WO2023024066A1 - 临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 - Google Patents
临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023024066A1 WO2023024066A1 PCT/CN2021/114989 CN2021114989W WO2023024066A1 WO 2023024066 A1 WO2023024066 A1 WO 2023024066A1 CN 2021114989 W CN2021114989 W CN 2021114989W WO 2023024066 A1 WO2023024066 A1 WO 2023024066A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- protein
- complex
- labeling
- biotin
- proximity
- Prior art date
Links
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 155
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 154
- 108060006004 Ascorbate peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 63
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 36
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 32
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 32
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 32
- VZWXNOBHWODXCW-ZOBUZTSGSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]pentanamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 VZWXNOBHWODXCW-ZOBUZTSGSA-N 0.000 claims description 23
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 18
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 13
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 claims description 13
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 6
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 claims description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 10
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 5
- 108091005626 post-translationally modified proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000035123 post-translationally modified proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 102000021178 chitin binding proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091011157 chitin binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 241000501667 Etroplus Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 3
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150052280 APEX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036162 GATC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091007767 MALAT1 Proteins 0.000 description 1
- 101100232268 Mus musculus Hoxc11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800002094 Mxe GyrA intein Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000002273 Polycomb Repressive Complex 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010000598 Polycomb Repressive Complex 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100465401 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SCL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027881 endodeoxyribonuclease SpeI Proteins 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法,其中,该临近标记复合物通过构建蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白,蛋白A可以特异性的与目标蛋白的抗体结合,通过特异性的抗体介导临近标记复合物与目标蛋白的紧密结合,不需要在细胞内构建抗坏血酸过氧化物酶与诱饵蛋白的融合蛋白,该临近标记复合物不受限于基因编辑,且能够应用于翻译后修饰的蛋白,通过该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子的有效性高。
Description
本发明涉及生物技术领域,特别涉及临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法。
许多生物过程是通过蛋白质和核酸的分子相互作用来执行和调节的,包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-RNA相互作用和蛋白质-DNA相互作用。这些相互作用关系的失衡会导致人类各种疾病的发生,如癌症、免疫失调和神经退行性疾病等。因此,研究细胞中这些分子间的相互作用的方法对了解人类疾病的生物学过程及其治疗提供有利的工具。
临近标记技术常被用来研究生物分子间的相互作用,其是通过运用基因编辑将工程化酶,例如过氧化物酶APEX/APEX2和HRP或生物素连接酶BioID、BASU、TurboID和miniTurbo等,与诱饵蛋白在细胞内融合表达,再利用生物素来标记与诱饵蛋白结合的目标蛋白邻近的相互作用的蛋白质、DNA或RNA,然后通过生物信息学分析或质谱鉴定进一步了解与目标蛋白相互作用的分子。
其中,工程化抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)是由源自植物的抗坏血酸过氧化物酶经工程改造而来。Ting等人研究证明,APEX2在活细胞内所有区域有活性,并可以利用生物素苯酚(Biotin-phenol,BP)催化生成活性强、半衰期短、膜不通透的活性分子,因此可以实现对特定亚细胞区域内或间隙中蛋白质组的标记。将细胞与生物素苯酚共同孵育30分钟后,添加过氧化氢(H
2O
2)可以激活酶促反应,生成生物素-苯氧自由基,这些自由基与富含电子的特定氨基酸(如Tyr、Trp、Cys和His)反应,使生物素被共价连接到蛋白质或核酸分子上,接着标记反应需要添加抑制剂来终止。由于苯氧自由基的半衰期很短(<1ms),只有距离目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA会被标记,1分钟内即可完成所需的标记。
生物素标记的分子通过偶联链霉亲和素的磁珠进行亲和富集,最后利用 质谱技术、DNA-seq或RNA-seq或相对定量PCR(qPCR)对生物素修饰的分子进行鉴定,得到目标蛋白的邻近蛋白质组、DNA或RNA。
基于APEX2技术的临近标记主要有以下个优点:1)苯氧自由基的寿命很短,在1ms以内,所以理论上只能标记空间范围在20nm以内的蛋白,和标记范围是200-300nm的HRP方法相比,极大地降低了假阳性的结果。2)自由基的活性很高,反应速度极快,标记反应只需要1分钟,所以无论对于瞬时的生物过程还是长时程的生物过程,APEX2技术都能很好地实现临近标记。
但是这些方法具有一定的局限性:1)需要用工程化酶在细胞内表达外源融合蛋白,这限制了其在难以转染的细胞系、原代细胞、组织和病理样品中的应用;2)不能应用于翻译后修饰的蛋白(例如组蛋白修饰);3)当在细胞中融合工程化酶时,可能会造成诱饵蛋白功能的丧失,以及与其相互作用蛋白的改变,从而造成假阳性。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种临近标记复合物,旨在解决现有临近标记方法受限于基因编辑,且不能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题,该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。
为实现上述目的,本发明提出一种临近标记复合物,包括蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白。
可选地,所述蛋白A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提出一种试剂盒,包括上述的一种临近标记复合物。
可选地,所述试剂盒还包括生物素苯酚和过氧化氢。
本发明还提出一种临近标记方法,使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明还提出一种临近标记方法,使用上述的一种试剂盒对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地,所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分 子进行生物素标记,具体包括:
向细胞中加入抗体孵育,使所述抗体与目标蛋白结合;
向细胞中加入所述临近标记复合物孵育,使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合,使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体;
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育;
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地,所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记,具体包括:
将所述临近标记复合物与抗体孵育,使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合,得到第一复合体;
向细胞中加入所述第一复合体孵育,使所述抗体与目标蛋白结合,使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体;
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育;
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地,所述目标蛋白为修饰的组蛋白。
可选地,所述生物素-苯氧自由基对所述目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明最后还提出一种分子间互作分析方法,包括:
使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记;
使用偶联链霉亲和素的磁珠对生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行富集;
通过LC-MS/MS、DNA-seq或RNA-seq或相对定量PCR方法将富集到的生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行分析鉴定。
本发明技术方案的临近标记复合物通过构建蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白,蛋白A可以特异性的与目标蛋白的抗体结合,通过特异性的抗体介导临近标记复合物与目标蛋白的紧密结合,不需要在细胞内构建抗坏血酸过氧化物酶与诱饵蛋白的融合蛋白,该临近标记复合物不受限于基因编辑,且能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题,通过该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明的临近标记复合物的基因结构设计图;
图2为本发明的临近标记复合物标记与目标蛋白互作的分子的原理示意图;
图3为本发明的分子间互作分析方法的过程示意图;
图4为3XFlag-pA-Tn5-F1质粒图谱;
图5为3XFlag-pA-APEX2质粒图谱;
图6为本发明的临近标记复合物分析与组蛋白修饰相关蛋白分子的实验结果图;
图7为本发明的临近标记复合物分析与组蛋白修饰相关DNA分子的特异性位点;
图8为本发明的临近标记复合物分析与组蛋白修饰相关RNA分子的特异性位点。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步 说明。
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种临近标记复合物,请参阅图1,包括蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白。
具体的,蛋白A(Protein A)是金黄色葡萄球菌的一个株系的细胞壁蛋白,它通过Fc区与哺乳动物的IgG结合,具有不在抗原结合位点而与免疫球蛋白结合的性质,能形成含有蛋白A、抗体、抗原的复合物。更具体的,本发明实施例的蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体的,抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)是由源自植物的抗坏血酸酶经工程改造而来,本发明实施例的抗坏血酸过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。APEX2在活细胞内所有区域有活性,并可以利用生物素苯酚(Biotin-phenol,BP)催化生成活性强、半衰期短、膜不通透的活性分子,因此可以实现对特定亚细胞区域内或间隙中蛋白质组的标记。
将细胞与生物素-苯酚共同孵育30分钟后,添加过氧化氢(H
2O
2)可以激活酶促反应,生成生物素-苯氧自由基,这些自由基与富含电子的特定氨基酸(如Tyr、Trp、Cys和His)反应,使生物素被共价连接到蛋白、DNA和RNA上,接着标记反应需要添加抑制剂来终止。由于苯氧自由基的半衰期很短小于1ms,只有距离目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA会被标记,1分钟内即可完成所需的标记。
具体的,蛋白A可以连接在抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)的C端或N端,得到的融合表达蛋白具有蛋白A与抗体特异性结合的特点,也具有抗坏血酸过氧化物酶的特点。APEX2在过氧化氢的催化下可将生物素标记在目标蛋白邻近20nm以内所有可标记的蛋白、DNA和RNA分子上,具体的,标记原理示意图如图2所示。然后采用链霉亲和素磁珠对生物素化的分子进行富集,并通过LC-MS/MS方法将富集到的生物素标记的蛋白分子进行质谱鉴定,通过 qPCR对富集到的生物素标记的DNA和RNA分子的特异位点进行检测。
本发明技术方案的临近标记复合物通过构建蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白,蛋白A可以特异性的与目标蛋白的抗体结合,通过特异性的抗体介导临近标记复合物与目标蛋白的紧密结合,不需要在细胞内构建抗坏血酸过氧化物酶与诱饵蛋白的融合蛋白,该临近标记复合物不受限于基因编辑,且能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题,通过该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。
可选地,所述临近标记复合物带有Flag标签。
Flag标签可以连接在蛋白A,也可以连接在APEX2,表达得到的临近标记复合物融合蛋白带有Flag标签,本发明实施例中,Flag标签连接在蛋白A上。后续检测主要通过Flag-tag这段肽链形成的免疫决定簇与其单克隆抗体的特异性结合来实现。检测手段有免疫荧光(immunofluorescence),免疫印记(Western Blotting)等。更具体的,Flag标签为3X Flag标签,3X Flag标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地,请继续参阅图1,所述临近标记复合物还包括内含肽(MXe GyrA intein)和几丁质结合蛋白(CBD)。CBD用于在纯化融合蛋白过程中与几丁质树脂结合固定融合蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。内含肽是蛋白质自剪接元件,用于将纯化后的融合蛋白进行剪切,使3X Flag-pA-APEX2与树脂剥离,达到纯化效果。在一实施例中,内含肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
更进一步地,3X Flag-pA-APEX2与内含肽和几丁质结合蛋白之间有连接肽,以防止内含肽剪切到3X Flag-pA-APEX2,影响临近标记复合物的功能。所述连接肽的氨基酸序列例如可以为SEQ ID NO.6所示。
本发明还提出一种试剂盒,包括上述的一种临近标记复合物。可选地,所述试剂盒还包括生物素苯酚和过氧化氢。
本发明还提出一种临近标记方法,使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明还提出一种临近标记方法,使用上述的一种试剂盒对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地,所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记,具体包括:
向细胞中加入抗体孵育,使所述抗体与目标蛋白结合;
向细胞中加入所述临近标记复合物孵育,使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合,使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体;
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育;
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地,所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记,具体包括:
将所述临近标记复合物与抗体孵育,使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合,得到第一复合体;
向细胞中加入所述第一复合体孵育,使所述抗体与目标蛋白结合,使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体;
向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育;
加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
可选地,所述目标蛋白为修饰的组蛋白。
可选地,所述生物素-苯氧自由基对所述目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
本发明最后还提出一种分子间互作分析方法,请参阅图3,包括:
使用上述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA 分子进行生物素标记;
使用偶联链霉亲和素的磁珠对生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行富集;
通过LC-MS/MS方法将富集到的生物素标记的蛋白分子进行质谱鉴定;
通过qPCR对富集到的生物素标记的DNA和RNA分子的特异位点进行检测。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1pA-APEX2融合蛋白的得到
1.1质粒构建
pA-APEX2是3X Flag-pA-APEX2的简写,是带有Flag标签的蛋白A(Protein A)与过氧化物酶APEX2融合表达后纯化得到的蛋白A-APEX2复合物。
使用3X Flag-pA-Tn5-F1质粒(Addgene plasmid#124601),质粒图谱如图4所示,作为构建3XFlag-pA-APEX2的骨架。APEX2基因序列通过聚合酶链反应从GFP-APEX2-NIK3x质粒(Addgene plasmid#129274)扩增得到,扩增引物序列分别为上游引物aggaggaggcggttcccatatgggaaagtcttacccaactgtgag(SEQ ID NO.7)和下游引物ccctcgggtagggcaactagtgcatctcccgtgatgcaggcatcagcaaacccaagct(SEQ ID NO.8)。将3X Flag-pA-Tn5-F1质粒序列中的Tn5序列用NdeI和SpeI内切酶剪切并用APEX2序列替代,得到3X Flag-pA-APEX2质粒,质粒图谱如图5所示。
1.2表达纯化
将表达的3X Flag-pA-APEX2质粒转入C3013感受态细胞37℃过夜培养。第二天挑取单克隆细胞于3mL 2xYT培养基(含氨苄抗生素)于37℃培养4h,随后将3mL菌液转至400mL 2x YT培养基(含氨苄抗生素)进行大体系培养至O.D.~0.6,将培养好的400mL菌液放置冰上降温至10℃,加入终浓度为0.25mM的IPTG过夜培养(16℃、200rpm)。第三天将菌液在4℃6000g离心30min收取细菌沉淀。
收取细菌沉淀后用40mL的HEGX Buffer(20mM HEPES-KOH pH 7.2、1M NaCl、1mM EDTA、10%glycerol、0.2%Triton X-100和蛋白酶抑制剂)裂解细菌重悬,冰上裂解15min,超声破碎后用4℃离心机16000g离心30min,小心收取蛋白上清。向蛋白上清液中加入4mL的几丁质树脂4℃孵育1h。然后转至两个20mL的重力纯化柱并用HEGX Buffer洗两遍。用含有终浓度为100mM DTT的HEGX Buffer进行剪切,DTT可将intein CBD结构切掉,使3XFlag-pA-APEX2与树脂剥离,达到纯化效果。最终经透析和浓缩得到较高纯度的3XFlag-pA-APEX2于-20℃保存。
实施例2pA-APEX2融合蛋白标记小鼠细胞组蛋白
pA-APEX2临近标记过程:1)小鼠成纤维细胞(MEF)用终浓度为0.1%甲醛对细胞进行轻度交联并用0.05%洋地黄皂苷对细胞膜进行通透;2)加入抗体(H3K27me3)4℃过夜孵育,使抗体与目标蛋白结合;3)加入pA-APEX2室温孵育1小时,蛋白A与抗体结合,使得APEX2通过抗体与目标蛋白结合在一起;4)用Wash buffer(20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.5mM亚精胺、RNA酶抑制剂和不含EDTA的蛋白酶抑制剂)洗涤两遍,加入终浓度为500μM的底物生物素苯酚(biotin-phenol)在室温下孵育30分钟;5)随后用1mM H
2O
2标记1分钟,APEX2在H
2O
2的催化下可将生物素标记在靶向修饰的组蛋白H3K27me3邻近20nm以内所有可标记的蛋白、DNA或RNA分子上,最后用还原剂淬灭反应,标记终止;6)裂解细胞,分别提取总蛋白、DNA或RNA,通过链霉亲和素标记的磁珠和亲和纯化方法将含有生物素标记的蛋白质、DNA或RNA进行富集,通过质谱分析,获得与组蛋白修饰相关的蛋白质组学信息,通过qPCR对富集的DNA和RNA的特异位点进行检测。
对比例1不加H
2O
2对照组
与实施例2相比,对比例1的区别仅在于不加H
2O
2催化,为阴性对照组,记为-H
2O
2。
对比例2IgG对照组
与实施例2相比,对比例2的区别在于向细胞中加入的是IgG抗体,而不 是H3K27me3抗体,为阴性对照。
本方案通过特异性的抗体介导pA-APEX2与目标蛋白紧密结合,为了排除非特异性结合产生的背景,设置IgG阴性对照组,因为IgG并不能特异性的与目标蛋白结合,那么IgG所介导pA-APEX2临近标记的蛋白、DNA或RNA都是非特异性的与IgG结合的分子,得到的结果就是背景。所以通过设置IgG阴性对照组排除背景,得到真实标记的目标分子。
结果分析
为了测试pA-APEX2是否可用于鉴定与组蛋白修饰相关的蛋白质、DNA和RNA,通过LC-MS/MS方法将富集到的生物素标记的蛋白分子进行质谱鉴定。结果表明,与IgG阴性对照组和不加H
2O
2的阴性对照组比较,加H
2O
2处理组可精准鉴定出MEF细胞中组蛋白修饰H3K27me3相关PRC1和PRC2亚基复合物,其结果与已有两种方法BAC-GFP和ChromID的鉴定结果相比较,鉴定范围和准确度有较大提升,结果如图6所示,其中BAC-GFP方法的参考文献为:
Vermeulen,M.et al.Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.142,967-980(2010)。ChromID方法的参考文献为:Villasenor,R.et al.ChromID identifies the protein interactome at chromatin marks.Nat Biotechnol 38,728-736,doi:10.1038/s41587-020-0434-2(2020)。
通过qPCR方法将富集到的生物素标记的DNA和RNA分子特异位点进行分析。结果表明,与IgG阴性对照组和不加H
2O
2的阴性对照组比较,加H
2O
2处理组可富集到H3K27me3特异性DNA位点Hoxc11(图7),使用的qPCR引物为Hoxc11_F:GGCAGGAGAAGAGAACGAT;Hoxc11_R:TGGGCAGATAGAGG TTGGA。
与IgG阴性对照组和不加H
2O
2的阴性对照组比较,加H
2O
2处理组可富集到H3K27me3特异性RNA位点MALAT1(图8),使用的qPCR引物为Malat1_F:CCTAACGACTAGCATTGGCA;Malat1_R:GCACTCTTTCCTGGGCTATC。
以上所述仅为本发明的可选实施例,并非因此限制本发明的专利范围, 凡是在本发明的发明构思下,利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (11)
- 一种临近标记复合物,其特征在于,包括蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白。
- 如权利要求1所述的一种临近标记复合物,其特征在于,所述蛋白A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
- 一种试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的一种临近标记复合物。
- 如权利要求3所述的一种试剂盒,其特征在于,还包括生物素苯酚和过氧化氢。
- 一种临近标记方法,其特征在于,使用权利要求1或2所述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
- 一种临近标记方法,其特征在于,使用权利要求3或4所述的一种试剂盒对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
- 如权利要求5所述的一种临近标记方法,其特征在于,所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记,具体包括:向细胞中加入抗体孵育,使所述抗体与目标蛋白结合;向细胞中加入所述临近标记复合物孵育,使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合,使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体;向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素酚孵育;加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生 物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
- 如权利要求5所述的一种临近标记方法,其特征在于,所述临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记,具体包括:将所述临近标记复合物与抗体孵育,使所述临近标记复合物的蛋白A与所述抗体结合,得到第一复合体;向细胞中加入所述第一复合体孵育,使所述抗体与目标蛋白结合,使得所述细胞内形成抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体;向形成所述抗坏血酸过氧化物酶-蛋白A-抗体-目标蛋白复合体的细胞中加入生物素苯酚孵育;加入过氧化氢激活所述抗坏血酸过氧化物酶利用所述生物素苯酚生成生物素-苯氧自由基对与所述目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
- 如权利要求7或8所述的一种临近标记方法,其特征在于,所述目标蛋白为修饰的组蛋白。
- 如权利要求9所述的一种临近标记方法,其特征在于,所述生物素-苯氧自由基对所述目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记。
- 一种分子间互作分析方法,其特征在于,包括:使用权利要求1或2所述的一种临近标记复合物对与目标蛋白互作的蛋白、DNA和RNA分子进行生物素标记;使用偶联链霉亲和素的磁珠对生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行富集;通过LC-MS/MS、DNA-seq或RNA-seq或相对定量PCR方法将富集到的生物素标记的蛋白、DNA和RNA分子进行分析鉴定。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2021/114989 WO2023024066A1 (zh) | 2021-08-27 | 2021-08-27 | 临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2021/114989 WO2023024066A1 (zh) | 2021-08-27 | 2021-08-27 | 临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2023024066A1 true WO2023024066A1 (zh) | 2023-03-02 |
Family
ID=85322363
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/CN2021/114989 WO2023024066A1 (zh) | 2021-08-27 | 2021-08-27 | 临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
WO (1) | WO2023024066A1 (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003014734A1 (fr) * | 2001-08-07 | 2003-02-20 | Keio University | Procede de detection d'une interaction entre une substance et une proteine, procede d'analyse de la proteine interagissant avec la substance et procede de formation d'un complexe contenant la substance et la proteine interagissant avec cette substance |
US20050059053A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-03-17 | Rainer Fischer | Complex formation for the stabilisation and purification of proteins of interest |
US20050277116A1 (en) * | 2001-04-20 | 2005-12-15 | Mckeon Frank | Compositions and methods for the identification of protein interactions in vertebrate cells |
CN101875923A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-11-03 | 杭州北斗生物技术有限公司 | 人血清白蛋白与尿酸氧化酶的融合蛋白及其制备方法 |
CN107043427A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-15 | 中南大学 | 一种融合蛋白和基于该融合蛋白的elisa方法 |
CN108285494A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-07-17 | 北京大学 | 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法 |
CN109142337A (zh) * | 2018-09-25 | 2019-01-04 | 无锡壹闪生物科技有限公司 | 空间邻近化学发光法检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其检测方法 |
CN112904017A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-06-04 | 上海交通大学 | 一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法 |
-
2021
- 2021-08-27 WO PCT/CN2021/114989 patent/WO2023024066A1/zh unknown
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050277116A1 (en) * | 2001-04-20 | 2005-12-15 | Mckeon Frank | Compositions and methods for the identification of protein interactions in vertebrate cells |
WO2003014734A1 (fr) * | 2001-08-07 | 2003-02-20 | Keio University | Procede de detection d'une interaction entre une substance et une proteine, procede d'analyse de la proteine interagissant avec la substance et procede de formation d'un complexe contenant la substance et la proteine interagissant avec cette substance |
US20050059053A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-03-17 | Rainer Fischer | Complex formation for the stabilisation and purification of proteins of interest |
CN101875923A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-11-03 | 杭州北斗生物技术有限公司 | 人血清白蛋白与尿酸氧化酶的融合蛋白及其制备方法 |
CN107043427A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-15 | 中南大学 | 一种融合蛋白和基于该融合蛋白的elisa方法 |
CN108285494A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-07-17 | 北京大学 | 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法 |
CN109142337A (zh) * | 2018-09-25 | 2019-01-04 | 无锡壹闪生物科技有限公司 | 空间邻近化学发光法检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其检测方法 |
CN112904017A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-06-04 | 上海交通大学 | 一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DU YANG-CHUN; TANG JING-LAN; WANG YOU-JUN; ZHANG XIAO-YAN: "Several New Techniques for The Study of Living Intracellular Subcellular Structural Proteomics: Application and Comparison of Proximity Labeling Strategy", SHENGWU HUAXUE YU SHENGWU WULI JINZHAN - BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, KEXUE CHUBANSHE, BEIJING, CN, vol. 46, no. 07, 31 December 2019 (2019-12-31), CN , pages 641 - 653, XP009543757, ISSN: 1000-3282, DOI: 10.16476/j.pibb.2019.0069 * |
LI XUE-WEN, REES JOHANNA S., XUE PENG, ZHANG HONG, HAMAIA SAMIR W., SANDERSON BAILEY, FUNK PHILLIP E., FARNDALE RICHARD W., LILLEY: "New Insights into the DT40 B Cell Receptor Cluster Using a Proteomic Proximity Labeling Assay", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 289, no. 21, 1 May 2014 (2014-05-01), US , pages 14434 - 14447, XP093039016, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M113.529578 * |
XU XIAO-JUN; ZHU XIN-YU; ZHANG RUI; XUE YAN-HONG; LI ZHEN-ZHEN; SONG E-LI; HOU JUN-JIE: "Advances in Applications of Ascorbate Peroxidase in Electron Microscope Imaging and Proximity Labeling in Live Cells", SHENGWU HUAXUE YU SHENGWU WULI JINZHAN - BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, KEXUE CHUBANSHE, BEIJING, CN, vol. 45, no. 05, 31 December 2018 (2018-12-31), CN , pages 519 - 528, XP009543759, ISSN: 1000-3282, DOI: 10.16476/j.pibb.2017.0362 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lin et al. | Protein–protein interactions: co-immunoprecipitation | |
WO2021017883A1 (zh) | 一种用于单细胞ChIP-seq文库制备的融合蛋白及其应用 | |
Dundas et al. | Streptavidin–biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications | |
Schimanski et al. | Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination | |
Ivanov et al. | A topological interaction between cohesin rings and a circular minichromosome | |
Bustos et al. | Characterizing ubiquitination sites by peptide-based immunoaffinity enrichment | |
Santos-Barriopedro et al. | Off-the-shelf proximity biotinylation for interaction proteomics | |
Zhong et al. | Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in ChIP-seq application | |
US11414680B2 (en) | Method for inserting desired DNA fragment into site located adjacent to binding domain of DNA-binding protein | |
Lai et al. | Pioneer factors in animals and plants—colonizing chromatin for gene regulation | |
Cotten et al. | Selection of proteins with desired properties from natural proteome libraries using mRNA display | |
Goh et al. | Going native: Complete removal of protein purification affinity tags by simple modification of existing tags and proteases | |
KR20220101738A (ko) | 생체자기 마이크로스피어 및 이의 제조 방법과 용도 | |
Sydor et al. | Establishment of intein-mediated protein ligation under denaturing conditions: C-terminal labeling of a single-chain antibody for biochip screening | |
JPH07147987A (ja) | ユビキチン接合性酵素(e2)融合タンパク質 | |
Matsumoto et al. | Site‐specific protein labeling with amine‐containing molecules using Lactobacillus plantarum sortase | |
Stiller et al. | Fast and Efficient Fc-Specific Photoaffinity Labeling to Produce Antibody–DNA Conjugates | |
Elion | Detection of protein‐protein interactions by coprecipitation | |
WO2023024066A1 (zh) | 临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 | |
Gopalan et al. | Multi-CUT&Tag to simultaneously profile multiple chromatin factors | |
CN113698496B (zh) | 临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法 | |
JP2009136280A (ja) | 新規ペプチドおよびその利用 | |
Smith et al. | Multiple repeat regions within mouse DUX recruit chromatin regulators to facilitate an embryonic gene expression program | |
Deng et al. | Multiplexed and ultralow-input chip-seq enabled by tagmentation-based indexing and facile microfluidics | |
US11236326B2 (en) | Methods and compositions for assessing protein function |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21954592 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |