CN101680033A

CN101680033A - 基因表达的测定方法

Info

Publication number: CN101680033A
Application number: CN200880015799A
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·斯潘塞·米勒; 约翰·R·梅尔基; 杰夫雷·W·格里格
Original assignee: Human Genetic Signatures Pty Ltd
Current assignee: Human Genetic Signatures Pty Ltd
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2010-03-24
Also published as: CA2680426A1; EP2126120A4; US20100092972A1; AU2008229628A1; WO2008113111A8; WO2008113111A1; EP2126120A1; JP2010521142A

Abstract

本发明包括基因表达的测定方法，其包括利用能够基本除去RNA二级结构的诸如亚硫酸氢盐的试剂处理RNA，并测量经处理的RNA的存在或数量，从而得到基因表达的指标。本发明还包括寡核苷酸、PNA、LNA或INA探针在所述测定方法中的应用。

Description

基因表达的测定方法

技术领域

本发明涉及基因表达的测定方法，其中RNA向DNA的转化并不是必需的。

背景技术

目前用以通过测量细胞群中的RNA产量评估基因表达的方法，例如通过利用芯片的微阵列表达谱(Schena et al，1995，Science 270：467-470；Chee etal，1996，Science 274：610-614)，或通过基因表达的系列分析(SAGE，Velculescuet al，1995，Science 270：484-487)，或通过全基因表达分析(TOGA，Sutcliffe et al，2000，Proc Natl Acad Sci USA 97：1976-1981)，或借助随机排列的可寻址高密度光学传感器阵列(Michael et al，1998，Anal Chem 70：1242-1248)，或借助微珠阵列上的大规模平行指纹测序(MPSS，Brenner et al，2000，NatureBiotechnology 18：630-634)，并不一定能够提供基因表达的真实程度或数量的准确信息。所使用的许多方法都是间接法，因为这些方法首先需要反转录介导的由RNA到相应cDNA分子的转化，然后对cDNA群进行扩增和标记。目前的这些方法最多仅提供了基因表达的指征(indication)，但并未提供关于特定目标基因表达的准确测量值。

困难之处非常明显。例如，已经阐述了SAGE技术中的偏差(Stollberg etal，2000，Genome Research 10：1241-1248)和芯片的偏差(Chudin et al，2001，Gene Biology 3：0005.1-0005.10；Kothapalli et al，2002，BMC Bioinformatics3：1-10；Workman et al，2002，Genome Biology 3：0048.1-0048.16)。已对当前方法中的问题进行了阐述(Martin and Pardee，2000，Proc Natl Acad Sci USA97：3789-3791；Wang et al，2000，Proc Natl Acad Sci USA 97：4162-4167)。

由于此前的变性RNA分子自发快速形成稳定的二级结构，所以难以通过与适当的特异探针的直接杂交来测定RNA。

本发明人现已开发出改良的测定方法，其能够更准确地评估生物体中、细胞群中或组织样品中的基因表达。

发明内容

第一方面，本发明提供了基因表达的测定方法，其包括：

(a)用基本除去RNA二级结构的试剂处理RNA；和

(b)检测经处理的RNA是否存在或其存在量，从而得到基因表达的指标。

第二方面，本发明提供了基本除去RNA的二级结构并稳定RNA的试剂在评估或测量基因表达的测定方法中的应用。

第三方面，本发明提供了具有所选化学组成的探针在通过检测RNA来测定基因表达中的应用。

优选地，所述探针主要由碱基A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)和C(胞嘧啶)组成，并且不含显著量的G(鸟嘌呤)。优选地，所述探针基本不含G(鸟嘌呤)。

本发明还涉及寡核苷酸、PNA、LNA或INA探针在使用基本除去RNA二级结构的试剂的基因表达测定方法中的应用。

第四方面，本发明提供了基因表达的测定方法，其包括：

(a)用基本除去RNA二级结构的试剂处理RNA；和

(b)利用能够与RNA的互补序列结合的引物反转录并扩增所述RNA；和

(c)检测经处理和扩增的RNA是否存在或其存在量，从而得到基因表达的指标。

在优选实施方式中，所述RNA来自真核生物或原核生物，包括微生物、一个或多个细胞或细胞群。

在优选实施方式中，所述RNA为mRNA。

在优选实施方式中，所述RNA来自微生物。

可以通过任何适合用于从微生物、细胞或细胞群或其他组织或生物来源分离RNA的方法获得所述RNA。此类方法在本领域中是熟知的，参见，例如Sambrook et al，″Molecular Cloning，A Laboratory Manual″second ed.，CSHPress，Cold Spring Harbor，1989。实例包括但不限于寡聚-dT包被的磁珠或树脂。RNA结合树脂的具体实例包括以下：RNeasy^TM和Oligotex^TM(Qiagen)、StrataPrep^TM total(Stratagene)、Nucleobond^TM(Clontech)，、RNAgents^TM和PolyATract^TM systems(Promega)等。还可以利用密度梯度离心技术分离RNA。

RNA可以来自真核生物或原核生物(例如细菌和病毒)。所述测定方法可以用于监测药物治疗、病毒荷量，以及测定样品中各种病毒的表达阵列(expression array)等。

优选地，使用能够修饰胞嘧啶碱基的试剂处理RNA，从而通过消除胞嘧啶减少C:G碱基对，由此减弱RNA互补区之间的结合强度。所产生的修饰消除了二级结构并基本稳定了以单链存在的RNA。优选地，所述试剂选自亚硫酸氢盐、羟胺、乙酸盐或柠檬酸盐。所述试剂更优选为亚硫酸氢盐或乙酸盐试剂。所述试剂还优选为亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠试剂可以在水的存在下将胞嘧啶修饰成尿嘧啶。

亚硫酸氢钠(NaHSO₃)容易与胞嘧啶的5，6-双键反应，从而形成反应中间产物磺化胞嘧啶，该中间产物易于脱氨基，并在水的存在下生成尿嘧啶亚硫酸盐。如果需要，可以在温和的碱性条件下除去亚硫酸盐基团，从而形成尿嘧啶。因此，几乎所有的胞嘧啶都将被转化为尿嘧啶。由于尿嘧啶碱基与任何互补碱基仅能形成两个氢键，而不象胞嘧啶能形成三个氢键，因此RNA重新形成复杂的二级结构的趋势大大减小。由此处理的修饰RNA可以顺利无碍地与特定的互补探针进行相互作用。

在本发明的某些实施方式中，不再需要像现有操作那样，在测定样品中目标序列的含量之前将RNA转化为相应的互补DNA(cDNA)，这一点非常重要。由于不需要反转录酶和聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤，本发明的方法更简单、更直接，且因此而使由标准方法中涉及的酶的序列复制偏差引起错误的可能性减小。

可以通过任何合适的方法对目标(经修饰)RNA的存在量进行测量。例如，靶向目标RNA的特异探针可以来源于相应目标转录单元的全部或一部分。或者，所述探针可以来源于任何其他具有碱基-序列特异性的物质，例如适当的抗体或抗体片段或单域抗体，适当序列的寡核苷酸或肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或插入核酸(Intercalating nucleic acid，INA)探针。

可以将本发明的探针设计成与待测RNA“基本”互补。当所述探针本质上是PNA、LNA、寡核苷酸或INA时，它们可以仅包含A(腺嘌呤)、T(胸腺嘌呤)或C(胞嘧啶)碱基，这是因为所述经修饰的RNA基本不包含未经修饰的C残基。

所述探针可以为任何适合的配体，例如寡核苷酸探针或PNA、LNA或INA探针。例如，可以使用聚合-T DNA或聚合-T PNA或LNA探针或聚合-T

INA探针，它们将与来自细胞且均具有聚合-A“尾巴”的经处理全RNA结合，并允许测量细胞、细胞群或组织中的全基因表达。或者，靶向目标RNA的特异探针可以用于测量给定细胞或组织中的特异基因表达。

为破坏RNA中随机形成的二级结构的稳定性而将胞嘧啶替换成尿嘧啶或其亚硫酸氢盐加合物将显著降低特异寡聚探针、PNA探针、LNA探针或INA探针与所述经修饰RNA的结合强度。经适当设计将插入基团限制到其末端位置的INA分子与互补序列结构的RNA的结合特性增强。为了进一步对此进行补偿，优选使用2，6-二氨基嘌呤(AP)取代探针中的腺嘌呤碱基，2，6-二氨基嘌呤可以与任何互补RNA链中的胸腺嘧啶形成三个氢键(而腺嘌呤可以形成两个氢键)，并由此增强探针和RNA间的结合。

通过在“正常”或“经修饰”核苷酸序列的各种位置连接能够插入到碱基序列具有互补性的DNA或RNA的相邻碱基之间的插入分子来构建INA探针。利用这种DNA分子，无论插入基团连接到INA探针内的哪个位置，这些插入部分的存在都在很大程度上稳定了探针和目标核酸间的相互作用。以下对INA的显著特性进行阐述。

当INA探针被设计用于结合RNA分子时，所述插入基团优选设置于INA的末端或接近末端以增强结合。出人意料的是，将插入基团设置于内部可能对RNA与互补DNA的杂交产生不利的影响，并会破坏杂交结构的稳定，而不是稳定杂交结构。以下对INA探针的构建方法进行阐述。

本发明的重点涉及特别构建的INA探针高度特异地且非常牢固地与经处理使所有胞嘧啶残基转化成尿嘧啶残基的目标RNA分子相结合的惊人能力。因此，本发明涉及能够避免目前使用的多个方法的间接过程引入的错误或偏差的方法。

如上所示，虽然可以在该测定方法中使用多种其他特异探针，但优选使用INA探针，其原因体现于有关其应用的详细阐述中。

优选使用能够与RNA的互补序列结合的INA引物进行所述RNA的扩增。通常使用基于反转录酶的PCR方法进行所述扩增。

对于能够在高严谨条件下与本发明使用的核酸分子杂交或者与本发明使用的核酸分子具有高度序列相似性的等效序列，“在高严谨条件下……杂交”可以与“严谨杂交条件”同义，是本领域熟知的术语，参见，例如Sambrook，″Molecular Cloning，A Laboratory Manual″second ed.，CSH Press，Cold Spring Harbor，1989；″Nucleic Acid Hybridisation，A Practical Approach″，Hames and Higgins eds.，IRL Press，Oxford，1985。

本发明的优点是能够实现RNA的直接测定而无需将RNA转化为cDNA。所述测定方法可以真实测定细胞群中的基因活性，而没有通过需要将RNA转化或扩增为cDNA的现有方法所引入的潜在错误。

可以利用本技术领域已知的任何合适的方法制备PNA或寡核苷酸探针。可以通过本技术领域已知的任何合适的方法制备INA探针。

也可以在利用合适的探针进行杂交试验前，利用INA引物对少量经处理RNA进行扩增。

本发明适合用于目前的阵列技术中，例如芯片或随机寻址的高密度光学阵列，从而可以快速测定大量基因。在这种实施方式中，可以在一次实验中测定数以万计的基因的活性。本发明还适合于，例如利用珠技术对少量基因进行测定的方法。经修饰的RNA分子可以以阵列的形式点在或涂覆到合适的基板上，且可以由多种探针测定所述阵列。

在一个优选的实施方式中，本发明特别利用了PNA分子没有净电荷而RNA分子由于其磷酸酯骨架而带有大量负电荷这一事实。可以利用如带正电荷的荧光染料的简单分子检测所结合的PNA探针，将与核酸长度成比例的多个所述分子与核酸特异结合并能够被直接检测。已知有多种此类合适的荧光染料。

所述检测系统还可以是具有带正电荷部分的酶，其将选择性地结合核酸分子并可以利用酶促实验进行检测，或者可以是带正电荷的放射性分子，其选择性地结合所捕获的核酸。可以理解，也可以使用纳米晶体。

另一个合适的检测系统是使用量子点生物结合物(quantum dotbioconjugates)(Chan and Nie 1998 Science 282：2016-2018)。

或者，也可以使用结合有序列特异性探针和多个荧光染料分子的微球。所述微球可以直接与靶向特定RNA分子的探针结合，或者通过RNA的二级非特异组成部分(例如聚腺嘌呤尾)与靶向特定RNA分子的探针结合。在后一种情况中，可以通过聚胸腺嘧啶序列(例如INA、PNA、LNA或寡核苷酸部分)结合微球信号检测系统。

由于携带荧光染料标记的微球可产生多种颜色或光谱，可在单个试验中测定存在于单个细胞样品的多个不同RNA分子中的每一种的量。另外，由于经过如此标记的单个微球易于观察和计数，因此可以相当准确地测定不同RNA分子间的微小表达差异。

检测与经修饰的目标RNA结合的配体的其他方法，例如用合适的放射性化合物或能够与底物反应从而形成有色产物的酶进行标记，也可以用于直接与所捕获的RNA或探针或底物结合的特定应用。

与使用寡核苷酸探针相比，利用INA或PNA或其他寡核苷酸探针作为该过程中的配体之一具有非常明显的优势。INA或PNA的结合达到平衡较快，并具有较高的序列特异性。PNA分子不带电荷，并且可以以高于常规寡核苷酸探针的结合常数与经修饰的目标RNA分子结合。特别地，INA探针增强了A-T和A-U碱基间的结合。对于经处理而将其胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基从而消除二级结构的RNA，这一点非常重要。作为RNA处理的结果，G-C碱基相互作用减少，而A-T和A-U碱基相互作用的数量则相应增加。

由于本发明可以使用直接检测法，所述测定方法可以真实而准确地测定样品中目标RNA的量。该测定方法没有受到依赖信号扩增过程(例如PCR，其中，常用于这种过程的酶可以通过对不同序列的扩增差异速率而引入系统偏差)的方法所固有的潜在偏差的不利影响。

本发明尤其适合检测疾病状况、干细胞和衍生细胞群的分化状况，检测或测量药物治疗对基因表达或细胞功能的影响，以及使用基因表达的准确指标的任何其他情况，例如，有助于为感染诸如丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的患者确定正确的用药方案的病毒荷量监测。

在说明书全文中，除非文章内容另有需要，术语“包括”或“包含”、“含有”应理解为表示具有所述要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组合，但不排除任何其他要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组合。

对于已经包含在本说明书中的文献、操作、材料、装置和文章等的任何讨论仅用于为本发明提供背景。尽管其在本发明优先权日期之前在澳大利亚已经存在，但并不就此而承认任何或全部这些内容构成部分现有技术基础或者是本发明相关领域中的公知常识。

为了可以更清楚的理解本发明，参考以下附图和实施例对所述优选方式进行阐述。

附图说明

图1A为基于微阵列的典型测定方法的示意图，其中暗点表示在特定RNA群中被上调的基因，亮点表示在同一群中被下调的基因。暗箭头和亮箭头分别表示在经亚硫酸氢盐处理的RNA中被测定为上调和下调的基因，而在传统方法中，这些基因由于二级结构阻碍了传统系统中的检测分子与其靶标结合而不能被检出。

图1B显示了与图1A类似的基于微阵列的测定方法，暗箭头和亮箭头分别表示在经亚硫酸氢盐处理的RNA中被测定为上调和下调的基因，而在传统方法中，这些基因由于表达分析前RNA酶处理过程中产生的偏差而导致RNA表达水平的测定不正确。酶处理可能引起令人误解的结果，并且在某些基因显示被上调或下调时，它们实际上并没有受到这样的调控。

图1C显示了与图1A类似的基于微阵列的测定方法，暗箭头和亮箭头分别表示由于检测分子的特异性提高而在经亚硫酸氢盐处理的RNA中被测定为上调和下调的基因，而在传统方法中则不能被检出。提高检测分子的特异结合强度可以检测到由于缺乏特异性而不能利用传统方法检测的RNA分子。

图2显示了对经亚硫酸氢盐处理的RNA进行PCR扩增后的凝胶分离结果。分离孔：M：100-1000bp标准物；第5道：野生型肌动蛋白引物外显子3a-3b；第6道：野生型肌动蛋白引物外显子3a-4；第7道：经亚硫酸氢盐转化的肌动蛋白引物外显子3a-3b；第8道：野生型肌动蛋白引物外显子3a-4。

图3表示肌动蛋白RNA的序列分析。A.经亚硫酸氢盐处理转化的肌动蛋白RNA(SEQ ID NO.1)和B.野生型肌动蛋白RNA(SEQ ID NO.2)。

图4显示了基于线性检测凝胶色谱(linearity performance gel)得到的丙型肝炎病毒(HCV)的结果。

图5显示了丙型肝炎病毒(HCV)RNA线性检测(linearity panel)的实时PCR定量结果。

图6显示了丙型肝炎病毒(HCV)动态范围(dynamic range)的实时PCR定量结果。

具体实施方式

定义

核酸

术语“核酸”包括天然存在的核酸、DNA和RNA。术语“核酸类似物”包括天然存在的核酸、DNA和RNA的衍生物，以及天然存在的核酸的合成类似物。合成类似物包括一种或多种核苷酸类似物。术语核苷酸类似物包括所有本质上与天然存在的核苷酸类似、能够引入到核酸骨架中并能够进行特异性碱基配对(参见下文)的核苷酸类似物，。

因此，术语“核酸”或“核酸类似物”指实质上由多个核苷酸和/或核苷酸类似物和/或插入假核苷酸(intercalator pseudonucleotide)构成的任何分子。用于本发明的核酸或核酸类似物可以包含具有不同骨架单体单元的多个不同核苷酸。

优选地，单链核酸或核酸类似物能够与基本互补的单链核酸和/或核酸类似物杂交，形成双链核酸或核酸类似物。更优选地，此类双链类似物能够形成双螺旋。优选地，所述双螺旋由氢键形成，更优选地，所述双螺旋是选自由A型双螺旋、B型双螺旋、Z型双螺旋和其中间体构成的组的双螺旋。

因此，用于本发明的核酸或核酸类似物包括但不限于DNA、RNA、LNA、PNA、MNA、ANA、HNA以及其混合物和其杂交物(hybrids)，以及其磷原子修饰物，包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸甲酯、亚磷酰胺、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯(phosphoboranoates)。另外，也可以将不含磷的化合物用于与核苷酸连接，例如但不限于甲基亚氨基甲基、formacetate、thioformacetate和包含酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似物可以包含一种或多种插入假核苷酸。

在本文中，“混合物”意在包括含有不同种类的核苷酸或核苷酸类似物的核酸或核酸类似物。另外，在本文中，“杂交物”意在包括下述核酸或核酸类似物：其所包含的一条链包含核苷酸或核苷酸类似物并具有一种或多种骨架，另一条链包含核苷酸或核苷酸类似物并具有不同种类的骨架。

HNA表示如Van Aetschot et al.，1995阐述的核酸。MNA表示Hossain et al，1998阐述的核酸。ANA指Allert et al，1999阐述的核酸。LNA可以是如WO99/14226(Exiqon)中阐述的任何LNA分子，优选地，LNA选自WO 99/14226摘要中描述的分子。更优选地，LNA为如Singh et al，1998，Koshkin et al，1998或Obika et al.，1997阐述的核酸。PNA指如Nielsen et al，1991阐述的肽核酸。

术语核苷酸指核酸或核酸类似物的构成组件(building blocks)，术语核苷酸包括天然存在的核苷酸和其衍生物，以及能够发挥与天然存在的核苷酸或其衍生物基本相同的功能的核苷酸。天然存在的核苷酸包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其中脱氧核糖核苷酸包含四种主要核酸碱基腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一，而核糖核苷酸包含四核酸碱基腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一。

核苷酸类似物可以是能够并入到核酸骨架并能够进行特异性碱基配对的任何核苷酸样分子。

非天然存在的核苷酸包括，但不限于DNA、RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2′-NH)-TNA、(3′-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA、α-L-木糖-LNA、β-D-木糖-LNA、α-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃来苏糖基-NA、2’-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA中包含的核苷酸。

核苷酸和核苷酸类似物的功能是能够通过与互补核苷酸的核酸碱基形成氢键而与互补核苷酸发生特异的相互作用，并能够并入到核酸或核酸类似物中。天然存在的核苷酸以及一些核苷酸类似物能够通过酶促作用(例如通过RNA或DNA聚合酶)并入核酸或核酸类似物中。然而，也可以通过化学作用将核苷酸或核苷酸类似物并入核酸或核酸类似物中。

另外，可以通过使两条较小的核酸或核酸类似物相互连接而制备核酸或核酸类似物，例如可以通过连接酶的酶促作用完成，或者通过化学作用完成。

核苷酸或核苷酸类似物包含骨架单体单元和核酸碱基。所述核酸碱基可以是天然存在的核酸碱基或其衍生物，或者其能够发挥基本相同的功能的类似物。核酸碱基的功能是能够通过氢键与一种或多种其他核酸碱基特异结合。因此，核酸碱基的重要特性是其仅能够与一种或少数其他核酸碱基形成稳定的氢键，但其不能与通常包括该碱基本身在内的多数其他核酸碱基形成稳定的氢键。一种核酸碱基与另一种核酸碱基间的特异性相互作用通常被称为“碱基配对”。

碱基配对导致指定核苷酸和互补核苷酸间的特异性杂交。互补核苷酸是包含能够进行碱基配对的核酸碱基的核苷酸。

在天然存在的常见核酸碱基中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对；而鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。因此，包含A的核苷酸与包含T或U的核苷酸互补，而包含G的核苷酸与包含C的核苷酸互补。

核苷酸可以经进一步衍生而包含附加的分子。可以在核酸碱基或骨架单体单元上对核苷酸进行衍生。碱基上的优选衍生位置包括腺嘌呤的8-位、尿嘧啶的5-位、胞嘧啶的5-位或6-位，以及鸟嘌呤的7-位。杂环修饰可以分成三个结构类型：增强碱基堆叠、附加氢键和这些类型的组合。通过扩大平面系统的π-电子云而增强碱基堆叠的修饰表示为嘧啶5-位和7-脱氮-嘌呤的共轭亲脂修饰。嘌呤修饰物5-位上的取代包括丙炔、己炔、噻唑和简单的甲基基团；7-脱氮嘌呤的7-位上的取代基包括碘代、丙炔基和氰基基团。也可能将胞嘧啶的5-位从丙炔修饰成5-元杂环和源自4-位和5-位(胞嘧啶夹(cytosineclamp))的三环稠合系统。第二类型的杂环修饰的代表为2-氨基-腺嘌呤，其中附加的氨基基团为A-T碱基对提供另一个氢键，其类似于G-C碱基对中的三个氢键。产生组合作用的杂环修饰的代表为2-氨基-7-脱氮-7修饰腺嘌呤和具有杂双链的乙氧基氨基官能团的三环胞嘧啶类似物。另外，N2-修饰的2-氨基腺嘌呤修饰的寡核苷酸也属于常规修饰。核糖或脱氧核糖部分上的优选衍生位置为非连接碳C-2′和C-4′位的修饰，连接碳C-1′、C-3′和C-5′的修饰，糖氧(O-4′)的取代，脱水糖的修饰(构象限定)，环糖修饰(构象限定)，呋喃核糖基环大小的变化，连接位置——糖与糖，(C-3′与C-5′/C-2′与C-5′)，杂原子环——修饰的糖，和以上修饰的组合。然而，其他位置也可以被衍生，只要不破坏核酸或核酸类似物的整体碱基配对特异性。最后，当骨架单体单元包含磷酸酯基团时，一些骨架单体单元的磷酸酯基团也可以被衍生。

本发明使用的寡核苷酸或寡核苷酸类似物为基本由核苷酸和/或核苷酸类似物和/或插入假核苷酸的序列组成的分子。优选地，寡核苷酸或寡核苷酸类似物包含5-100个单核苷酸。寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以包括DNA、RNA、LNA、2′-O-甲基RNA、PNA、ANA、HNA和其混合物，以及任何其他核苷酸和/或核苷酸类似物和/或插入假核苷酸。

RNA

本发明所使用的RNA包括任何来源(如细胞)的信使RNA(mRNA)、未成熟RNA(miRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)，来自病毒或其他微生物的基因组RNA，来自DNA的转录RNA，和相应DNA的RNA拷贝等。

相应的核酸

当核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够杂交时，认为它们是相应的。优选地，相应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在低严谨条件下杂交，更优选地，相应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在中严谨条件下杂交，更优选地，相应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在高严谨条件下杂交。

本发明使用的高严谨条件应表示通常在例如Southern E.M.，1975，J.Mol.Biol.98：503-517阐述的Southern印迹和杂交中使用的严谨度。出于这种目的，常规操作中包括预杂交和杂交的步骤。如1989年Sambrook et al.在″MolecularCloning/A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor中的阐述，此步骤通常利用包含6xSSPE、5％ Denhardt′s、0.5％SDS、50％甲酰胺、100μg/ml变性的鲑鱼睾丸DNA的溶液进行(在42℃温育18hr)，然后用2xSSC和0.5％SDS洗涤(室温和37℃)，并用0.1xSSC和0.5％SDS洗涤(在68℃温育30分钟)。

本发明使用的中严谨条件应表示在包含1mM EDTA、10mMNa₂HPO₄·H₂O、140mM NaCl、pH 7.0的缓冲液中的杂交。优选地，提供约1.5μM的各种核酸或核酸类似物的链。或者，中严谨条件也可表示在包含50mM KCl、10mM TRIS-HCl(pH 9.0)、0.1％Triton X-100、2mM MgCl₂的缓冲液中的杂交。

低严谨条件表示在由1M NaCl、10mM Na₃PO₄构成的pH 7.0的缓冲液中的杂交。

或者，相应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸在给定序列上彼此基本互补，例如大于70％的互补，例如大于75％的互补，例如大于80％的互补，例如大于85％的互补，例如大于90％的互补，例如大于92％的互补，例如大于94％的互补，例如大于95％的互补，例如大于96％的互补，例如大于97％的互补。

优选地，所述给定序列的长度为至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸，例如至少20个核苷酸，例如至少25个核苷酸，例如至少30个核苷酸，例如10-500个核苷酸，例如10-100个核苷酸长度，例如10-50个核苷酸长度。更优选地，相应寡核苷酸或寡核苷酸类似物在其全长上基本互补。

交叉杂交

术语交叉杂交包括至少两个核酸或核酸类似物间的非预期杂交。因此，术语交叉杂交可以用于描述，例如核酸探针或核酸类似物探针序列与除其预期靶标序列之外的其他核酸序列或核酸类似物序列的杂交。

交叉杂交通常发生在探针和一个或多个相应非靶标序列之间，只是比所述探针和其相应靶标序列的互补程度低。这种不良作用可能是由于探针对靶标而言大大过量和/或快速退火动力学。极少核酸碱基对(例如PCR反应中的引物)间的氢键也会发生交叉杂交，导致引物二聚体的形成和/或非特异PCR产物的形成。

包含与同一类型的核苷酸类似物具有高亲和力的一种或多种核苷酸类似物的核酸易于基于碱基配对而形成二聚体或更高级的复合物。包含核酸类似物(例如但不限于LNA、2′-O-甲基RNA和PNA)的探针通常对与包含同一类型的骨架单体单元的其他寡核苷酸类似物的杂交具有高亲和力。因此，即使探针分子个体仅具有低互补程度，其也易于杂交。

自杂交

术语自杂交包括以下过程：核酸或核酸类似物分子通过向其本身折叠而与其自身退火产生二级结构，例如发夹结构。在多数应用中，避免自杂交是非常重要的。二级结构的产生可能抑制与预期核酸靶标序列的杂交。这在多数测定方法中都是不期望的，例如当核酸或核酸类似物用作PCR反应中的引物或者用作核酸外切酶试验的荧光团/淬灭剂标记的探针的情况下。在两种试验中，自杂交都将抑制与靶标核酸的杂交，另外，外切酶试验中荧光团的淬灭程度降低。

包含与同一类型的核酸类似物具有高亲和力的一种或多种核酸类似物的核酸易于发生自杂交。包含核苷酸类似物(例如但不限于LNA、2′-O-甲基RNA和PNA)的探针通常对自杂交具有高亲和力。因此，即使探针分子个体仅具有低互补程度，其也易于自杂交。

解链温度

核酸的解链(melting)表示双链核酸分子两条链的分离。解链温度(T_m)表示出现50％的螺旋形式(杂交)与50％的盘绕形式(未杂交)时的摄氏温度。

高解链温度表示复合物是稳定的，并由此表示单个链之间具有高亲和力。类似地，低解链温度表示单个链之间的亲和力相对较低。因此，两条链间的强氢键通常可以产生高解链温度。

另外，双链核酸的核酸碱基间插入的插入物也可以稳定双链核酸，并由此产生较高的解链温度。

另外，解链温度依赖于环境的物理/化学状况。例如，解链温度依赖于盐浓度和pH。

可以通过多个实验进行测定解链温度，例如其可以利用UV光谱确定杂交的形成和降解(解链)从而进行测定。

INA/IPN定义

插入核酸(INA)为一类独特的DNA结合分子。INA由核苷酸和/核苷酸类似物、和插入假核苷酸(IPN)单体构成。INA与互补DNA具有非常高的亲和力，IPN位于内部时具有高达10级的稳定性，IPN位于末端位置时稳定性高达11级。如果设计得当，INA自身可以称为与DNA的杂交性优于互补RNA的选择性分子。已经证明，如果IPN被置于分子内部，则INA与RNA结合的效率比与寡核苷酸引物的结合效率小约25倍。然而，传统的寡核苷酸、寡核苷酸类似物和PNA对RNA和DNA具有相等的亲和力。因此，INA是首个真正的选择性DNA结合剂。另外，INA对互补DNA的特异性和亲和力高于其他天然DNA分子。

另外，在富含AT的环境中IPN对DNA的稳定作用最佳，这使在表观遗传学研究领域中特别有用。IPN通常作为凸出物(bulge)或末端插入物而被置于INA分子中。IPN本质上是能够与核酸双链中的核酸碱基共堆叠的平面的(杂)多环芳族化合物。

还证明INA分子耐受核酸外切酶的攻击。这使这些分子特别适合在利用诸如phi29的酶扩增中作为引物使用。Phi29具有内在的核酸外切酶活性，用作扩增模板的引物必须在其3′末端进行特异修饰以防止酶降解。然而，可加入INA分子而无需进一步修饰。

INA可以用在传统的PCR扩增反应中，并作为传统引物发挥作用。然而，INA对DNA或RNA模板具有较高特异性，从而使其对于模板有限且反应敏感性至关重要的情况下的应用特别理想。在富含AT的环境中INA对DNA的稳定作用最佳，这使其在对经亚硫酸氢盐处理的DNA序列的扩增中特别有用。这是由于在亚硫酸氢盐转化后，所有胞嘧啶碱基都被转化为尿嘧啶，随后在PCR或其他扩增后被转化成胸腺嘧啶的事实。因此，经亚硫酸氢盐处理的DNA富含大量T。提高INA分子中的IPN分子数量可以提高INA/DNA双链的稳定性。INA中的IPN越多，INA/DAN双链的解链温度就越高。

本申请人之前已经开发出一类插入假核苷酸，当其并入到寡核苷酸或寡核苷酸类似物中时，形成插入核酸(INA)(WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133和WO03/052134)，所述插入核酸具有作为寡核苷酸的补充或替代而具有新的有用特性。

所述插入假核苷酸优选选自1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-芘甲氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。优选地，所述插入假核苷酸选自(S)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-芘甲氧基-2-丙醇的亚磷酰胺或(R)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-芘甲氧-基2-丙醇的亚磷酰胺。

寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以选自DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、插入核酸(INA)、环己基核酸(CNA)及其混合物和其杂交物，以及其磷原子修饰物，例如但不限于硫代磷酸酯、磷酸甲酯、亚磷酰胺、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯以及硼代磷酸酯。非天然存在的核苷酸包括，但不限于以下核苷酸，包括：DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2′-NH)-TNA、(3′-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA、α-L-木糖-LNA、β-D-木糖-LNA、α-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃来苏糖基-NA、2′-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，也可以将不含磷的化合物用于与核苷酸连接，例如但不限于甲基亚氨基甲基、formacetate、thioformacetate以及包含酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似物可以包含一种或多种插入假核苷酸。

本发明人发现当将IPN置于INA分子中以用于特异地检测甲基化位点时，避免将IPN置于潜在的CpG位点是有用的。这是由于当利用IPN割裂CpG位点时，所产生的INA的特异性降低这一事实。

肽核酸(PNA)

肽核酸是能够与序列特异的核酸(DNA和RNA)杂交的非天然存在的聚酰胺。(参见美国专利第5,539,082号和Egholm et al.，Nature(1993)365，566-568)。因为具有多个合乎需要的性质，所以PNA是基于探针的杂交试验中核酸探针的候选替代物/取代物。PNA是非手性聚合物，其与核酸杂交从而形成在热力性学上比相应的核酸/核酸复合物更稳定的杂交物。由于是非天然存在的分子，所以其不是降解肽或核酸的已知酶的底物。因此，PNA在生物样品中稳定，且具有长保存期。与非常依赖于离子强度的核酸杂交不同，PNA与核酸的杂交完全不依赖于离子强度，并且可受益于非常不利于核酸与核酸杂交的低离子强度条件。离子强度对PNA复合物的稳定性和构象的影响已经得到了广泛的研究。与DNA对DNA的识别相比，PNA对DNA或RNA的序列识别更加有效。然而，与DNA探针相比，在杂交试验中PNA探针的单个碱基改变、插入或缺失(insertion or deletion，indel)或多态性区别的优点在某种程度上似乎依赖于序列。另一个优点是，PNA可在平行和反平行两个方向上与核酸杂交，但优选反平行方向。

通过对目前商业可得的标准肽合成过程进行适应性改造，以此来合成PNA。(关于PNA单体和寡聚体的制备，请参见综述：Dueholm et al.，New J.Chem.(1997)，21，19-31 or Hyrup et.al.，Bioorganic & Med.Chem.(1996)4，5-23)。可购买(参见：PerSeptive Biosystems Promotional Literature：BioConcepts，Publication No.NL612，Practical PNA，Review and Practical PNA，Vol.1，Iss.2)或利用可商购的产品制备标记和未标记的PNA寡聚体。

PNA探针和标准的核酸探针间确实存在许多差异。这些差异可以方便地分为生物差异、结构差异和物理化学差异。如上下文中的讨论，当试图在通常使用核酸的应用中使用PNA探针时，这些生物差异、结构差异和物理化学差异可能产生不可预测的结果。这种不同组成的非等价性通常可在化学领域中观察到。

关于生物差异，作为基因传递和表达的工具，核酸是在活生命体中起重要作用的生物物质。核酸的体内特性已经得到相当充分的了解。然而，PNA是最近开发出的一种完全人造的分子，由化学家构思并通过有机化学合成制备。它还没有已知的生物功能。

PNA在结构上也与核酸显著不同。虽然两者都能使用常规的核酸碱基(A、C、G、T和U)，但两种分子的骨架在结构上有所不同。RNA和DNA的骨架由重复的核糖磷酸二酯和2-脱氧核糖单元组成。与之相比，PNA的骨架由N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元构成。另外，在PNA中，核酸碱基通过另外的亚甲基羰基单元与骨架相连。

尽管具有如此命名，但PNA并不是酸，且不包含任何如DNA和RNA中存在的那些带电酸性基团。由于缺少形式电荷，PNA通常比其等价的核酸分子更疏水。PNA的疏水特性可允许在核酸中不能观察到的非特异性(疏水/疏水相互作用)相互作用的可能性。另外，PNA是非手性的，使其具有在RNA/DNA领域中并不存在的等同的结构构象。

PNA和DNA或RNA间的物理/化学差异也是重要的。PNA与其互补核酸结合的速度比核酸探针与相同靶标序列结合的速度更快。人们认为这种特性至少部分是由于PNA骨架上缺乏电荷这一事实。另外，最近的出版物证明，向PNA中引入带正电荷的基团将改进杂交的动力学。由于骨架上缺乏电荷，PNA/核酸复合物的稳定性高于类似的DNA/DNA或RNA/DNA复合物。在某些情况，PNA将形成高度稳定的三螺旋复合物，或者通过所谓的“链置换”过程形成小环。在DNA/RNA领域中，尚未发现类似的链置换过程或结构。

总之，由于PNA与具有序列特异性的核酸杂交，PNA是用于开发基于探针的测定方法的有用候选者。重要的是，PNA探针不是核酸探针的等效物。然而，即使在最严谨的条件下，精确的靶标序列和密切相关序列(例如具有单点突变的非靶标序列(单个碱基对错配))间也经常存在可用标记的核酸或标记的PNA探针检测到的相互作用。与密切相关的非靶标序列的任何杂交都将导致不良背景信号的产生。由于所述序列的相关度非常密切，所以点突变是在所有核酸修饰中最难于利用基于探针的测定实验检测到的一类。多种疾病(例如镰状细胞血症和囊性纤维化)有时是由基因组核酸的单点突变引起的。因此，可提高基于探针检测的特异性、灵敏度和可信度的任何方法、试剂盒或组合物都可用于含DNA样本的检测、分析和定量。

亚硫酸氢钠

利用亚硫酸氢钠处理核酸的方法可见于多种参考文献，包括Frommer etal 1992，Proc Natl Acad Sci 89：1827-1831；Grigg and Clark 1994 BioAssays16：431-436；Shapiro et al 1970，J Amer Chem Soc 92：422 to 423；Wataya andHayatsu 1972，Biochemistry 11：3583-3588。

本发明人还开发出了提高或增强亚硫酸氢盐处理核酸的成效的方法。

以下列出了对核酸进行有效亚硫酸氢盐处理的示例性方案。该方案可以保留几乎所有处理的DNA。本文中该方法也被称为人类遗传印记(HumanGenetic Signatures，HGS)法。可以理解，可以改变样品或试剂的体积或用量。

优选的亚硫酸氢盐处理方法可见于US 10/428310或PCT/AU2004/000549。

向2μg DNA(如果需要可以用适当的限制性酶进行预消化)中加入2μl(1/10体积)的3M NaOH(6g/50ml水，新鲜制备)，终体积为20μl。因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链分子反应，该步骤将双链DNA分子变性为单链形式。将混合物在37℃温育15分钟。可用高于室温的温度进行温育，以提高变性效率。

温育后，接连加入208μl 2M焦亚硫酸钠(7.6g/20ml水和416ml的10NNaOH；BDH AnalaR #10356.4D；新鲜制备)以及12μl的10mM对苯二酚(0.055g/50ml水，BDH AnalR #103122E；新鲜制备)。对苯二酚是还原剂，并有助于降低试剂的氧化作用。还可以使用其他还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(氢醌)或其他合适的还原剂。用200μl矿物油覆盖样品。矿物油覆盖可以防止试剂的蒸发和氧化，但并非必不可少的。随后将样品在55℃温育过夜。或者，也可以使该样品在热循环仪中进行如下循环：如下温育约4小时或温育过夜：第一步，在PCR仪中循环55℃/2小时；第二步，95℃/2分钟。第一步可以在从约37℃至约90℃之间的任何温度进行，时间长度可以从5分钟至8小时之间变化。第二步可以在从约70℃至约99℃之间的任何温度进行，时间长度可以从1秒至60分钟或者更长之间变化。

用焦亚硫酸钠处理后，除去油，若DNA浓度低则加入1μl tRNA(20mg/ml)或2μl糖原。这些添加剂是可选的，并且可以用来通过与靶标DNA共沉淀而提高所获得的DNA产量，尤其是DNA以低浓度存在时。当核酸量＜0.5μg时，则通常需要使用作为载体的添加剂以更加有效地沉淀核酸。

异丙醇提纯处理如下进行：将800μl水加入样品中，混匀，然后加入1ml异丙醇。水或缓冲液将反应管中的亚硫酸氢盐浓度降低到该盐不随目的靶标核酸一起沉淀的水平。稀释度通常为约1/4至1/1000，只要将盐浓度稀释至低于如本文所公开的预期范围即可。

将样品重新混匀，并于4℃至少静置5分钟。将样品在微型离心机中离心10-15分钟，并将沉淀用70％ETOH洗涤2次，每次均涡旋。该洗涤处理除去任何与核酸一起沉淀的残余盐。

将沉淀干燥，然后重悬于pH 7.0-12.5的适当体积(例如50μl)的T/E(10mM Tris/0.1mM EDTA)中。已经发现pH 10.5的缓冲液特别有效。出于悬浮核酸的需要，将样品在37℃至95℃温育1分钟至96小时。

基本除去RNA二级结构的试剂

适合用于本发明的试剂包括亚硫酸氢盐、羟胺、乙酸盐或柠檬酸盐。优选亚硫酸氢盐试剂，其包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸氢胍，如WO2005054502中所述。在这方面，可以进行如下的RNA处理：其中使用亚硫酸氢胍制备含胍离子和亚硫酸根离子的溶液并随后处理RNA。

细胞系

表1.用于RNA分析的细胞系

名称	细胞类型	培养条件
名称	细胞类型	培养条件	HeLa	宫颈癌	RPM1+10％HI FCS(用于初始快速生长)，随后使用DMEM+10％ HI FCS(用于较慢生长)。以1∶10传代，每周2次
HepG2	肝癌	DMEM(高葡萄糖4.5g/L)+10％HI FCS+2mM谷氨酰胺。以1∶4传代，每周2次	HeLa	宫颈癌

从细胞提取RNA

I.除去培养液后向细胞(90％融合度)中直接加入1ml Trizol。

II.充分混合样品并室温下静置5分钟以分解核蛋白复合物。

III.向不含Rnase的1.5ml洁净离心管中加入0.5ml上述混合样品。

IV.然后将样品在4℃以12,000Xg离心10分钟，以除去高分子量的DNA和其他污染物。

V.将上清移入到洁净试管中，加入100μl 100％氯仿并手动剧烈混合样品15秒，然后在室温温育2-3分钟。

VI.然后在4℃以12,000Xg离心10分钟，以分离各个相。

VII.将上部的水相移入到洁净试管中，并保证移液管头不与界面接触，然后加入1μl 20mg/ml糖原，并对样品进行涡旋。

VIII.向涡旋的试管中加入等体积100％异丙醇(0.25ml)，然后在室温下静置10分钟。

IX.然后在4℃以12,000Xg离心样品10分钟，以沉淀RNA。

X.除去上清，并用0.75ml 80％的乙醇洗涤沉淀以除去cDNA合成反应的抑制剂，短暂涡旋，随后在4℃以7,500Xg离心样品5分钟，以沉淀RNA。

XI.再次重复步骤X。

XII.然后在微量离心机中旋转10秒，除去残留的乙醇并立即将沉淀重悬在25μl不含Rnase的水中。注意：如果沉淀过干，将难以重悬RNA且260/280比例将小于1.6。

XIII.然后记录OD_260/280/310值，并将RNA贮存在-70℃直至使用。

RNA的制备

从所需细胞或组织中提取RNA后，将RNA样品重悬在20μl不含核酶的水中。

将样品在60℃-100℃加热2-3分钟，以分解二级结构并立即用于亚硫酸氢盐反应中。

亚硫酸氢盐的处理

以下阐述的示例方法用于证明本发明用亚硫酸氢盐处理RNA的有效性。该方案可以成功地保留几乎所有处理的RNA。本发明的这个方法也被称为人类遗传印记(Human Genetic Signatures，HGS)法。可以理解，可以改变样品或试剂的体积或用量。

将2μg RNA重悬在总计20μl的不含Rnase的水中。然后将样本在65℃温育2分钟，以除去二级结构。温育后，接连加入pH为5.0的208μl 2M的焦亚硫酸钠(7.6g/20ml水或10mM Tris/1mM EDTA与416ml 10N NaOH；BDH AnalaR #10356.4D；新鲜制备)。此时也可以根据生产商的说明加入Rnase抑制剂，例如RNaseOUT(Invitrogen cat# 10777-019)。用200μl矿物油覆盖所述样品。矿物油覆盖可以防止试剂的蒸发和氧化，但并非必不可少的。随后将样品在55℃温育过夜。这种温育可以在从约37℃至约90℃的任何温度下进行，时间长度可以在从5分钟至16小时之间变化。

用焦亚硫酸钠处理后，除去油，若DNA浓度低则专门加入1μl糖原(20mg/ml)。这些添加剂是可选的，并且可以用来通过与靶标DNA特异共沉淀而提高所获得的RNA产量，尤其是RNA以低浓度存在时。当核酸量＜0.5μg时，则通常需要使用作为载体的添加剂以更有效地沉淀核酸。

异丙醇清除处理可以如下进行：将800μl不含RNase的水加入样品中，混匀，然后加入1ml异丙醇。水或缓冲液将反应管中的亚硫酸氢盐浓度降低到该盐不随目的靶标核酸一起沉淀的水平。稀释度通常为约1/4至1/1000，只要将盐浓度稀释至低于如本文所公开的预期范围即可。

将样品重新混匀，并4℃静置至少5分钟，但可以达60分钟。将样品在微型离心机中离心10-15分钟，并将沉淀用80％ ETOH洗涤2次。该洗涤处理除去任何与核酸一起沉淀的残余盐。

可以轻微干燥沉淀以除去残留的乙醇，但要保证沉淀没有完全干燥，因为这样会降低RNA的终产量，然后将沉淀重悬在合适体积(例如50μl)的pH为7.0-12.5的T/E(10mM Tris/0.1mM EDTA)中。已经发现pH 10.5的缓冲液特别有效。出于悬浮核酸的需要，将样品在37℃至95℃温育1分钟至96小时。

cDNA的合成

针对每个cDNA合成反应，在0.5ml不含Rnase的薄壁试管中制备以下试剂。

RNA(1μg) 3.5μl

随机六聚体(10μM) 1μl

去离子水 2.5μl

将上述内容物混合并在微量离心机中短暂离心。

将样品在70℃温育3分钟从而使RNA变性。

在RNA变性时制备以下通用混合物(Master Mix)：

Per rxn

5x第一链缓冲液 2μl

DTT(20mM) 1μl

50x dNTP混合物 1μl

总体积 4μl

将试管从PCR仪上取出，并在冰上冷却2分钟，然后短暂离心以收集内容物。

然后将样品在42℃温育2分钟。

向每个反应(1.75μl)中加入0.5μl Powerscript反转录酶，通过移液管吹打将通用混合物混合均匀。

向各个样品和对照试管中加入4.5μl完全通用混合物，然后将样品在42℃温育60分钟，随后将样品转移到冰上。

向各个样品中加入40μl pH为7.6的10mM Tris/1mM EDTA。

将试管在72℃加热7分钟，然后在-70℃下保存直至使用。

PCR扩增

对1μl经亚硫酸氢盐处理的RNA进行PCR扩增：在含1μl经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的25μl反应混合物中，使用Promega PCR通用混合物和引物(每种引物6ng/μl)进行PCR扩增。

将1μl第一轮扩增产物转移到第二轮扩增反应混合物中。将PCR产物的样本在ThermoHybaid PX2热循环仪中按Clarke et al.阐述的条件进行扩增。

表2.用于扩增肌动蛋白基因的引物

基因	引物序列	SEQ ID NO：
基因	引物序列	SEQ ID NO：	ACTIN-3F1	gacggccaggtcatcaccattggcaat	3
ACTIN-3F2	gttccgctgccctgaggcactcttccag	4	ACTIN-3F1	gacggccaggtcatcaccattggcaat	3
ACTIN-3F2	gttccgctgccctgaggcactcttccag	4	ACTIN-4R1	ggtagtttcgtggatgccacaggactc	5
ACTIN-4R2	gatgtccacgtcacacttcatgatgga	6	ACTIN-4R1	ggtagtttcgtggatgccacaggactc	5
ACTIN-4R2	gatgtccacgtcacacttcatgatgga	6	ACTIN-4F1	ccatgtaccctggcattgccgacag	7
ACTIN-4F2	aggagatcactgccctggcacccagcac	8	ACTIN-4F1	ccatgtaccctggcattgccgacag	7

利用每50ml琼脂糖含一滴溴化乙锭(CLP #5450)的1％TAE制备琼脂糖凝胶(2％)。将5μl源自PCR的产物与1μl 5X琼脂糖上样缓冲液混合，并利用潜入式水平电泳槽在X1TAE中以125mA进行电泳。标准物为100-1000bp(低型，low type)。利用Kodak UVIdoc EDAS 290系统在UV照射下目测观察凝胶。

利用珠子的检测系统

包被磁珠

可以以多种方式修饰用于与磁珠结合的INA。在本实施例中，包含5′氨基或3′氨基基团的INA使用诸如EDC的杂-双功能连接子使INA和珠子共价连接。然而，还可以用诸如生物素的5′基团对INA进行修饰，此后，所述生物素可以被动地与用亲和素或链霉亲和素(Streptavidin)基团修饰的磁珠结合。

将10μl羧酸盐修饰的Magnabind^TM珠子(Pierce)或100μl D ynabeads^TM链霉亲和素(Dynal)转移到1.5ml的洁净试管中，并加入90μl PBS溶液。

混合珠子，然后磁化并弃去上清。在PBS中洗涤珠子两次(每次洗涤100μl)，并最终重悬在90μl pH为4.5的50mM MES中或者重悬在制造商说明书中确定的另一缓冲液中。

向样品中加入1μl 250μM INA(其浓度依赖于通过寡聚杂交试验测定的所选INA的特异活性)，然后涡旋试管并在室温下静置10-20分钟。

然后加入10μl新制备的10mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，涡旋样品并在室温或4℃的温度下温育达60分钟。

然后磁化样品，弃去上清并可以通过加入100μl 0.25M NaOH或0.5MpH 8.0的Tris来封闭珠子。

然后用PBS溶液洗涤珠子2次，并最终重悬在100μl PBS溶液中。

利用磁珠的杂交

将INA包被的10μl Magnabind^TM珠子转移到洁净的试管中，然后加入40μl纯的或用蒸馏水以1∶1稀释的ExpressHyb^TM缓冲液(Clontech)，或纯的或用蒸馏水以1∶1/1∶2或1∶4稀释的Ultrahyb^TM缓冲液(Ambion)，或者自配的杂交缓冲液。所述缓冲液还可以含有浓度已知的阳离子/阴离子或两性洗涤剂(zwittergents)或其他诸如肝素和聚氨基酸的添加剂。

然后向上述溶液中加入1-5μl RNA样品并涡旋试管，随后在根据所选INA/RNA杂交物的解链温度在55℃或其它温度下温育20-60分钟。

使样品磁化并弃去上清，在上个步骤的杂交温度下用0.1XSSC/0.1％SDS洗涤珠子2次，每次5分钟，在两次洗涤之间磁化样品。

放射标记的检测球的制备

可以用诸如氨基基团、巯基基团或生物素的分子，对INA或寡聚分子进行3′或5′标记。

所述经过标记的分子还可以具有第二标记，例如引入到所述分子的第一标记的相反端的P³²或I¹²⁵。

目前，可以利用杂-双功能连接子(例如EDC)将该双标记检测分子共价连接到羧酸盐或尺寸已知的经修饰乳胶珠上。

然后可以通过洗涤除去未结合的分子，留下被大量特异检测分子/信号放大分子包被的珠子。

然后，这些珠子可以与目标核酸样品杂交，从而产生信号放大作用。

荧光标记的检测球的制备

所述经标记的分子还可以具有引入到分子的第一标记的相反端的第二标记，例如Cy-3、Cy-5、FAM、HEX、TET、TAMRA或任何其他合适的荧光分子。

目前，可以利用杂-双功能连接子(例如EDC)将该双标记检测子分子共价连接到羧酸盐或尺寸已知的经修饰乳胶珠子上。

然后，这些珠子可以与目标RNA样品杂交，从而产生信号放大作用。

酶标记的检测球的制备

可以用诸如氨基基团或巯基基团的分子，对INA或寡聚分子进行3′或5′标记。

所述经标记的分子还可以具有通过杂-双功能连接子结合到分子第一标记的相反端的第二标记，例如生物素或其他分子(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。

目前，可以利用杂-双功能连接子(例如EDC)将该双标记检测子分子可以共价连接到羧酸盐或尺寸已知的经修饰乳胶珠子上。

然后，可以通过与如链霉亲和素的分子结合或通过涉及显色底物的酶促反应获得信号放大作用。

INA寡聚物的组合

初始杂交优选涉及使用由与目标RNA互补的INA包被的磁珠。

通过需要，第二杂交可以涉及上述任何检测方法。

可以利用与目标核酸互补的第二INA或者与目标RNA互补的寡聚体或经修饰寡聚体完成该杂交反应。

树状物(dendrimer)和适体(aptamer)

树状物是分枝的树状分子，其能够以可控的方式化学合成从而可以产生用特异分子标记的多个层。它们可以从内向外逐步合成，反之亦然。

控制树状物结构及其产生的最重要参数之一是各步骤产生的分枝数量，这决定构建预期分子所需要的重复步骤数。

可以合成树状物，使其包含诸如I¹²⁵或P³²的放射性标记或诸如Cy-3、Cy-5、FAM、HEX、TET、TAMRA或其他任何合适荧光分子的荧光标记，以增强信号放大作用。

或者，可以合成树状物，使其包含羧酸盐基团(carboxylate group)或可用于结合经修饰的INA或DNA分子的任何其他反应性基团。

利用阵列的检测系统

经处理的RNA可以应用于任何合适的基板，从而形成阵列，例如可以筛选基因活性或目标表达单元的微阵列。本领域技术人员熟悉用于制备合适阵列的适当技术。

实施例

图1A、图1B和图1C显示了利用典型微阵列的基于实验对本发明(经亚硫酸氢盐处理的RNA)与现有技术的比较。图1A为基于微阵列的典型测定方法的示意图，其中暗点表示在特定RNA群中被上调的基因，亮点表示在同一群中被下调的基因。暗箭头和亮箭头分别表示在经亚硫酸氢盐处理的RNA中被测定为上调和下调的基因，而在非传统方法中，这些基因由于二级结构阻碍了传统系统中的检测分子与其靶标结合而不能被检出。

肌动蛋白

根据上述，提取RNA并纯化，然后用亚硫酸氢盐处理并扩增。在扩增后，根据生产商的说明利用Marligen PCR清理试剂盒对PCR产物进行纯化，并重悬在20μl水中。向10μl PCR产物中加入100ng反向引物，并将样本送往Supermac(Camperdown，Sydney)进行DNA测序。

图2表示利用经亚硫酸氢盐修饰的来自细胞系材料的总RNA的反转录PCR。从图中可以看出，当使用靶向肌动蛋白基因的外显子3a-4或外显子3a-3b的野生型引物(未经亚硫酸氢盐转化)时，在两种情况下都没有得到扩增产物。这表明RNA的转化非常有效，从而不能检测到任何野生型序列。相反，如果在相同的样品上使用经亚硫酸氢盐转化的靶向外显子3a-4或外显子3a-3b的引物，则产生独特的PCR条带，这表明可能从经亚硫酸氢盐转化的材料扩增特异的mRNA。

图3显示对经亚硫酸氢盐转化的RNA产生的PCR产物的直接测序。从测序图谱可以看出，由于产物的序列携带了外显子3和4之间的剪切位点，所以PCR产物源自RNA，而非DNA污染物。另外，从图3可以看出，由于样品中的所有起源C残基都转化成了T残基，所以PCR产物已被完全转化。

丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒(HCV)RNA样品从Acrometrix(OptiQual HCV高阳性对照)或BBI diagnostics(HCV RNA线性检测样品板(linearity panel))获得，并根据生产商的说明用Ultrasens Viral纯化试剂盒进行纯化。用亚硫酸氢钠处理样品，并按如下所述使用Superscript III反转录酶(Invitrogen)反转录经转化的HCV RNA样品。

11μl转化的RNA模板

1μl随机引物(300ng/μl)

1μl dNTPs(10mM)

在65℃加热样品5分钟，然后立即置于冰上至少1分钟，之后加入以下试剂：

4μl 5x第一链缓冲液

1μl RNase OUT(40U/μl)

1μl DTT(100mM)

1μl Superscript III(200U/μl)

利用以下条件对样品进行反转录：

25℃，12分钟

27℃，2分钟

29℃，2分钟

31℃，2分钟

33℃，2分钟

35℃，2分钟

37℃，30分钟

45℃，15分钟

50℃，5分钟

75℃，5分钟

然后，利用HCV 5′NTR特异性引物和探针对2μl cDNA进行PCR扩增。

(正向引物-ttatgtagaaagtgtttagttatggtgt(SEQ ID NO：9)；

反向引物-acccaaatytccaaayattaaacaaat(SEQ ID NO：10)；

探针-tcCacAaaCcaCtaTaaCtcTcc(SEQ ID NO：11)，

(其中大写字母表示存在LNA)在Corbett 6000 Rotor Gene中利用以下试剂盒和循环条件：

Sigma Jumpstart 2x通用混合物 12.5μl

正向引物 50ng

反向引物 50ng

25mM MgCl₂ 3.5μl

400nM探针(终浓度) xμl

加水至23μl xμl

95℃，10分钟

95℃，10秒(50x)

53℃，90秒(50x)

60℃，30秒

结果示于图4，其中从图中可以看出所述测定方法的检测极限约为2.5IU病毒。

表3.图4中所示结果的总结

样品号	IU/PCR	拷贝/PCR	样品#	IU/PCR	拷贝/PCR
样品号	IU/PCR	拷贝/PCR	样品#	IU/PCR	拷贝/PCR	1	1.2x10⁵	3.2x10⁵	7	3.8	10
2	2x10⁴	5.3x10⁴	8	1	2.7	1	1.2x10⁵	3.2x10⁵	7	3.8	10
2	2x10⁴	5.3x10⁴	8	1	2.7	3	1.2x10⁴	3.2x10⁴	9	0.3	1
4	2.5x10³	6.7x10³	10	0	0	3	1.2x10⁴	3.2x10⁴	9	0.3	1
4	2.5x10³	6.7x10³	10	0	0	5	1.4x10²	3.7x10²	11	0	0
6	11.8	31				5	1.4x10²	3.7x10²	11	0	0

图4的凝胶结果表明，亚硫酸氢盐法可用于在宽靶标浓度范围内(低至2.5IU HCV)监测HCV的表达水平。

nc＝阴性对照

图5显示HCV线性检测样品板滴定的实时qPCR结果。该图的标准曲线是线性的，R值为0.99947，R²值为0.9989。

表4.图5中分析的经处理HPV的样品。

样品号	线	Ct	给定浓度(IU)	计算浓度(IU)	Var(％)
样品号	线	Ct	给定浓度(IU)	计算浓度(IU)	Var(％)	1	........	25.06	3,250.0	3,591.8	10.5
2	-----	29.75	732.5	670.0	8.5	1	........	25.06	3,250.0	3,591.8	10.5
2	-----	29.75	732.5	670.0	8.5	3	__·__	37.03	55.0	49.5	10.0
4	__··__	42.60	6.0	6.8	12.6	3	__·__	37.03	55.0	49.5	10.0
4	__··__	42.60	6.0	6.8	12.6	5	_____	46.87	1.5	1.5	2.4

图6显示在动态滴定范围内，HCV定量报告的qPCR结果。该图的标准曲线是线性的，R值为0.99856，R²值为0.99713。

表5.图6中分析的经处理HCV的样品

样品号	线	Ct	给定浓度(IU)	计算浓度(IU)	％Var
样品号	线	Ct	给定浓度(IU)	计算浓度(IU)	％Var	1	...........	25.53	156,250.0	169,174.2	8.3
2	------	29.68	31,250.0	26,876.3	14.0	1	...........	25.53	156,250.0	169,174.2	8.3
2	------	29.68	31,250.0	26,876.3	14.0	3	·__·__·	32.67	6,250.0	7,117.9	13.9
4	__·__	36.89	1,250.0	1,090.6	12.8	3	·__·__·	32.67	6,250.0	7,117.9	13.9
4	__·__	36.89	1,250.0	1,090.6	12.8	5	____	39.53	312.5	337.7	8.1

线性检测样品板和动态范围内样品的结果显示出在实时PCR过程中产生的定量曲线。曲线的线与阈值相交的点被称为Ct值，其用于对样品进行定量。对每组样品，将跨越3个数量级的一系列浓度已知的病毒纯化、由亚硫酸氢盐转化和扩增，所产生的标准曲线显示反应的效率是恒定的，并且在所检测浓度范围内都为线性，例如R²值接近1。这些结果和图4的结果证明利用端点PCR和利用病毒特异性探针的实时PCR对HCR病毒RNA(范围为156250IU至1.5IU)的检测都具有敏感性和特异性，说明所述测定方法可以在很宽的浓度范围内检测病毒基因的表达。

本领域的技术人员可以理解，对如在具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或更改并不脱离经广义描述的本发明的精神或范围。因此，应认为本实施方案在所有方面是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>人类遗传标记控股有限公司(Human Genetic Signatures Pty Ltd)

<120>基因表达的测定方法(Assay for gene expression)

<130>205986983

<160>11

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>59

<212>DNA

<213>人

<400>1

aaataatttc ataaatacca caaaactcca tacccaagaa aaaagaacta aaaaaatac 59

<210>2

<211>58

<212>DNA

<213>人

<400>2

ggatagtttc gtggatgcca caggactcca tgcccaggaa ggaaggctgg aagagtgc 58

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>3

gacggccagg tcatcaccat tggcaat 27

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人

<400>4

gttccgctgc cctgaggcac tcttccag 28

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>5

ggtagtttcg tggatgccac aggactc 27

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>6

gatgtccacg tcacacttca tgatgga 27

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人

<400>7

ccatgtaccc tggcattgcc gacag 25

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人

<400>8

aggagatcac tgccctggca cccagcac 28

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>9

ttatgtagaa agtgtttagt tatggtgt 28

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>10

acccaaatyt ccaaayatta aacaaat 27

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>11

tccacaaacc actataactc tcc 23

Claims

1.一种基因表达的测定方法，其包括：

用基本除去RNA二级结构的试剂处理所述RNA；和

检测经处理的RNA是否存在或其存在量，以获得基因表达的指标。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其中利用寡核苷酸、PNA、LNA或INA探针检测所述RNA。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其中所述探针主要包含碱基：腺嘌呤A、胸腺嘧啶T和胞嘧啶C。

4.根据权利要求2或3所述的测定方法，其中所述探针为INA探针。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的测定方法，其中所述RNA为mRNA。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的测定方法，其中所述RNA来自动物、植物、微生物、一个或多个细胞、或细胞群。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其中所述微生物为病毒或细菌。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的测定方法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、羟胺、乙酸盐或柠檬酸盐。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。

10.一种基因表达的测定方法，其包括：

用基本除去RNA二级结构的试剂处理所述RNA；

利用能够与RNA的互补序列结合的引物反转录并扩增所述RNA；和

检测经处理和扩增的RNA是否存在或其存在量，以获得基因表达的指标。

11.根据权利要求10所述的测定方法，其中所述RNA是mRNA。

12.根据权利要求11所述的测定方法，其中所述RNA来自动物、植物、微生物、一个或多个细胞、或细胞群。

13.根据权利要求12所述的测定方法，其中所述微生物为病毒或细菌。

14.根据权利要求13所述的测定方法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、羟胺、乙酸盐或柠檬酸盐。

15.根据权利要求14所述的测定方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。

16.寡核苷酸、PNA、LNA或INA探针在基因表达的测定方法中的应用，其中所述测定方法使用基本除去RNA二级结构的试剂。

17.根据权利要求16所述的应用，其中所述探针主要包含碱基：腺嘌呤A、胸腺嘧啶T和胞嘧啶C。

18.根据权利要求16所述的应用，其中所述探针基本不含鸟嘌呤G。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的应用，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、羟胺、乙酸盐或柠檬酸盐。

20.根据权利要求18所述的应用，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。