JP2003246794A

JP2003246794A - ヌクレオチド鎖修飾方法

Info

Publication number: JP2003246794A
Application number: JP2002049055A
Authority: JP
Inventors: Shigeki Joko; 茂樹上甲
Original assignee: Matsushita Kotobuki Electronics Industries Ltd; Matsushita Kotobuki Electronics Peripherals of America Inc
Current assignee: PHC Corp; Matsushita Kotobuki Electronics Peripherals of America Inc
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2003-09-02

Abstract

(57)【要約】【課題】ヌクレオチド鎖の３´末端に限定して修飾物
質を直接的に修飾する修飾方法を提供するものである。【解決手段】ヌクレオチド鎖３´末端に形成したアル
デヒド基とアミノ基を有する修飾物質と間でシッフ塩基
を形成させることで、ヌクレオチド鎖内の塩基に不要な
修飾物質を付加させることなく、直接的に任意の数量の
修飾物質を修飾させ、安定性の高いヌクレオチド鎖のラ
ベル化、標識化、固定化を実現させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヌクレオチド鎖の
修飾方法に関するものであり、特にヌクレオチド鎖の３
´末端を修飾物質で直接的に修飾させることによりヌク
レオチド鎖をラベル化、標識化、固定化することに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、遺伝子解析をするための手段とし
てＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸等のヌク
レオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾物質とし
て当初は放射性同位元素が採用されていたが、半減期に
よる取扱期間の制限、取扱場所の制限、被爆の問題、廃
棄の問題等のため利用が減少傾向にある。この代替とし
てフルオレセイン等の蛍光物質あるいはビオチン等を修
飾物質としてヌクレオチド鎖を修飾し、ヌクレオチド鎖
をラベル化、標識化する方法が遺伝子解析で汎用される
ようになっている。このヌクレオチド鎖を修飾する方法
として５´末端修飾法、３´末端修飾法、内部修飾法の
３つに大別できる。

【０００３】まず５´末端修飾法としては、Ｃｈｕ
Ｂ．Ｃ．Ｆら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１１巻６５１３頁１９８３年）により５´末端のリ
ン酸基を介してビオチンを修飾する方法が考案され、さ
らにビオチンとアビジンの高親和性を利用し、さらにア
ルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
等の酵素を修飾することで、酵素による化学発光を利用
して遺伝子解析の高感度化を報告している（例えば、Ｂ
ｅｃｋ．Ｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１
６巻１４３頁１９９２年、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ．
Ｉ．らＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１７巻
３９８頁１９９３年等）。

【０００４】ヌクレオチドの５´末端へのリン酸基を介
した修飾方法はＣｈｕらの方法以外に多数提案されてい
る（例えば、特許１７０６２８９号、Ａｌｖｅｓ．Ａ．
Ｍ．らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３０巻
３０８９頁１９８９年Ｃｏｃｕｚｚａ．Ａ．Ｊ．
ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３０巻６２８
７頁１９８９年、Ｔｈｅｉｓｅｎ．Ｐ．らＴｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３３巻５０３３頁１
９９２年、Ｋｅｍｐｅ．Ｔ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．１３巻４５頁１９８５年、Ｓｍｉ
ｔｈ．Ｌ．Ｍ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１３巻２３９９頁１９８５年、Ａｎｓｏｒｇ
ｅ．Ｗ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
５巻４５９３頁１９８７年、Ｃｏｏｋ．Ａ．Ｆ．
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６巻４０７
７年１９８８年、Ｒｏｇｅｔ．ＡらＮｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７巻１９８９年、Ｍｉｓｉ
ｕｒａ．Ｋ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１８巻４３４５頁１９９０年、Ｐｉｅｌｅｓ．
Ｕ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８巻
４３５５頁１９９０年等）。しかしながら５´末端
のリン酸基を介した修飾方法は、ヌクレオチド鎖への修
飾物質の修飾量は基本的に１つであり、高感度化のため
に用いるアルカリフォスファターゼは５´末端のリン酸
基の基質であり、スクレオチド鎖の５’末端のリン酸基
を解離させること、さらにアルカリフォスファターゼは
空気中に浮遊する細菌中にも存在するためヌクレオチド
鎖の５´末端のリン酸基を介して修飾した修飾物質が解
離しやすい等、修飾状態に安定性を欠くという課題があ
る。

【０００５】次にヌクレオチドの３´末端修飾法として
は、予めラベル化、標識化処理を施したデオキシヌクレ
オチド三リン酸あるいはジデオキシヌクレオチド三リン
酸を合成し（例えばＬａｎｇｅｒ．Ｐ．Ｒ．らＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８巻６
６３３頁１９８１年、特開昭６１−１１５０９４
等）、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼを利用してヌクレオチド鎖の３´側にラベル化
剤、標識化処理を施したヌクレオチド付加させるテーリ
ング法が開発されている（例えば、Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈ
ｕｒｙ．Ｒ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．３巻１０１頁１９７６年、Ｖｉｎｃｅｎｔ．
Ｃ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０巻
６７８７頁１９８２年、Ｙｏｕｓａｆ．Ｓ．Ｉ．ら
Ｇｅｎｅ３巻３０９頁１９８４年、Ｓｃｈｍｉｔ
ｚ．Ｇ．Ｇ．らＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２巻
２２２頁１９９１年、特告平７−３１１９４等）。ヌ
クレオチド鎖の３´末端修飾法は、５´末端修飾法に比
べ、修飾物質の保持安定性が高く、汎用されているが、
付加するデオキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデオ
キシヌクレオチド三リン酸に予めラベル化、標識化処理
を施すことは煩雑であり誰にでも容易に任意のラベル
化、標識化処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸
あるいはジデオキシヌクレオチド三リン酸を得ることが
困難であり、結果としてヌクレオチド鎖を修飾する修飾
物質の種類が限定される課題がある。またテーリング法
は、ヌクレオチド鎖の３´側に不要のヌクレオチド配列
を形成し、特にデオキシヌクレオチド三リン酸を利用し
た場合、反応条件によりヌクレオチド鎖に付加するヌク
レオチド数がランダムであり（Ｊａｃｋｓｏｎ．Ｄ．
Ａ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ６９巻２９０５頁１９７２年）、遺伝子解析の
高感度化は実現できるが、定量性に課題がある。またテ
ーリング法を利用した場合、不要の塩基配列を３´側に
付加してしまうため、遺伝子解析のハイブリダイダイゼ
ーションの際にミスマッチの要因となる課題がある。こ
の課題を回避するため化学合成ヌクレオチド鎖により化
学合成初期に３´末端のヌクレオチドに直接的にラベル
化、標識化のための修飾物質を修飾する方法もあり、ヌ
クレオチド鎖への修飾した修飾物質の高い保持安定性を
実現しているが、化学合成で得られるヌクレオチド鎖の
ヌクレオチド数は、合成副産物、収率等の合成能力の関
係で、１００程度であり、生体抽出及びＰＣＲ等で増幅
した１００を超えるヌクレオチド鎖の３´末端への直接
的な修飾物質の修飾は適用できないため修飾するヌクレ
オチド鎖の鎖長に制限があるという課題がある。

【０００６】次に内部修飾法としてヌクレオチド鎖を複
製させる反応の際にラベル化、標識化のための修飾物質
で予め修飾処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸
をヌクレオチド鎖内に取り込ませることでヌクレオチド
鎖をラベル化、標識化するランダムプライマー法あるい
はニックトランスレーション法が開発されている（例え
ば、Ｌａｎｇｅｒ．Ｐ．Ｒ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８巻６６３３頁１９
８１年、特表２０００−５０８７０９等）。これら方法
は、遺伝子増幅反応であるポリメラーゼ連鎖反応いわゆ
るＰＣＲ法（Ｍｕｌｌｉｓ．Ｋ．Ｂ．らＭｅｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５５巻３３５頁１９８７
年、Ｓａｉｋｉ．Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９巻、４８
７頁１９８８年、Ｓｉｅｂｅｒｔ．Ｐ．Ｄ．らＮａ
ｔｕｒｅ３５９５５７頁１９９１年、Ｈｅｉｄ．
Ｃ．Ａ．らＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６巻９８６頁
１９９６年、特許１８１４７１３、特許２０９３７３
０、特許２０９３７３１、特許２６１３８７７等）と組
み合わせることで、ヌクレオチド鎖の増幅とラベル化、
標識化を同時することが可能であり、遺伝子解析の高感
度化をもたらし、遺伝子マイクロアレイに代表される定
量的遺伝子解析のハイスループットを実現している（例
えば、Ｓｃｈｅｎａ．Ｍ．らＳｃｉｅｎｃｅ２７０
巻４６７頁１９９５年、Ｓｃｈａｌｏｎ．Ｄ．ら
ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６巻６３９頁１９９６年、Ｎ
ａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２１
巻１月号１９９９年等）。しかしながらこの方法は
遺伝子解析の高感度化は実現でき、定量性も報告してい
るが、ヌクレオチド鎖内へラベル化、標識化処理を施し
たヌクレオチドの取り込み数が、１０〜２，３０程度
（アマシャムバイオサイエンス社ウエッブサイト，ｈｔ
ｔｐ：//ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ．ｃｏｍ/ｃｙｓｃｒｉｂｅ/ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔ
ｍ，２００２年２月アクセス）と完全な遺伝子解析定量
化には課題があると同時に３´末端修飾法であるテーリ
ング法と同様にヌクレオチド鎖内に取り込ませるための
デオキシヌクレオチド三リン酸にラベル化、標識化処理
を施すことは煩雑であり、誰にでも容易に任意の修飾物
質でラベル化、標識化処理を施したデオキシヌクレオチ
ド三リン酸を得ることが困難であり、結果としてヌクレ
オチド鎖を修飾する修飾物質の種類が限定される課題が
ある。さらにヌクレオチド鎖内に修飾物質が取り込まれ
ているため遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際に
ヌクレオチド鎖の二本鎖形成において取り込まれた修飾
物質による立体障害を回避できない課題がある。

【０００７】次に従来のヌクレオチド鎖を基板に固定化
するためのヌクレオチド鎖修飾方法は、ヌクレオチド鎖
の５´末端あるいは３´末端がアミノ基、アルデヒド基
になるように修飾処理を施し、基板となるガラス、シリ
コンに表面をヌクレオチド鎖の末端がアミノ基の時はア
ルデヒド基、アルデヒド基の時はアミノ基となるように
処理を施すことによりヌクレオチド鎖の基板への固定化
が可能となり、遺伝子解析マイクロアレイを実現してい
るが、上述のヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するた
めの修飾方法でも示した通り、基板への固定化したヌク
レオチド鎖を安定に保持するためには、ヌクレオチド鎖
の３´末端にアミノ基あるいはアルデヒド基を形成する
ことが望ましく、これに適用可能なヌクレオチド鎖は、
化学合成したヌクレオチド鎖のみであるが、これも上述
のヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾方
法でも示した通り、合成能力の関係から化学合成可能な
ヌクレオチド鎖のそのヌクレオチド数は１００程度に制
限される課題がある。一方、生体由来、ＰＣＲで増幅し
た長鎖のヌクレオチド鎖を基板へ固定化する場合は、基
板表面をアミノ基となるよう表面処理を施し、ヌクレオ
チド鎖のリン酸基と基板のアミノ基による静電結合によ
り固定化し、長鎖のヌクレオチド鎖を用いたマイクロア
レイを実現しているが、基板表面に形成したアミノ基へ
のヌクレオチド鎖の結合様式はリン酸基の数に対応し、
ヌクレオチド鎖１分子中にリン酸基が多い場合、ヌクレ
オチド鎖１分子の基板占有率が高くなり、すなわち長鎖
のヌクレオチド鎖ほど基板への固定化量が少なくなる課
題がある。この課題を回避するためにヌクレオチド鎖の
５´末端あるいは３´末端に基板へ固定化するための修
飾物質を修飾することになるが、上述のヌクレオチド鎖
をラベル化、標識化するための修飾方法でも示した通
り、５´末端への修飾物質の修飾は保持安定性に欠け、
３´末端への修飾物質の修飾についても上述のヌクレオ
チド鎖をラベル化、標識化するための修飾方法でも示し
た通り、ヌクレオチド鎖３´側に余分なヌクレオチド配
列の形成等の課題があり、ヌクレオチド鎖の３´末端へ
の修飾物質の直接的な修飾には、化学合成したヌクレオ
チド鎖を適用することになるが、前記の通り、合成能力
の関係から化学合成可能なヌクレオチド鎖のそのヌクレ
オチド数は１００程度に制限される課題がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述の通り、ヌクレオ
チド鎖の３´末端部に修飾物質を修飾する方法がヌクレ
オチドのラベル化、標識化、固定化のために修飾した修
飾物質を安定に保持できるため、修飾物質の修飾部位と
して好適にもかかわらず、その修飾法が予め修飾物質で
修飾処理を施したヌクレオチドをヌクレオチド鎖の３´
側に付加する間接的な修飾法であるテーリング法かある
いは合成過程初期に予め３´末端を直接的に修飾物質で
修飾する化学合成ヌクレオチド鎖を採用するしかなく、
しかも化学合成したヌクレオチド鎖のヌクレオチド数
は、合成能力の関係で、１００程度に制限されるため、
３´末端修飾のためのヌクレオチド鎖の鎖長、修飾物質
の種類、用法、用途が極めて限定されている。本発明の
目的はヌクレオチド鎖の鎖長に関係なくヌクレオチド鎖
の３´側に直接的に簡便に任意の修飾物質を修飾させ、
安定に保持可能なヌクレオチド鎖のラベル化、標識化を
実現させる方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、ヌクレオチド
鎖３´末端に形成したアルデヒド基と修飾物質のアミノ
基との間にシッフ塩基を形成させることでヌクレオチド
に修飾物質を修飾させ、これにより修飾物質がラベル
化、標識化を目的とする場合には任意、定量性、安定性
を有した修飾をすることが可能となり、さらに修飾物質
がヌクレオチド鎖を基板へ固定化させる目的とする場合
にはヌクレオチド鎖と基板の間のリンカーとして安定、
強固な固定化を可能とすることを特徴としたものであ
る。

【００１０】上記のヌクレオチド鎖の３´末端にアルデ
ヒド基を形成させるために、ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼによりヌクレオチド鎖の３
´末端にポリウラシル塩基の配列を付加した後、ウラシ
ルＤＮＡグリコシラーゼを作用させ、ウラシル塩基とグ
リコシドのグリコシド結合を切断し、さらにアルカリ熱
処理により残存するデオキシリボース−リン酸結合を切
断する。これによりヌクレオチド鎖の３´末端にアルデ
ヒド基を形成し、アミノ基を有する修飾物質と反応さ
せ、ヌクレオチドの３´末端に修飾物質を修飾すること
を特徴としたものである。

【００１１】本発明によれば、アミノ基を有する修飾物
質をヌクレオチド鎖の３´末端側へ直接的に簡便に任意
の修飾物質を修飾させることが可能であり、ヌクレオチ
ド鎖の簡便なラベル化、標識化、固定化する方法を提供
できる。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の請求項１に記載のヌクレ
オチド鎖修飾方法は、ヌクレオチド鎖の３´末端を直接
的に修飾させることを特徴としたものであり、ヌクレオ
チド鎖内に不必要な塩基配列、修飾した塩基の取り込み
を排除し、ヌクレオチド鎖の３´末端に限定して修飾物
質の修飾を可能する方法である。

【００１３】次に本発明の請求項２に記載のヌクレオチ
ド鎖の３´末端に形成させたアルデヒド基とアミノ基を
有する修飾物質とを反応させることを特徴としたもので
あり、ヌクレオチド鎖の３´末端に形成させたアルデヒ
ド基とアミノ基との間のシッフ塩基の形成によりヌクレ
オチド鎖３´末端への修飾物質の修飾を実現するもので
ある。

【００１４】つぎに本発明の請求項３に記載のヌクレオ
チド鎖修飾方法は、修飾物質でヌクレオチド鎖の３´末
端を修飾することが遺伝子解析対象物の検出プローブあ
るいはターゲットとして標識可能となることを特徴とし
たものであり、適当なラベル化、標識化機能を有する修
飾物質をヌクレオチド鎖の３´末端へ直接的に修飾する
ことを実現するものである。

【００１５】つぎに本発明の請求項４に記載のヌクレオ
チド鎖修飾方法は、ヌクレオチド鎖３´末端とアミノ
酸、オリゴペプチド、タンパク質を直接的に融合するこ
とを可能とすることを特徴としたものであり、アミノ
酸、オリゴペプチド、タンパク質は元来、アミノ基を有
するためアルデヒド基を３´末端に形成したヌクレオチ
ド鎖に融合させることによりヌクレオチド鎖にアミノ
酸、ポリペプチド、タンパク質が有する機能をヌクレオ
チド鎖に付加することを可能とさせるものである。

【００１６】つぎに本発明の請求項５に記載のヌクレオ
チド鎖修飾方法は、修飾物質でヌクレオチド鎖の３´末
端を修飾することが遺伝子解析対象物の検出プローブあ
るいはターゲットとして貴金属、ガラス等の基板へ固定
化するためのリンカーであることを特徴とするものであ
り、修飾物質が貴金属、ガラスとの結合能を有する場
合、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するための媒体とし
て機能させることで遺伝子解析用プローブあるいはター
ゲットとして貴金属基板、ガラス基板等へヌクレオチド
鎖の安定した固定化を実現するものである。

【００１７】つぎに本発明の請求項６に記載のヌクレオ
チド鎖修飾方法は、ヌクレオチド鎖の３´末端にあるウ
ラシル塩基にウラシルＤＮＡグリコシラーゼが作用する
ことで、アルデヒド基を形成させることを特徴としたも
のであり、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによるウラシ
ル塩基とデオキシリボース間のグリコシド結合を切断す
る（Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７１巻３６４９頁１９７４
年、Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ．Ｅ．Ｃ．らＪ．Ｖｉｒｏ
ｌ．１６巻３１５頁１９７５年、Ｌｉｎｄａｈ
ｌ．Ｔ．Ｎａｔｕｒｅ２５９巻６４頁１９７６
年、Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｔ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５２巻３２８６頁１９７７年）ことによりヌ
クレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を形成するもの
である。

【００１８】つぎに本発明の請求項７に記載のヌクレオ
チド鎖修飾方法は、ヌクレオチド鎖をターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼで反応させ、ヌク
レオチド鎖の３´側にウラシル塩基を少なくとも２つ以
上連結させることを特徴としたものであり、ヌクレオチ
ド鎖の３´末端にウラシルＤＮＡグリコシラーゼの基質
となるウラシルを意図的に付加させ、分解することによ
り、ヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を形成す
るものである。

【００１９】つぎに本発明の請求項８に記載のヌクレオ
チド鎖修飾方法は、化学合成ヌクレオチド鎖の場合、３
´側にウラシルを含む塩基配列の合成を予め施しておく
ことを特徴としたものであり、ヌクレオチド鎖の３´側
にウラシルＤＮＡグリコシラーゼの基質となるウラシル
塩基を予め意図的に付加させるよう化学合成を施してお
き、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより分解すること
により、ヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を形
成するものである。

【００２０】(実施の形態1)以下に、本発明の請求項
１、請求項２、請求項３、請求項５、請求項６、請求項
７及び請求項８に記載された発明の実施の形態につい
て、図１、化１、化２を用いて説明する。

【００２１】図１は、ヌクレオチド数３０の配列を有す
一本鎖化学合成ヌクレオチド鎖に対し、本発明の修飾方
法を実施したプロセスを８モル尿素−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により追跡した結果である。

【００２２】ヌクレオチド鎖２５μＭを４単位（以下、
ｕと略す）／μｌターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、１０ｍＭ２−デオキシウリジン−５
´三リン酸、２ｍＭ塩化コバルト、１ｍＭジチオスレイ
トール、０．１Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）の
反応液に混和し、３７℃で６時間反応させ、ヌクレオチ
ド鎖の３´側にウラシル塩基を有すヌクレオチドの配列
を形成した。次にエタノール沈殿によりヌクレオチド鎖
を回収した後、０．４ｕ／μｌウラシルＤＮＡグリコシ
ラーゼ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭジチオ
スレイトール、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−
１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸−水酸化ナトリ
ウム（ｐＨ８．０）の反応液に混和し、３７℃で４時間
反応させ、先にヌクレオチド鎖３´側に形成したヌクレ
オチド配列のウラシル塩基のグリコシド結合を切断し、
さらに０．１Ｍになるよう水酸化ナトリウムを添加し、
１００℃で５分間加熱することによりウラシルの３´側
のリン酸を解離させ、ヌクレオチド鎖の３´末端にアル
デヒド基を形成させた後、アルデヒド基を形成したヌク
レオチド鎖をエタノール沈殿により回収した。予めアミ
ノ酸の一種であるシステインの側鎖に存在するチオール
基にラベル化剤として繁用される５−ヨードアセトアミ
ドフルオレセインを結合させたＳ−アセトアミドフルオ
レセインシステイン（以下、Ｃｙｓ（Ｆ）と略す）をヌ
クレオチド鎖に修飾する修飾物質として利用し、１ｍＭ
Ｃｙｓ（Ｆ）、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）
にアルデヒド基を３´末端に形成したヌクレオチド鎖を
混合し、室温で２時間反応させ、ヌクレオチド鎖の３´
末端のアルデヒド基とＣｙｓ（Ｆ）のシステイン主鎖に
存在するアミノ基の間でシッフ塩基を形成させた後、５
ｍｇ／ｍｌになるよう水素化ホウ素ナトリウムを添加
し、４℃で一昼夜反応させ、シッフ塩基を還元すること
で結合を安定化させた。

【００２３】図１に示す通り、ヌクレオチド数３０の一
本鎖のヌクレオチド鎖（１）にターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを反応させることにより
３´側にウラシル塩基を有すヌクレオチドを付加するこ
とでヌクレオチド鎖が長くなり、ヌクレオチド鎖のヌク
レオチド数が１００程度になったことを示している
（２）。次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼとの反応さ
らにアルカリ熱処理を施すことにより３´側に形成した
ヌクレオチドのウラシル塩基のグリコシド結合及びウラ
シル３´末端のリン酸が切断され、ヌクレオチド鎖もヌ
クレオチド数３０に短くなることを示している（３）。
次にＣｙｓ（Ｆ）によりヌクレオチド鎖を修飾した時の
結果を示しているが、Ｃｙｓ（Ｆ）で修飾したヌクレオ
チド鎖の電気泳動の移動度に有意な変化は認められない
（４）が、これをＳｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．９８巻５０３頁１９７５年）により
ナイロン膜に転写した後、抗フルオレセイン抗体により
検出する（５）ことでヌクレオチド鎖をＣｙｓ−Ｆで修
飾していることが認められる。次にＣｙｓ（Ｆ）で修
飾したヌクレオチド鎖に対しパーフェクトマッチするヌ
クレオチド数３０のヌクレオチド鎖を電気泳動後、ナイ
ロン膜に転写し、Ｃｙｓ（Ｆ）で修飾したヌクレオチド
鎖をプローブとしてＳｏｕｔｈｅｒｎの方法に従い、ハ
イブリダイゼーションを実施した結果（６）であり、３
´末端を直接的に修飾したヌクレオチド鎖がプローブと
して問題なく適用可能であることを示している。

【００２４】化１は図１のヌクレオチド鎖の３´末端に
アルデヒド基を形成する反応を化学構造式として示した
ものであり、化２は図１の３´末端にアルデヒド基を形
成したヌクレオチド鎖にＣｙｓ（Ｆ）をシッフ塩基によ
り修飾する反応を化学構造式として示したものであり、
Ｎｕ、Ｕ、Ｎｕ´はヌクレオチドの塩基の種類を示し、
Ｎｕはアデニン、グアニン、チミン、シトシンの各塩基
を、Ｕはウラシル塩基を、Ｎｕ´はアデニン、グアニ
ン、チミン、シトシン、ウラシルの各塩基を示してい
る。

【００２５】

【化１】

【００２６】

【化２】

【００２７】以上、図１、化１、化２に示す通り、ヌク
レオチド鎖の３´末端側に直接的に修飾物質を修飾する
ことで、ヌクレオチド鎖の標識化、ラベル化が可能であ
り、遺伝子解析の手段として有効であることを示すもの
である。

【００２８】ラベル化、標識化するための修飾物質とし
てＣｙｓ（Ｆ）を例に示したが、Ｃｙｓ（Ｆ）のシステ
インをはじめとするアミノ酸の主鎖に存在するアミノ基
とカルボキシル基とをアミノ結合させることによりＣｙ
ｓ（Ｆ）が２つ、３つ、４つ連結したジペプチド、トリ
ペプチド、テトラペプチドさらにはそれ以上連結したポ
リペプチドを任意の連結数で合成可能であることは既知
であり、その結果、Ｃｙｓ（Ｆ）単独の修飾に比べさら
に高感度化が可能となり、さらに修飾物質のラベル数、
標識数も任意に調整することが可能であるため、遺伝子
解析の高感度化及び定量化が容易に実現できる。

【００２９】(実施の形態２)次に本発明の請求項４に記
載された発明の実施の形態について、図２を用いて説明
する。図２は、修飾物質を８−アミノオクタンチオール
をとし、実施の形態１に記載の修飾方法に従い、８−ア
ミノオクタンチオール末端のアミノ基により実施の形態
１と同様のヌクレオチド数３０の配列を有す一本鎖化学
合成ヌクレオチド鎖の３´末端を修飾した後、金電極に
リンカーとしてもう一方の末端に存在するチオール基を
介してヌクレオチド鎖を金電極に固定化処理を施した時
のヘキサアミンルテニウムのサイクリックボルタングラ
ムである。なお、実線はヌクレオチド鎖固定化未処理の
金電極、破線はヌクレオチド鎖固定化処理の金電極を示
している。

【００３０】図２においてヌクレオチド鎖の固定化処理
を施した金電極はヘキサアミンルテニウムの酸化還元電
流の減少が固定化未処理の金電極と比較して有意である
ことは、８−アミノオクタンチオール等のアルカンチオ
ールの金を初めとする貴金属と強固、安定、高密度な結
合が生じ、貴金属電極の酸化還元電流が減少するという
既知の性質から８−アミノオクタンチオールを介して金
電極にヌクレオチド鎖の安定な固定化が実現しているこ
とを示すものである。

【００３１】以上の実施の形態１及び２に示す通り、本
発明のヌクレオチド鎖３´側へ修飾物質を修飾すること
で、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化が簡
便、容易に実現可能であるが、ラベル化、標識化、固定
化するヌクレオチド鎖として３０塩基の配列を有す一本
鎖化学合成ヌクレオチド鎖を例に示したが、これは実施
の一例であり、ヌクレオチド鎖の長さ、ヌクレオチド配
列の順序を限定するものではなく、ヌクレオチド鎖の由
来も特に限定せず生体由来、ＰＣＲ増幅物、化学合成物
あるいはいずれかの組み合わせを適用することが可能で
ある。また一本鎖に限らず二本鎖のヌクレオチド鎖にも
適用可能である。また本発明のヌクレオチド鎖の３´末
端にアルデヒド基を形成させるための反応条件は、実施
の一例であり、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼあるいはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
の添加量等の反応組成、反応時間、反応温度は適時、変
更可能である。なお、本発明において３´末端にアルデ
ヒド基を形成したヌクレオチド鎖にアミノ基を有する修
飾物質で修飾したが、ヌクレオチド内のアデニン塩基、
グアニン塩基、シトシン塩基にもアミノ基が存在するた
めヌクレオチド鎖内部で自己反応してしまう可能性もあ
るが、図１（ｃ）に示す通り、自己反応は生じない。し
かしながら必要があれば、ヌクレオチド鎖の化学合成時
に用いられるベンゾイル基、イソブチリル基等によりヌ
クレオチド鎖内のアミノ基を保護することも可能であ
る。実施の形態１においてラベル化、標識化するための
修飾物質としてアミノ酸とラベル化剤の組み合せである
Ｃｙｓ（Ｆ）、ポリＣｙｓ（Ｆ）を例に示したが、シス
テイン、ポリシステインとラベル化剤の組み合せとして
実施の形態１で示したヨードアセトアミド基を有するフ
ルオレセインの他にハロゲン化アセトアミド基、ハロゲ
ン化アルキル基、モノブロムプロピオン酸アミド基、マ
レイミド基、チオフタルイミド基等を有するフルオレセ
イン、テキサスレッド、ローダミン、スクアラート染料
系化合物、ジゴギシゲニン、ビオチン等ヌクレオチドを
ラベル化、標識化する物質は適用可能である。さらにシ
ステイン以外のアミノ酸とラベル化剤の組み合わせも可
能であり、例えばリシン、ポリリシンあるいはアルギニ
ン、ポリアルギニンを採用した場合、リシン及びアルギ
ニンの側鎖にはアミノ基が存在するので、カルボキシル
基、イソチオシアネート基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド基、パラニトロフェニルホルメート基、トリクロロ
フェニルクロロホルメート基、イミダゾール基、イミド
エステル基、ニトロアリルハロゲン基等を有する上記の
ヌクレオチドをラベル化、標識化する物質が適用可能で
ある。

【００３２】また上記のヌクレオチドをラベル化、標識
化する物質を単独で使用する場合は、アミノ基を有する
上記のラベル化、標識化する物質を採用すればよい。

【００３３】また修飾物質にアミノ基が存在しない場
合、ヌクレオチド鎖３´末端のアルデヒド基とアミノ基
を有する適当なスペーサ-を介在させることで、ヌクレ
オチド鎖への修飾物質の修飾が可能であり、例えば、修
飾物質がアルデヒド基しか有しない場合、スペーサ-と
して１，２−ジアミノエタン、１，６−ジアミノヘキサ
ンを介在させることでヌクレオチド鎖の修飾が可能とな
る。

【００３４】修飾物質としてタンパク質を利用する場
合、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、有
色性、蛍光性を有するトランスフェリン、ヘモグロビ
ン、緑色蛍光タンパク、青色蛍光タンパク、エクオリン
等を採用することにより遺伝子解析をする際、ヌクレオ
チド鎖の修飾位置が３´末端に特定可能であり、さらに
抗体等を利用した間接的な検出ではなく、検出が直接的
となり、検出感度、精度、確度を向上させる。

【００３５】次に実施の形態２に示した固定化において
金電極にヌクレオチド鎖を固定化するためのリンカーと
して８−アミノオクタンチオールを例に示したが、実施
の一例であり、アミノ基とチオール基を有する物質であ
れば適用可能であり、特に２−アミノエタンチオール、
６−アミノヘキサンチオール、８−アミノオクタンチオ
ール、１１−アミノウンデカンチオール等、一方の末端
にアミノ基がもう一方の末端にチオール基を有する物質
を適用することが望ましい。また固定化する基板として
金電極を例に示したが、これも実施の一例であり、基板
の用途を電極に限定することなく、材料も金以外に白
金、銀、銅、パラジウム、インジウム、ニッケル、鉄、
アルミニウム及びそれらの合金等の貴金属を基板として
適用が可能であり、基板の材料、測定法を限定するもの
ではない。ガラス、シリコン、シリカ，アルミナ，マイ
カ及びポリスチレン、ナイロン、エポキシ等の高分子樹
脂等の基板に固定化する場合は、リンカーとして末端に
アミノ基を有するシラン化合物であるガンマ−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチ
ル）−ガンマ−アミノプロピルメチルジメトキシシラ
ン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロ
ピルトリメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）
−ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、ガンマ
−アミノプロピルトリメトキシシラン等を適用すること
ができる。さらに基板にヌクレオチド鎖を固定化する方
法としてヌクレオチド鎖を予めリンカーで修飾する例を
示したが、これも実施の一例であり、基板に予めリンカ
ーを固定化しておいた後、固定化したリンカーにヌクレ
オチド鎖を修飾することも適用可能であり、ハイブリダ
イゼーション等の様々な遺伝子解析のための測定法に適
用可能である。

【００３６】

【発明の効果】以上のように、本発明のヌクレオチド鎖
修飾方法によれば、ヌクレオチド鎖の３´末端に形成し
たアルデヒド基とアミノ基を有する修飾物質との間でシ
ッフ塩基を形成させることで、ヌクレオチド鎖の修飾物
質による修飾が可能となり、簡便かつ安定なヌクレオチ
ド鎖のラベル化、標識化、固定化方法を提供することが
可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態1におけるヌクレオチド鎖
修飾方法の修飾プロセス及び修飾状態を示す尿素−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動図

【図２】本発明の実施の形態２におけるヌクレオチド鎖
の固定化処理を施した金電極のサイクリックボルタング
ラムを示す図

【符号の説明】

１ヌクレオチド数３０の配列を有すヌクレオチド鎖２３´側に多数のウラシル塩基配列を付加したヌクレ
オチド鎖３３´末端にアルデヒド基を形成したヌクレオチド鎖４修飾物質を修飾したヌクレオチド鎖５ヌクレオチド鎖を修飾物質で修飾した有無の検出６ハイブリダイゼーションによる修飾ヌクレオチド鎖
の検出

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヌクレオチド鎖の３´末端に修飾物質を
直接的に修飾させることを特徴とするヌクレオチド鎖修
飾方法。
【請求項２】ヌクレオチド鎖の３´末端に形成させた
アルデヒド基とアミノ基を有する修飾物質とを反応させ
ることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオチド鎖修
飾方法。
【請求項３】修飾物質でヌクレオチド鎖の３´末端を
修飾することが遺伝子解析対象物の検出プローブあるい
はターゲットとして標識可能となる請求項１及び２に記
載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項４】ヌクレオチド鎖３´末端とアミノ酸、オリ
ゴペプチド、タンパク質を直接的に融合することを可能
とする請求項１及び２に記載のヌクレオチド鎖修飾方
法。
【請求項５】修飾物質でヌクレオチド鎖の３´末端を
修飾することが遺伝子解析対象物の検出プローブあるい
はターゲットとして貴金属、ガラス等の基板へ固定化す
るためのリンカーであることを特徴とする請求項１及び
２に記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項６】ヌクレオチド鎖の３´側にあるウラシル
塩基にウラシルＤＮＡグリコシラーゼが作用すること
で、アルデヒド基を形成させることを特徴とする請求項
１及び２に記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項７】ヌクレオチド鎖をターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼで反応させ、ヌクレオ
チド鎖の３´側にウラシル塩基を少なくとも２つ以上連
結させることで、請求項６を実現させることを特徴とす
る請求項１及び２のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項８】化学合成ヌクレオチド鎖の場合、３´側
にウラシルを含む塩基配列の合成を予め施しておくこと
で請求項６を実現させることを特徴とする請求項１及び
２のヌクレオチド鎖修飾方法。