KR102529958B1

KR102529958B1 - 저 gc 함량 dna의 정량적 증폭을 위한 pcr 첨가제 조성물

Info

Publication number: KR102529958B1
Application number: KR1020210006612A
Authority: KR
Inventors: 홍승진; 유문간; 이혜정; 장지연
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2023-05-08
Also published as: KR20220104400A

Abstract

본 발명은 정량적 증폭이 어려운 저 GC 함량 유전자를 재현성 높게 증폭하기 위한 PCR(polymerase chain reaction) 첨가제 조성물, 이를 포함하는 키트 및 저 GC 함량 유전자의 증폭 방법에 관한 것으로서, 낮은 GC 함량으로 인해 정량적인 증폭이 어려웠던 유전자 분석에 있어서, 높은 재현성으로 반복적인 분석을 가능하게 하는 효과가 있다. 특히, 비이온성 계면활성제인 폴리소르베이트 20만 첨가한 경우에도 특이적인 증폭이 가능하였으며, 추가로 알부민을 첨가해준 경우에는 더욱 높은 재현성을 나타냈다. 따라서 본 발명에 따른 PCR 첨가제 조성물, 이를 포함하는 키트 및 저 GC 함량 유전자 증폭 방법을 이용하면 다양한 분야의 유전자 연구에 기여할 수 있을 것으로 사료되며, 특히 유전자 메틸 검사를 획기적으로 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

저 GC 함량 DNA의 정량적 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물 {PCR additive composition for quantitative amplification of low GC content DNA}

본 발명은 정량적 증폭이 어려운 저 GC 함량 유전자를 재현성 높게 증폭하기 위한 PCR(polymerase chain reaction) 첨가제 조성물, 이를 포함하는 키트 및 저 GC 함량 유전자의 증폭 방법에 관한 것이다.

중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)은 소량의 유전자 검체에서 특정 염기서열을 선택적으로 증폭하여 생물정보를 획득할 수 있어 광범위하게 사용된다. 유전자를 구성하는 핵 염기(nucleobase) 중 구아닌(Guanine, G)은 사이토신(Cytosine, C)과 상보적으로 수소결합을 하며, 아데닌(Adenine, A)과 티민(Thymine, T)의 수소결합보다 높은 결합 에너지를 가지고 있다. 염기서열 분석에 있어서, 관심 있는 유전자의 염기서열(DNA sequences)과 프라이머(primer) 사이의 결합 특이도(specificity)를 높이기 위해서는 GC 함량(%)이 높아야 하며, 통상적으로 PCR의 효과적인 수행을 위해 증폭하려는 유전자의 프라이머 결합 부위(primer binding site)의 GC 함량은 50-70%가 유지되어야 한다. GC 함량이 50% 미만인 경우, 즉 저 GC 함량 염기서열은 유전자-프라이머간 결합이 약하여 원하지 않은 염기서열이 비특이적으로 증폭될 수 있다는 문제점이 있다.

상기와 같은 문제점에 의해 염기서열의 GC 함량이 낮은 유전자의 연구에서는 PCR에 의한 유전자 증폭이 제한되므로, 통상 주변의 염기서열 중 GC 함량이 높은 부위를 선택하여 프라이머를 고안한다. 하지만 GC 함량이 낮아서 PCR에 의한 프라이머의 제작이 어려운 경우가 있다. 예를 들면, 조직 특이적 유전자(tissue-specific genes)는 전사시작부위(transcriptional start sites)에 CpG 섬(CpG islands)이 존재하지 않아 GC 함량이 낮다. 또한, 조직 공통 유전자(housekeeping genes)의 경우 전사시작부위에는 CpG 섬이 있어서 GC 함량이 높으나 CpG 섬 주변부(CpG-island margins)는 GC 함량이 낮다. 줄기세포는 조직세포로의 분화 과정에서 조직 특이적 유전자의 발현은 증가하고 조직 공통 유전자의 발현은 감소한다. 한편, 유전자 메틸화의 변화는 유전자 발현과 반대로 조직 특이적 유전자의 메틸이 감소하고 조직 공통 유전자의 CpG 섬 주변부 메틸이 증가한다. 유전자 메틸은 조직 분화 과정에서 획득한 표현형의 안정화 역할을 하며, 불안정하면 암세포로 분화할 수 있다. 따라서 염기서열 내에서 메틸의 변화를 확인함으로써 조직 분화와 암의 발병 위험 예측 등의 중요한 생물학적 정보를 파악할 수 있다. 유전자 메틸 연구를 위하여 메틸화 되어 있지 않은 C를 T로 변환하는 방법이 주로 사용되어 왔지만, 유전자 염기서열의 GC 함량이 더 낮아져 정량적 증폭이 거의 불가능하게 되는 문제점이 있다.

PCR 결과물을 개선하기 위하여 다양한 PCR 첨가제(PCR additives)가 개발되어 왔다. 대부분의 PCR 첨가제는 고 GC 함량의 염기서열에서 유전자-프라이머 결합이 강하여 PCR 효율이 낮아지는 것을 개선하기 위한 방향으로 개발되어 왔다. 그러나, 저 GC 함량의 염기서열을 분석하기 위한 PCR 첨가제에 대한 연구는 전무한 실정이다.

KR 10-2141757 B1

본 발명의 목적은 비이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 저 GC 함량(%) 유전자 증폭을 위한 PCR 프리믹스(premix) 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR 반응물에 비이온성 계면활성제를 첨가하는 단계를 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 에톡실화 비이온성 계면활성제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 에톡실화 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, DDM(n-Dodecyl-B-D-maltoside) 및 디지토닌(Digitonin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 전체 PCR 반응물 기준 0.05-4 %(v/v) 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 알부민(albumin)을 유효성분으로 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 알부민은 소혈청알부민, 인간혈청알부민, 렛(rat)혈청알부민, 말혈청알부민, 토끼혈청알부민, 양혈청알부민 및 돼지혈청알부민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 알부민은 전체 PCR 반응물 기준 30-600 ng/μl 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 유전자는 GC 함량이 50% 이하인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 PCR은 일반적인 PCR, 메틸화 특이적 PCR, 실시간 PCR 또는 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing)용 PCR인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 (a) 염화마그네슘(MgCl₂)을 포함하는 완충액(buffer solution); (b) dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 혼합물; (c) DNA 중합효소; 및 (d) 본 발명에 따른 상기 PCR 첨가제 조성물을 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 프리믹스(premix) 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 PCR 반응물에 비이온성 계면활성제를 첨가하는 단계를 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20으로서 전체 PCR 반응물 기준 0.05-4 %(v/v) 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단계는 PCR 반응물에 알부민을 더 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 알부민은 소혈청알부민으로서 전체 PCR 반응물 기준 30-600 ng/μl 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 PCR은 90℃ 이상의 핫-스타트(hot-start) 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 PCR 첨가제 조성물은 낮은 GC 함량으로 인해 정량적인 증폭이 어려웠던 유전자 분석에 있어서, 높은 재현성으로 반복적인 분석을 가능하게 해 준다. 특히, 비이온성 계면활성제인 폴리소르베이트 20만 첨가한 경우에도 특이적인 증폭이 가능하였으며, 추가로 알부민을 첨가해준 경우에는 더욱 높은 재현성을 나타냈다. 따라서 본 발명에 따른 PCR 첨가제 조성물, 이를 포함하는 키트 및 저 GC 함량 유전자 증폭 방법을 이용하면 다양한 분야의 유전자 연구에 기여할 수 있을 것으로 사료되며, 특히 유전자 메틸 검사를 획기적으로 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 CDH1 유전자에 대한 메틸화 특이적 PCR에서 첨가제의 종류(1, DMSO; 2, 글리코겐; 3, 연어 고환 DNA; 4, 소혈청알부민; 5, 폴리소르베이트 20)에 따른 특이적 증폭 향상 효과를 비교 분석한 결과이다(U, unmethylation; M, methylation, 이하 도 3 및 도 4에서도 동일)
도 2는 CDH1 유전자에 대한 메틸화 특이적 PCR에서 폴리소르베이트 20의 농도에 따른 특이적 증폭 향상 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 3은 CDH1 유전자에 대한 메틸화 특이적 PCR에서 폴리소르베이트 20과 함께 추가로 첨가한 물질의 종류에 따른 특이적 증폭 향상 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 4는 CDH1 유전자에 대한 메틸화 특이적 PCR에서 폴리소르베이트 20과 다양한 농도의 소혈청알부민 처리에 따른 특이적 증폭 향상 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 5는 시판되는 qPCR 프리믹스에 폴리소르베이트 20을 추가하여 실시간 메틸화 특이적 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 시판되는 qPCR 프리믹스에 폴리소르베이트 20을 추가하고, 핫-스타트로 실시간 메틸화 특이적 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 도 7d는 폴리소르베이트 20 및 소혈청알부민을 첨가하여 실시간 메틸화 특이적 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프로서, 도 7a는 TFF2 유전자, 도 7b는 PGC 유전자, 도 7c는 CDH1 유전자, 도 7d는 CDKN2A 유전자에 대한 결과이다.

본 발명자들은 GC 함량이 낮은 염기서열의 정량적 분석을 위해 여러 종류의 PCR 첨가제의 효과를 비교 분석한 결과, 비이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제와 알부민을 함께 첨가해주는 경우 특이적인 증폭이 일어남을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 조직 공통 유전자의 CpG-섬 주변부(margins)와 조직 특이적 유전자의 프로모터 부위를 선택하고, 메틸화가 되지 않은 C를 T로 전환하는 바이설파이트 변형(bisulfite modification)을 통해 저 GC 함량의 염기서열을 만들었다. 핫-스타트(hot-start) PCR을 수행하여 비특이 증폭을 줄이고, 실시간 PCR의 TaqMan 탐색자(probe)를 고안하여 원하는 염기서열의 증폭에 있어서 본 발명에 따른 PCR 첨가물의 효과를 확인하였다(실시 예 1 이하 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, CDH1 유전자에 대한 메틸화 특이적 PCR(이하 'MSP'라 함)에서 첨가제로 DMSO, 연어 고환 DNA, 글리코겐, 소혈청알부민 및 폴리소르베이트 20(Tween^® 20)를 각각 첨가하여 특이적 증폭에 미치는 효과를 분석하였고, 그 결과 폴리소르베이트 20을 첨가한 경우 특이적 밴드가 가장 선명하게 나타났다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, MSP에서 다양한 농도의 폴리소르베이트 20(Tween^® 20)를 첨가하여 그 효과를 분석하였고, 0.075 내지 3%의 농도 범위에서 특이적 증폭이 이루어짐을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, MSP에서 폴리소르베이트 20(Tween^® 20) 및 추가로 BSA, 연어 고환 DNA 또는 글리코겐을 각각 첨가하여 그 효과를 분석하였고, 그 결과 폴리소르베이트 20과 BSA를 함께 첨가한 경우 특이적 밴드가 가장 강하게 나타남을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, MSP에서 폴리소르베이트 20에 다양한 농도의 BSA를 첨가하여 그 효과를 분석하였고, 그 결과 60~510 ng/μl 농도의 BSA를 첨가해 준 경우 특이적인 밴드 증폭이 나타남을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, TaqMan 탐색자를 이용하여 실시간 MSP를 시행하였고, 폴리소르베이트 20 첨가 및 핫-스타트 Taq을 이용한 매뉴얼 실시간 PCR에서 CDH1 유전자의 비메틸화 및 메틸화의 형광 강도가 모두 증가함을 확인하였으며, TFF2, PGC, CDH1 및 CDKN2A유전자에 대한 실시간 MSP에서도 폴리소르베이트 20 및 BSA를 첨가에 의해 상기 4종의 유전자 모두에서 특이적 증폭을 확인할 수 있었다(실시예 6 참조).

따라서 본 발명은 비이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 에톡실화 비이온성 계면활성제일 수 있다.

상기 “비이온성 계면활성제(nonionic surfactant)”는 생리적으로 적절한 조건 하에서 비이온화된 표면 활성제를 지칭한다. 본 명세서에 제공된 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물에 대해 유용한 에톡실화 비이온성 계면활성제의 비제한적 예는 폴리소르베이트 20 (트윈^® 20), 폴리소르베이트 40 (트윈^® 40), 폴리소르베이트 60 (트윈^® 60), 폴리소르베이트 80 (트윈^® 80), 트리톤 X-100, DDM(n-Dodecyl-B-D-maltoside), 디지토닌(Digitonin) 등을 포함하며, 바람직하게는 폴리소르베이트 20일 수 있다.

본 발명의 범주 내에서 사용되는 바와 같은 비이온성 계면활성제 폴리소르베이트 20 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트는 구매 가능한 폴리소르베이트 20(CAS 번호: 9005-64-5, E 432), 바람직하게는 크로다 아메리카스/머크 케미칼스(Croda Americas/Merck Chemicals)로부터의 트윈(Tween^®) 20/트윈^® 20 엠프로브(EMPROVE^®) 를 지칭한다. 폴리소르베이트 20의 대안적인 상업적 형태에는, 예를 들어 아르모탄(Armotan^®) PML 20; 캡뮬(Capmul^®) POE-L; 크릴레트(Crillet)™1; 유멀긴(Eumulgin^®) SML 20; 글리코스퍼스(Glycosperse^®) L-20; 리포소브(Liposorb^®) L-20; 몬타녹스(Montanox)^TM 20; 노니온(Nonion^®) LT-221; 리타베이트(Ritabate^®) 20; 소르박스(Sorbax) PML-20; T마즈(T-Maz^®) 20; 프로타소브(Protasorb)™L-20; 테고(Tego^®) SML 20; 알케스트(Alkest^®) TW 20; 윌서프(Wilsurf^®) TF-20이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 전체 PCR 반응물 기준 0.05-4 %(v/v) 농도로 첨가될 수 있으며, 예를 들어 0.075-3 %(v/v) 농도로 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 조성물은 알부민(albumin)을 유효성분으로 더 포함할 수 있다.

상기 “알부민(albumin)”은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로 자연 상태에서 존재하는 단순 단백질이며 분자량이 65-70 kDa 정도이다. 본 명세서에 제공된 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물에 대해 유용한 알부민의 비제한적 예로서 소혈청알부민, 인간혈청알부민, 렛(rat)혈청알부민, 말혈청알부민, 토끼혈청알부민, 양혈청알부민, 돼지혈청알부민 등을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 알부민은 전체 PCR 반응물 기준 30-600 ng/μl 농도로 첨가될 수 있으며, 예를 들어 60-510 ng/μl 농도로 첨가될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 GC 함량이 50% 이하인 것일 수 있다.

유전자에서 저 GC 함량의 염기서열은 PCR 증폭이 어려워서 실험이 제한되어 왔으나 줄기세포 분화와 암세포 전환의 연구에 중요한 부위이다. 유전자 분석에 사용되는 클로닝(cloning)과 시퀀싱(sequencing) 방법도 PCR에 의한 유전자 증폭을 이용하고 있으며, 저 GC 함량의 염기서열 분석을 위한 PCR 방법이 근본적인 해결책이다. 유전자 메틸 연구를 위하여 흔히 사용되는 바이설파이트 변형(bisulfite modification)은 메틸화가 되지 않은 C를 T로 전환하여 유전자 메틸 변화를 확인하기에 용이하나, GC 함량이 낮아지므로 프라이머를 고안하기 어렵고 재현성 있는 실험이 힘들었다. 본 연구에서는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 20 및 BSA를 PCR 첨가제로 사용하여 50% 이하의 GC 함량을 갖는 염기서열에서 안정인 증폭 결과물을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 PCR은 일반적인 PCR, 메틸화 특이적 PCR, 실시간 PCR 또는 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing)용 PCR일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기를 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 프리믹스(premix) 키트를 제공할 수 있다:

(a) 염화마그네슘(MgCl₂)을 포함하는 완충액(buffer solution);

(b) dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 혼합물;

(c) DNA 중합효소; 및

(d) 본 발명에 따른 PCR 첨가제 조성물.

본 명세서에서 사용된 용어 “프리믹스 키트”는 PCR 반응전에 미리 제조된 반응 혼합물로서 여기에 분석하고자 하는 DNA 샘플 및 이에 특이적으로 결합하도록 디자인된 프라이머를 넣고 바로 PCR 반응을 수행할 수 있는 즉시 사용 가능한 시약(Ready-to-use Reagents)를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 PCR 반응물에 비이온성 계면활성제를 첨가하는 단계를 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20으로서 전체 PCR 반응물 기준 0.05-4 %(v/v) 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

폴리소르베이트 20(Tween^® 20)은 Taq 중합효소를 안정화하고 2차 구조 형성을 방지하는 것으로 알려져 있으며, GC 함량이 상이한 염기서열이 혼재된 경우 안정적인 PCR을 유도하는 것으로 보고되어 있다. 유전자 메틸은 세포 분열에 따라 변화하며 인간 검체에서 얻은 유전자에는 상이한 메틸 값을 가진 염기서열이 다양하게 혼재되어 있어 정교한 실험이 요구된다. 상품화된 프리믹스 실시간 PCR 키트는 특이적 증폭을 보여주지 못하였다. 프리믹스에 첨가한 보조제들이 저 GC 함량의 염기서열 증폭을 저해하는 것으로 추정된다.

본 발명에 있어서, 상기 단계는 PCR 반응물에 알부민을 더 첨가하는 것일 수 있으며, 상기 알부민은 소혈청알부민으로서 전체 PCR 반응물 기준 30-600 ng/μl 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)은 PCR 억제제가 포함되거나 오래된 DNA의 PCR에 효과적으로 알려져 있다. 유전자의 바이설페이트 변형은 12시간의 화학 처리를 하는 과정에서 유전자의 손상이 일어날 수 있으며, BSA가 유전자 메틸화 특이적 PCR에 안정적인 주형-프라이머 결합(template-primer binding)을 유도하는 것으로 보인다.

본 발명에 있어서, 상기 PCR은 90℃ 이상의 핫-스타트(hot-start) 조건으로 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험 재료 및 방법

1. 증폭 대상 유전자의 선정

저 GC 함량 유전자의 정량적 증폭 실험에 있어서, 본 발명에 따른 PCR 첨가제 조성물의 효과를 확인하기 위해 조직 특이적 유전자 2종[TFF2 (Trefoil factor 2), PGC (Progastricsin)]과 조직 공통 유전자 2종[CDH1 (Cadherin-1), CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)]의 메틸변이부위에서 메틸화 특이적 PCR을 위한 프라이머를 고안하였다. TFF2 유전자와 PGC 유전자는 위의 점막세포에서 특이적으로 발현한다.

2. 유전자 분리 및 메틸화 패턴 분석을 위한 바이설파이트(bisulfite) 처리

검체는 내시경 생검 조직을 사용하였다. 위내시경을 통해 몸체(body)와 날문방(antrum)에서 약 1 mm³정도 크기의 검체를 획득하고, -70℃에서 보관하였다. 유전자는 DNA 추출 버퍼(0.5% Tween 20, 1 mM EDTA, 50 mM Tris, 및 0.5 mg/ml proteinase K)로 50℃에서 12시간 동안 처리하여 용해하였다. 추출한 검체는 다음과 같이 바이설파이트 변형(bisulfite modification)을 시행하였다: 21.5 μl의 유전자에 3 M 수산화나트륨(NaOH)을 넣고 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 2.3 M 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite)와 10 mM 하이드로퀴논(hydroquinone)을 50℃에서 12시간 동안 처리하였다. 유전자는 위자드 DNA 정제 수지(Wizard purification resin; Promega, 미국)를 사용하여 정제하고, 3 M 수산화나트륨을 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킴으로써 탈황(desulfonate) 처리하였고, 이어서 에탄올로 침전하였다. 유전자는 5 mM Tris 버퍼 40 μl로 용해하였다.

3. 메틸화 특이적 PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction, MSP)과 PCR 첨가제

메틸화 특이적 PCR(이하 'MSP'라 함)은 저 GC 함량을 감안하여 핫-스타트(hot start) PCR을 시행하였다. MSP는 1 μl의 유전자에 1 μl의 10X PCR 버퍼(100 mM Tris-HCl pH 8.9, 500 mM KCl), 0.6 μl의 염화마그네슘(MgCl₂), 5 pM의 프라이머에 각각 62.5 mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP와 0.3 unit의 Taq 중합효소(Takara, 일본)를 추가하였다. PCR 첨가제로는 DMSO(Dimethyl Sulfoxide), 폴리소르베이트 20(Tween^® 20), 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA), 연어 고환(Salmon testis) DNA를 이용하였다.

증폭을 위한 온도 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 가열하여 변성(denaturation)시킨 후 PCR 중합효소와 dNTP 혼합물 추가; 93℃에서 30초, 66℃ 3초, 53-61℃에서 1분, 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 32 사이클 반응; 72℃에서 3분 반응. MSP 결과물은 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분리하여 EtBr(Ethidium bromide) 또는 GelRed(EtBr의 대체품)를 이용한 적외선 스캐너(Gel Doc XR, biorad, 미국)로 확인하였다.

4. 서열 검증을 위한 실시간 PCR

MSP 결과물의 염기서열을 검증하기 위해, TaqMan 탐색자를 고안하여 Real time PCR(또는 qPCR)을 시행하였다. TaqMan 탐색자의 5'-말단 염로는 6-FAM(6-Carboxyfluorescein)을 이용하였고, 3'-말단 소광제(quencher)는 BHQ^®-1(Black Hole Quencher 1)을 사용하였다. qPCR 프리믹스(DYRT1350S, Dyne, 대한민국) 제품과 매뉴얼 MSP를 시행하였다. 매뉴얼 MSP는 0.3 unit의 핫-스타트 Taq 중합효소(R007, 일본)를 사용하였다. 유전자 검체는 실시간 PCR 장비(CFX96, BioRad, 미국)를 이용하여 증폭 반응을 시행하였다.

실시예 1. 유전자 분석 부위의 GC 함량(%) 분석

TFF2, PGC, CDH1, 및 CDKN2A 유전자의 프라이머 결합 부위에서 바이설페이트 변형(bisulfite modification) 전과 후의 GC 함량(%) 변화는 하기 표 1에 정리하였다. 바이설페이트 변형 전의 GC 함량(%)은 54.2~72.7%였으며, 바이설페이트 변형 후의 메틸화 프라이머는 GC 함량(%)이 28.0~57.1%로 나타났고, 비메틸화 프라이머(unmethylation primer)는 25.9~47.6%로 나타났다. PCR 결과물의 길이는 TFF2의 경우 121 bp, PGC는 118 bp, CDH1는 108 bp, CDKN2A는 125 bp였다.

유전자	프라이머	서열번호	서열	GC %
TFF2	Forward site	1	GCCCTGTGCAGGCGAGGCTTCC	72.7
	Reverse site	2	CACGTGGCCGGTTTTCCACG	65
	Methylation Forward	3	GGTAGTTGTGTTTTGTGTAGGC	45.5
	Methylation Reverse	4	CACGTAACCGATTTTCCACG	50
	Unmethylation Forward	5	GGTAGTTGTGTTTTGTGTAGGT	40.9
	Unmethylation Reverse	6	CACATAACCAATTTTCCACA	35
PGC	Forward site	7	GGTGTACCCTGTGCTTCGTGTATC	54.2
	Reverse site	8	GCTTGCACCTCCTGGCCTCCG	71.4
	Methylation Forward	9	GTGTATTTTGTGTTTCGTGTATC	34.8
	Methylation Reverse	10	GCTTACACCTCCTAACCTCCG	57.1
	Unmethylation Forward	11	GGTGTATTTTGTGTTTTGTGTATT	29.2
	Unmethylation Reverse	12	ACTTACACCTCCTAACCTCCA	47.6
CDH1	Forward site	13	GGTGAACCCTCAGCCAATCAGCGGTAC	59.3
	Reverse site	14	TCACAGGTGCTTTGCAGTTCCGACG	56
	Methylation Forward	15	TGAATTTTTAGTTAATTAGCGGTAC	28
	Methylation Reverse	16	ACAAATACTTTACAATTCCGACG	34.8
	Unmethylation Forward	17	GGTGAATTTTTAGTTAATTAGTGGTAT	25.9
	Unmethylation Reverse	18	TCACAAATACTTTACAATTCCAACA	28
CDKN2A	Forward site	19	TCGGGACTAGGCCCAGCTCCG	71.4
	Reverse site	20	TCCGGGACAGCCGAGTGCGA	70.0
	Methylation Forward	21	TCGGGATTAGGTTTAGTTTCG	42.9
	Methylation Reverse	22	AAACCCTATCGACTCACGCT	50.0
	Unmethylation Forward	23	TTGGGATTAGGTTTAGTTTTGG	36.4
	Unmethylation Reverse	24	CTATAAAACCCTATCAACTCACACT	36.0

실시예 2. PCR 첨가제의 종류에 따른 정량적 증폭 효과 분석

저 GC 함량(%) 염기서열의 PCR 첨가제의 효과를 확인하기 위해, 메틸화 특이적 PCR(MSP) 과정에 DMSO 2%, 연어 고환(Salmon testis) DNA 5 ng/μl, 글리코겐(Glycogen) 50 ng/μl, 소혈청알부민(BSA) 200 ng/μl 또는 폴리소르베이트 20(Tween^® 20) 1%를 각각 추가하였다. CDH1 유전자에 대한 MSP은 상기 실험 재료 및 방법에서 서술한 바와 같이 32 사이클로 시행하였다.

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 글리코겐, 연어 고환 DNA 또는 BSA를 처리한 경우 특이적 밴드(specific bands)가 약하게 관찰되었으며, 폴리소르베이트 20(Tween^® 20)을 추가한 경우 특이적 밴드가 선명하게 관찰되었다. 다시 말하면, 캐리어 DNA인 연어 고환 DNA와 캐리어 단백질인 글리코겐은 MSP에서 소폭의 효과를 보이는데 그쳤다. DMSO는 고 GC 함량의 염기서열에서 안정적인 PCR을 유도하는 물질로 알려져 있으며, 저 GC 함량의 염기서열 증폭에서는 적절하지 않음이 확인되었다.

실시예 3. PCR 첨가제로서 폴리소르베이트 20의 농도에 따른 정량적 증폭 효과 분석

상기 실시예 2의 결과에서 폴리소르베이트 20의 효과가 가장 좋았기 때문에, PCR 첨가제로서 다양한 농도(0.075, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3 및 4%)의 폴리소르베이트 20을 첨가하여 그 효과를 분석하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 폴리소르베이트 20은 0.075-3% 농도 범위에서 특이적 증폭(specific amplification)이 이루어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 4. PCR 첨가제로서 폴리소르베이트 20 및 다른 물질의 조합에 따른 정량적 증폭 효과 분석

저 GC 함량(%) 염기서열의 MSP에서 폴리소르베이트 20(Tween^® 20)과 다른 PCR 첨가제의 공동 효과를 확인하기 위해, 폴리소르베이트 20 1%에 각각 BSA 200 ng/μl, 연어 고환 DNA 또는 글리코겐 50 ng/μl을 첨가하여 CDH1 유전자에 대한 MSP를 수행하였다.

그 결과 도 3에서 나타난 바와 같이, 폴리소르베이트 20과 BSA를 함께 첨가한 경우 특이적 밴드가 강하게 나타났으며, 폴리소르베이트 20과 연어 고환 DNA 또는 글리코겐을 조합하여 첨가한 경우에도 밴드의 시그널 강도가 증가하는 양상을 나타냈다.

실시예 5. PCR 첨가제로서 폴리소르베이트 20 및 다양한 농도의 BSA 첨가에 따른 정량적 증폭 효과 분석

상기 실시예 4에서 폴리소르베이트 20(Tween^® 20)과 BSA를 조합하여 첨가한 경우 효과가 가장 좋았기 때문에, 폴리소르베이트 20 1%에 다양한 농도(60, 122, 160, 226, 310, 410 및 510 ng/μl)의 BSA를 첨가하여 특이적 반응 효과를 비교하였다.

그 결과 도 4에서 나타난 바와 같이, BSA를 60~510 ng/μl의 농도 범위로 첨가해 준 경우 특이적인 밴드 증폭이 나타남을 확인하였다.

실시예 6. 실시간(real-time) MSP에 의한 특이 반응 확인

6.1. 폴리소르베이트 20 단독 첨가

증폭된 PCR 앰플리콘(amplicon)이 CDH1 유전자에 대한 특이적 반응인지 확인하기 위해, TaqMan 탐색자를 이용하여 실시간 MSP를 시행하였다.

먼저, 도 5에 나타난 바와 같이 qPCR 프리믹스(PreMix)에 폴리소르베이트 20(Tween^® 20)을 추가하여 사용한 경우에는 특이적인 증폭(specific amplification)을 확인할 수 없었다. 이와 비교하여 핫-스타트 Taq을 이용한 매뉴얼 실시간 PCR에서는 도 6에서 나타난 바와 같이, CDH1 유전자의 비메틸화(Unmethylation) 및 메틸화(Methylation)의 형광 강도가 증가함을 확인하였다.

6.2. 폴리소르베이트 20 및 BSA 혼합 첨가

상기 실시예 6.1에서와 같은 방법으로 TFF2, PGC, CDH1 및 CDKN2A 유전자에 대하여 TaqMan 탐색자를 이용한 실시한 MSP를 시행하였다. PCR 첨가제로는 폴리소르베이트 20(Tween^® 20) 및 BSA를 사용하였다.

그 결과 도 7a 내지 7d에 나타난 바와 같이 4종의 유전자 모두에서 특이적 증폭(specific amplification)을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과는 기존의 특이적인 정량 증폭이 어려웠던 저 GC 함량 유전자에 대한 특이적 증폭 결과를 최초로 보여준 것이며, 따라서 본 발명에 따른 PCR 첨가제 조성물을 이용하면 본 명세서에서 언급된 TFF2, PGC, CDH1 및 CDKN2A 유전자뿐만 아니라 다른 저 GC 함량 유전자 분석에 있어서도 재현성 높은 정량적 분석이 가능할 것으로 기대된다.

특히, 유전자 메틸의 변화는 조직 특이적 유전자의 전사시작부위와 조직 공통 유전자의 CpG-섬 주변부에서 주로 관찰되는데, 이들 메틸 변이부는 줄기세포의 분화 과정에서 메틸변화가 남아있어 새로운 줄기세포 유입과 분화를 추적하기에 용이하다. 염증에 의한 조직 손상으로 줄기세포의 안정적인 분화가 유도되지 않으면 메틸 변화가 지연되며, 종양줄기세포의 형성을 유전자 메틸 검사로 예측할 수 있다. 따라서 본 연구에서 확인한 저 GC 함량 염기서열의 PCR 증폭 기술은 유전자 메틸 검사를 획기적인 개선하는데 기여할 것으로 생각된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> PCR additive composition for quantitative amplification of low GC content DNA <130> MP20-207 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward site primer for TFF2 gene <400> 1 gccctgtgca ggcgaggctt cc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse site primer for TFF2 gene <400> 2 cacgtggccg gttttccacg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Forward primer for TFF2 gene <400> 3 ggtagttgtg ttttgtgtag gc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Reverse primer for TFF2 gene <400> 4 cacgtaaccg attttccacg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Forward primer for TFF2 gene <400> 5 ggtagttgtg ttttgtgtag gt 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Reverse primer for TFF2 gene <400> 6 cacataacca attttccaca 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward site primer for PGC gene <400> 7 ggtgtaccct gtgcttcgtg tatc 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse site primer for PGC gene <400> 8 gcttgcacct cctggcctcc g 21 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Forward primer for PGC gene <400> 9 gtgtattttg tgtttcgtgt atc 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Reverse primer for PGC gene <400> 10 gcttacacct cctaacctcc g 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Forward primer for PGC gene <400> 11 ggtgtatttt gtgttttgtg tatt 24 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Reverse primer for PGC gene <400> 12 acttacacct cctaacctcc a 21 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward site primer for CDH1 gene <400> 13 ggtgaaccct cagccaatca gcggtac 27 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse site primer for CDH1 gene <400> 14 tcacaggtgc tttgcagttc cgacg 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Forward primer for CDH1 gene <400> 15 tgaattttta gttaattagc ggtac 25 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Reverse primer for CDH1 gene <400> 16 acaaatactt tacaattccg acg 23 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Forward primer for CDH1 gene <400> 17 ggtgaatttt tagttaatta gtggtat 27 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Reverse primer for CDH1 gene <400> 18 tcacaaatac tttacaattc caaca 25 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward site primer for CDKN2A gene <400> 19 tcgggactag gcccagctcc g 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse site primer for CDKN2A gene <400> 20 tccgggacag ccgagtgcga 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Forward primer for CDKN2A gene <400> 21 tcgggattag gtttagtttc g 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methylation Reverse primer for CDKN2A gene <400> 22 aaaccctatc gactcacgct 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Forward primer for CDKN2A gene <400> 23 ttgggattag gtttagtttt gg 22 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Unmethylation Reverse primer for CDKN2A gene <400> 24 ctataaaacc ctatcaactc acact 25

Claims

에톡실화 비이온성 계면활성제, 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하고,
상기 계면활성제는 전체 PCR 반응물 기준 0.05-4 %(v/v) 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하고,
상기 알부민은 전체 PCR 반응물 기준 30-600 ng/μl 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 에톡실화 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, DDM(n-Dodecyl-B-D-maltoside) 및 디지토닌(Digitonin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 알부민은 소혈청알부민, 인간혈청알부민, 렛(rat)혈청알부민, 말혈청알부민, 토끼혈청알부민, 양혈청알부민 및 돼지혈청알부민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 유전자는 GC 함량이 50% 이하인 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물.
제1항에 있어서,
상기 PCR은 일반적인 PCR, 메틸화 특이적 PCR, 실시간 PCR 또는 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing)용 PCR인 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 첨가제 조성물.
하기를 포함하는, 저 GC 함량 유전자 증폭을 위한 PCR 프리믹스(premix) 키트:
(a) 염화마그네슘(MgCl₂)을 포함하는 완충액(buffer solution);
(b) dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 혼합물;
(c) DNA 중합효소; 및
(d) 제1항의 PCR 첨가제 조성물.
PCR 반응물에 에톡실화 비이온성 계면활성제, 및 알부민(albumin)을 첨가하는 단계를 포함하고,
상기 계면활성제는 전체 PCR 반응물 기준 0.05-4 %(v/v) 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하고,
상기 알부민은 전체 PCR 반응물 기준 30-600 ng/μl 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭 방법.
제11항에 있어서,
상기 에톡실화 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20인 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭 방법.
삭제
제11항에 있어서,
상기 알부민은 소혈청알부민인 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭 방법.
제11항에 있어서,
상기 PCR은 90℃ 이상의 핫-스타트(hot-start) 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 저 GC 함량 유전자 증폭 방법.