列互补的区域。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法用于检测样品中超过一种靶标RNA，其中，所述样品与多个不同的发夹探针或探针组接触，所述探针或探针组各自具有对不同靶标RNA的特异性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述发夹探针是寡核苷酸，所述寡核苷酸至少其5’端区域的部分能够与所述寡核苷酸3’端的区域杂交使得所述寡核苷酸形成发夹结构。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述发夹结构从5’至3’包含：
(i)5’端的单链区；
(ii)第一茎链区；
(iii)单链环区；和
(iv)3’端的第二茎链区。
6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中，包含与靶序列互补的所述第一区域的所述第一结构域包含所述发夹探针所述5’单链区的全部或部分和所述第一茎链区的至少部分，并且所述单链区起到作为结合所述靶标RNA的立足点的作用。
7.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，包含与同源环形或可环化探针互补的所述第二区域的所述第二结构域包含所述发夹探针所述第二茎链区和所述环区的至少部分。
8.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，所述第二结构域位于所述发夹结构的环区。
9.如权利要求4所述的方法，其中，所述发夹结构从5’至3’包含：
(i)5’端的第一茎链区；
(ii)单链环区；和
(iii)3’端的第二茎链区。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述第一结构域位于所述发夹结构的所述环区，且所述第二结构域位于所述发夹结构的所述第二茎链区。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述发夹结构的茎区有一处或多处错配。
12.如权利要求2至11中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括将所述样品与两种或更多种不同的环形或可环化探针接触，各个探针与不同的发夹探针同源。
13.如权利要求2至6或8至11中任一项所述的方法，其中，发夹探针组中各成员的所述第二结构域相同。
14.如权利要求13所述的方法，其中，步骤(b)包括将所述样品与两种或更多种环形或可环化探针接触，各个探针与不同的发夹探针组同源。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述靶标RNA是mRNA。
16.如权利要求3至13中任一项所述的方法，其中，各RNA靶标的所述环形或可环化探针具有不同的报道域。
17.如权利要求2至12、15或16中任一项所述的方法，其中，在探针组内，给定靶标RNA内各靶序列的环形或可环化探针具有不同的报道域；或者，如权利要求2至11或13至16中任一项所述的方法，其中，在探针组内，给定靶标RNA内各靶序列的环形或可环化探针具有相同的报道域。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，用与所述RCA产物特异性杂交的检测寡核苷酸、核酸染料或用来掺入所述RCA产品的加标核苷酸来检测所述RCA产物。
19.一种用于检测靶标RNA分子的发夹探针，所述探针包含：
(i)第一结构域，其包含与所述靶标RNA中的靶序列互补的第一区域并且能够与所述靶标RNA杂交；
(ii)第二结构域，其不能与所述靶标RNA杂交，其包含与同源环形或可环化探针互补的第二区域，并且能够作为RCA反应的引物；
其中，所述第二结构域至少部分包含在所述探针的发夹结构之内，从而使得所述第二结构域在从所述发夹结构中释出之前不能结合所述同源环形或可环化探针和/或引发RCA反应，其中所述发夹结构使得所述第一结构域与所述靶序列杂交引起所述发夹结构打开并释出所述第二结构域。
20.一种探针组，包含两个或更多如权利要求19中所述的靶标特异性发夹探针，各探针对同一靶标RNA内不同的靶序列具有特异性，组中各发夹探针的所述第一结构域具有与所述靶标RNA内不同靶序列互补的区域。
21.如权利要求20所述的探针组，其中，所述探针组的成员是权利要求3至10和12中任一项所述的发夹探针。
22.一种试剂盒，其包括：
(i)权利要求19中所述的靶标特异性发夹探针或权利要求20或21中所述的探针组；和
(i)与所述发夹探针同源的环形或可环化探针，或与所述探针组中多个发夹探针同源的多个环形或可环化探针，各环形或可环化探针包含一个或多个与所述发夹探针所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的区域，如果所述探针是可环化探针，它包含与所述第二结构域中所述互补性的第二区域互补的3’端和5’端区域从而所述两端并排杂交以实现直接或间接地彼此连接。
23.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒包括(i)环形或可环化探针组，所述环形或可环化探针组的各成员与不同的发夹探针同源，或(ii)一个或多个环形或可环化探针，各探针与给定发夹探针组的全体成员同源。
24.如权利要求1至23中任一项所述的探针、探针组或试剂盒，其中：
(i)所述第二结构域能够起到引物的作用；或
(ii)所述环形或可环化探针是挂锁探针。
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