JP2008516584A - 新規ホットスタート核酸増幅法 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、非特異的プライマー伸長産物を減少または消失させる方法を提供する。より具体的には、本方法は、これらの産物を減少または消失させるために、一本鎖核酸結合タンパク質を用いる。この発明は、ポメラーゼ連鎖反応(PCR)のための新規のホットスタートの方法として特に有用であると考えられる。
核酸の増幅は現代科学において基礎的な重要性を有している。この過程において、核酸は協調的な触媒的合成を介して複製される。
using Purified Genes 23:683-693)。この方程式は、#をプライマーに存在するA、G、CまたはT塩基の数とする時、Tm(℃)は2×(#A+#T)+4×(#G+#C)であるというものである。したがって、等しい塩基を持つ20塩基長のプライマーは、2×(5+5)+4×(5+5)=60℃というTmを持つと予想されるだろう。
鋳型核酸の標的部と相補的な核酸配列を有するプライマーが鋳型核酸とハイブリダイズし、酵素により伸長される、鋳型核酸およびその一部分を複製する方法が提供される。その方法は、(a)第一の温度で、プライマー、鋳型の核酸、プライマー伸長を触媒するために有効な酵素、および、一本鎖の核酸との結合タンパク質の有効量を含む反応混合液を準備する工程、(b)前記第一の温度より高い第二の温度で、ハイブリダイズされた産物を生産するために、ハイブリダイゼーション反応を実行する工程、および(c)第二の温度より高い第三の温度で、前記ハイブリダイズされた産物から伸長産物を生産するためにプライマー伸長反応を行う工程;を含み、第一の温度における、反応混合液への一本鎖核酸結合タンパク質の導入の結果として、特異的伸長産物の生成が改善される方法である。
ここで用られるところでは、5−25(もしくは5から25)のような範囲が与えられる時、これは、好ましくは少なくとも5以上を意味し、それとは別に独立して、少なくとも25以下を意味する。
・ 増幅を望む、一本鎖又は二本鎖であってもよい、鋳型核酸;
・ 鋳型核酸の標的部分と相補的な少なくとも一のプライマー−−もしその鋳型が二本鎖で両方の鎖の増幅が望まれるならば、それぞれが鋳型のセンス鎖とアンチ鎖の、それぞれにおける特異的標的部分と相補的な、少なくとも二のプライマーが提供されるであろう;
・ 酵素による核酸合成に必要な4つのデオキシリボ核酸(dATP、dGTP、dTTPおよびdCTP)、場合によっては外来性の核酸もまた含まれてもよい(例えば、dUTP);
・ 核酸合成を行う1または複数の酵素、典型的にはTaq DNAポリメラーゼおよび/または他の熱安定性ポリメラーゼ、鋳型がRNAの場合は逆転写酵素(例えば、MMLV−RTまたはAMV−RT)、もしくは他の適する酵素;
・ ポリメラーゼが用いられる時は、ポリメラーゼ活性に補助的な、Mg2+、Mn2+などのような二価カチオン;
・ 更に以下に述べるようなハイブリダイゼーションサイクルとプライマー伸長反応をサポートすることのできる適切な反応バッファー。
1) 変性温度は典型的には100℃未満だが90℃より高く;インキュベーション時間は1秒から約15分までである。これらの温度と時間は、十分にdsDNAを変性させ、ssDNAを生成するように選ばれる。
2) ハイブリダイゼーション温度は典型的には、72℃前後かそれ未満であるが、50℃より高く、プライマーの融解温度(Tm)に応じて、高いストリンジェンシーを与えるような特異的な温度が選択される。
T7SSB発現プラスミドの作成 − Ndeの制限酵素部位を持つ5’末端プライマー(5’-ATC-CAT-ATG-GCT-AAG-AAG-ATT-TTC-ACC-TCT- GCG-3’、配列番号1)とSal1とXma1制限酵素部位を持つ3’末端プライマー(5’-GTC-GAC-CCC-GGG-TTA-GAA-GTC-GCC-GTC-TTC-GTC-TGC-TTC-C-3’、配列番号2)の2のプライマーが、精製バクテリオファージT7ゲノムDNA(USB Corporation, Cleveland, Ohio)の9158−9856の位置からの野生型T7SSB遺伝子の核酸配列をPCRで増幅するために用いられた。T7の完全なゲノム配列は、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の遺伝子座NC_001604で見ることができる。バクテリオファージT7は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)からカタログ番号11303−B38TMおよびBAA−1025−B2TMで公然と入手可能である。野生型T7gene2.5、その対応するタンパク質(wtT7gp2.5、T7SSBとも呼ばれる)および、ここで議論されるそれらの変異体の配列は、便宜上、参照しやすいように、配列表で提供される。
遺伝子産物Numb(配列番号8の配列)の306塩基対(bp)領域を、5ナノグラム(ng)のヒトゲノムDNAから、更に以下に示すような、SSBの種類および濃度、ポリメラーゼの選択などの様々な異なる条件の下で、個別に増幅した。標的は、NCBIでNT_026437.11として同定されている(配列位置:54742877から54743182)。それぞれ長さが25塩基である、次の増幅用プライマーが用いられた。
Numb 順方向:5’-GAGGTTCCTACAGGCACCTGCCCAG-3’ (配列番号9)および
Numb 逆方向:5’-CAAAATCACCCCTCACAGTACTCTG-3’ (配列番号10)
反応1:抗体の結合したTaq DNAポリメラーゼ、SSB無し;
反応2:化学修飾されたTaq DNAポリメラーゼ、SSB無し;
反応3:未修飾のTaq DNAポリメラーゼ、SSB無し;
反応4:1μgの野生型大腸菌SSB、抗体の結合したTaq DNAポリメラーゼ;
反応5:1μgの野生型大腸菌SSB、化学修飾されたTaq DNAポリメラーゼ;
反応6:1μgの野生型大腸菌SSB、未修飾のTaq DNAポリメラーゼ;
反応7:1μgの野生型T7SSB、抗体の結合されたTaq DNAポリメラーゼ;
反応8:1μgの野生型T7SSB、化学修飾したTaq DNAポリメラーゼ;
反応9:1μgの野生型T7SSB、未修飾のTaq DNAポリメラーゼ;
反応10:1μgのΔ21CT7SSB、抗体の結合したTaq DNAポリメラーゼ;
反応11:1μgのΔ21CT7SSB、化学修飾されたTaq DNAポリメラーゼ;
反応12:1μgのΔ21CT7SSB、未修飾のTaq DNAポリメラーゼ;
反応13:1μgのF232LT7SSB、抗体の結合したTaq DNAポリメラーゼ;
反応14:1μgのF232LT7SSB、化学修飾されたTaq DNAポリメラーゼ;
反応15:1μgのF232LT7SSB、未修飾のTaq DNAポリメラーゼ。
この実施例は、ホットスタート法における野生型および変異型T7SSBの効果を説明する。具体的には、この実施例は、非特異的なプライマー伸長産物の生成を減少させるために、ポリメラーゼ連鎖反応に、質量比で1:1の野生型T7SSBおよびΔ26Cを用いる。この実験では、1マイクログラム(μg)の混合物は0.5μgのそれぞれのタンパク質を含んでいた。遺伝子産物p53(配列番号11)の1142塩基対(bp)領域が、1ナノグラム(ng)または100ピコグラム(pg)のヒトゲノムDNAのどちらかを基に増幅された。この標的は、NCBIではNT_010718.15(7174821から7175962までの配列位置)として同定されている。以下の増幅用プライマーが用いられた;
p53順方向: 5’-TGCTTTATCTGTTCACTTGTGCCC-3’ 24塩基長(配列番号12)、
および
p53逆方向: 5’-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3’ 20塩基長(配列番号13)
反応1:100pgのゲノムDNA、SSB無し;
反応2:0.5μgのT7SSB、100pgのゲノムDNA;
反応3:1.0μgのT7SSB、100pgのゲノムDNA;
反応4:2.0μgのT7SSB、100pgのゲノムDNA;
反応5:1ngのゲノムDNA、SSB無し;
反応6:0.5μgのT7SSB、1ngのゲノムDNA;
反応7:1.0μgのT7SSB、1ngのゲノムDNA;
反応8:2.0μgのT7SSB、1ngのゲノムDNA。
この実施例は、室温でのプライマー伸長の阻止における野生型および変異型T7SSBの混合物の効果を示す。具体的には、この実施例は、ハイブリッド形成するように意図して設計された2のプライマーでプライマー伸長が行われる「モック」ポリメラーゼ連鎖反応において、1:1の質量比の野生型T7SSBおよびΔ26Cタンパク質を用いる。したがって、外来性のdsDNA鋳型は反応中には無く、プライマーそれら自身のみが合成のための鋳型として働く。このアッセイは、SSBが2つの温度において、伸長され得るハイブリッドからのDNA合成を阻止できるかを評価するように設計された。最初の温度は室温(25℃)であり、これは反応が一般的に調製される温度をシミュレートした。第二の温度は72℃であり、これはTaq DNAポリメラーゼによるDNA合成がより最適な温度である。
順方向:5’-[HEX]-CTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3’ 23塩基長(配列番号14)、
および
逆方向:5’-ATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGAC-3’ 41塩基長(配列番号15)。
反応1:SSB無し、Taq DNAポリメラーゼ無し、25℃インキュベーション;
反応2:Taq DNAポリメラーゼ、SSB無し、25℃インキュベーション;
反応3:0.5μgのT7SSBミックス、Taq DNAポリメラーゼ、25℃インキュベーション;
反応4:1.0μgのT7SSBミックス、Taq DNAポリメラーゼ、25℃インキュベーション;
反応5:2.0μgのT7SSBミックス、Taq DNAポリメラーゼ、25℃インキュベーション;
反応6:SSB無し、Taq DNAポリメラーゼ無し、72℃インキュベーション;
反応7:Taq DNAポリメラーゼ、SSB無し、72℃インキュベーション;
反応8:0.5μgのT7SSBミックス、Taq DNAポリメラーゼ、72℃インキュベーション;
反応9:1.0μgのT7SSBミックス、Taq DNAポリメラーゼ、72℃インキュベーション;
反応10:2.0μgのT7SSBミックス、Taq DNAポリメラーゼ、72℃インキュベーション。
この実施例は、所望の、非特異的プライマー伸長産物の生成減少効果を達成するT7SSBの効果的な濃度の有用な範囲を示す。以下の実験は、a)タンパク質単量体当たり7の核酸に結合するT7SSBの化学量論的結合比、およびb)与えられた反応でのプライマー(ssDNA)の総量、の双方を考慮に入れて設計された。本実験では、実施例1で用いられたヒトゲノムDNA1ngから306bpのNumbを標的として増幅した。プライマーは、以下のように、それぞれ25塩基長であった;
Numb順方向:5’-GAGGTTCCTACAGGCACCTGCCCAG-3’ (配列番号8)および
Numb逆方向:5’-CAAAATCACCCCTCACAGTACTCTG-3’ (配列番号9)。
反応1:SSB無し;
反応2:0.0625μgの野生型T7SSB;
反応3:0.125μgの野生型T7SSB;
反応4:0.25μgの野生型T7SSB;
反応5:0.5μgの野生型T7SSB;
反応6:1.0μgの野生型T7SSB;
反応7:2.0μgの野生型T7SSB。
Claims (39)
- 鋳型核酸、またはその一部分を複製するための方法であって、その鋳型核酸の標的部分と相補的な核酸配列を有するプライマーが鋳型核酸とハイブリダイズされ、その後酵素を介して伸長される方法において、
(a)第一の温度において、プライマー、鋳型核酸、プライマー伸長を触媒するために有用な酵素、および、一本鎖核酸結合タンパク質の有効量を含む反応混合液を準備する工程、
(b)前記第一の温度より高い第二の温度において、ハイブリダイゼーション反応を実行してハイブリダイズされた産物を生産する工程、および
(c)第二の温度より高い第三の温度において、プライマー伸長反応を実施して前記ハイブリダイズされた産物から伸長産物を生産する工程、
を含み、前記第一の温度において前記反応混合液に前記一本鎖核酸結合タンパク質が導入された結果として、特異的伸長産物の生成が改善される方法。 - 前記酵素がポリメラーゼであり、前記反応混合液が更に前記第一の温度において二価カチオンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の温度において、前記一本鎖核酸結合タンパク質が非特異的プライマー伸長産物の生成を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の温度において、前記一本鎖核酸結合タンパク質により、前記プライマーがハイブリダイゼーション反応に関与することが実質的に阻害されない、請求項3に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が前記第二の温度において変性する結果として、あるいはそれと関連して、前記プライマーがハイブリダイゼーション反応に関与することが阻害されなくなる、請求項4に記載の方法。
- 前記第三の温度において、前記一本鎖核酸結合タンパク質により、前記プライマーがプライマー伸長反応に関与することを阻害されない、請求項3に記載の方法。
- 前記第一の温度が37℃あるいはそれ以下であり、前記第二の温度および前記第三の温度がそれぞれ50℃から約72℃の範囲にある、請求項1に記載の方法。
- 前記(a)工程と前記(b)工程の間に行われる以下の工程を更に含む、請求項1に記載の方法:
(a.1)前記第二の温度および前記第三の温度より高い第四の温度まで、反応混合液を初期加熱して、反応混合液中に存在する二本鎖鋳型核酸を変性させる工程。 - 前記(c)工程に続いて実行される以下の工程を更に含む、請求項1に記載の方法:
(d)前記第二の温度および前記第三の温度より高い第四の温度の温度まで、反応混合液を加熱して、前記(c)工程の間に生成した反応液中に存在する二本鎖伸長産物を変性する工程。 - 少なくとも1度、前記(b)工程および前記(c)工程を繰り返すことにより、増幅反応を実行して、増幅産物を生成することを含み、前記第一の温度において前記一本鎖核酸結合タンパク質を前記反応混合液に導入した結果として、特異的増幅産物の生成が改善される、請求項9に記載の方法。
- 前記第一の温度が37℃あるいはそれ以下であり、前記第二の温度および第三の温度がそれぞれ50℃から約72℃の範囲であり、前記第四の温度が90℃あるいはそれ以上である、請求項10に記載の方法。
- 前記第二の温度と前記第三の温度が同じである、請求項10に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が既知の酵素活性を有しない、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、野生型T7gp2.5およびその変異体またはそれらの混合物のうちの少なくとも一を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質がT7gp2.5−F232Lを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質がT7gp2.5−Δ21Cを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質がT7gp2.5およびT7gp2.5−Δ26Cを含むタンパク質の混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の温度において反応混合液が調製されることに続いて、反応混合液に付加的な反応試薬が導入されることを含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合液中のプライマー分子に対する一本鎖核酸結合タンパク質分子の化学量論比が1より大きいか、あるいは1と等しい、請求項1に記載の方法。
- 前記化学量論比が2より大きいか、あるいは2と等しい、請求項19に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、バッファー溶液中に該タンパク質を含む組成物から供給され、該バッファー溶液が、1−100mM Tris−HCl pH7.5、1−100mM EDTA、0.005−200mM DTT、10−80質量%グリセロール、残部の水を含む、請求項1に記載の方法。
- 鋳型核酸分子の特定の標的部と相補的な核酸配列を有するプライマーと、
前記プライマーと相互作用する一本鎖核酸結合タンパク質を含むプライマー複合体であって、
前記一本鎖核酸結合タンパク質が、1)少なくとも30℃、あるいはそれ以下の第一の温度まで、前記プライマーがプライマー伸長反応に関与することを事実上阻害し、かつ2)30℃から約72℃の範囲での第二の温度において、前記一本鎖核酸結合タンパク質により前記プライマーがプライマー伸長反応に関与することが実質的に阻害されないように、前記相互作用が終結するか、あるいは乱される、ように選ばれる、複合体。 - 前記第二の温度が50℃から72℃の範囲にある、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が非共有結合を介して前記プライマーと結合している、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、少なくとも50℃まで、前記プライマーがプライマー伸長反応に関与することを事実上阻害するように選ばれ、その阻害能が90℃でのインキュベーションの後に失われる、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質の阻害能が90℃でのインキュベーションの後に失われる、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質がT7gp2.5またはその変異体またはそれらの組合わせを含む、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質がT7gp2.5を含む、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が野生型T7gp2.5−F232Lを含む、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が野生型T7gp2.5−Δ21Cを含む、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、野生型T7gp2.5およびT7gp2.5−Δ26Cを含むタンパク質の混合物を含む、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、約50℃から約72℃の範囲における前記第二の温度において自発的に切断される熱不安定性結合を介して、前記プライマーと結合している、請求項22に記載の複合体。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質の変性の結果、あるいはそれと関連して前記相互作用が乱されるように、前記一本鎖核酸結合タンパク質が前記第二の温度において変性されている、請求項22に記載の複合体。
- 鋳型核酸の特定の標的部と相補的な核酸配列を有するプライマー、および、少なくとも30℃かそれ以下での第一の温度まで前記プライマーがプライマー伸長反応に関与することを阻害するのに効果的な一本鎖核酸結合タンパク質を含むPCR反応混合液であって、前記一本鎖核酸結合タンパク質の阻害能が30℃から約72℃の範囲にある第二の温度において失われる、PCR反応混合液。
- 前記第二の温度が50℃から約72℃の範囲にある、請求項34に記載のPCR反応混合液。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、野生型T7gp2.5およびその変異体の少なくとも一、またはそれらの組合わせを含む、請求項34に記載のPCR反応混合液。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、T7gp2.5−F232LおよびT7gp2.5−Δ21Cのうちの少なくとも一を含む、請求項34に記載のPCR反応混合液。
- 前記一本鎖核酸結合タンパク質が、野生型T7gp2.5およびT7gp2.5−Δ26Cを含むタンパク質の混合物を含む、請求項34に記載のPCR反応混合液。
- 前記PCR反応混合液における一本鎖核酸結合タンパク質分子とプライマー分子の化学量論比が1より大きいか、あるいは1と等しい、請求項34に記載のPCR反応混合液。
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