CN114644713B - 生物素化的转座子在鉴定和/或富集染色质开放区域转录机器中的应用 - Google Patents

生物素化的转座子在鉴定和/或富集染色质开放区域转录机器中的应用 Download PDF

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Abstract

生物素化的转座子在鉴定和/或富集染色质开放区域转录机器中的应用。本发明的优点在于，通过利用链霉亲和素偶联的磁珠结合生物素化的转座子拉下来的染色质开放区上正在进行转录的DNA片段及转录复合物，进行质谱鉴定及ATAC‑seq鉴定，能够检测到、瞬时互作的转录机器(转录因子/转录共调节因子)及DNA结合序列。只需少量细胞，可对转录机器进行精准定量。同时，本发明将阴离子交换技术与其结合(fATAC‑MS)，获得更精确的DNA‑蛋白质相互作用信息。进一步的，利用更为靶向的Tn5‑dCas9融合蛋白(ctATAC‑MS)，更换sgRNA可以定位任意开放区域中转录机器结合的位置。

Description

生物素化的转座子在鉴定和/或富集染色质开放区域转录机 器中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域中转录蛋白机器富集分离与鉴定的方法，利用生物素化的转座体，直接捕获内源性染色质开放性区域中转录因子及转录共调控因子。
背景技术
转录因子(Transcription factors，TFs)是结合在特定DNA序列上，参与转录调控的蛋白；转录共调控因子(transcriptional cofactor，TCs)是在基因转录过程中，被特定的转录因子募集到基因的启动子区，与其形成复合物，转录激活或抑制转录的蛋白。在调控基因转录的过程中，转录因子和转录共调控因子形成转录机器，结合在染色质开放区，共同调节转录。然而，转录因子在细胞内的表达丰度极低(仅占细胞总蛋白的0.01-0.001％)，使得对转录因子的纯化及鉴定非常困难。此外，转录是一个动态变化的过程，如何直接鉴定到生物体内特定位点正在进行转录的蛋白机器，亦成为难题。
如TFRE技术(PMID:30703471)，利用引入外源串联多拷贝双链DNA结合元件，富集内源性转录因子，此方法结合的更多的是游离在细胞内的转录因子，而非结合在DNA上正在进行转录的转录因子(见图1)。如ATI-assay技术(PMID:29786094)，需要建立复杂的DNA文库，且根据motif推测TF，而非真正检测到TF(见图2)。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用生物素化的转座子鉴定染色质开放区域转录机器的方法(ATAC-MS)。
本发明提供了一种可以结合ATAC-seq的技术，同时鉴定到正在进行转录的染色质开放区的DNA序列及结合在上面的转录机器，共同揭示转录机制。
随着细胞梯度的增加，ATAC-MS鉴定到的转录蛋白机器丰度都呈线性增加，说明ATAC-MS对转录蛋白机器有着精准的定量能力。
进一步地，ATAC-MS可以与阴离子交换技术结合(fATAC-MS)，利用分子带电差异将DNA-转录机器复合物分成不同组分，降低转录蛋白机器及DNA复杂度。
本发明还将ATAC-MS技术升级，将Tn5酶与dCas9蛋白融合(ctATAC-MS)，鉴定特定靶向开放区域的DNA序列及结合在DNA序列上的转录蛋白机器。
以下为解决本发明技术问题的技术方案。
本发明的一个方面涉及生物素化的转座子在鉴定和/或富集染色质开放区域转录机器中的应用。
其中，所述生物素化的转座子的制备方法可为本领域常规，优选包括：
(1)将带有生物素的两对DNA单链退火，得双链DNA，混匀后得接头；其中每对所述DNA单链中一条的5’端经生物素修饰；
(2)使所述接头与转座酶或其融合蛋白反应，得生物素化的转座子；
所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9、或Tn10；
所述融合蛋白自N端到C端优选依次包含转座酶和Cas蛋白。
以上步骤(2)中，当所述接头与转座酶进行反应时，优选通过包埋的方式进行反应；当所述接头与包含转座酶的融合蛋白进行反应时，反应温度优选25℃。
本发明中的Cas蛋白可为本领域常规的Cas蛋白，例如Cas9(或其变体dCas9)、Cas12f或者Cas12a；优选dCas9。
在本发明一优选实施方案中，所述应用包括：
a.将生物素化的转座子与裂解液通透化后的样本孵育以进行转座反应；
b.去除转座子特异性结合；
c.链霉亲和素磁珠富集、去除杂蛋白；
d.TCEP法解交联。
其中，当所述生物素化的转座子中包含dCas9蛋白时，所述转座反应包括：
将包含生物素化的Td转座子、10X Cas9 cleavage buffer、以及针对靶位点的sgRNA的混合物与裂解液通透化后的样本孵育以进行转座反应。
在本发明一更优选的实施方案中，步骤a～d满足如下条件中的一个或者两个以上：
步骤a中所述孵育的温度为37℃；
步骤a中在通透化所述样本之前，使用甲醛对其进行交联；
步骤b中使用阴离子交换技术去除转座子特异性结合；
步骤c中所述去除杂蛋白为使用0.2％SDS以及，HPLC H2O或者1×PBS依次清洗富集后的链霉亲和素磁珠；
步骤d中将TECP溶液与步骤c所得去除杂蛋白后的磁珠混合，于95℃震荡10～30min，所述TECP溶液包含2％DOC(Sodium deoxycholate)，10μMTCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)，40mM CAA(二氯乙酰胺)，100mM Tris-HCl、pH 8.5以及1mMPMSF；其中的百分比为质量体积百分比。
本发明中的阴离子交换技术优选包括将转座反应得到的上清与阴离子交换填料混合、孵育，然后进行梯度洗脱。
所述阴离子交换技术中用到的填料优选经过10-50mM NaCl溶液(例如20mM)清洗过的填料。
所述阴离子交换技术中的梯度洗脱优选使用浓度为20～1000mM的NaCl溶液进行；例如，梯度洗脱中用到的NaCl溶液浓度可分别为：20mM、100mM、200mM、300mM、500mM、700mM和1000mM。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的优点在于，通过利用链霉亲和素偶联的磁珠结合生物素化的转座子拉下来的染色质开放区上正在进行转录的DNA片段及转录复合物，进行质谱鉴定及ATAC-seq鉴定，能够检测到、瞬时互作的转录机器(转录因子/转录共调节因子)及DNA结合序列。只需少量细胞，可对转录机器进行精准定量。同时，本发明将阴离子交换技术与其结合(fATAC-MS)，获得更精确的DNA-蛋白质相互作用信息。进一步的，利用更为靶向的Tn5-dCas9融合蛋白(ctATAC-MS)，更换sgRNA可以定位任意开放区域中转录机器结合的位置。
附图说明
图1为TFRE技术。
图2为ATI-assay技术。
图3为ATAC-MS流程示意图。
图4显示ATAC-MS技术所鉴定到的TFs和TCs。
图5显示ATAC-MS对于TFs/TCs的富集作用。
图6显示ATAC-MS在不同细胞数量下检测到的TFs/TCs数量。
图7显示fATAC-MS在不同组分中鉴定到不同的TFs/TCs。
图8显示了ctATAC-MS和ctATAC-seq的靶向富集作用。
图9为fATAC-MS流程示意图。
图10为ctATAC-MS流程示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1利用ATAC-MS富集并鉴定染色质开放区转录机器及DNA结合序列
1.生物素化的接头制备。将合成的带有biotin的两对DNA单链退火得到双链DNA。反应结束后，混匀得到接头。
第一对DNA单链：
F：5'-P-CTGTCTCTTATACACATCT-3’；
R:5’-biotin-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；
第二对DNA单链：
F：5'-P-CTGTCTCTTATACACATCT-3’；
R：5'-biotin-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3。
2.转座子制备：
将步骤1得到的接头与Tn5酶包埋，得到生物素化的转座子。
3.样本处理：
样本可以是细胞或者组织，将样品用甲醛进行交联。接着用裂解液通透化。
为了进行细胞梯度实验，分别取e4、5e4、e5、5e5、e6细胞，在同一体系的前提下进行后续反应。
4.转座反应：
将细胞沉淀与转座子37℃孵育。
此步反应可得到内源性DNA上正在进行转录的转录因子。
5.去除转座子特异性结合：
加入适量SDS，室温孵育，洗走特异性Tn5转座子。
6.链霉亲和素磁珠富集：
将步骤5中获取的上清与链霉亲和素磁珠轻轻颠倒混匀孵育。
7.多次清洗磁珠，去除杂蛋白：
8.TCEP法解交联：
TCEP溶液成分(2％DOC,10μM TCEP,40mM CAA,100mM Tris-HCl,pH 8.5,1mMPMSF).95℃，震荡10～30min。
9.质谱样本准备：
向步骤8得到的混合物加入胰酶酶解成肽段，之后进行脱盐得到干净的肽段。
10.质谱检测：
将步骤9获得的肽段利用LC-MS/MS检测，并利用相应生物信息学工具对其中的转录因子/转录共调节因子或蛋白进行鉴定、定量(具体流程见图3)。
结果显示：ATAC-MS在293T、MCF7、HeLa和HepG2四个细胞系中成功鉴定到转录因子TFs和转录共调控因子TCs(见图4)。且与核提取物NE相比，ATAC-MS拉到的总蛋白量明显减少，但鉴定到的TFs/TCs的数量却和NE相当，证明了ATAC-MS对于TFs/TCs的富集作用(图5)。随着细胞数量的增加，ATAC-MS鉴定到的TFs/TCs的数量也呈线性增加，证明了ATAC-MS对于转录蛋白机器有着精准的定量能力(图6)。
实施例2 ATAC-MS技术和阴离子交换技术结合(fATAC-MS)
1-4.与上述ATAC-MS实验步骤1-4相同。
5.清洗填料：
取阴离子交换填料至EP管中，使用浓度为20mM的NaCl溶液清洗几遍。
6.填料富集：
将步骤4转座反应得到的上清加入步骤5清洗后的填料中，旋转反应孵育数分钟。
7.梯度洗脱：
分别、依次加入20/100/200/300/500/700/1000mM NaCl溶液至步骤6反应后的填料中，室温旋转孵育，离心分别取上清。取步骤6填料富集后的上清作为FT组分。填料用20mMNaCl重悬，作为Agrose组分。一共9个组分。
8.富集：
将步骤7中获取的上清与链霉亲和素磁珠轻轻颠倒混匀孵育。
9.除杂蛋白：
用0.2％SDS清洗步骤8中富集有样本蛋白的链霉亲和素磁珠一次、用HPLC H2O，或1×PBS等依次清洗数次，弃溶液。
10.解交联：
TCEP溶液成分(2％DOC，10μM TCEP，40mM CAA，100mM Tris-HCl、pH 8.5，1mMPMSF)，95℃，震荡10～30min。
11.溶液内酶解：
向步骤10中的溶液中加入胰酶酶解成肽段。
12.样品收集：
脱盐收集。真空浓缩上清得到肽段。
13.质谱检测：
将步骤12获得的肽段利用LC-MS/MS检测，并利用相应生物信息学工具对其中的转录因子/转录共调节因子或蛋白进行鉴定、定量(具体流程见图9)。图7显示fATAC-MS能够在不同组分(不同的梯度洗脱后得到的样本)中鉴定到不同的TFs/TCs。
实施例3 ATAC-MS技术和Tn5-dCas9技术结合
1.Tn5-dCas9融合蛋白的表达：
融合蛋白Tn5-dCas9由高活性Tn5转座酶基因和pdCas9细菌的dCas9基因构建。利用293T真核细胞进行表达。
2.接头制备：
与上述ATAC-MS实验步骤1。
3.Tn5-dCas9转座子制备：
将步骤2得到的接头与步骤1表达的Tn5-dCas9融合蛋白25℃反应，得到生物素化的Tn5-dCas9转座子。
4.设计合成靶向sgRNA。
5.按照如下体系配制组装反应mix：
10X Cas9 cleavage buffer、Td转座子以及针对靶位点的sgRNA(以不添加sgRNA为对照)；
将以上mix在室温孵育数分钟。
6.转座反应：
将上述反应mix与处理后的细胞、缓冲液混合，37℃孵育。
7.去除转座子特异性结合：
加入适量SDS，室温孵育，洗走特异性Tn5-dCas9转座子。
8.链霉亲和素磁珠富集：
将步骤7中获取的上清与链霉亲和素磁珠轻轻颠倒混匀孵育。
9.多次清洗磁珠，去除杂蛋白。
10.TCEP法解交联：
TCEP溶液成分(2％DOC，10μM TCEP，40mM CAA，100mM Tris-HCl、pH 8.5，1mMPMSF)，95℃，震荡10～30min。
11.质谱样本准备：
向步骤10得到的混合物加入胰酶酶解成肽段，之后进行脱盐得到干净的肽段。
12.质谱检测：
将步骤11获得的肽段利用LC-MS/MS检测，并利用相应生物信息学工具对其中的转录因子/转录共调节因子或蛋白进行鉴定、定量(具体流程见图10)。
结果显示：在加入靶向sgRNA后，ctATAC-MS鉴定到的转录因子CLOCK的丰度显著高于不加sgRNA组(图8，右)。对上述过程中富集到的染色质开发区DNA片段进行测序(ctATAC-seq)，鉴定到的总peak数减少，但在Per1 promoter区有peak数量的富集，证明了ctATAC-MS和ctATAC-seq的靶向富集作用(图8，左)。

Claims (7)

1.生物素化的转座子在鉴定和/或富集染色质开放区域转录机器中的应用；
所述转录机器为转录因子/转录共调节因子；所述生物素化的转座子的制备方法包括：
（1）将带有生物素的两对DNA单链退火，得双链DNA，混匀后得接头；其中每对所述DNA单链中一条的5’端经生物素修饰；
（2）使所述接头与转座酶或其融合蛋白反应，得生物素化的转座子；
所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9、或Tn10；所述应用包括：
a．将生物素化的转座子与裂解液通透化后的样本孵育以进行转座反应；
b．去除转座子特异性结合；
c．链霉亲和素磁珠富集、去除杂蛋白；
d．TCEP法解交联；
步骤a~d满足如下条件中的一个或者两个以上：
步骤a中所述孵育的温度为37℃；
步骤a中在通透化所述样本之前，使用甲醛对其进行交联；
步骤b中使用阴离子交换技术去除转座子特异性结合；所述阴离子交换技术包括将转座反应得到的上清与阴离子交换填料混合、孵育，然后进行梯度洗脱；
步骤c中所述去除杂蛋白为使用0.2%SDS以及，HPLC H2O或者1×PBS依次清洗富集后的链霉亲和素磁珠，其中的百分比为质量体积百分比；
步骤d中将TECP溶液与步骤c所得去除杂蛋白后的磁珠混合，于95℃震荡10~30min，所述TECP溶液包含2% DOC，10 μM TCEP，40 mM CAA，100 mM Tris-HCl、pH 8.5以及1 mMPMSF；其中的百分比为质量体积百分比。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在与所述上清混合前，使用10-50 mM NaCl溶液对阴离子交换填料进行清洗。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，使用20 mM NaCl溶液对阴离子交换填料进行清洗。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，使用浓度为20~1000 mM的NaCl溶液进行所述梯度洗脱。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白自N端到C端依次包含转座酶和Cas蛋白。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转座酶为Tn5；
和/或，所述Cas蛋白为dCas9。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，当所述生物素化的转座子中包含dCas9蛋白时，所述转座反应包括：
将包含生物素化的转座子、10X Cas9 cleavage buffer以及针对靶位点的sgRNA的混合物与裂解液通透化后的样本孵育以进行转座反应。
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