CN116004784A - 一种用于核酸检测的探针组合和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种用于核酸检测的探针组合和方法。本公开的探针组合包含至少一个探针对，所述探针对由第一靶探针和第二靶探针组成，所述第一靶探针和第二靶探针分别识别靶核酸中的两个临近区域，所述第一靶探针的3’端包含与靶核酸杂交的第一靶识别序列，所述第二靶探针的5’端包含与靶核酸杂交的第二靶识别序列，所述第一靶探针和第二靶探针各自的3’端的茎链区与5’端的茎链区杂交形成茎环结构，所述茎环结构包括茎部结构和单链环区。该探针组合能够降低探针之间以及探针与靶核酸间的非特异性结合，提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本公开涉及生物检测领域，尤其涉及一种用于核酸检测的探针组合和方法。
背景技术
单细胞的基因表达能够揭示生物组织的异质性和复杂性。单细胞分辨率的原位基因表达检测技术，可以提供基因表达定量和空间位置信息，有助于更深入的研究细胞的命运、状态、功能等变化，越来越受到科研工作者的重视。目前单细胞分辨率的原位基因表达技术主要有原位测序技术和原位杂交技术。
原位杂交技术(ISH，In Situ Hybridization)又称原位杂交组织(或细胞)化学技术，是一种固相核酸分子杂交技术。自1969年J.G.Gall与M.L.Pardue首次使用同位素标记的核糖体RNA探针将特定的靶DNA序列定位于细胞核仁中，建立了以核酸分子为基础的原位杂交技术以来，原位杂交技术逐渐发展为细胞遗传学中组织、细胞、细胞核及染色体定位和相对定量的重要工具。1986年Cremer与Lieher等，通过荧光标记探针，实现了原位杂交技术在荧光显微镜下的应用。然而，传统的原位杂交技术局限于灵敏度、特异性不高，之后虽历经多次改进产生了单分子荧光原位杂交技术(smFISH，single-molecule RNAfluorescence in situ hybridization)、MERFISH技术(multiplexed error-robustfluorescence in situ hybridization)、STARmap技术(Spatially-resolved TranscriptAmplicon Readout Mapping)、BOLORAMIS技术(barcoded oligonucleotides ligated onRNA amplifified for multiplexed and parallel in situ analyses)等检测技术，但仍存在诸多缺陷。为了实现组织单细胞样品单细胞分辨率的原位基因表达检测，通常需要投放大量的识别探针，以及通过滚环扩增等方式对靶信号进行放大，而目前的挂锁探针成环扩增方式，随着探针数量的增多，会引起探针与探针之间，探针与非靶序列之间的非特异性结合的干扰，增加了探针设计的困难，影响之后的成环效率。
发明内容
为了解决以上问题，减少探针设计的复杂性和成本，减少探针之间、探针与靶基因之间的非特异性结合，同时提高原位基因表达检测的敏感性和特异性，发明人采用茎环探针结合滚环扩增(RCA)的技术路线以克服现有技术的不足。一方面，本公开提供了一种用于核酸检测的探针组合，其中，所述探针组合包含至少一个探针对，所述探针对由第一靶探针和第二靶探针组成，所述第一靶探针和第二靶探针分别识别靶核酸中的两个临近区域，所述第一靶探针的3’端包含与靶核酸杂交的第一靶识别序列，所述第二靶探针的5’端包含与靶核酸杂交的第二靶识别序列，所述第一靶探针和第二靶探针各自的3’端的茎链区与5’端的茎链区杂交形成茎环结构，所述茎环结构包括茎部结构和单链环区；以及
a)所述第一靶探针的5’端包含第一模板结合序列，所述第二靶探针的3’端包含第二模板结合序列，所述第一模板结合序列和所述第二模板结合序列用于与滚环扩增模板A杂交，所述第二靶探针3’端的序列用作滚环扩增引物a；或者
b)所述第一靶探针和所述第二靶探针不含所述模板结合序列，所述第一靶探针的两端与所述第二靶探针的两端用于彼此连接形成环状探针作为滚环扩增模板B，所述第一靶探针和/或所述第二靶探针中具有引物结合序列用于与滚环扩增引物b杂交。
在某些实施方式中，在所述a)中，所述滚环扩增模板A包含与所述第一模板结合序列杂交的第一靶探针结合序列、与所述第二模板结合序列杂交的第二靶探针结合序列以及与检测探针结合的检测探针结合序列；可选地，所述第一靶探针结合序列和/或第二靶探针结合序列的长度为6-15个核苷酸；可选地，所述滚环扩增模板A中的检测探针结合序列的长度为15-25个核苷酸；可选地，所述滚环扩增模板A的长度为50-200个核苷酸；可选地，所述滚环扩增模板A为环状单链DNA分子或可环化单链DNA分子。
在某些实施方式中，在所述b)中，所述第一靶探针的5’端和/或所述第二靶探针的3’端还包含与检测探针结合的检测探针结合序列；可选地，所述第一靶探针的5’端或所述第二靶探针的3’端中的检测探针结合序列的长度为15-25个核苷酸。
在某些实施方式中，在所述b)中，第一靶探针和第二靶探针分别具有检测探针结合序列和引物结合序列。
在某些实施方式中，所述核酸检测为原位核酸检测。
在某些实施方式中，所述靶核酸包括mRNA、lncRNA和/或miRNA。
在某些实施方式中，所述探针组合包含靶向同一靶核酸的不同位置的至少两个探针对。
在某些实施方式中，所述探针组合包含靶向不同靶核酸的至少两个探针对。
在某些实施方式中，在所述靶核酸中，所述两个临近区域之间具有0-10个核苷酸。
在某些实施方式中，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列包含第一靶探针和/或第二靶探针相应一端所述茎链区的全部或部分；可选地，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列还包含部分单链环区。
在某些实施方式中，在所述a)中，所述第一模板结合序列和/或第二模板结合序列包含第一靶探针和/或第二靶探针相应一端所述茎链区的全部或部分；可选地，所述第一模板结合序列和/或第二模板结合序列还包含部分单链环区。
在某些实施方式中，所述茎部结构的长度为6-12个核苷酸。
在某些实施方式中，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列的长度为15-25个核苷酸。
在某些实施方式中，所述a)中，所述第一模板结合序列和/或所述第二模板结合序列的长度为6-15个核苷酸。
在某些实施方式中，所述b)中，所述引物结合序列的长度为15-25个核苷酸。
另一方面，本公开还提供了一种核酸检测的方法，所述方法包括：
(1)提供待检测的样品；
(2)使所述样品与本公开任何实施方式的探针组合接触；
(3)a)当所述探针组合含有第一模板结合序列和第二模板结合序列时，加入滚环扩增模板A，所述探针组合中的第一模板结合序列和第二模板结合序列与滚环扩增模板A进行杂交；
或者b)当所述探针组合不含模板结合序列时，加入连接剂使所述探针组合中的第一靶探针的两端分别与第二靶探针的两端连接形成环状探针作为滚环扩增模板B；
(4)在a)中，以第二靶探针3’端的序列作为滚环扩增引物a，进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；或者在b)中，加入滚环扩增引物b，进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；以及
(5)加入检测探针，使所述滚环扩增产物与所述检测探针杂交；
(6)检测所述检测探针的信号，得到核酸检测结果。
在某些实施方式中，所述样品是经固定、透化处理的。
在某些实施方式中，使用phi29 DNA聚合酶进行所述滚环扩增。
在某些实施方式中，所述连接剂包括选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶的连接酶和选自CircLigase环化酶、ssDNA/RNA环化连接酶的环化酶。
在某些实施方式中，在步骤(2)和步骤(3)之间和/或步骤(3)和步骤(4)之间还有洗脱步骤。
在某些实施方式中，所述核酸检测为原位核酸检测。
另一方面，本公开还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开任何实施方式的探针组合。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包含滚环扩增模板A。
本公开提供的探针组合、使用该探针的检测方法以及试剂盒具有如下技术效果中的至少一种：
1)探针对中的双茎环结构不仅可以防止分子内部形成二聚体，还可以降低探针之间以及探针与靶核酸间的非特异性结合。
2)在涉及滚环扩增模板A的实施方式中，可以同时将滚环扩增模板A和茎环结构的探针对同时施用于样品进行杂交反应，减少了杂交步骤；同时可以通过成环反应预先制备滚环扩增模板A作为储备试剂，避免检测过程中的成环步骤，缩短了实验时长。
3)在涉及滚环扩增模板A的实施方式中，一对茎环结构的靶探针同时特异性地结合到靶区域，茎环结构打开并与滚环扩增模板A牢固结合，而只有一条茎环结构的靶探针与靶核酸结合时，该茎环探针与滚环扩增模板A的结合不稳定，不能产生滚环扩增产物，降低了非特异性结合信号，减少了背景噪音。
4)在涉及滚环扩增模板B的实施方式中，每个探针对在连接剂的作用下直接成环作为滚环扩增模板B，简化了实验步骤。
5)通过同一条mRNA设计多组探针，进一步提高了低质量mRNA可检测性，提高了低丰度mRNA检测信噪比，增加了的灵敏度，可以用于单细胞样本、冷冻切片(fresh frozen)样本以及FFPE(formalin fixation and paraffin embedding)样本的直接原位检测单分子mRNA，避免了反转录效率低造成的分子数减少，可实现亚细胞水平mRNA检测。
6)可以通过调节探针的结构从而用于mRNA，lncRNA，miRNA等多种靶核酸类型的检测。
附图说明
图1显示的是本公开的实施例1中制备的环状DNA探针的电泳图。
图2显示的是本公开的实施例2中环状DNA探针与茎环探针对的滚环扩增产物的电泳图。
图3显示的是本公开的实施例3中环状DNA探针与茎环探针对检测的细胞中BIRC5基因(A)、ACTB基因(B)和阴性对照(C)的mRNA表达情况。
图4显示的是本公开的实施例4中成环茎环探针对检测的细胞中BIRC5基因(A)、ACTB基因(B)和阴性对照(C)的mRNA表达情况。
图5显示的是本公开的实施例4中无茎环结构的挂锁探针检测的细胞中BIRC5基因(A)、ACTB基因(B)和阴性对照(C)的mRNA表达情况。
图6显示的是本公开的探针对与挂锁探针检测相同细胞中相同基因表达的结果统计图。
图7显示的是根据本公开的一个实施方式的探针对的结构示意图。
图8显示的是本公开的涉及滚环扩增模板A的某些实施方式的示意图，其中探针对在与靶核酸结合后茎环结构展开，然后该探针对进一步与滚环扩增模板A结合。
图9显示的是本公开的涉及滚环扩增模板B的某些实施方式的示意图，其中探针对在与靶核酸结合后茎环结构展开，然后该探针对连接成环。
图10显示的是本公开的实施例1中制备的环状DNA探针的示意图。
图11显示的是本公开的涉及滚环扩增模板A的某些实施方式的检测流程图。该过程中，首先设计至少一对具有茎环结构的靶探针，该成对的茎环结构探针包含两条分别与目标区域特异性结合的寡核苷酸序列，即第一靶探针和第二靶探针，其中第一靶探针的3’端包含与靶核酸目标区域的5’端特异性结合的靶识别序列，该序列能够与第一靶探针的5’端区域杂交形成茎环结构，第二靶探针5’端包含与靶核酸目标区域的3’端特异性结合的靶识别序列，该序列能与第二靶探针3’端区域互补形成茎环结构；同时还设计了至少一条环状单链DNA探针，其包含检测探针结合序列以及分别与第一靶探针5’端互补结合、与第二靶探针3’端互补结合的两个探针结合序列；将环状单链DNA探针、成对的茎环结构靶探针与细胞样品中mRNA杂交，目标mRNA的两条茎环结构靶探针结合到邻近的靶向区域，茎环结构展开，展开的末端序列分别与环状单链DNA探针杂交结合，稳定结合后将多余的探针和/或滚环扩增模板洗脱掉，加入phi29 DNA聚合酶，以第二靶探针的3’末端为引物进行滚环扩增，生成扩增产物。滚环扩增反应之后，加入检测探针实现原位多重检测。在此类情况下，如果第一靶探针和第二靶探针中的一条与非靶向区域发生非特异性结合(即脱靶)，另一条靶探针则难以结合到该脱靶区域的临近区域，这样单链环状DNA探针就不能与发生非特异性结合的那一条探针稳定结合，从而不能启动滚环扩增，也就不能形成有效的滚环扩增产物(RCP)，保证了检测的特异性。
图12显示的是本公开的涉及滚环扩增模板B的某些实施方式的检测流程图。该过程中，首先设计至少一对具有茎环结构的靶探针，该成对的茎环结构探针包含两条分别与目标区域特异性结合的寡核苷酸序列，即第一靶探针和第二靶探针，其中第一靶探针的3’端包含与靶核酸目标区域的5’端特异性结合的靶识别序列，该序列能够与第一靶探针的5’端区域杂交形成茎环结构，第二靶探针同样包含与靶核酸目标区域的3’端特异性结合的靶识别序列，该序列能与第二靶探针3’端区域互补形成茎环结构，第一靶探针的中间包含一段引物结合序列，用于结合滚环扩增引物，第二靶探针中间包含一段检测探针结合序列，该序列可以是特异性编码的序列，用来在多基因检测中区分多个基因。当一对茎环探针结合到邻近的靶向区域后，茎环结构展开，在DNA连接酶作用下完成靶核酸结合处的连接，连接完成后，两条探针的另外两端在DNA环化酶的作用下连接成环作为滚环扩增模板B。滚环引物与滚环扩增模板B结合后在phi29 DNA聚合酶作用下进行滚环扩增反应，形成原位滚环扩增产物。向滚环扩增产物中加入荧光标记的检测探针实现RNA的原位检测。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，所属领域技术人员可由说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
以下对本申请做进一步描述：在本文中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
在本文中，术语“检测”通常是指测定靶标核酸是否存在或靶核酸的任何形式的量度指标(例如表达丰度、表达量在某一时间内的变化、表达的位置等)的方式。因此，“检测”可包括以任何方式确定、测量、评估或分析靶核酸的存在或不存在或数量或位置。包括定量(包括半定量)和定性的测定、测量或评估。此类测定、测量或评估可能是相对的，例如检测样品中两个或更多不同靶核酸时，或者是绝对的。因此，就样品中靶核酸的定量而言，术语“定量”可以指绝对定量或相对定量。绝对定量可通过纳入一种或多种已知浓度的对照核酸并且/或者将靶核酸的测得水平与已知对照相比较来进行。或者，相对定量可通过将两种或更多不同核算的测定量彼此比较从而得出两种或更多不同核酸各自的相对量，即相对于彼此的相对定量。
在本文中，术语“原位”指靶核酸的天然状态，即靶核酸在其通常所在的细胞或组织内。因此，“原位检测”可以是指天然的或原生的靶核酸的定位和/或定量。换言之，可以检测在其原生环境中或情况下的靶核酸。即靶核酸未离开其天然存在的位置，包括未被分离或纯化或转移到其他位置或介质等的靶核酸。通常，该术语是指出现于细胞内或出现于细胞或组织样品内的靶核酸，例如，其在细胞或组织内的天然位置和/或其天然细胞环境内的位置。在某种情况下，原位检测包括检测组织样品例如组织切片中的靶标RNA。其他实施方式中，所述方法可对分离的细胞样品实施，此时细胞本身则是不在原位的，原位则指的是靶核酸在细胞中所处的位置。
在本文中，术语“探针组合”通常是指一对以上探针的集合，其通过对靶核酸(或目标核酸)的识别、结合(通过杂交配对的方式)而实现对靶核酸的定位和/或定量。探针组合中的各个探针通常是一段寡核苷酸，例如一段单链DNA分子。在某些实施方式中，探针组合可以包含1个探针对，这对探针靶向靶核酸中的两个临近区域，并分别与这两个临近区域特异性地杂交结合。在某些实施方式中，探针组合可以包含2个以上探针对，例如3个以上、例如5个以上、例如8个以上、例如10个以上、例如15个以上、例如20个以上、例如25个以上、例如30个以上、例如35个以上、例如40个以上、例如45个以上、例如50个以上、例如55个以上探针对，其上限没有特别限制，可以根据具体的检测目的确定探针组合中使用的探针对的数量。在某些实施方式中，探针组合中的2个以上探针对可以各自靶向同一靶核酸序列中的不同位置，在RCA反应后增加同一基因的RCA产物信号，该方式可以用于RNA表达低的样品检测，或RNA完整性较差的样品，例如FFPE样品。在某些实施方式中，探针组合中的2个以上探针对可以各自靶向不同靶核酸序列(例如其中的1个探针对靶向基因BIRC5的mRNA，另1个探针对靶向基因ACTB的mRNA，还可以有其它的探针对靶向其它任意靶核酸)，在RCA反应后，可以检测不同基因的RCA产物信号，该方式可以用于同时检测样品中多个基因RNA的表达水平。在某些实施方式中，探针组合中的2个以上探针对可以靶向不同靶核酸序列，其中1个以上探针对各自靶向同一靶核酸序列中的不同位置，例如探针组合中包含15个探针对，其中探针对1-3靶向基因A，探针对4-6靶向基因B，探针对7-9靶向基因C，探针对10-11靶向基因D，探针对12-15靶向基因E；在RCA反应后，可以检测不同基因的RCA产物信号。这种情况下可以同时检测样品中多个基因RNA的表达水平，并且每个基因的检测信号都较一对探针更强。上述关于15个探针对的描述仅作为示例，实际上探针组合中探针对的数目可以是任何符合需要的数目，靶向不同核酸的数目也可以是各不相同的，例如靶向基因A的为3个探针对，靶向基因B的为5个探针对，靶向基因C的为8个探针对，等等。
在本文中，术语“探针对”通常是指两条在功能上互相配合的探针，通常一起发挥作用共同识别靶核酸位点并在后续实验条件下被直接或间接检测到。探针对由第一靶探针和第二靶探针组成，第一靶探针和第二靶探针分别识别靶核酸中的两个临近区域，第一靶探针的3’端包含与靶核酸杂交的第一靶识别序列，第二靶探针的5’端包含与靶核酸杂交的第二靶识别序列，第一靶探针和第二靶探针各自的3’端的茎链区与5’端的茎链区杂交形成茎环结构，该茎环结构包括茎部结构和单链环区；以及
a)第一靶探针的5’端包含第一模板结合序列，第二靶探针的3’端包含第二模板结合序列，第一模板结合序列和第二模板结合序列用于与滚环扩增模板A杂交，第二靶探针3’端的序列用作滚环扩增引物a；或者
b)第一靶探针和第二靶探针不含模板结合序列，第一靶探针的两端与第二靶探针的两端用于彼此连接形成环状探针作为滚环扩增模板B，第一靶探针和/或第二靶探针中具有引物结合序列用于与滚环扩增引物b杂交。
在本文中，“第一靶探针”和“第二靶探针”中的“第一”、“第二”仅为了对本公开的探针对进行描述的目的，通过“第一”、“第二”的命名方式对其中的两条探针进行描述，仅为了清楚的目的，而不表示对它们与靶核酸杂交位置(在本文中也称做临近区域)的限定，即以靶核酸5’端至3’端的方向，第一靶探针的杂交位置可以在第二靶探针杂交位置的上游，也可以在第二靶探针杂交位置的下游。类似地，“第一靶识别序列”、“第一模板结合序列”表示它们位于“第一靶探针”中，“第二靶识别序列”、“第二模板结合序列”表示它们位于“第二靶探针”中。
更具体地，在a)的情况下，当第一靶识别序列和第二靶识别序列与靶核酸杂交后，茎环结构展开并释放出第一模板结合序列、第二模板结合序列，第一模板结合序列和第二模板结合序列与滚环扩增模板A杂交，以第二靶探针3’端的第二模板结合序列为滚环扩增引物a，从而进行滚环扩增。
更具体地，在b)的情况下，当第一靶识别序列和第二靶识别序列与靶核酸杂交后，茎环结构展开并释放出第一靶探针的5’端、第二靶探针的3’端以及第一靶探针和/或第二靶探针中的引物结合序列，第一靶探针的两端分别与第二靶探针的两端连接形成环状探针，环状探针作为滚环扩增模板B，引物结合序列与滚环扩增引物b杂交，从而进行滚环扩增。
第一靶探针或第二靶探针通常是指一段寡核苷酸序列。在本文中，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“DNA分子”可以是任何长度的核苷酸(例如，核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸)的聚合形式，在允许的各种应用中，这些术语可以互换使用。该术语可以包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。该术语可以包括修饰的(例如，甲基化、封端、锁核酸修饰和/或其他任何现有技术已知的基团改变)或未修饰的核苷酸。在某些实施方式中，第一靶探针/第二靶探针是一段单链DNA分子，该单链DNA分子的5’端和3’端互补杂交从而形成带有部分双链结构(茎部结构)和部分单链结构(单链环区)的茎环探针，也称为发夹探针。该茎环探针/发夹探针的茎部结构可以是平末端，也可以是粘性末端。第一靶探针和第二靶探针的长度可以是相同的也可以是不同的，在第一靶探针和第二靶探针中，除了靶识别序列和/或模板结合序列之外，其它部分的核苷酸可以是相同的也可以是不同的。在满足本公开的目的的前提下，第一靶探针和第二靶探针的长度以及核苷酸组成可以由本领域技术人员根据具体的检测目的确定。
在粘性末端的情况下，第一靶探针和第二靶探针可以均为粘性末端，即，第一靶探针的序列包含：5’端的单链区，5’端的茎链区，单链环区，3’端的茎链区；第二靶探针的序列包含：5’端的茎链区，单链环区，3’端的茎链区，3’端的单链区。也可以是：第一靶探针为粘性末端，第二靶探针为平末端；或者第一靶探针为平末端，第二靶探针为粘性末端。
在平末端的情况下，第一靶探针和第二靶探针可以均为平末端(例如图7中所示)，第一靶探针和第二靶探针的序列各自包含：5’端的茎链区，单链环区，3’端的茎链区。
在某些实施方式中，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列包含第一靶探针和/或第二靶探针相应一端茎链区的全部或部分；可选地，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列还可以包含部分单链环区。可选地，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列还可以包含粘性末端(5’端的单链区/3’端的单链区)的全部或部分。
在某些实施方式中，所述第一模板结合序列和/或第二模板结合序列包含第一靶探针和/或第二靶探针相应一端茎链区的全部或部分；可选地，所述第一模板结合序列和/或第二模板结合序列还包含部分单链环区。
在本文中，靶核酸中的“两个临近区域”是指中间间隔不超过10个核苷酸的两个区域。更具体地，当第一个区域的最后一个核苷酸与第二个区域的第一个核苷酸的距离是0至10个核苷酸时，认为这两个区域是临近区域。例如，两个临近区域之间通常具有不超过10个(9，8，7，6，5，4，3，2或1个)核苷酸。分别与第一靶识别序列与第二靶识别序列互补杂交的两个临近区域也可以是直接邻接的位置(即距离0nt)。在涉及滚换扩增模板B的某些实施方式中，当两个临近区域之间具有1个以上核苷酸时，可以先利用DNA聚合酶将第一靶探针和第二靶探针之间的缺口补齐，然后再用连接酶连接。
在本文中，术语“茎链区”通常是指本申请的茎环探针中互补杂交从而形成双链茎部结构的单链寡核苷酸序列，包括5’端的茎链区和3’端的茎链区。5’端的茎链区、3’端的茎链区和茎部结构的长度确定为：自5’端和3’端第一对互补配对的核苷酸开始到直接邻接单链环区的一对互补配对的核苷酸为止的长度。由于中间允许不影响本公开的发明目的的错配，因此，茎部结构的长度、5’端的茎链区长度和3’端的茎链区长度可能相同也可能不同。在本文中，“相应一端茎链区”是指第一靶识别序列、第二靶识别、第一模板结合序列、第二模板结合序列各自所在的那一端(5’端或3’端)的茎链区。可以按照具体的应用目的设计茎部的长度，通常情况下茎部的长度过短会导致茎部不稳定，过长则不容易打开，在某些实施方式中，所述茎部结构的长度可以是6-12个核苷酸，例如7-10个核苷酸、为6-7个核苷酸、7-11个核苷酸、6-10个核苷酸、6-11个核苷酸、6-9个核苷酸或6-8个核苷酸。
在本文中，术语“靶识别序列”是指第一或第二靶探针上与靶核酸互补的序列。第一靶识别序列与第二靶识别序列互补杂交于靶核酸上的两个临近区域。通常可以根据需要检测的靶核酸选择靶识别序列的长度，靶识别序列的长度太短可能降低结合特异性，太长则可能使杂交效率降低，每个靶识别序列的长度通常情况下可以是约15-25个核苷酸，例如18-23个、18-21个、15-20个、18-22个、17-24个。
在本文中，当涉及某个序列或区域(例如靶识别序列或形成茎环结构的区域等)在探针序列中的位置时，在没有明确定义的情况下，术语“5’端”或“3’端”通常是指某个序列在探针中的相对位置，而并非指该序列严格地包含5’末端的第一个核苷酸或3’末端的第一个核苷酸。例如在滚环扩增模板B情况下，“第二靶探针的3’端还包含与滚环扩增引物结合的引物结合序列”是指引物结合序列相对于靶识别序列位于该探针的3’端，该引物结合序列可以包含3’末端的第一个核苷酸，也可以不包含3’末端的第一个核苷酸(例如在该引物结合序列的3’端还可以有检测探针结合序列)。
在本文中，术语“茎环结构展开”通常是指所述茎环结构中茎部结构的核苷酸配对被打开从而使探针成为线性单链状态。茎环结构展开是通过靶识别序列与靶核酸的杂交结合实现的。参见例如Xiaohui Liu等，Science advances,2022,8(2):eabk0133.；Saka,S.K.等，Nature biotechnology,37(9),1080-1090。发夹探针茎区和环区的长度可以根据本领域公知的此类探针设计原则来设计或选择。仅作为举例，茎区的长度可以是至少7个核苷酸，例如至少7个或8个核苷酸。很多优秀的核酸分析软件可以帮助设计、分析探针杂交互配等，比如NUPACK核酸分析设计软件。
在本文中，术语“滚环扩增模板”通常是指一段环状单链DNA分子(也可称作环状单链DNA探针)或一条以上可环化的单链DNA分子，它们可以作为模板启动滚环扩增。本文中的滚环扩增模板A是能够与本申请的第一靶探针和第二靶探针结合并以其中一条探针的结合区序列作为引物启动滚环扩增的滚环扩增模板，它不与靶核酸杂交结合。滚环扩增模板A在与靶探针接触时可以是已经连接好的环状单链DNA探针，也可以是一条以上可环化的单链DNA分子，在与靶探针接触后在合适的条件下(例如在连接酶和/或聚合酶的作用下)连接成环。滚环扩增模板A包含与所述第一模板结合序列杂交的第一靶探针结合序列、与所述第二模板结合序列杂交的第二靶探针结合序列，还包含与检测探针结合的检测探针结合序列；在某些实施方式中，所述第一靶探针结合序列和/或第二靶探针结合序列的长度为6-15个核苷酸，例如7-14个核苷酸、例如7-10个核苷酸、7-11个核苷酸、8-10个核苷酸、9-12个核苷酸、10-14个核苷酸或12-14个核苷酸。在某些实施方式中，所述滚环扩增模板A的长度为50-200个核苷酸，例如50-70个、70-120个、60-180个、70-150个、80-120个、90-180个、100-200个、50-150个、80-150个、90-150个、90-140个、80-160个、70-130个、60-120个核苷酸。在某些实施方式中，滚环扩增模板A在与第一靶探针和第二靶探针接触时为环状单链DNA分子。在某些实施方式中，滚环扩增模板A在与第一靶探针和第二靶探针接触时为一条或两条单链DNA分子，在与第一靶探针和第二靶探针接触后再进行环化从而形成环状单链DNA分子；一条单链DNA分子的自我环化或者两条单链DNA分子互相连接成为环状单链DNA分子的方法都是本领域已知的。本文中的滚环扩增模板B是本申请的第一靶探针和第二靶探针互相连接成环后形成的滚环扩增模板。在这种情况下，第一靶探针和第二靶探针的5’端有磷酸化修饰，以允许它们彼此连接成环。第一靶探针的3’端包含第一靶识别序列，第二靶探针的5’端包含第二靶识别序列，第一靶探针的5’端和/或所述第二靶探针的3’端还包含与检测探针结合的检测探针结合序列。在滚环扩增模板B的情况下，检测探针结合序列和引物结合序列可以位于一个探针对的同一条靶探针中，例如第一靶探针自5’端至3’依次包含：1)引物结合序列、检测探针结合序列、第一靶识别序列；或者2)检测探针结合序列、引物结合序列、第一靶识别序列；和/或，第二靶探针自5’端至3’依次包含：1)第二靶识别序列、引物结合序列、检测探针结合序列；或者2)第二靶识别序列、检测探针结合序列、引物结合序列。检测探针结合序列和引物结合序列也可以分别位于一个探针对的两条靶探针中：例如：第一靶探针自5’端至3’依次包含：引物结合序列、第一靶识别序列，第二靶探针自5’端至3’依次包含：第二靶识别序列、检测探针结合序列。在涉及滚环扩增模板B的某些实施方式中，第一靶探针和第二靶探针分别包含检测探针结合序列或引物结合序列的一部分，当第一靶探针和第二靶探针彼此连接成环后，分别位于第一靶探针和第二靶探针中的部分检测探针结合序列或部分引物结合序列连接在一起形成完整的检测探针结合序列或引物结合序列。
在某些实施方式中，可以根据具体的检测目的设计检测探针结合序列的长度。检测探针结合序列的长度过短可能降低结合特异性，过长可能会使杂交效率降低。通常情况下，滚环扩增模板A和/或滚环扩增模板B中的检测探针结合序列的长度为15-25个核苷酸，例如18-23个、18-21个、15-20个、18-22个、17-24个核苷酸。在涉及滚环扩增模板B的情况下，扩增模板B中的检测探针结合序列也被称作第一靶探针中的检测探针结合序列和/或第二靶探针中的检测探针结合序列。
在涉及滚环扩增模板A的某些实施方式中，可以根据具体的滚环扩增模板A设计模板结合序列的长度，模板结合序列的长度过短，则可能会降低与滚环扩增模板A的特异性结合，并且结合力弱，结合不稳定；如果模板结合序列的长度过长，则可能导致单条靶探针序列即可与滚环扩增模板A稳定结合，从而增加非特异性检测，降低灵敏度。通常，第一模板结合序列和/或第二模板结合序列的长度可以为6-15个核苷酸，例如7-14个核苷酸、7-10个、7-11个、9-13个、9-14个、11-13个或12-14个核苷酸。
在涉及滚环扩增模板B某些实施方式中，可以根据具体的检测目的设计引物结合序列的长度。引物结合序列的长度过短可能会降低结合特异性，太长则会降低杂交效率。通常情况下，引物结合序列的长度为15-25个核苷酸，例如18-23个、18-21个、15-20个、18-22个、17-24个核苷酸。
在某些实施方式中，所述探针组合包含以下核酸组合中的任意一种以上：
1)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸序列；
2)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核酸序列；
3)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核酸序列；
4)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核酸序列；
5)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核酸序列；
6)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的核酸序列；
7)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的核酸序列；
8)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的核酸序列；
9)SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的核酸序列；
10)SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的核酸序列；
11)SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的核酸序列；或
12)SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示的核酸序列。
在某些实施方式中，所述滚环扩增模板A包含SEQ ID NO：17、24-25中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中，所述滚环扩增引物b包含SEQ ID NO：32所示的核酸序列。
在某些实施方式中，所述检测探针包含SEQ ID NO：26和/或27所示的核酸序列。
在本文中，术语“可环化”表示构成可环化探针的寡核苷酸呈线性分子的形式，具有可连接的末端(例如，5’末端具有磷酸化修饰)，该线性分子可通过末端直接或间接连在一起即彼此相连而环化，或者通过末端分别与居间(“缺口”)寡核苷酸的对应末端相连或与可环化寡核苷酸的延伸3’端相连而环化。
在本文中，术语“滚环扩增(RCA)”通常是指以环状DNA为模板，通过一个引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs合成单链DNA，此单链DNA包含许多重复的模板互补片段。由于其信号放大和高灵敏度的特点，被广泛应用于组织细胞原位测序上，例如Lee J.等开发了基于滚环扩增的FISSEQ(Fluorescent in situ sequencing)技术，通过将mRNA反转录为cDNA，通过环化酶形成单链环区，然后通过利用滚环扩增技术(RCA)产生信号放大。滚环扩增技术是本领域已知的(参见例如Baner等，Nucleic Acids Research，26:5073-5078，1998；Lizardi等，Nature Genetics 19:226，1998；Schweitzer等，Proc.NatlAcad.Sci.USA 97:10113-119,2000；Faruqi等，BMC Genomics2:4，2000；Nallur等，Nucl.Acids Res.29:el 18，2001；Dean等，Genome Res.11:1095-1099，2001；Schweitzer等，Nature Biotech.20:359-365，2002；美国专利号6054274、6291187、6323009、6344329和6368,801)。
在本文中，术语“滚环扩增引物”通常是指一段能够与滚环扩增模板(例如上述滚环扩增模板A和/或B)杂交并在合适的条件下启动滚环扩增的寡核苷酸。滚环扩增引物的设计以及启动滚环扩增的反应条件(例如温度、时长、离子浓度等)都是本领域已知的，所属领域技术人员可根据具体的检测目的进行选择。在本文中，滚环扩增引物a是指靶探针3’端的一段寡核苷酸，它可以与上述滚环扩增模板A杂交并在合适的条件下启动滚环扩增；滚环扩增引物b是指在涉及滚环扩增模板B的某些实施方式中，任何能够与滚环扩增模板B杂交并在合适的条件下启动滚环扩增的寡核苷酸。在某些实施方式中，滚环扩增引物a和/或滚环扩增引物b的长度可以是15-25个核苷酸例如18-23个、18-21个、15-20个、18-22个、17-24个核苷酸。
在本文中，术语“检测探针”通常是指可以在杂交或退火条件下与滚环扩增产物杂交结合从而确定靶核酸的存在和水平的寡核苷酸序列。所述检测探针包含可检测标记，所述可检测标记可被测量和定量。在某些实施方式中，检测探针带有单个可检测标记。在某些实施方式中，检测探针带有多个可检测标记(例如，2个或3个)。
在本文中，术语“可检测标记”是指在检测条件下，能够提供可检测信号的任何组分，包括直接的和间接的可检测的标记。可检测标记包括可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或其它手段间接或直接检测的任何组分。例如，用标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素，荧光染料(例如荧光素，德士古红，罗丹明，荧光团标记如阿利克斯Fluor标记、FITC、TAMTA、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)及SYBR GreenⅠ等)，多环芳烃吲哚、萘、蒽、芘等，芳香杂环化合物吖啶、香豆素、菲锭类等，镧系稀土的螯合物，藻红素N、哌洛宁、色霉素A3等。所述可检测标记可以使用光电检测器(例如荧光显微镜)来检测产生的信号。当用于单细胞多参数和多细胞多参数多重测定时，可以通过定量成像和荧光共焦显微镜术来识别输入细胞类型并读取参数，荧光共焦显微镜的方法是本领域已知的(例如参见Methodsin Molecular Biology，第122卷，Humana Press，1998)。
在本文中，术语“检测探针的信号”通常是指由上述可检测标记提供的可被检测到的信号，可以通过对该信号的检测和/或分析实现对靶核酸的识别、定位和/或定量。
在本文中，原位核酸检测的方法中包含本公开任一实施方式的探针组合。在该方法中，步骤(2)和(3)可以依次进行，也可以同时进行，例如当涉及滚环扩增模板A时，即探针组合和滚环扩增模板A时可同时加入样品，在这种情况下，探针组合先与其靶序列杂交，茎环结构打开，然后滚环扩增模板A与打开的探针组合杂交。例如当涉及滚环扩增模板B时，探针组合先与其靶序列杂交，茎环结构打开，洗掉多余探针及杂交缓冲液后，然后加入连接剂使探针组合中的第一靶探针的两端分别与第二靶探针的两端连接形成环状探针作为滚环扩增模板B。在某些实施方式中，可以通过洗涤步骤来提高特异性，例如在探针组合与靶核酸杂交之后，和/或在滚环扩增模板A与打开的探针组合杂交之后和/或连接步骤之后包括一个或多个洗涤步骤。通过洗去未结合的、非特异性结合的和/或未连接的反应物可以降低背景噪音，提高特异性。例如，在所述方法中，在步骤(2)和步骤(3)之间和/或步骤(3)和步骤(4)之间还可以有洗脱步骤。
在本文中，术语“杂交”、“可杂交的”或者“互补的”通常是指在合适的温度和溶液离子强度的体外和/或体内条件下，核酸(例如RNA，DNA)包含的核苷酸序列能够特异性地非共价结合(即形成Watson-Crick碱基对和/或G/U碱基对)至另一个核酸序列。Watson-Crick碱基配对包括：腺嘌呤/腺苷(A)与胸苷/胸腺嘧啶(T)配对，A与尿嘧啶/尿苷(U)配对，鸟嘌呤/鸟苷(G)配对与胞嘧啶/胞苷(C)配对。在某些实施方式中，两个RNA分子(例如，dsRNA)之间的杂交，或者DNA分子与RNA分子的杂交(例如，当探针的靶识别序列与mRNA配对时等)，G也可以与U碱基配对。杂交需要两个核酸包含互补序列，但是不能排除碱基之间可能的错配。适用于两种核酸之间杂交的条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域众所周知的。两个核苷酸序列之间的互补程度越大，具有这些互补序列的核酸的杂交体的解链温度(Tm)的值越大。
在本申请中，术语“靶核酸”或者“靶多核苷酸”通常是指一段需要被识别、检测、定位或捕获的目的核苷酸序列。在以本申请的探针组合作为识别、检测、定位或捕获的方式下，所述靶核酸通常包含与探针对中的两条探针具有互补性的一段连续或不连续的序列，该序列也可以称为靶序列。靶序列与探针对的完全互补性不是必需的，需要的条件是存在足够的互补性以引起杂交并且实现探针对靶核酸的识别和定位。靶核酸可以是任何来源的多核苷酸，例如，来自于动物、植物、微生物体的核酸序列，可以包括mRNA或由mRNA反转录获得的cDNA；例如，该靶核酸还可以是来自于福尔马林固定石蜡包埋的(Formalin-Fixed andParrffin-Embedded，FFPE)含有遗传物质的样品；例如，该靶核酸还可以来自于单细胞样品或组织样品。
靶核酸可以是存在于细胞中的任何多核苷酸分子(例如，DNA分子；RNA分子，修饰的核酸分子等)。在一些实施方式中，靶核酸是编码RNA(例如mRNA)。在某些实施方式中，靶核酸是非编码RNA(例如tRNA，rRNA，microRNA(miRNA)，成熟miRNA，未成熟miRNA，LncRNA(长链非编码RNA)等)。在某些实施方式中，靶核酸是RNA分子(例如mRNA，前mRNA等)的剪接变体。优选地，合适的靶核酸可以是未剪接的RNA(例如，pre-mRNA，mRNA)，部分剪接的RNA或完全剪接的RNA等。
在本文中，术语“样品”可以是任何需要对靶核酸进行检测的样品。样品中可能含有靶核酸，也可能不含有靶核酸，这将通过检测来确定。样品中可以含有1种以上靶核酸。样品可以包含任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。此类生物样品可以包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类(包括蓝绿藻)、真菌、细菌、原生动物等等。样品可以是为了用于本公开的方法而经任何方便或期望的方式预处理过的。针对原位检测，样品可以是其中可能存在RNA分子的任何细胞样品，只要这种样品适合进行定位原位检测。通常，样品可以是任何可能存在RNA的生物、临床或环境样品，特别是其中的RNA存在于固定、可检测或能够可视化的位置的样品。因此，样品将是反映常规或天然(“原位”)RNA定位的任何样品，即RNA通常或天然存在于其中的任何样品。样品可以是细胞或包含细胞的组织。其中可以通过检测RNA来揭示RNA的定性性质，即它是否存在，或RNA的核苷酸序列或RNA内一个或多个核苷酸的存在情况和/或鉴定信息，以及相对于细胞其他特征的定位。细胞样品可以是新鲜制备的或经任何方便的方式预处理过的，例如固定或冷冻。因此，可以使用新鲜、冷冻或固定的细胞或组织，例如FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)组织。样品可以包含任何含RNA的细胞类型。代表性样品包括临床样品，例如全血和血液衍生品、血细胞、组织、组织活检，以及其他样品，例如细胞培养物和细胞悬液等。原位检测的代表性样品还可以包括固定组织切片、新鲜冷冻组织或包含一个或多个细胞的细胞学制备物。
在本文中，术语“固定”可以是对样品进行处理从而使样品中所含的靶核酸(例如RNA)固定于样品中，例如令其固定于细胞基质。该过程是本领域已知的。例如，在原位杂交领域将mRNA固定于细胞的试剂是已知的。例如，利用多聚甲醛(PFA)进行固定；例如，RNA的5’磷酸基团可通过EDC介导的偶联(EDC：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)与细胞基质中蛋白质上的胺相连，从而保持RNA相对于其他细胞组分的定位。该技术被用于微小RNA及其原位杂交检测(参见Pena等，(2009)，Nat.Methods，6(2):139-141)。
在本文中，术语“透化”通常是指对样品进行处理以使其中的靶核酸(例如RNA)变得可及。透化的合适方法是本领域公知的，包括例如采用除垢剂，例如适当稀释的TritonX-100溶液，例如0.1％Triton X-100、0.5％ Triton X-100，或Tween或酸处理(例如用0.1MHCl)。组织样品的透化还包括用一种或多种酶来处理样品，例如胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶原或链霉蛋白酶等。此外，还可以按照本领域中的记载对样品进行微波处理。
在本文中，连接剂包括连接酶和环化酶。连接酶包括任何能够将本文中的靶探针、可环化DNA分子连接为环状结构的连接酶。其通常可以在寡核苷酸3'-羟基和5'-磷酸末端之间形成磷酸二酯键。代表性的连接酶包括但不限于：T4 DNA连接酶、T7连接酶、大肠杆菌连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶、Tth连接酶和/或Pfu连接酶；代表性的连接酶包括但不限于：ssDNA/RNA环化连接酶和/或CircLigase环化酶。合适的连接酶和任何需要的辅助试剂(例如缓冲液等)、杂交反应条件(例如时间、温度)等都是本领域已知的，所属领域技术人员可根据采用的连接酶进行选择。
在本文中，进行滚环扩增(RCA)的程序是本领域众所周知的。RCA反应混合物出上文所述的模板引物之外，还包括DNA聚合酶(例如phi29 DNA聚合酶)和DNA聚合酶反应所需的辅助试剂(例如缓冲液等)。所需要的聚合酶活性可由一种或多种不同的聚合酶提供。一些实施方式中，聚合酶具有外切核酸酶活性，例如5’和/或3’外切核酸酶活性。优选地采用具有3’外切核酸酶活性的聚合酶，例如phi29或基于phi29的DNA聚合酶，因为这种外切核酸酶活性可以在必要时消化发夹探针的3’端以产生杂交的3’端来作为RCA反应的引物。
在本文中，试剂盒包含本公开任一实施方式的探针组合。当需要时，试剂盒还包含本公开的滚环扩增模板A(例如环状DNA探针)。可选地，试剂盒还可以包含本公开的检测方法中一个以上步骤所需的试剂。此类试剂可以包括用于RCA反应的聚合酶，用于缺口填平延伸反应以及末端连接反应的聚合酶、连接酶、环化酶，以及用于检测RCA产物的试剂(例如检测探针)。可选地，试剂盒还可以包括核苷酸和/或缓冲液，试剂盒还可包括实施检测方法的说明书。
在本文中，术语“包含”或“包括”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
实施例
本公开实施例3-4中的靶探针的茎区设计为7nt，探针与mRNA的互补配对长度为15nt到17nt，发卡探针与环状单链DNA探针的结合长度为10nt。本公开实施例中所用细胞、试剂等均可通过商业渠道获得。表1中列出了部分材料的获取渠道。
表1
实施例1制备环状DNA单链探针
将终浓度1uM CCC1(SEQ ID NO：17)和1uM CCC-RT(SEQ ID NO：18)置于1X T4 DNA连接酶缓冲液中，95℃，5min，之后0.1℃/s降温速率降至25℃，CCC-RT作为夹板序列与CCC1的5’和3’杂交互配，形成含缺口的部分双链结构。加入1ul T4 DNA连接酶、0.5mM ATP，37℃孵育1h，将CCC1的5’和3’端环化，之后65℃孵育20min，使T4DNA连接酶失活。随后加入1ulExoI外切酶(20U/ul)和1ul ExoIII(100U/ul)外切酶，37℃孵育3h，切除CCC-RT。随后用RCA体系验证环状DNA单链探针制备是否成功，RCA体系为1X phi29缓冲液、1U/ul phi29 DNA聚合酶、0.25mM dNTP、0.2mg/ml BSA、5％甘油、100nM制作的环状DNA单链探针、有/无100nMCCC-RT)，此处CCC-RT可以作为RCA引物。结果如图1中所示，泳道1显示的是单链环状DNA探针在RCA体系中没有产生RCA产物，表明体系中不存在夹板序列CCC-RT(同时可作为RCA引物)；泳道2显示的是单链环状DNA探针在RCA体系中添加夹板序列CCC-RT后产生RCA产物，表明成功制备了单链环状DNA探针；泳道3为RCA阴性对照，为单链环状DNA探针在RCA体系中添加夹板序列CCC-RT，未加phi29 DNA聚合酶，没有RCA产物产生。
实施例2RCA产物扩增及定量
步骤1：杂交。在5ul 2X SSC中，终浓度100nM的第一和第二靶探针(SEQ ID NO：1-16)、通过实施例1制备的终浓度为100nM的环状DNA单链探针以及终浓度为100nM的ACTB基因的mRNA靶标序列(SEQ ID NO：19)在37℃下杂交3h。
步骤2：扩增。向步骤1完成后的样本中加入40ul的反应混合物，其包含(终浓度)：1X phi29缓冲液、1U/ul phi29聚合酶、0.25mM dNTP、0.2mg/ml BSA、5％甘油，37℃孵育60min。
步骤3：定量。取上述RCA产物，通过2％琼脂糖电泳检测RCA产物量。结果如图2所示。图2中，泳道1-8为由环状DNA探针、ACTB mRNA模板、与环状DNA探针配对的第二靶探针组成的滚环反应体系，泳道1-8依次对应的第二靶探针为：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14和16，第二靶探针中与环状DNA探针的配对核苷酸长度依次为：7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp和14bp，7-14bp均未见到明显的RCA产物；泳道9-16为由环状DNA探针、ACTB mRNA模板、与环状DNA探针配对的包括第一和第二靶探针的探针对(SEQ ID NO：1-16)组成的滚环反应体系，泳道9-16依次为第一和第二靶探针对：SEQ ID NO：1和2，3和4，5和6，7和8，9和10，11和12，13和14，15和16，探针对中与环状DNA探针的配对核苷酸长度依次为：7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp和14bp，其中，泳道9-17均出现明显的RCA产物；17、18分别为RCA体系的阳性，阴性对照。阳性对照为：单链环状DNA探针在RCA体系中添加CCC-RT序列后，产生RCA产物；阴性对照为：单链环状DNA探针在RCA体系中添加了CCC-RT序列，未加phi29 DNA聚合酶，没有RCA产物产生。实施例1和2所用序列如表2中所示。
表2
实施例3使用与环状探针结合的靶探针对乳腺癌细胞MDA-MB-231的2个基因mRNA表达进行原位检测
1.按照实施例1的方式，利用CCC2(SEQ ID NO：24)、CCC3(SEQ ID NO：25)分别与CCC-RT(SEQ ID NO：18)制备环状DNA单链探针，用于后续实验。
2.细胞培养与固定。人乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自美国ATCC细胞库，货号HTB-26)经RPMI1640培养基(含10％FBS，1％双抗)培养48h，用胰蛋白酶消化处理成悬浮细胞，按照6000细胞/ul的细胞浓度接种于表面经过多聚赖氨酸处理的无菌载玻片，重新培养12h。随后将载玻片放在玻片围栏中，后续所有的反应都在围栏中进行。围栏的作用为减少试剂用量，减少样本间试剂串扰。DEPC-PBS冲洗3次，每次3min，用4％ PFA常温固定30min；DEPC-PBS冲洗一次。
3.透化。细胞爬片上覆盖DEPC-PBS-0.5％Triton X-100室温孵育10min，之后用DEPC-PBS-0.05％Tween20冲洗3次。
4.探针杂交。分别针对基因BIRC5和ACTB设计第一和第二靶探针(SEQ ID NO：20-23)。细胞爬片上覆盖40ul反应混合物，其包含(终浓度)：2XSSC缓冲液、10％甲酰胺、0.1uM第一靶探针/基因、0.1uM第二靶探针/基因、0.1uM环状DNA单链探针/基因，阴性组只加入了相同浓度的第二靶探针(SEQ ID NO：21，23)，而没有加入第一靶探针(SEQ ID NO：20，22)，37℃孵育180min。之后用DEPC-PBS-0.05％Tween20洗3次。
5.滚环扩增。细胞爬片上覆盖40ul的反应混合物，其包含(终浓度)：1X phi29缓冲液、1U/ul phi29聚合酶、0.25mM dNTP、0.2mg/ml BSA、5％甘油30℃孵育过夜。
6.检测探针杂交及荧光成像。将细胞爬片覆盖检测探针(SEQ ID NO：30，31)，DAPI染料染核，成像检测。具体包括将细胞爬片用DEPC-PBS-0.05％Tween20洗3次，加入含有0.1uM检测探针RS1(SEQ ID NO：30)和RS2(SEQ ID NO：31)、20％甲酰胺的2XSSC缓冲液，37℃孵育30min，加入含100ng/ml DAPI的封片剂室温孵育5min后荧光显微镜成像(尼康显微镜，ECLIPSE Ni-U)。
成像结果如图3所示。其中，图3A为BIRC5的染色结果图，图3B为ACTB的染色结果图，图3C为阴性样本的染色结果图。其中，图3A和3B中均显示出靶基因的检测信号，图3C中没有显示出靶基因的检测信号，这表明需要一个探针对与靶基因结合才可启动滚环扩增，从而实现靶基因的特异性检测。这与实施例2的结果是一致的。本实施例所用序列如表3中所示。
表3
实施例4使用成环靶探针对乳腺癌细胞MDA-MB-231的2个基因mRNA表达进行原位检测。
1.按照实施例3中步骤2和3的方法处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231样本。
2.探针杂交。分别针对基因BIRC5和ACTB设计第一及第二靶探针(SEQ ID NO：28-31)。细胞爬片上覆盖杂交缓冲液，其包含(终浓度)：2xSSC，10％甲酰胺，0.1uM第一靶探针/基因、0.1uM第二靶探针/基因，37℃孵育90min。之后用DEPC-PBS-0.05％Tween20洗3次。
3.探针连接成环。向细胞爬片覆盖40ul反应混合物，其包含(终浓度)：1X SplintR缓冲液、0.5U/ul SplintR连接酶、1U/ul Ribolock RNA酶抑制剂，37℃孵育60min。之后用DEPC-PBS-0.05％ Tween20洗3次。随后再向细胞爬片覆盖40ul反应混合物，其包含(终浓度)：1X ssDNA/RNA CircLigase缓冲液、0.5U/ul CircLigase连接酶、1U/ul Ribolock RNA酶抑制剂、10％甲酰胺，65℃孵育60min。随后用DEPC-PBS-0.05％Tween20洗3次。
4.滚环扩增。细胞爬片上覆盖40ul的反应混合物，其包含(终浓度)：6X SSC、10％甲酰胺，0.1uM滚环引物(SEQ ID NO：32)，37℃孵育60min。随后用DEPC-PBS-0.05％Tween20洗3次。再向细胞爬片覆盖40ul的反应混合物，其包含(终浓度)：1X phi29缓冲液、1U/ulphi29聚合酶、0.25mM dNTP、0.2mg/ml BSA、5％甘油30℃孵育过夜，阴性组的体系中没有加入phi29聚合酶。
5.按照实施例3中步骤6的方法进行检测探针杂交以及荧光成像。其中检测探针如SEQ ID NO：26、27所示。成像结果如图4所示。图4A为BIRC5的染色结果图，图4B为ACTB的染色结果图，图4C为阴性样本的染色结果图。其中，图4A和4B中均显示出靶基因的检测信号，图4C中没有显示出靶基因的检测信号，这表明检测信号来自滚环扩增产物。本实施例所用序列如表4中所示。
表4
实施例5使用无茎环挂锁探针成环靶序列探针对乳腺癌细胞MDA-MB-231的2个基因mRNA表达进行原位检测。
1.按照实施例3中步骤2和3的方法处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231样本。
2.探针杂交。分别针对基因BIRC5和ACTB设计挂锁探针(SEQ ID NO：33-34)。细胞爬片上覆盖杂交缓冲液，其包含(终浓度)：6xSSC，10％甲酰胺，0.1uM挂锁探针/基因，37℃孵育过夜。之后用2xSSC，20％甲酰胺洗3遍，DEPC-PBS-0.05％ Tween20洗3次。
3.探针连接成环。向细胞爬片覆盖40ul反应混合物，其包含(终浓度)：1X SplintR缓冲液、0.5U/ul SplintR连接酶、1U/ul Ribolock RNA酶抑制剂，37℃孵育90min。之后用2xSSC，20％甲酰胺洗3遍，DEPC-PBS-Tween20洗3次。
3.按照实施例4中步骤4和5的方法进行滚环扩增、检测探针杂交以及荧光成像，阴性组为滚环反应中没有加入Phi29聚合酶。其中检测探针如SEQ ID NO：26、27所示，滚环引物如SEQ ID NO：32所示。成像结果如图5所示。图5A为BIRC5的染色结果图，图5B为ACTB的染色结果图，图5C为阴性样本的染色结果图。其中，图5A和5B中均显示出靶基因的检测信号，图5C中没有显示出靶基因的检测信号，这表明检测信号来自滚环扩增产物。本实施例所用序列如表5中所示。
表5
采用Cellprofiler4软件，根据荧光大小及强度，对实施例3-5的成像结果数据进行统计，统计结果如图6所示，实施例3中探针对与环状探针结合的方案检测灵敏度最高，检测出的两个基因的表达量最高，同时该方案可以预先制备并储存环状探针，节省实验时间；实施例4中探针对自成环的方案检测灵敏度同样优于实施例5的挂锁探针方案；与实施例5的挂锁探针方案相比，实施例3和实施例4检出的基因数在统计上均有显著性区别。在实施例3的方案中仅使用一条靶探针，实施例4的方案或实施例5的挂锁探针方案未进行滚环反应的实验中，均未检测到荧光信号，说明本实验结果真实可信。茎环探针在多靶基因检测或多探针靶基因检测方面能有效降低背景荧光信号，有助于对低丰度基因的表达检测。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。
Claims (23)
1.一种用于核酸检测的探针组合，其中，所述探针组合包含至少一个探针对，所述探针对由第一靶探针和第二靶探针组成，所述第一靶探针和第二靶探针分别识别靶核酸中的两个临近区域，所述第一靶探针的3’端包含与靶核酸杂交的第一靶识别序列，所述第二靶探针的5’端包含与靶核酸杂交的第二靶识别序列，所述第一靶探针和第二靶探针各自的3’端的茎链区与5’端的茎链区杂交形成茎环结构，所述茎环结构包括茎部结构和单链环区；以及
a)所述第一靶探针的5’端包含第一模板结合序列，所述第二靶探针的3’端包含第二模板结合序列，所述第一模板结合序列和所述第二模板结合序列用于与滚环扩增模板A杂交，所述第二靶探针3’端的序列用作滚环扩增引物a；或者
b)所述第一靶探针和所述第二靶探针不含所述模板结合序列，所述第一靶探针的两端与所述第二靶探针的两端用于彼此连接形成环状探针作为滚环扩增模板B，所述第一靶探针和/或所述第二靶探针中具有引物结合序列用于与滚环扩增引物b杂交。
2.根据权利要求1所述的探针组合，其中，在所述a)中，所述滚环扩增模板A包含与所述第一模板结合序列杂交的第一靶探针结合序列、与所述第二模板结合序列杂交的第二靶探针结合序列以及与检测探针结合的检测探针结合序列；可选地，所述第一靶探针结合序列和/或第二靶探针结合序列的长度为6-15个核苷酸；可选地，所述滚环扩增模板A中的检测探针结合序列的长度为15-25个核苷酸；可选地，所述滚环扩增模板A的长度为50-200个核苷酸；可选地，所述滚环扩增模板A为环状单链DNA分子或可环化单链DNA分子。
3.根据权利要求1所述的探针组合，其中，在所述b)中，所述第一靶探针的5’端和/或所述第二靶探针的3’端还包含与检测探针结合的检测探针结合序列；可选地，所述第一靶探针的5’端或所述第二靶探针的3’端中的检测探针结合序列的长度为15-25个核苷酸。
4.根据权利要求3所述的探针组合，其中，在所述b)中，第一靶探针和第二靶探针分别具有检测探针结合序列和引物结合序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的探针组合，其中，所述核酸检测为原位核酸检测。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的探针组合，其中，所述靶核酸包括mRNA、lncRNA和/或miRNA。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的探针组合，其中，所述探针组合包含靶向同一靶核酸的不同位置的至少两个探针对。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的探针组合，其中，所述探针组合包含靶向不同靶核酸的至少两个探针对。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的探针组合，其中，在所述靶核酸中，所述两个临近区域之间具有0-10个核苷酸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的探针组合，其中，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列包含第一靶探针和/或第二靶探针相应一端所述茎链区的全部或部分；可选地，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列还包含部分单链环区。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的探针组合，其中，在所述a)中，所述第一模板结合序列和/或第二模板结合序列包含第一靶探针和/或第二靶探针相应一端所述茎链区的全部或部分；可选地，所述第一模板结合序列和/或第二模板结合序列还包含部分单链环区。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的探针组合，其中，所述茎部结构的长度为6-12个核苷酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的探针组合，其中，所述第一靶识别序列和/或第二靶识别序列的长度为15-25个核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的探针组合，其中，所述a)中，所述第一模板结合序列和/或所述第二模板结合序列的长度为6-15个核苷酸。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的探针组合，其中，所述b)中，所述引物结合序列的长度为15-25个核苷酸。
16.一种核酸检测的方法，所述方法包括：
(1)提供待检测的样品；
(2)使所述样品与权利要求1-15中任一项所述的探针组合接触；
(3)a)当所述探针组合含有第一模板结合序列和第二模板结合序列时，加入滚环扩增模板A，所述探针组合中的第一模板结合序列和第二模板结合序列与滚环扩增模板A进行杂交；
或者b)当所述探针组合不含模板结合序列时，加入连接剂使所述探针组合中的第一靶探针的两端分别与第二靶探针的两端连接形成环状探针作为滚环扩增模板B；
(4)在a)中，以第二靶探针3’端的序列作为滚环扩增引物a，进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；或者在b)中，加入滚环扩增引物b，进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；以及
(5)加入检测探针，使所述滚环扩增产物与所述检测探针杂交；
(6)检测所述检测探针的信号，得到核酸检测结果。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述样品是经固定、透化处理的。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，使用phi29 DNA聚合酶进行所述滚环扩增。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中，所述连接剂包括选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶的连接酶和选自CircLigase环化酶、ssDNA/RNA 环化连接酶的环化酶。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中，在步骤(2)和步骤(3)之间和/或步骤(3)和步骤(4)之间还有洗脱步骤。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中，所述核酸检测为原位核酸检测。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-15中任一项所述的探针组合。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含滚环扩增模板A。
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