JP5867402B2 - smallRNAの取得方法 - Google Patents
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Description
本願発明者らは、上記状況に鑑み鋭意研究を重ねた結果、免疫沈降法において、Argonauteファミリータンパク質-small RNA複合体を担持した担体を特定の溶液中で加熱することで複合体からsmall RNAを溶出することができ、溶出液を直接その後の反応系に用いることが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、ハイスループットに適用することができ、簡便に効率よくsmall RNAを取得し得る方法の提供を課題とする。
更に、本発明の方法は、small RNAの取得効率に関しても、従来法と同等又はそれ以上の高い効率でsmall RNAを取得できる。従って、本発明の方法によれば、サンプル数が多い場合であっても短時間でsmall RNAの取得を可能とするため、多数のサンプルを扱う研究や診断等に適した方法である。
また、上記アプタマーの作製方法としては、米国特許第5,270,163号に記載の方法等が好ましい。
即ち、上記の如き本発明に係る担体1gに対して抗Ago2抗体等の本発明に係るタンパク質親和性物質0.1〜10mg存在するようにして炭酸水素ナトリウム緩衝液中に添加し、30〜40℃で、2〜10時間反応させることにより、本発明に係るタンパク質親和性物質が粒子の表面上に固定化され、本発明に係るタンパク質親和性物質固定化担体が得られる。
[工程(1)]本発明に係るタンパク質親和性物質固定化担体と、本発明に係るタンパク質RNA複合体とを接触させて、当該担体にタンパク質RNA複合体を結合させ、
[工程(2)]要すれば、当該タンパク質RNA複合体が結合した担体を洗浄し、
[工程(3)]当該タンパク質RNA複合体が結合した担体を、水又はpHが3.0〜8.0の緩衝液中で70〜100℃で加熱し、small RNAを遊離させることによりなされる。
まず、タンパク質RNA複合体を含む溶液と本発明に係るタンパク質親和性物質固定化担体とを混合し、2〜37℃、好ましくは2〜10℃で1〜30時間、好ましくは2〜10時間、より好ましくは2〜5時間反応させ、本発明に係るタンパク質親和性物質固定化担体に、本発明に係るタンパク質RNA複合体を結合させる。
上記工程(1)の反応の後、要すれば、本発明に係るタンパク質RNA複合体が結合した担体を、反応溶液から単離し、更に、担体表面に付着した、遊離のタンパク質RNA複合体や細胞由来成分を取り除くため、得られた担体を洗浄液で洗浄するのが好ましい。
工程(1)の後または工程(2)の後、本発明に係るタンパク質RNA複合体が結合した担体を、担体1mgに対して10〜100μL、好ましくは10〜50μLの水又はpHが3.0〜8.0の緩衝液中で、通常70〜100℃で30〜600秒加熱する。その後、要すれば当該溶液を遠心分離に付した後、該溶液の上清を分取することにより、目的のsmall RNAを含有する溶液を得る事ができる。このような溶液は、逆転写反応やPCR反応の試料として直接用いることができる。
(1)抗ヒトAgo2抗体固定化担体の作製
抗ヒトAgo2抗体固定化担体はAntibody Immobilization Kit IP(和光純薬工業(株)製)と1mg/mL抗ヒトAgo2抗体(和光純薬工業(株)製)を用いて下記のように作製した。
即ち、Antibody Immobilization Beads 200mgにAntibody Immobilization Buffer 9.0mLと1mg/mL抗ヒトAgo2抗体1.0mLを添加混合し、37℃で4時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、5分間)後、上清をピペットで除き、Washing Buffer(Neutral) 10mLで洗浄を3回行った。その後、Blocking Buffer 10mLを入れ、室温で1時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、5分間)後、上清をピペットで除き、Washing Buffer(Neutral) 10mLで洗浄を5回行い、Storage Buffer10mLで洗浄を1回行った後、Storage Buffer5.0mLでビーズを懸濁し、抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液(以下、このようにして得た溶液を、抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液と記載する)を得た。
ヒトプール血漿(コージンバイオ(株)製)1mLを遠心分離(20000×g、15分間)した後、上清を新しいチューブに移し、ポリ(オキシエチレン)ノニルフェニルエーテル(和光純薬工業(株)製)を終濃度0.1 w/v %となるように添加したものを、ヒト血漿サンプルとして用いた(以下、このように前処理したヒト血漿サンプルを前処理済みヒト血漿サンプルと記載する)。
上記(1)で得た抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量含量)を遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、0.05w/v%ポリ(オキシエチレン)ノニルフェニルエーテル(和光純薬工業(株)製)及び200mM塩化ナトリウム含有20mMトリス塩酸水溶液(pH7.4、以下、免疫沈降洗浄液と略記する)1mLで1回洗浄を行った後、前記処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄した。その後ペレットにヌクレアーゼフリー水(ニッポンジーン(株)製)50μLを添加し、サーモミキサー(エッペンドルフ社製)を用いて1400rpmで攪拌しながら95℃で5分間インキュベーションした。遠心分離(3000×g、30秒間)の後、上清を分取し、得られたものを測定用試料とした。
miRNAの逆転写反応はTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ社製)およびTaqMan MicroRNA Assay Kit(hsa-miR-92a用)(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて下記のように行った。
即ち、上記方法で得られた測定用試料5μLに、100mM dNTP mix 0.15μL、10×RT Buffer 1.5μL、20U/μL RNase Inhibitor 0.19μL、50U/μL Multiscribe RT enzyme 1μL 、5×RT primer( hsa-miR-92a用)3μL、精製水4.16μLを添加しtotal 15μLの反応液を調製した。各反応液を 16℃で30分間、42℃で30分間インキュベーションした後、85℃で5分間インキュベーションし、逆転写反応産物を得た。
得られた逆転写反応産物1μLに、TaqMan 2×PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製)7.5μL、20×TaqMan Assay Mix( hsa-miR-92a用)0.75μL、精製水5.75μLを添加し、total 15μLの反応液を調製し、ABI7500 Fast Real-Time PCR System(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて定量PCR検出を行い、各Ct値を求めた。
一方、1本鎖合成miR-92a(5'- UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU -3')を標準RNAとし、精製水で101〜105copies/μLに10倍希釈した希釈溶液を調製し、各希釈溶液1μLを上記と同様の方法で逆転写反応させ定量PCR検出を行った。得られた各希釈標準RNA溶液のCt値とその分子数から、miR-92aの検量線を作成した。該検量線を用いて、上記で得られた各Ct値よりmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図1に示す。
(1) 免疫沈降SDS・フェノール/クロロホルム溶出法によるヒト血漿からのmiRNA取得
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで1回洗浄を行った後、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄し、沈殿物(ペレット)を得た。その後、該ペレットに0.5w/v% SDS溶液50μLを添加し、担体に結合したタンパク質を溶出した。更に、溶出液に滅菌水350μL、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合した後、遠心分離(20000×g、10分間)した。上層を分取し、これにクロロホルム400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離(20000×g、10分間)した。その上層を分取し、エタ沈メイト(ニッポンジーン(株)製) 3μL、3M酢酸ナトリウム 40μL、エタノール 1mLを加え、ボルテックスミキサーで懸濁後、遠心分離(20000×g、15分間)した。得られた沈殿物を70 v/v %エタノール1mLで洗浄後、室温で20分間風乾し、その乾燥物をヌクレアーゼフリー水50μLに溶解したものを、測定用試料とした。
得られた測定用試料を用いて、実施例1(4)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、得られたCt値からmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図1に実施例1の結果と併せて示す。
(1)免疫沈降酸性溶出法によるヒト血漿からのmiRNA取得
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで1回洗浄を行った後、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄し、沈殿物(ペレット)を得た。その後、該ペレットに0.1Mグリシン-塩酸緩衝液(pH2.5)46.5μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離(3000×g、30秒間)を行い、上清を分取し、1M CAPS(pH11.0) 3.5μLを添加して中和した溶液を測定用試料とした。
得られた測定用試料を用いて、実施例1(4)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、得られたCt値からmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図1に実施例1の結果と併せて示す。
(1)免疫沈降加熱溶出法によるヒト血漿からのmiRNA取得
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで1回洗浄を行った後、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵(約5℃)で3時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄し、沈殿物(ペレット)を得た。その後、該ペレットにヌクレアーゼフリー水(ニッポンジーン(株)製)50μLを添加し、サーモミキサー(エッペンドルフ社製)を用いて1400rpmで攪拌した。上記操作と同様にして得た溶液を6種類準備し、それぞれ、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃で5分間インキュベーションした。遠心分離(3000×g、30秒間)の後、上清を分取し、それらを測定用試料とした。
得られた各測定用試料を用いて、実施例1(4)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、得られたCt値からmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図2に示す。
(1)免疫沈降加熱溶出法によるヒト血漿からのmiRNA取得
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)した後、上清を除き、免疫沈降洗浄液 1mLで1回洗浄を行った。次いで、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。更に、遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄し、沈殿物(ペレット)を得た。該ペレットにヌクレアーゼフリー水(ニッポンジーン(株)製)50μLを添加した。上記操作と同様にして得た溶液を24種類準備し、サーモミキサー(エッペンドルフ社製)を用いて1400rpmで攪拌しながら、それぞれ70℃、80℃、90℃、100℃で10、30、60、90、120、180秒間インキュベーションした。最後に、遠心分離(3000×g、30秒間)の後、上清を分取し、それらを免疫沈降溶出液とした。
得られた測定用試料を用いて、実施例1(4)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、得られたCt値からmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図3に示す。
(1)免疫沈降加熱溶出法によるヒト血漿からのmiRNA取得
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)し、その後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで1回洗浄を行った。次いで、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。更に、遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄した後、沈殿物(ペレット)を得た。上記操作と同様にして得た溶液を11種類を準備し、ペレットそれぞれに、ヌクレアーゼフリー水(ニッポンジーン(株)製)、10mMクエン酸緩衝液(pH3.0)、10mMクエン酸緩衝液(pH4.0)、10mMクエン酸緩衝液(pH4.5)、10mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、10mMクエン酸緩衝液(pH5.5)、10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)、10mM MES緩衝液(pH6.5)、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、10mMリン酸緩衝液(pH8.0)又は10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)各50μLを添加し、サーモミキサー(エッペンドルフ社製)を用いて1400rpmで攪拌しながら90℃で90秒間インキュベーションした。最後に、遠心分離(3000×g、30秒間)の後、上清を分取し、それらを測定用試料とした。
得られた各測定用試料を用いて、実施例1(4)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、得られたCt値からmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図4に示す。
(1)免疫沈降加熱溶出法によるヒト血漿からのmiRNA取得
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで1回洗浄を行った。次いで、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。更に、遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄し、沈殿物(ペレット)を得た。上記操作と同様にして得た溶液を7種類を準備し、ペレットそれぞれに、ヌクレアーゼフリー水(ニッポンジーン(株)製)、大腸菌リボゾーマルRNA(rRNA、和光純薬工業(株)製)を終濃度0.1、1、10ng/μLとなるように添加したヌクレアーゼフリー水、サケ精子DNA(ssDNA、和光純薬工業(株)製)を終濃度0.1、1、10ng/μLとなるように添加したヌクレアーゼフリー水各50μLを添加し、サーモミキサー(エッペンドルフ社製)を用いて1400rpmで攪拌しながら90℃で90秒間インキュベーションした。遠心分離(3000×g、30秒間)の後、上清を分取し、測定用試料とした。
得られた各測定用試料を用いて、実施例1(4)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、得られたCt値からmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図5に示す。
(1)免疫沈降加熱溶出法によるヒト血漿からのmiRNA取得
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで1回洗浄を行った後、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄し、沈殿物(ペレット)を得た。上記操作と同様にして得た溶液4種類を準備し、各ペレットにヌクレアーゼフリー水(ニッポンジーン(株)製)、大腸菌リボゾーマルRNA(rRNA、和光純薬工業(株)製)を終濃度1ng/μLとなるように添加したヌクレアーゼフリー水、サケ精子DNA(ssDNA、和光純薬工業(株)製)を終濃度1ng/μLとなるように添加したヌクレアーゼフリー水、10mMクエン酸緩衝液(pH5.5)50μLを添加し、サーモミキサー(エッペンドルフ社製)を用いて1400rpmで攪拌しながら90℃で90秒間インキュベーションした。遠心分離(3000×g、30秒間)の後、上清を分取し、測定用試料とした。
miR-92a量の測定に関しては、得られた各測定用試料を用いて、実施例1(4)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、得られたCt値からmiR-92aの分子数を算出した。
即ち、得られた各測定用試料5μLに、100mM dNTP mix 0.15μL、10×RT Buffer 1.5μL、20U/μL RNase Inhibitor 0.19μL、50U/μL Multiscribe RT enzyme 1μL 、5×RT primer(hsa-miR-16用)3μL、精製水4.16μLをそれぞれ添加しtotal 15μLの反応液を調製した。各反応液を16℃で30分間、42℃で30分間インキュベーションした後、85℃で5分間インキュベーションし、逆転写反応産物を得た。
次いで、各逆転写反応産物1μLに、TaqMan 2×PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製)7.5μL、20×TaqMan Assay Mix(hsa-miR-16用)0.75μL、精製水5.75μLを添加し、total 15μLの反応液を調製し、ABI7500 Fast Real-Time PCR System(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて定量PCR検出を行い、各Ct値を求めた。
一方、1本鎖合成miR-16(5'- UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG -3')を標準RNAとして、精製水で101〜105copies/μLに10倍希釈した希釈溶液を調製し、その各希釈溶液1μLを上記と同様の方法で逆転写反応させて定量PCR検出を行った。得られた各希釈標準RNA溶液のCt値とその分子数から、miR-16の検量線を作成した。該検量線を用いて、上記で得られた各Ct値よりmiR-16の分子数を算出した。その結果を、miR-92aの結果と併せて図6に示す。
(1)免疫沈降従来法SDS・フェノール/クロロホルム溶出によるmiRNAの精製
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液50μL(ビーズ2mg相当量)を遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで1回洗浄を行った後、前処理済みヒト血漿サンプル200μLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。遠心分離(3000×g、30秒間)後上清を除き、免疫沈降洗浄液1mLで3回洗浄し、沈殿物(ペレット)を得た。その後、該ペレットに2w/v% SDS溶液50μLを添加し、担体に結合したタンパク質を溶出した。溶出液に滅菌水350μL、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離(20000×g、10分間)した。上層を分取し、クロロホルム400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離(20000×g、10分間)した。上層を分取し、エタ沈メイト(ニッポンジーン(株)製) 3μL、3M酢酸ナトリウム 40μL、エタノール 1mLを加え、ボルテックスミキサーで懸濁後、遠心分離(20000×g、15分間)した。沈殿を70 v/v %エタノール1mLで洗浄後、室温で20分間風乾し、ヌクレアーゼフリー水50μLに溶解し、該溶液を測定用試料とした。
得られた測定用試料を用いて、実施例6(2)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、miR-16及びmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図6に実施例6の結果と併せて示す。
(1)AGPC法によるmiRNA精製
前処理済みヒト血漿サンプル200μLにISOGEN-LS(ニッポンジーン(株)製)600μLとグリコーゲン(和光純薬工業(株)製)2μLを添加し、ボルテックスミキサーにより2分間混合した後、クロロホルム160μLを添加し、ボルテックスミキサーで10分間混合した。更に、遠心分離(20000×g、10分間)後、上層を分取し、イソプロパノール0.6mLを添加混合し遠心分離(20000×g、10分間)した。次いで、沈殿物を取り出し、70 v/v %エタノール1mLで洗浄後、室温で20分間風乾した。得られた乾燥物を、滅菌水50μLに溶解し、得られた溶液を測定用試料とした。
得られた各測定用試料を用いて、実施例6(2)記載の方法と同様に、逆転写反応および定量PCR検出を行い、miR-16及びmiR-92aの分子数を算出した。その結果を、図6に実施例6及び比較例3の結果と併せて示す。
また、miR-92aに関しても、本発明の免疫沈降加熱溶出法によれば、何れの溶液を用いても、SDS溶出の後フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿を行う従来の免疫沈降法と同等若しくはそれ以上の回収量を示し、大腸菌リボゾーマルRNA添加ヌクレアーゼフリー水(終濃度1ng/μL)、サケ精子DNA添加ヌクレアーゼフリー水(終濃度1ng/μL)、10mMクエン酸緩衝液(pH5.5)を用いた免疫沈降加熱溶出法はAGPC法とほぼ同等の回収量を示した。
従って、この結果から、本発明の免疫沈降加熱溶出法は、簡便な操作で実施できるにもかかわらず、従来法と比較して同等若しくはそれ以上の効率で血漿中のmiRNA等のsmall RNAを回収できる優れた方法であることが判った。
Claims (9)
- Argonauteサブファミリータンパク質に対して親和性を有する物質をその表面に固定化した担体と、Argonauteサブファミリータンパク質とsmall RNAの複合体(タンパク質RNA複合体)とを接触させて、当該担体にタンパク質RNA複合体を結合させ、
該タンパク質RNA複合体が結合した担体を、水又はpHが3.0〜8.0の緩衝液中で70〜100℃に加熱してsmall RNAを遊離させて取得することを特徴とする、small RNAの取得方法。 - 前記Argonauteサブファミリータンパク質がAgo1, Ago2, Ago3又はAgo4である、請求項1記載の取得方法。
- 前記Argonauteサブファミリータンパク質がAgo2である、請求項1記載の取得方法。
- 前記担体に前記タンパク質RNA複合体を結合させた後、加熱する前に、得られたタンパク質RNA複合体が結合した担体を洗浄する、請求項1〜3の何れかに記載の取得方法。
- 担体を緩衝液中で加熱する、請求項1〜4の何れかに記載の取得方法。
- 緩衝液のpHが4.5〜7.0である、請求項1〜5の何れかに記載の取得方法。
- 緩衝液が、クエン酸緩衝液、Good’s緩衝液又はリン酸緩衝液である、請求項1〜6の何れかに記載の取得方法。
- 加熱が、30〜600秒間の加熱である、請求項1〜7の何れかに記載の取得方法。
- 水又は緩衝液が、対象のsmall RNAの塩基配列を含まないRNA、又は、DNAを含有するものである、請求項1〜8の何れかに記載の取得方法。
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