JPH08506967A - ３’−アミノ置換オリゴヌクレオチドの酵素による連結反応 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １またはそれ以上の標的核酸を検出するための方法とキットを提供する。３’アミノ基を有する第一のオリゴヌクレオチドおよび５’ホスフェート基を有する第二のオリゴヌクレオチドを、標的核酸の隣接する相補的領域にアニーリングする。第一のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドが、標的核酸上の向かい合うヌクレオチドに相補的であるときは必ず、核酸リガーゼが、ホスホルアミデートの形成によって第一と第二のオリゴヌクレオチドを連結する。標的核酸の存在は連結した第一と第二のオリゴヌクレオチドの検出によっで決定される。

Description

【発明の詳細な説明】 ３’−アミノ置換オリゴヌクレオチドの酵素による連結反応 本発明はホスホルアミデート結合を有する共役体を形成するための３’−アミ ノ基を有するオリゴヌクレオチドと５’−リン酸化オリゴヌクレオチドの酵素に よる連結方法に関するものである。さらに特に、本発明は特定のヌクレオチド配 列を検出するための連結反応に基づくアッセイの改良に関するものである。 背景 核酸配列分析は多くの研究、医療、および産業分野において次第に重要になっ てきている、例えばカスキイ、Science，236: 1223-1228（1987）；ランデグレ ンら、Science，242: 229-237（1988）；およびアーンハイムら、Ann．Rev．Bio chem.，61: 131-156（1992）。特に連結反応に基づく技術、例えばオリゴヌクレ オチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、連結鎖反応（ＬＣＲ）、連結増幅反応（ＬＡＲ ）等は、配列分析手段の重要なファミリイを形成し、例えば、バラニイ、PCR Me thods and Applications 1: 5-16（1991）；ランデグレンら、米国特許4,988,61 7; ランデグレンら、Science，241: 1077-1080（1988）；バックマンら、ヨーロ ッパ特許公告0439182A2; ホワイトリイら、米国特許4,883,750; ユおよびワレー ス、Genomics,4: 560-569（1989）；ニッカーソンら、Proc．Natl．Acad．Sci． 87: 8923-8927（1990）；等がある。 連結反応に基づく技術は標的配列の隣接領域にアニーリングするオリゴヌクレ オチドに依存する。オリゴヌクレオチド間の接合点で標的配列とオリゴヌクレオ チドとの間に完全な相補性がある場合、そこで連結を行うことができる。いずれ かのオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドが接合点で標的配列上の対応するヌ クレオチドと相補的でない場合、そこでは連結を行うことができない。連結反応 に基づくアッセイの鍵となる特徴は連結反応の能力であり、性質が化学的か酵素 的か、接合点でのミスペアリングと接合点での完全な相補性との間で区別する。 しかしながら、末端ヌクレオチドがそれらの対応する標的ヌクレオチドと相補性 があるとしても、末端ヌクレオチドのひとつが、例えばＡＴリッチの末端で生じ るようなアニーリングしていない平衡状態で実質的な滞留時間をもつ場合、ある いは連結を高温で行う場合にはやはり連結できない。連結を用いるアッセイでは 感度のロスとなる。 ヌクレオチド配列を分析するための連結反応に基づく技術の感度は実質的に、 相補的標識配列にハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドの安定性を高めるた めの方法の有用性とともに増大する。 発明の概要 本発明はホスホルアミデート結合を有する共役体を形成するための３’−アミ ノ基を有するオリゴヌクレオチドと５’−リン酸化オリゴヌクレオチドの酵素に よる連結方法およびキットに関するものである。本発明の重要な特徴は、３’ア ミノ基を有する第一のオリゴヌクレオチドと５’モノホスフェート基を有する第 二のオリゴヌクレオチドとを用いる連結反応に基づくアッセイによって１または それ以上の標的核酸を検出することである。このようなアッセイでは、標的核酸 が試料中にあるときは必ず、第一と第二のオリゴヌクレオチドを標的核酸上の隣 接する相補的配列領域にアニーリングして、第一のオリゴヌクレオチドの３’ア ミノ基が第二のオリゴヌクレオチドの５’−モノホスフェート基と隣接させ、こ れによって第一のオリゴヌクレオチドをリガーゼによって第二のオリゴヌクレオ チドに共役結合させる。この連結反応の結果、第一と第二のオリゴヌクレオチド との間にホスホルアミデート結合を形成する。完全に相補的な標的核酸が存在し ないと、オリゴヌクレオチドの一方または両方が標的核酸にアニーリングしない か、または第一のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドの１またはそれ以 上が、または第二のオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの１またはそれ 以上が、標的配列上のそれらのそれぞれ向かい合ったヌクレオチドに相補的では ないという理由で、実質的に連結は行われない。通常、３’および５’末端ヌク レオチドは、それぞれ、第一のオリゴヌクレオチドの３’末端からの第一と第二 のヌクレオチド、および第二のオリゴヌクレオチドの５’末端からの第一と第二 のヌクレオチドである。これら４つのヌクレオチドは時には、それぞれ、ここで は３’末端ヌクレオチド、３’終りから２番目のヌクレオチド、５’末端ヌクレ オチド、および５’終りから２番目のヌクレオチドと呼称する。 一つの局面では、本方法は直接または他の技術、例えば、ランデグレンら、米 国特許4,988,617; ムリス、米国特許4,683,202; ムリスら、米国特許4,965,188; 等によって記載されているような技術による増幅の後に、１またはそれ以上の標 的ポリヌクレオチドを検出する手段を提供する。この局面では、本方法は各隣接 する相補的領域に対して２個のオリゴヌクレオチドを用いる。 他の局面では、本方法は１またはそれ以上のポリヌクレオチドを増幅し検出す る方法を提供する。この局面では、標的ポリヌクレオチドは二本鎖ポリヌクレオ チドであり、一対の第一のオリゴヌクレオチドと一対の第二のオリゴヌクレオチ ドをランドグレンら、米国特許4,988,617に記載された原理に従い標的ポリヌク レオチドを増幅する際に用いることを含める。 本発明の重要な特徴はリガーゼが３’アミノと５’モノホスフェートの反応に 触媒作用を及ぼしホスホルアミデート結合を形成することができるという発見に ある。これは３’アミノを有するオリゴヌクレオチドを連結反応に基づくアッセ イに使用できるようにする。このクラスのオリゴヌクレオチドはそれらの３’ヒ ドロキシ対応部と比較して相補的配列をもつ一層安定なハイブリッドを形成する 。安定性が増すと、アニーリング状態の緊縮を増すことができ、これによってバ ックグラウンド信号を減らすことができるので、連結反応に基づくアッセイの標 的核酸の検出が一層鋭敏になる。 定義 「連結反応に基づくアッセイ」は、連結したオリゴヌクレオチドの相補的核酸 配列の存在を検出する手段として２またはそれ以上のオリゴヌクレオチドの連結 、または共有結合を用いる任意のアッセイを意味する。特に、連結反応に基づく アッセイはオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、米国特許4,883,750; リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）アッセイ、例えばバラニー、Proc．Natl．Acad．Sci. ，88: 189-193（1991）；リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）アッセイ、例えばウおよ びワラス、Genomics，4: 560-569（1989）；ポリメラーゼ−リガーゼ鎖反応（Ｐ ＬＣＲ）アッセイ、例えばバックマンら、ヨーロッパ特許公告0 439 182 A2（19 91）；等のアッセイを含む。 標的核酸に関して「隣接相補的領域」は標的核酸中のヌクレオチドの連続した 配列を意味し、本発明のオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成のために向け、 このようなオリゴヌクレオチドがリガーゼによって、単独またはポリメラーゼと 結合して、共有的に結合することができる。 本発明の第一と第二のオリゴヌクレオチドに関して「隣接する」は、第一のオ リゴヌクレオチドの３’末端が第二のオリゴヌクレオチドの５’末端に充分に近 接し、そして５’末端に関しては適当な方向にあり、その結果リガーゼはホスホ ルアミデート結合によって２個のオリゴヌクレオチドを共有結合することができ ることを意味する。 結合に関して「ホスホルアミデート結合」は、第一のオリゴヌクレオチドの３ ’末端ヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとの間 の結合の形成を意味し、その結合は架橋酸素（−Ｏ−）をアミノ基（−ＮＲ−） と置換するような自然のホスホジエステル結合と類似しており、前記Ｒは水素お よび１ないし３個の炭素原子を有するアルキルから成る群から選ばれる。好まし くは、Ｒは水素およびメチルから成る群から選ばれる。最も好ましくは、Ｒは水 素である。 第一と第二のオリゴヌクレオチドに関して「酵素による結合」はリガーゼによ って触媒作用を及ぼされる反応を含む方法においてオリゴヌクレオチドの共有結 合を意味する。この語は第一のオリゴヌクレオチドを伸ばしてこれを第二のオリ ゴヌクレオチドと隣接する位置に持っていくポリメラーゼの使用をさらに含む方 法を含む。 「標的核酸」は第一と第二のオリゴヌクレオチドを調製しハイブリッド形成す ることができる任意のＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、好ましくは、標的核酸は一 本鎖ポリデオキシリボ核酸である。 第一と第二のオリゴヌクレオチド、および標的核酸の隣接相補的領域に関して 「アニール」は、第一と第二のオリゴヌクレオチドおよび隣接相補的領域との間 の二本鎮分子のハイブリッド形成、または生成を意味する。 第一のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチ ドの５’末端ヌクレオチドに関して「向かい合ったヌクレオチド」は、このよう なヌクレオチドが３’末端ヌクレオチドと５’末端ヌクレオチドに相補的である とすれば、それぞれ、第一のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドと第二 のオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとのワトソン−クリック型塩基対 になる隣接相補的領域のヌクレオチドを意味する。 発明の詳細な説明 本発明は連結反応に基づくアッセイ、特に二本鎖基体を要するリガーゼを用い るアッセイの改良に向けられている。本発明の鍵となる特徴は、３’末端ヌクレ オチドとその向かい合うヌクレオチドが相補的であるときは常に、標的核酸の隣 接相補的領域と一層安定な二本鎖分子を形成できる３’アミノ基を有する第一の オリゴヌクレオチドの使用にある。他の連結反応に基づくアッセイとして、標的 核酸の検出は第二のオリゴヌクレオチドと第一のオリゴヌクレオチドの共有結合 に基づき、この結合は、標的配列上にそれぞれ向かい合っているヌクレオチドに 相補的である第一のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドと第二のオリゴ ヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに依存している。 好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドは、ここに参考文献として組み込まれ るグリアツノフおよびレッシンガー、Nucleic Acids Research，20: 3403-3409 （1992）によって記載されているような固相支持体上で合成される。簡単には脱 保護後に、標準スクシニル連結を介して支持体に結合したデオキシチミジンの５ ’ヒドロキシルを、適当な溶媒、例えばジクロロメタン／ジイソプロビルエチル アミン中でクロロ−（ジイソプロピルエチルアミノ）−メトキシホスフィンと反 応させてホスフィチル化する。テトラゾールで活性化した後、５’−ホスフィチ ル化チミジンを５’−トリチル−Ｏ−３’−アミノ−３’−デオキシヌクレオシ ドと反応させて、ヌクレオシド部分がホスホルアミデート結合によって共有結合 したヌクレオシド−チミジン二量体を形成する。オリゴヌクレオチドの残りは標 準のホスホルアミダイト化学によって合成される。スクシニル結合を開裂した後 、３’末端アミノ基をもつオリゴヌクレオチドを酸処理によって、例えば80％の 酢酸水溶液によって18〜20時間室温で開裂させて生成する。５’−トリチル−Ｏ −５’−アミノ５’，３’−デオキシヌクレオシドは、ここに参考文献として組 み込まれるグリンスキら、J．Chem．Soc．Chem．Comm.，915-916（1970）；ミラ ーら、J．Org．Chem．29: 1772（1964）；ジーリンキおよびオーゲル、Nucleic Acids Research，13: 2469-2484（1985）および15: 1699-1715（1987）；オゾル スら、Synthesis，7: 557-559（1980）；およびアザイェブら、Nucleic Acids R esearch， 6: 625-643（1979）に従って合成することができる。 第一のオリゴヌクレオチドはまた、第一のオリゴヌクレオチド前駆体を隣接相 補的領域にアニーリングして次に３’アミノヌクレオシドトリホスフェートの存 在で核酸ポリメラーゼで前駆体を伸ばし、最終生成物が第二のオリゴヌクレオチ ドに隣接するようにすることによって、標的ポリヌクレオチド上に形成すること ができる。隣接する第一と第二のオリゴヌクレオチドを次に本発明に従って連結 する。３’−アミノヌクレオシドトリホスフェートは、レッシンガーら、Bioche mistry，15: 2810-2816（1976）；レッシンガーら、Nucleic Acids Research，3 : 1053-1063（1976）；および／またはアザイェブら（上記）に開示されている 。本例では、３’末端ヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチド前駆体に関係し ていると解される。３’末端ヌクレオチドがそれらの向かい合っているヌクレオ チドに相補的でないならば、そのときは第一のオリゴヌクレオチド前駆体がハイ ブリッド形成しないか、または核酸ポリメラーゼによって伸びないかである。 第二のオリゴヌクレオチドは従来法、例えば、市販のＤＮＡ合成器でホスホル アミダイト化学によって合成される。５’モノホスフェートは第二のオリゴヌク レオチドに化学的にまたはキナーゼを用いて酵素的に結合することができる、例 えばサムブルックら、Molecuh1r Cloning: A Laboratory Mannual，2nd Edition （Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989）。化学的リン酸化はホー ンとウルデア、Tetrahedron Lett.，27: 4705（1986）によって記載されており 、試薬は例えば、Clontech Laboratories（Palo Alto，California）からの5’P hosphate-ON（登録商標）が市販されている。 第一と第二のオリゴヌクレオチドは１またはそれ以上のヌクレオシド類似体を 含むことができ、種々の理由のために組み込まれることでき、単一のオリゴヌク レオチドを異なる試料の異なる標的配列に結合することができ、オリゴヌクレオ チド結合特性等を変更する、例えばマセビクツ、米国特許5,002,867に開示され ている。 第一と第二のオリゴヌクレオチドは同じかまたは異なる鎖長をもつことができ る。第一のオリゴヌクレオチドの長さは特異性を最大にするように選択される。 通常、この長さは、所定の組の結合反応条件の下に第一のオリゴヌクレオチドの 標的核酸への特異的結合とリガーゼの操作と一致させてできるだけ短い。好まし くは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは、10〜20個のヌクレオチドの範囲であ る。さらに好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さは12〜20個のヌクレオ チドの範囲である。第二のオリゴヌクレオチドは、特異性を与え、アニーリング が行われた後にリガーゼを操作できるように少なくとも充分な長さであるが、合 成に不便なほど長くはない。好ましくは、第二のオリゴヌクレオチドの長さは10 〜30個のヌクレオチドの範囲である。さらに好ましくは、第二のオリゴヌクレオ チドの長さは12〜20個のヌクレオチドの範囲である。 本発明に従って使用できる幾つかのリガーゼは文献に記載されており市販され ている、例えばレーマン、Science，186: 790-797（1974）；コーンバーグおよ びベーカー、DNA Replication，307-315頁（Freeman，NEW York，1992）；ヒギ ンスおよびコザレリ、Methods in Enzymol．68: 50-71（1979）；バーカーら、N ucleic Acids Research，13: 8323-8337（1985）；アームストロングら、Nuclei c Acids Research，11: 7145-7156（1983）；ラビンら、J．Biol．Chem．26: 10 637-10647（1986）；タカハシら、J．Biol．Chem．259: 10041-10047（1983）； バラニイら、PCT出願PCT/US91/02968等を参照。使用するリガーゼの条件は一般 に当該分野で良く知られており、サムブルックら（上記）；バラニイ、PCR Meth ods and Applications，1: 5-16（1991）；ニッカーソンら、Proc．Natl．Acad ．Sci.，87: 8923-8927（1990）；ランデグレンら、米国特許4,988,617（この特 許を参照文献として組み込む）等のような文献に記載されている。通常、標的ポ リヌクレオチドは連結反応の緩衝液中に約1mg/mlないし約100mg/mlの濃度での変 性ＤＮＡである。連結反応の緩衝液は選択されたリガーゼを活性にするｐＨで、 一般には、約７〜９のｐＨで水溶液である。好ましくはは、ｐＨは約５mMないし 50mMの濃度でTris-HClによって維持される。この連結反応の緩衝液は１またはそ れ以上ノ阻害物質、通常はEDTAのようなカルシウムイオンキレーターを含むこと ができる。代表的には、EDTAは約0.1ないし10mMの濃度で含まれる。連結反応の 緩衝液は活性化すべき選択されたリガーゼに補因子が必要とするものは何でも含 む。通常、これは約0.2mMないし20mMの濃度で二価のマグネシウムイオンであり 、一般的には塩化物塩として提供される。E．coli DNAリガーゼに対しては、NAD が補因子 として要求され、T4 DNAリガーゼに対してはATPが補因子として要求される。ま たリガーゼ緩衝液は還元剤、例えばジチオスレイトールまたはジチオエリスリト ールを、一般的には約0.1mMないし約10mMの濃度で含む。任意には、リガーゼ緩 衝液はオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドの非特異的結合を減らす薬剤を含 むことができる。例えば、薬剤は鮭精子ＤＮＡ、ニシン精子ＤＮＡ、血清アルブ ミン、デンハルツ溶液等を含む。 好ましくは、連結反応の条件は第一と第二のオリゴヌクレオチドが、標的配列 の隣接相補的領域の塩基と完全にマッチした二本鎖分子を形成する場合に、連結 反応が起きるように調整される。しかしながら、いくつかの好適例では第一のオ リゴヌクレオチドの５’末端と第二のオリゴヌクレオチドの３’末端上でペアに なっていないヌクレオチドが、検出を促進し、または例えば、バラニイ、Proc． Natl．Acad．Sci．（上記）によって教示されているような平滑末端連結反応を 減らすことができる利点があることが理解される。連結反応の重要なパラメータ ーは、温度、塩濃度、ホルムアミドのような変性剤の有無および濃度、第一と第 二のオリゴヌクレオチドの濃度、使用するリガーゼの型等を含む。反応のための ハイブリッド形成条件を選択する際のガイダンスは多くの文献に見られる、例え ばウエトムル、Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，26 :227-259（1991）；ドーブおよびダビドソン、J．Mol．Biol．5: 467-478（1962 ）；フットン、Nucleic Acids Research，10: 3537-3555（1977）；ブレスロー エルら、Proc．Natl．Acad．Sci.，83: 3746-3750（1986）；インニスら、著者 、PCR Protocols（Academic Press，New York，1990）等。好ましくは、連結反 応は緊縮ハイブリッド形成条件下に起き、完全にマッチしたオリゴヌクレオチド のみがハイブリッド形成することを保証する。一般的には、緊縮は、ある一定の 値にて、例えば100mMのNaCl、または同等のものの塩濃度を保持する間にハイブ リッド形成が起きる温度を調節することによって制御される。他の関連した因子 は第一と第二のオリゴヌクレオチドの特別の配列、第一と第二のオリゴヌクレオ チドの長さ、選択されたリガーゼの熱不安定性等を含むと理解される。好ましく は、連結反応の緩衝液中のハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドの溶融温度 に近い温度にて連結反応は行われる。さらに好ましくは、連結反応の緩衝液中の ハイブリッド 形成したオリゴヌクレオチドの溶融温度の10℃内の温度で連結反応は行われる。 最も好ましくは、連結反応の緩衝液中のハイブリッド形成したオリゴヌクレオチ ドの溶融温度の０〜５℃下の温度で連結反応は行われる。 連結反応が完了または冷却した後、第一と第二のオリゴヌクレオチドの連結し た生成物は、存在すれば、例えば、電気泳動、螢光分析等によって、検出のため 反応混合物から通常分離される。 本発明の方法を応用して、種々の起原、例えばヒト診断試料、植物試料、微生 物培養物からの試料等から、標的ポリヌクレオチドを検出する。本発明の方法の 応用のための核酸試料は標準の技法、例えば、カワサキ、18章、in Innisら（上 記）によって調製される。胎児試験ではバーター、Am，J．Obstet，Gynecol.，9 9: 795-805によって開示されている技法を用いる羊水穿刺によって試料を得るこ とができ、またはイバーソンら、Prenatal Diagnosis，9: 31-48（1981）等によ って記載されているように螢光活性化細胞分類を用いる妊婦の末梢血液から得る ことができる。他の組織と試料源は異なる核酸単離法を必要としてもよい。特定 のプロトコルのための手引は標準のテキスト、例えばデイビスら、Basic Method s in Molecular Biology（Elsevier，New York，1986）に見ることができる。幾 つかの好適例では、標的ポリヌクレオチドは良く知られた技法、例えばアウスベ ルら、Current Protocols in Molecular Biology，3.7.1-3.7.3頁（Willey-Inte rscience，New York，1987）を使用して関係する１またはそれ以上のＲＮＡｓの 逆転写によって形成することができる。一度単離すると、ＤＮＡ標的ポリヌクレ オチドは良く知られた技法、例えば溶融温度まで、通常は約80℃と100℃の間で 連結反応緩衝液中で加熱して、一本鎖にする。 本発明に従って連結した第一と第二のオリゴヌクレオチドは種々の方法、例え ばマシュースら、Anal．Biochem．169: 1-25（1988）によって開示されているよ うに検出することができる。ひとつの好ましい好適例は、第一および／または第 二のオリゴヌクレオチドを、コーンハーら、Nucleic Acids Research，17: 7779 -7784（1989）；リバクら、Nucleic Acids Research，20: 4831-4837（1992）； ジャッケら、Tetrahedron Lettres，34: 301-304（1993）等によって開示されて いるように、第一と第二のオリゴヌクレオチドの連結生成物の電気泳動による移 動 度を変化させる共有結合する化学基によって修飾する。この方法では、似た大き さの第一と第二のオリゴヌクレオチドのセットを使用して、多数の標的ポリヌク レオチドの存在を検出することができる。連結反応の生成物の電気泳動による移 動度を異なる程度まで変化させる共有結合修飾を選択し、メイランドら、Clinic al Chemistry，36: 2063-2071（1990）によって教示されているように、これに よって電気泳動による分離後のバンドのパターンにより多数の標的ポリヌクレオ チドを検出することができる。 本発明の第一および／または第二のオリゴヌクレオチドは、電気泳動検出また は他の手段による検出、例えばマニアチスら、Molecular Cloning: A Laborator y Manual （Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1982）；Current Proto cols in Molecular Biology ，Unit 6.4（John Wiley & Sons，New York，1987） ；またはマキシムおよびギルバート、Meth．Enzymol.，Vol．65，499-560頁（19 80）のための標準のプロトコルを用いて³²Ｐで放射線による標識を付けることが できる。 好ましくは、第一および／または第二のオリゴヌクレオチドは、例えばフング ら、米国特許4,757,141; 4,855,255等によって教示されるように、オリゴヌクレ オチドの一方または両方に螢光分子を結合して螢光による標識を付ける。好まし くは、異なる連結した第一と第二のオリゴヌクレオチドを異なる螢光標識で標識 を付ける。適当な螢光標識を選択するための手引はスミスら、Methods in Enzym ology，155巻、260-301頁（1987）；カーガーら、Nucleic Acids Research，19 巻、4955-4962頁（1991）：ホーグランド、Handbook of Fluorescent Probes an d Research Chemicals（Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，1989）等に見ら れる。好ましい螢光標識は、例えばカンナら、米国特許4,318,846及び／または メンチェンら、米国特許5,188,934によって開示されているようなフルオレセイ ンとその誘導体、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、テキサスレッド等を 含む。最も好ましくは、複数の螢光染料を用いる場合、フングら（上記）によっ て教示されているように、これらをスペクトルにより分離できる。簡単には、こ こで使用される「スペクトルにより分離できる」螢光染料は画期的な収率、発光 バンド幅、および標識を付けたポリヌクレオチドを電気泳動により分離できる発 光 最大値をもち、分離したポリヌクレオチドの濃度バンドの実質的なオーバーラッ プにもかかわらず容易に検出できるものである。 いくつかの好適例では、第一と第二のオリゴヌクレオチドの連結生成物の検出 は、例えばホワイトリーら（上記）によって定義されたように、「フック」部分 を含むようにオリゴヌクレオチドのひとつを修飾して改良することができる。例 示的な「フック」はビオチン、ハプテン修飾ヌクレオチド等を含み、アビジンま たはストレプタビジン被覆支持体または微粒子を介して、または抗体を介して、 それぞれ、単離することができる。 ひとつの好適例では、本発明のキットは１またはそれ以上の第一と第二のオリ ゴヌクレオチドペア、核酸リガーゼ、およびリガーゼ緩衝液からなる。この１ま たはそれ以上の第一と第二のオリゴヌクレオチドペアは、分離して、または適当 な溶液、ＴＥ（10mMTris-HCl（pH8.0）および１mMのEDTA（pH8.0））中に溶解し た混合物として提供される。このリガーゼ緩衝液は一般には、選択した核酸リガ ーゼ（上述した）および使用した特定の第一と第二のオリゴヌクレオチドの両方 に対して最適であろう。通常は、キットはまた少なくとも１対のコントロールオ リゴヌクレオチド、すなわち、試料中の既知の標的ポリヌクレオチドに対して特 異的な第一と第二のオリゴヌクレオチドを含み、問題の標的ポリヌクレオチドが 検出されなくとも連結反応が首尾よく行われたことを確認する。 実施例１ 標的ポリヌクレオチドにアニーリングした後の第一と第二の オリゴヌクレオチドの連結反応 グリアズノフとレッシンガー（上記）に従って、配列5’-NH₂-TTT TTT TTT T- NH₂-3’を有する第一のオリゴヌクレオチドを調製した。第二のオリゴヌクレオ チドは、刊行された製造者のおよび／または発行されたプロトコル、例えばAppl ied Biosystems Inc.モデル392および394 DNA/RNA Synthesizers Users Manual （Foster City，California）；カルーサースら、J．Am．Chem．Soc．113: 6324 （1991）；コンネルら、Biotechniques，5: 342（1987）等を用いて、3’-アミ ン-ON（登録商標）CPG（Clontech，Palo Alto，California）および5’-ホスフ ェート-ON（登録商標）（Clontech，Palo Alto，California）で制御されたポア ガ ラス支持体上に調製した。CPG支持体から分離した後、遊離3’アミンをカルボキ シフルオレスセイン染料JOE（Applied Biosystems Inc.，Foster City，Califor nia）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、次の配列の螢光 による標識を付けた第二のオリゴヌクレオチドを形成した：5’-（ホスフェート ）-TTG GTG TTT CCT ATG ATG AAT ATA G-（JOE）-3’。次の標識ポリヌクレオチ ドは刊行された方法を用いて調製した：5’-CTA TAT TCA TCA TAG GAA ACA CCA AAA AAA AAA AA-3’。 第一と第二のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドにアニーリングして T4 DNAリガーゼ（400U/ml，New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA）で連結 した。10XのT4リガーゼ緩衝液は500mM Tris-HCl，pH7.5，100mM MgCl₂，100mMジ チオスレイトール（DTT），10mM ATP，250mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）か ら成る。Gene-Amp（登録商標）反応チューブ（Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，C T）中で、連結反応混合物は第一のオリゴヌクレオチド（10ml、水中500nM）、第 二のオリゴヌクレオチド（10ml、水中50nm）、標的ポリヌクレオチド（10ml、水 中50nM）、T4 DNAリガーゼ80ユニット、10mlの10Xの連結反応緩衝液、10mlの水 中4mgのニシン精子、および50mlの水を含んでいた。反応混合物を60mlの鉱油を 被せて、Perkin-Elmer Cetus DNAサーマルサイクラー内に置き、15℃、25℃、35 ℃、45℃、および55℃に30分間、各温度にて連続して保持した。水層を３Ｍの酢 酸ナトリウム（10ml）とエタノール（250ml）で沈澱させ、その後、ドライアイ ス（15分聞）上に置き、遠心分離し（15分間）、デカントし、70％のエタノール （200ml）で洗浄し、遠心分離し（15分間）、デカントし、サバント上で乾燥さ せた。50mMのEDTA（５ml）とホルムアミド中の試料の40分の１をApplied Biosys tems Inc.モデル373A DNAシーケンサーで６％のポリアクリルアミドゲルを用い て分析した。得られた電気泳動図はホスホルアミデート連結反応生成物の実質的 な存在を示した。標的ポリヌクレオチドを連結反応混合物に含めなかったことを 除いて、前記と同様にコントロール実験を行い、連結反応生成物は何も認められ なかった。連結反応を25℃で２時間行ったことを除いて前記と同様に別の実験を 行い、反応生成物が認められたが、標的ポリヌクレオチドなしのコントロール反 応では連結反応生成物は認められなかった。 実施例２ ｂ−グロブリン遺伝子の鎌状赤血球突然変異体の検出 ｂ_s遺伝子型のための各同型接合体の末稍血液から単離された細胞を20mlの0.1 M KOHおよび0.1%のTriton X-100を用いて65℃で20分間溶離して、20mlの0.1M HC lおよび0.1%のTriton X-100を用いて中和する。ゲノムＤＮＡを標準のフェノー ル／クロロホルム抽出法によって、次にエタノール沈澱によって単離する。ｂ− グロブリン遺伝子を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によってプライマ−5’-CA ACTTCATCCACGTTCACCTTGCCおよび5’-AGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGで標準のプロトコル を用いて増幅する。簡単には、Gene-Amp（登録商標）反応チューブ中で、ＰＣＲ 試薬（５ml、20mMのTris-HClを含む（pH8.3），100mM KCl，3mM MgCl₂，20ng/ml のウシ血清アルブミン、各400mMの４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェー ト、各0.5mMのプライマー、0.1%のTriton X-100、および0.05ユニットのTaq Ｄ ＮＡポリメラーゼ）、ゲノムＤＮＡ（５ml、0.1%のTriton X-100を含む殺菌蒸留 水中2ng/ml）、および70mlの鉱油。ＤＮＡを93℃で４分間インキュベートして変 性させて、40サイクルで93℃で30秒間、61℃で45秒間、そして72℃で90秒間増幅 する。増幅したＤＮＡを0.1%のTriton X-100を含む45mlの0.25M NaOHで変性させ る。10mlの50％ホルムアルデヒドに溶解した本発明に従って調製した第一と第二 のオリゴヌクレオチド（5’-ATGGTGCACCTGACTCCTGT-NH₂および5’-（フォスフェ ート）GGAGAAGTCTGCCGTTACTG-（JOE））（各200fmol）および２Ｘリガーゼ緩衝 液（100mM Tris-HCl，pH7.5，20mM MgCl₂，2mMスペルミジン、2mM ATP，10mM DT T）をAmp（登録商標）反応チューブ等に入れる。ＤＮＡ試料を45mlの0.25M HCl で中和し、上記混合物中の第一と第二のオリゴヌクレオチドに添加し、その後に 反応混合物を70mlの鉱油で被覆する。増幅したＤＮＡを93℃で２分間変性させて 冷却し、５mlのT4 DNAリガーゼ（５ユニット／ml）を１Ｘリガーゼ緩衝液に添加 する。リガーゼ反応は室温で２時間行い、その後４℃まで冷却する。次に反応混 合物をエタノールで沈澱させ、その後に沈澱物を５mlのホルムアミド/EDTA，50m mol/L（4/l容量）中に再溶解する。93℃で２分間変性した後、溶液のＤＮＡ化合 物をＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems，モデル373A）のゲル上に、８Ｍ 尿素中６％のアクリルアミドゲル、Tris-Borate緩衝液（リットル当たり：89mmo l Tri s-HCl，89mmolホウ酸、および２mmolのEDTA，pH8.3）と共に装填する。２時間15 00Ｖにて電気泳動を行う。ＤＮＡ成分の分析は、JOE-標識連結反応生成物が存在 し、連結していない第一のオリゴヌクレオチドからの相当する信号が存在しない ことを示していた。 配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人：スティーブン フング、サーゲイ エム，グリアツノフ （ii）発明の名称： ３’−アミノ置換オリゴヌクレオチドの酵素による連結 反応 （iii）配列の数：７ （iv）相当する住所： （Ａ）あて先：アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド， ステフコーン シー，マセビクツ （Ｂ）街路：リンコルン センター ドライブ ８５０ （Ｃ）市：フォスター シティ （Ｄ）州：カリホルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：９４４０４ （ｖ）コンピューター読み取り型 （Ａ）媒体タイプ：３．５インチ ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）操作システム：ウインドウズ ３．１／ＤＯＳ ５．０ （Ｄ）ソフトウェア：ウインドウズ用マイクロソフトワード バージョン ２．０ （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９４年３月２１日 （Ｃ）分類： （vi）先の出願のデータ： （Ａ）出願番号：０８／０４８，９７５ （Ｂ）出願日：１９９３年４月１６日 （Ａ）出願番号：０８／０３８，６６３ （Ｂ）出願日：１９９３年３月２２日 （viii）代理人情報： （Ａ）名前：ステフェン シー，マセビクツ （Ｂ）登録番号：３０，２８５ （Ｃ）参照／ドケット番号：４２１０ＰＣＴ （ix）電話伝達情報： （Ａ）電話：（４１５）３５８−７８５５ （Ｂ）ファクシミリ：（４１５）３５８−７７９４ （２）SEQ ID NO:1のための情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：SEQ ID N0:1： （２）SEQ ID N0:2のための情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：SEQ ID NO:2： （２）SEQ ID NO:3のための情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３５ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：SEQ ID NO:3： （２）SEQ ID NO:4のための情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５ヌクチオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：SEQ ID NO:4： （２）SEQ ID NO:5のための情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１ヌクチオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎮の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：SEQ ID NO:5： （２）SEQ ID NO:6のための情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：SEQ ID NO:6： （２）SEQ ID NO:7のための情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：SEQ ID NO:7：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドを標的核酸上の隣 接する相補的領域にアニーリングして、第一のオリゴヌクレオチドの３’末端を 第二のオリゴヌクレオチドの５’末端に隣接させるようにする、１またはそれ以 上の標的核酸を検出するための連結反応によるアッセイにおいて、 ３’アミノ基を有する第一のオリゴヌクレオチドおよび５’モノホスフェート 基を有する第二のオリゴヌクレオチドを用意し；そして 第一と第二のオリゴヌクレオチドを酵素による連結を行い、第一のオリゴヌク レオチドの３’末端ヌクレオチドが標的核酸上の向かい合うヌクレオチドに相補 的であり、５’末端ヌクレオチドが標的核酸上の向かい合うヌクレオチドに相補 的であるときは必ず、それらの間にホスホルアミデート結合を形成する 工程から成るように改良したアッセイ方法。 ２．前記３’アミノ基が型−ＮＲＨを有し、Ｒは水素および１〜３個の炭素原 子を有するアルキルから成る群から選択される請求項１記載の方法。 ３．Ｒが水素である請求項２記載の方法。 ４．酵素による連結の前記工程がＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行われる請求 項３記載の方法。 ５．３’アミノ基を有する第一のオリゴヌクレオチド； ５’モノホスフェート基を有する第二のオリゴヌクレオチド； 核酸リーゼ；および リガーゼ緩衝液 から成る、標的核酸を検出するためのキット。 ６．前記３’アミノ基が型−ＮＲＨを有し、Ｒは水素および１〜３個の炭素原 子を有するアルキルから成る群から選択される請求項５記載のキット。 ７．Ｒが水素である請求項６記載のキット。 ８．生物学的試料における標的ポリヌクレオチドを検出するための方法が、 標的ポリヌクレオチドを増幅し； ３’アミノ基を有する第一のオリゴヌクレオチドおよび５’モノホスフェ ート基を有する第二のオリゴヌクレオチドを用意し、第一と第二のオリゴヌクレ オチドは標的ポリヌクレオチドの隣接する相補的領域に対して特異的であり； 第一と第二のオリゴヌクレオチドを隣接する相補的領域にアニーリングし て；そして 第一と第二のオリゴヌクレオチドを酵素による連結を行い、第一のオリゴ ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド上の向かい合うヌ クレオチドに相補的であり、５’末端ヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド上の 向かい合うヌクレオチドに相補的であるときは必ず、ホスホルアミデート結合を 有する連結反応生成物を形成し； この連結反応生成物を検出する 各工程から成る方法。 ９．前記連結反応生成物を、連結していない第一と第二のオリゴヌクレオチド および前記標的ポリヌクレオチドから分離する工程をさらに含む請求項８記載の 方法。