CN112813153B - 一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其dna结合序列的方法和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的方法通过BioID富集来源于目的蛋白表达体系的蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，进而对富集的生物素化蛋白进行鉴定和定量，并结合ChIP‑Seq方法对富集的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测，最终筛选并确定出与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列，具有检测范围宽和准确可靠的优点，提供的方法可以用于科学研究和药物筛选等中。

Description

一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列 的方法和其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域中下游转录因子的富集和鉴定的方法，具体涉及一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法和其应用，尤其涉及一种结合利用BioID和ChIP-Seq快速富集、鉴定、定量和筛选激酶下游弱的、瞬时互作的转录因子及其DNA结合序列的方法，及其在筛选对与目的蛋白相关的生物学通路起到激活或抑制作用的药物中的应用。

背景技术

转录因子是指能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，这些蛋白质能调控其基因的转录。从本质上来讲，转录因子具有DNA序列的识别、结合以及控制基因表达的基本机能，这一机能可以单独或者通过与其它蛋白质形成复合体来完成。人类基因组中大约有1500个基因控制转录因子的编码。然而，转录因子在细胞内的表达丰度极低(仅占细胞总蛋白的0.01-0.001％)，使得对转录因子的纯化及鉴定非常困难，如通过传统色谱方法进行转录因子的纯化通常需要抽提成百升细胞培养物，通过10,000-100,000倍富集得到的转录因子也仅够用于化学和功能的分析。采用特异性抗体进行亲和纯化是分离纯化转录因子的有效手段，然而，一方面抗体成本太高，另一方面，目前仅少量的转录因子存在抗体，这大大限制了抗体亲和纯化方法的应用。

人类所有的蛋白并不是同时表达的，相反，很多蛋白的表达具有显著的组织或时空特异性；同时，基因(编码目的蛋白)的激活/去激活所必要的信号途径通常是存在于级联下游转录因子。因此，与目的蛋白(例如激酶)互作的转录因子(统称为下游转录因子)会通过控制靶蛋白表达的开和关，来影响不同组织细胞、不同发育阶段中靶蛋白所表达的数目及程度，因此，对下游转录因子进行分离、鉴定，可以为阐述特异转录因子对靶基因的转录调控奠定重要基础。

然而，与目的蛋白互作的转录因子的表达水平往往很低，用传统方法在蛋白质组水平上分析下游转录因子表达谱通常很困难。解析下游转录因子表达谱或其动态变化时，在样品制备过程中需要采用特定的试剂(如抗体)对下游转录因子进行富集分离，但由于抗体的成本较高，且种类有限，采用特定抗体进行免疫沉淀来富集分离下游转录因子的应用受到很大限制；而且这种策略也仅能对个别下游转录因子进行分析，难以实现对所有下游转录因子的大规模富集分离和鉴定，对下游转录因子的定量以及与其交联的DNA结合序列的确定亦成为难题。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法，包括富集、鉴定、定量和筛选的过程，具体包括以下步骤：

1)利用过表达体系过表达目的蛋白，和野生型表达所述目的蛋白；

2)利用过表达的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第一蛋白样本，利用野生型表达的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第二蛋白样本；

3)使用链霉亲和素磁珠富集第一蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第一样本；使用链霉亲和素磁珠富集第二蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第二样本；

4)使用LC-MS/MS分别对步骤3)的第一样本和第二样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；

5)比较步骤4)中获得的第一样本中的转录因子和第二样本中的转录因子的定量数据，从中筛选出定量数据具有显著差异的转录因子作为与目的蛋白互作的下游转录因子；

6)分别对步骤3)的第一样本和第二样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

7)比较步骤6)中获得的第一样本和第二样本中的DNA片段的丰度，从中筛选出丰度具有显著差异的DNA片段作为步骤5)中筛选出的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列。

上述方法还包括由以下T1)-T5)组成的第一验证步骤：

T1)利用药物刺激所述过表达体系，表达获得经药物刺激后的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；

T2)利用经药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第三蛋白样本；

T3)使用链霉亲和素磁珠富集第三蛋白样本中生物素化的蛋白，作为第三样本；

T4)使用LC-MS/MS对第三样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；

T5)从步骤T4)中获得的第三样本中的转录因子中选取由步骤5)筛选出的下游转录因子，将其定量数据与步骤4)中获得的第一样本中的转录因子的定量数据比较，定量数据具有显著差异的转录因子经验证确定为与目的蛋白互作的下游转录因子。

上述方法还包括由以下S1)-S5)组成的第二验证步骤：

S1)利用药物刺激所述过表达体系，表达获得经药物刺激后的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；

S2)利用经药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第四蛋白样本；

S3)使用链霉亲和素磁珠富集第四蛋白样本中与生物素化的蛋白交联的DNA片段，作为第四样本；

S4)对所述第四样本中的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

S5)从步骤S4)中获得的第四样本中的DNA片段中选取由步骤7)筛选出的DNA结合序列，将其丰度与步骤6)中获得的第一样本中的DNA片段的丰度比较，丰度具有显著差异的DNA片段经验证确定为与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列。

上述方法中，所述第一蛋白样本、第二蛋白样本、第三蛋白样本和第四蛋白样本来源于全细胞蛋白。

上述方法中，所述目的蛋白为IKKB激酶；与IKKB激酶互作的下游转录因子为NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1和TFCP2。

本发明另一方面还提供一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法，包括富集、鉴定、定量和筛选的过程，具体包括以下步骤：

P1)利用药物刺激过表达体系表达获得经药物刺激后的目的蛋白，利用未经药物刺激过表达体系表达获得未经药物刺激的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；

P2)利用P1)的经药物刺激后的目的蛋白和未经药物刺激的目的蛋白分别进行生物素化处理和ChIP交联制备第七蛋白样本和第八蛋白样本；

P3)使用链霉亲和素磁珠富集第七蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第七样本；使用链霉亲和素磁珠富集第八蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第八样本；

P4)使用LC-MS/MS分别对步骤P3)的第七样本和第八样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；

P5)比较步骤P4)中获得的第七样本中的转录因子和第八样本中的转录因子的定量数据，从中筛选出定量数据具有显著差异的转录因子作为与目的蛋白互作的下游转录因子；

P6)分别对步骤P3)的第七样本和第八样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

P7)比较步骤P6)中获得的第七样本和第八样本中的DNA片段的丰度，从中筛选出丰度具有显著差异的DNA片段作为步骤P5)中筛选出的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列；

其中所述第七蛋白样本和第八蛋白样本可来源于核蛋白或全细胞蛋白。

本发明又一方面还提供一种筛选对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物的方法，包括以下步骤：

M1)利用候选药物对过表达目的蛋白的过表达体系进行刺激，表达获得刺激后的目的蛋白；

M2)利用经候选药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第五蛋白样本；

M3)使用链霉亲和素磁珠富集第五蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第五样本；

M4)使用LC-MS/MS对所述第五样本中由上述的确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法中所确定的与目的蛋白互作的下游转录因子进行定量，并与第八样本中的与目的蛋白互作的下游转录因子的定量数据进行比较与判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响；

其中第五样本和第八样本来源相同，即同来源于全细胞蛋白或同来源于核蛋白。

上述筛选对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物的方法，其还包括由以下M11)和M12)组成的第三验证步骤：

M11)对所述第五样本中的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

M12)将所述第五样本中的由上述的确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法中所确定的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度与第八样本中的DNA结合序列的丰度进行比较和判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响；

M4)和M12)判断一致时确定该候选药物是否对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用。

本发明再一方面还提供一种筛选对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物的方法，包括以下步骤：

N1)利用候选药物对过表达目的蛋白的过表达体系进行刺激，表达获得刺激后的目的蛋白；

N2)利用经候选药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第六蛋白样本；

N3)使用链霉亲和素磁珠富集第六蛋白样本中与生物素化的蛋白交联的DNA片段，作为第六样本；

N4)对所述第六样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

N5)将所述第六样本中的由上述的确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法中所确定的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度与第八样本中的DNA结合序列的丰度进行比较和判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响；

其中第六样本和第八样本来源相同，即同来源于全细胞蛋白或同来源于核蛋白。

由上述的确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法中所确定的与IKKB激酶互作的下游转录因子，特别是STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2在制备作用于与IKKB激酶相关的生物学通路的制剂中的用途也属于本发明的内容，基于此，本发明还提供一种作用于与IKKB激酶相关的生物学通路的生物制剂，其包含与IKKB激酶互作的下游转录因子为活性成分，所述下游转录因子包括STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2中的一种或多种；任选地，所述下游转录因子还包括选自NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3的一种或多种。

上述方法中，所述过表达体系为将表达所述目的蛋白的重组表达载体导入宿主细胞获得。

本发明基于以上技术方案提供的确定与目的蛋白(例如激酶)互作的下游转录因子及其DNA结合序列的方法包括富集、鉴定、定量和筛选的步骤，其结合利用BioID和ChIP-Seq的基本原理，通过构建目的蛋白的过表达体系，并利用链霉亲和素偶联的磁珠，只需要较低浓度的生物素(浓度最低可为50μM)便可有效标记与目的蛋白互作的任意蛋白(包括下游转录因子)以及与蛋白交联的DNA片段，通过磁珠结合富集目的蛋白过表达体系中生物素化的复合物(包括蛋白、DNA等)，亲和纯化分离后进行LC-MS/MS鉴定、定量以及DNA片段的测序、文库比对和丰度检测，相对于目的蛋白的野生型表达体系，能够将生物蛋白样本中生物素化的与目的蛋白(瞬时)互作的、弱的下游转录因子及其DNA结合序列进行放大检测，从而容易确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列；并且本发明提供的方法可以直接利用全细胞蛋白样本进行检测，因此其可以全景式反映生物蛋白样本中与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的种类和含量(丰度)，因此检测范围更宽，且对与目的蛋白互作的下游转录因子进行富集、鉴定和定量的成本大大降低。

本发明还可以通过构建经药物——该药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活(使更多的与目的蛋白互作的下游转录因子磷酸化)或抑制(抑制与目的蛋白互作的下游转录因子磷酸化)作用——刺激的目的蛋白的过表达体系，并比较该药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的定量结果与本发明构建的未经过药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的定量结果，和/或比较该药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度与未经过药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度，可以验证确认本发明方法中通过比较目的蛋白的过表达体系和野生型表达体系中的与目的蛋白互作的下游转录因子的定量结果和转录因子的DNA结合序列的丰度所确定的结果。因此，本发明提供的方法所确定的与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列更加准确可靠。

本发明在确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的基础上，还可以实现对与目的蛋白相关的生物学通路(即从目的蛋白和与其互作的下游转录因子磷酸化，至磷酸化的下游转录因子入核的生物学通路)起到激活(使更多的与目的蛋白互作的下游转录因子磷酸化并入核)或抑制(抑制与目的蛋白互作的下游转录因子磷酸化以减少其入核)作用的药物的筛选，因此本发明方法还可以为药物研发提供基础数据。另一方面，在本发明确定的与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的基础上，有利于进一步确定下游转录因子结合的靶基因，对于阐述特异转录因子对靶基因的转录调控等的机理研究具有重要意义。

附图说明

图1为IKKB激酶过表达的Western检测图片；

图2为实施例1中IKKB激酶过表达后被显著富集的与其互作的部分下游转录因子(NFKB1、NFKB2、REL、RELA)定量结果柱状图；

图3为与IKKB激酶互作的下游转录因子的motif，其中A幅为NFKB2的motif的logo图，B幅为RELA的motif的logo图；

图4为经TNFa刺激IKKB激酶过表达体系0min至60min的全细胞蛋白样本中与IKKB激酶互作的下游转录因子RELA(A幅)和NFKB2(B幅)的motif的丰度波动峰图。

具体实施方式

本发明旨在对与目的蛋白互作的下游转录因子(包括弱的、瞬时互作的转录因子)及其DNA结合序列进行确定(富集、鉴定、定量(测序、文库比对以及丰度检测)和筛选)，并提供一种筛选对与目的蛋白相关的生物学通路起到激活或抑制作用的药物的方法。

为了实现该目的，发明人利用邻近蛋白标记-BioID的基本原理，其可以将靠近某一标记物质的蛋白或分子标记生物素化，如重组表达带有BirA*生物素连接酶的蛋白，从而便于检测(包括富集、鉴定和/或定量)出与该标记物质互作的蛋白或分子；同时结合利用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP，又称为结合位点分析法)和第二代测序技术(ChIP-Seq)，在与标记物质互作的蛋白或分子富集的同时也富集到与蛋白或分子交联的DNA片段，进而可以对这些DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测。基于以上原理和技术手段，发明人惊讶发现，可以首先构建某一目的蛋白的过表达体系，然后利用BioID和ChIP方法对该目的蛋白过表达体系中生物素化的蛋白进行富集、鉴定和定量分析以及与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行富集、测序、文库比对和丰度检测，通过与目的蛋白的野生型表达体系相比，进而从中筛选出与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列。该方法可以对生物蛋白样本中与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列进行放大和全景式检测，因此该方法可以大大提高对与该目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的确定结果的准确性和范围，并因此可以广谱用于对与任意已知目的蛋白(例如激酶)互作的(包括瞬时互作的)、已知或未知的下游转录因子及其DNA结合序列进行快速确定。

为了验证确定结果的准确性和可靠性，还可利用对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物刺激目的蛋白的过表达体系，并比较该药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的定量结果与构建的未经过药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的定量结果，和/或比较该药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度与未经过药物刺激的目的蛋白的过表达体系中与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度，可以进一步确认通过比较目的蛋白的过表达体系和野生型表达体系中的与目的蛋白互作的下游转录因子的定量结果和转录因子的DNA结合序列的丰度所确定的结果。

以下结合具体实施例对本发明作进一步描述。

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，以下描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

以下描述中目的蛋白以IKKB激酶为代表，实施例中以确定(富集、鉴定、定量和筛选)与IKKB激酶互作的下游转录因子及其DNA结合序列为例进行说明，但本发明方法并不限于确定与IKKB激酶互作的下游转录因子及其DNA结合序列，其可以有效确定与任意已知目的蛋白互作的任何已知或未知的下游转录因子及其DNA结合序列。

实施例1：与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子及其DNA结合序列的确定(富集、鉴定、定量和筛选)

以下以过表达IKKB(Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase SubunitBeta)激酶的Hela细胞为例，描述结合利用BioID和ChIP从中快速确定(包括富集、鉴定、定量和筛选步骤)与IKKB激酶互作的下游转录因子及其DNA结合序列的过程。

(1)与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子的确定

1.1、IKKB-BirA表达载体的构建

根据NCBI数据库中IKKB基因的序列信息，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，经过PCR扩增、胶回收IKKB目的片段、双酶切IKKB目的片段与载体BirA-pLVXyu(复旦大学生物医学研究院余发星教授实验室提供，参考文献：Kyle等.2013.Kyle J.Roux,Dae InKim,Brian Burke.BioID:A Screen for Protein-Protein Interactions[J].CurrentProtocols in Protein Science,2013Nov 5；74:19.23.1-19.23.14.)、清洁回收、连接、转化、涂板、次日挑取单克隆、测序(由上海生工生物工程有限公司完成)，筛选得到带有IKKB表达基因的BirA-pLVXyu重组慢病毒载体，命名为IKKB-BirA；以空白载体BirA-pLVXyu作为对照。

1.2、HEK 293T细胞转染和病毒包装

1.2.1、按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)的说明书，大量提取步骤1.1构建的慢病毒载体IKKB-BirA，病毒包装载体pMD2.G和psPAX2(均购自上海生工生物工程有限公司)的质粒。

1.2.2、按照IKKB-BirA:psPAX2:pMD2.G＝8μg:6μg:2μg(4:3:1)比例关系将IKKB-BirA、psPAX2、pMD2.G质粒混合并与1mL opti-EME(购自Thermo Fisher Scientific)混合孵育5min，获得第一混合液；同时将25μL Lipo2000(购自Thermo Fisher Scientific)与1mL opti-EME混合孵育5min，获得第二混合液。

1.2.3、将步骤1.2.2的第一混合液和第二混合液混合孵育15min后，转染HEK 293T细胞(购自上海生命科学研究院)，6h后更换为DMEM完全培养基(购自Thermo FisherScientific)；

1.2.4、培养24h后收取上清(24h上清液)，更换新鲜的完全培养基，培养24h后再次收取上清(48h上清液)；以2000rpm，15min的条件分别对上述收取的24h上清液和48h上清液进行离心，分别获得24h病毒液和48h病毒液，用于以下步骤。

1.3、病毒感染Hela细胞，筛选稳转株，western验证过表达

1.3.1、用5mL 24h病毒液及3mL新鲜DMEM完全培养基(含1:1000比例的polybrene(购自sigma))感染Hela细胞(购自上海生命科学研究院)，培养12h；

1.3.2、更换为8mL新鲜DMEM完全培养基，培养6-8h；

1.3.3、用5mL 48h病毒液及3mL新鲜DMEM完全培养基(含1:1000比例的polybrene)再次感染细胞，培养12h；

1.3.4、更换为8mL新鲜DMEM完全培养基，培养6-8h；

1.3.5、添加嘌呤霉素(购自sigma)(终浓度3μg/mL)筛选稳转株细胞，继续培养。

1.3.6、取筛选到的稳转株细胞培养液，4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀，用1×PBS重悬细胞沉淀，再次4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀；用50mM NETN裂解液(含100mM NaCl，20mM Tris·HCl pH 8.0，0.5mM EDTA，0.5％NP-40，使用前加入1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))裂解细胞、超声破碎(超声2s间歇2s，1min，冰上操作)，16,500g、4℃离心15min、弃沉淀、收上清获得目的蛋白液；按照Bradford法测目的蛋白浓度，取50μg总蛋白进行Western试验，具体为：配制10％SDS-PAGE，定压跑胶(80V浓缩胶，约20min/110V分离胶约1h)；转膜1.5h；5％脱脂奶粉常温封闭1h，1×TBST快速洗2～3次；一抗(flag抗体(购自sigma))4℃孵育过夜/常温2h，1×TBST洗5次，6min/次；二抗(鼠抗(购自Cell SignalingTechnology))常温孵育2h，1×TBST洗5次，6min/次；曝光。Western检测结果如图1所示，其中IKKB_OE泳道表示过表达的IKKB激酶，BirA_对照泳道表示空白载体对照，以上步骤获得过表达IKKB激酶的过表达体系(即表达IKKB激酶的稳转株)，以转入空白载体BirA-pLVXyu的Hela细胞作为野生型表达体系。

1.4、生物素化蛋白质亲和纯化

1.4.1、将步骤1.3.5筛选获得的稳转株(过表达IKKB激酶的体系)继续培养至细胞密度生长至80％时，将培养基更换为含50μM生物素(购自sigma)的DMEM完全培养基，细胞孵育16-18h；同步培养转染对照空白载体的Hela细胞(野生型表达体系)；

1.4.2、细胞用冷的1×PBS洗两次，弃溶液并置于冰上；

1.4.3、蛋白样本制备，样本包括样本1和样本2，其中：

样本1(ChIP获取细胞全蛋白)的制备过程如下：

a)细胞固定(交联(crosslink))：取正常培养的稳转株Hela细胞(步骤1.4.2的细胞，10cm细胞培养皿培养，细胞数量约10⁷个/皿)，向培养皿中加入9ml含终浓度1％甲醛的1×PBS，室温下置于水平摇床，轻摇10min；

b)终止交联：加入1mL 1.25M的甘氨酸使其终浓度为0.125M，室温下置于水平摇床，轻摇5min；

c)向培养皿中加入冷的1×PBS，用细胞刮收集细胞，4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀，用冷的1×PBS重悬细胞沉淀，再次4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀；

d)用ChIP细胞裂解液(50mM HEPES/KOH(PH7.5)、500mM NaCl、1％Triton X-100、0.1％脱氧胆酸纳、1mM EDTA、0.1％SDS，建议加入量为500μL/1-1.5×10⁷细胞)重悬细胞沉淀，冰上超声破碎，High挡，超声30s间歇30s，50个循环(实际总工作时间25min，初次超声不同样本需进行时间梯度预实验)；

f)14000rpm，4℃离心10min，弃沉淀，收上清，获得染色质免疫沉淀样本(Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)Sample)的细胞全蛋白，分装后用液氮速冻，于-80℃存储备用；制得样本1(过表达体系表达，作为第一蛋白样本或全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)，和对照样本1(野生型表达，作为第二蛋白样本)。

样本2(核蛋白)的制备过程如下：

a)向步骤1.4.2的细胞培养皿中加入胰蛋白酶(0.25％Trypsin-EDTA，购自ThermoFisher)消化收集正常培养的稳转株Hela细胞(步骤1.4.2的细胞，10cm细胞培养皿培养，细胞数量约10⁷个/皿)，4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀，用冷的1×PBS重悬细胞沉淀，再次4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀；

b)用10倍沉淀体积的低渗溶液(10mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，10mMKCl，使用前加入1mM PMSF)重悬细胞沉淀，冰上放置30min后，4℃、3715g离心10min，弃上清；

c)用1/2沉淀体积的低盐溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，20mM KCl，0.2mM EDTA，25％Glycerol，使用前加入1mM PMSF)重悬细胞沉淀，立即涡旋震荡20s，冰上放置10min；

d)逐滴加入1/2细胞体积的高盐溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，1.2M KCl，0.2mM EDTA，25％glycerol，使用前加入1mM PMSF)，每加入一滴，立即涡旋震荡5s，之后再次加入，立即涡旋震荡5s，重复直至加完，4℃垂直混匀1h；

e)加入等体积BC0溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，0.2mM EDTA，20％glycerol，使用前加入1mM PMSF)，充分混匀，4℃、16000g离心40min，收集上清得到核蛋白，分装后用液氮速冻，于-80℃存储备用；制得样本2(从IKKB激酶过表达体系制备的核蛋白样本，作为核蛋白来源的第八蛋白样本)，和对照样本2(从IKKB激酶野生型表达体系制备的核蛋白样本)。

1.4.4、取新的1.5mL离心管，每管加入100μL充分混合均匀的链霉亲和素磁珠(

M-280streptavodin，购自Invitrogen公司，1.2-1.4×10⁷个磁珠)，加入1mL 1×B&W Buffer(2M NaCl、1M Tris-HCl(pH 7.5)、10mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.5M EDTA、1mMEDTA)，手轻轻弹起磁珠，上下颠倒混匀，置于磁性分离器，磁珠聚集于管底，弃上清，重复3次；

1.4.5、继续向离心管中加入1mL NETN IP Buffer(100mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5mM EDTA、0.5％NP-40)，手轻轻弹起磁珠，上下颠倒混匀，置于磁性分离器，磁珠聚集于管底，弃上清，重复3次；

1.4.6、继续向离心管中加入1mL 50mM NETN裂解液(配方同上)，手轻轻弹起磁珠，上下颠倒混匀，置于磁性分离器，磁珠聚集于管底，弃上清，重复3次；

1.4.7、将步骤1.4.3的蛋白样本(例如样本量的90％)转移至步骤1.4.6处理后的磁珠中，手轻轻弹起磁珠，上下颠倒混匀，4℃混合仪旋转孵育2h；

1.4.8、洗涤磁珠，除杂蛋白，具体包括以下步骤：

a)室温下，将步骤1.4.7的离心管置于磁性分离器上收集磁珠，弃上清；

b)将1mL 50mM NETN裂解液(配方同上)加入离心管中，轻轻弹起磁珠，上下颠倒10次，收集磁珠，弃上清，重复3次；

c)将1mL 1×PBS加入离心管中，轻轻弹起磁珠，上下颠倒10次，收集磁珠，弃上清，重复3次；

d)将1mL 50mM NH₄HCO₃添加到离心管中，轻轻弹起磁珠，上下颠倒10次，收集磁珠，弃上清，重复3次。最终获得富集有蛋白样本中生物素化的蛋白的磁珠。

1.5、溶液内酶解，收集肽段

1.5.1、将50μL 50mM NH₄HCO₃添加到经步骤1.4处理的装有富集有蛋白样本中生物素化的蛋白的磁珠的离心管中，加入10μL 100ng/μL胰酶，37℃酶解1h，再加入10μL 100ng/μL胰酶，37℃酶解过夜；

1.5.2、加入200μL 50％乙腈和0.1％甲酸的混合溶液，震荡5min，12000rpm，离心5min，取出上清；

1.5.3、重复步骤1.5.2；

1.5.4、将步骤1.5.2和步骤1.5.3两次收集的上清合并后12000rpm离心5min，取上清；

1.5.5、真空浓缩步骤1.5.4的上清得到肽段(即富集到的生物素化的蛋白肽段)。

1.6、与IKKB激酶互作的下游转录因子的鉴定和定量

该步骤使用LC-MS/MS(液相色谱-质谱/质谱联用)对下游转录因子进行鉴定和定量，其中LC-MS/MS鉴定条件如下：

色谱条件：预柱：C18，3μm，

2cm×100μm ID；色谱柱：C18，1.9μm，

15cm×150μm ID；

流动相：A，水+0.1％甲酸；B，80％乙腈+0.1％甲酸；

流速：600nl/min；洗脱梯度从5％B液至100％B液，梯度时间75min；

质谱条件：数据采集时间75min，喷雾电压(spray voltage)2.1KV；碰撞能量(normalized collision energy)32％，采集质量范围300-1400Da；

LC-MS检测过程如下：

1.6.1、将步骤1.5真空浓缩获得的肽段用含有0.1％的甲酸溶液复溶并上样。液相使用nano-HPLC C18柱(预柱：3μm，

2cm×100μm ID；分析柱：1.9μm，

15cm×150μm ID)对肽段进行分离，流速600nl/min，梯度时间75min，B液(含有0.1％甲酸的80％乙腈溶液)比例从5％升至100％。离子源使用2.1KV电压和320℃温度。一级采用Orbi扫描，母离子扫描范围300–1400m/z，分辨率120,000(m/z 200),AGC 5e5，最大注入时间50ms。二级采用线性离子阱，碎裂能量32％。用LC-MS/MS(液相色谱-质谱/质谱联用)获得富集的内源转录因子及其复合物的谱图。

1.6.2、搜库和定量

利用生物信息学工具和方法将步骤1.6.1获得的谱图进行搜库。数据库搜索利用Maxquant搜索，分子量精度设为母离子20ppm，二级碎片离子0.5Da。检索数据库为HumanRefSeq蛋白质数据库(NCBI)。其中搜库过程是通过对质谱产出的数据中的母离子的二级谱图进行分析，在一定的质量偏差范围内对碎片离子的强度分布情况与理论强度进行对比，通过未超出质量偏差范围的碎片离子情况对母离子进行评分从而得到母离子(肽段)的鉴定结果。再将肽段与已知的蛋白质氨基酸序列库进行匹配，确定所检测到的肽段所属的蛋白信息，得到蛋白的鉴定结果。

将搜库确定的肽段进一步进行定量。定量的方法为非标定量方法。通过数据库搜索产生的肽段匹配图谱信息对原始数据中的一级谱图进行计算，得到所有肽段的一级定量结果的比值。批量计算的程序可使用已有的《基于高解析度质谱数据肽段交叉回归的蛋白丰度定量软件[简称：PQPCR]》V 1.0(中华人民共和国国家版权局计算机软件著作权登记书号：软著登字第0451332号，登记号2012SR083269，登记日期2012年09月04日，著作权人：北京蛋白质组研究中心)。

1.6.3、鉴定和定量结果

a)该实施例针对样本1(作为第一蛋白样本)的蛋白肽段得到约十万多张谱图，据此从过表达IKKB激酶的体系中富集到蛋白中有转录因子(TF)38种；其中与对照样本1(作为第二蛋白样本)中富集得到的TF的定量数据进行比较，筛选出10种TF(NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2)的定量数据在过表达体系和野生型表达体系中有显著差异，因此将以上10种TF确定为与IKKB激酶潜在互作的下游转录因子。如下表1所示，列出了过表达IKKB激酶的体系(第一蛋白样本)与野生型表达体系(第二蛋白样本)相比有显著差异的10个TF的定量数据，其中FOT是指Fraction of total，是该蛋白在整个鉴定结果中数据归一化的定量情况；BirA_WCE表示空白载体表达，IKKB_WCE表示IKKB激酶过表达载体表达。可见IKKB激酶过表达后其下游转录因子(NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2)的定量结果显著升高；图2以NFKB1、NFKB2、REL、RELA为例示出了与IKKB激酶互作的下游转录因子的显著富集情况，因此将这10种TF(NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2)确定为与IKKB激酶互作的下游转录因子。

表1：全细胞蛋白样本中IKKB激酶、及与IKKB激酶互作的各转录因子的定量数据

现有技术中已报道的与IKKB激酶互作的下游转录因子有NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3，而利用本发明的方法不仅可以确定出现有技术中已经被报道的与IKKB激酶互作的下游转录因子，还确定出另外四种未知的与IKKB激酶互作的下游转录因子(STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2)，可见本发明提供的方法可以更加全面确定出与IKKB激酶互作的下游转录因子，并且还提供了与IKKB激酶互作的下游转录因子的定量数据(如上表1所示)。

(2)与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的确定

利用上述步骤(1)中步骤1.4中获取的样本(第一蛋白样本和第二蛋白样本)进行纯化获取与IKKB激酶互作的下游转录因子的DNA结合序列，以获得该下游转录因子的motif。与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子经ChIP的交联作用(crosslink)结合(binding)至与其互补的DNA片段上，ChIP完成后经一系列操作纯化出该DNA片段并进行seq鉴定，从而获得该DNA片段的序列信息(即motif)及其丰度。具体操作如下：

1)洗脱磁珠并去交联：将上述(1)中步骤1.4中获取的样本的量的10％置于离心管A中，并向离心管A中加入200μL Elution Buffer(50mM Tris·HCl(PH8.0)、10mM EDTA、1％SDS)，50℃，振荡4h，边去交联边从磁珠上洗脱吸附蛋白。

2)纯化DNA：向离心管A中加入200μL TE Buffer(20mM Tris-Cl+2mM EDTA)和120μL 5×Protease K Buffer、30μL 20μg/μL的Protease K和10μL 50μg/μL的RNase A，降解蛋白和RNA，50℃放置5-6h，整个溶液作为DNA提取的样本溶液。

3)酚氯仿抽提DNA：

a)将样本溶液分装至400-500μL/管的离心管B，加入与样本溶液等体积的中性酚氯仿，上下颠倒混匀；

b)将离心管B在12000rpm离心15min，取上清转移至新的1.5mL离心管C；

c)向新的离心管C中加入与上清等体积的氯仿，上下颠倒混匀，12000rpm离心15min，取上清至新的1.5mL离心管D；

d)向离心管D中加入2.5倍上清体积的无水乙醇和1/10上清体积的醋酸钠(3M pH：5.2)，-20℃放置过夜或-80℃放置2h，然后在4℃、12000rpm离心10min，弃上清；沉淀即为富集的DNA；

e)向离心管D中加入1mL 75％乙醇洗涤DNA片段，在4℃、12000rpm离心10min，弃上清；洗2～3遍；

f)最后吸弃75％乙醇，离心管D置于超净台晾干后，加入30μl水4℃溶解过夜，作为测序用DNA样品；送北京诺禾致源科技股份有限公司进行测序。

4)构建测序文库以及对DNA片段信息进行文库比对和丰度检测(此步骤由北京诺禾致源科技股份有限公司进行操作)：

对步骤3)经ChIP富集的DNA样品(混合DNA片段)进行电泳割胶，回收150-300bp范围左右的所有DNA片段，然后对回收的各DNA 片段进行PCR扩增，上机测序，测得各DNA片段的序列。

将所有DNA片段的序列归集，比对到相关的参考基因组，构建起与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子结合DNA片段序列的测序文库。该文库包含所有与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子(参见上述(1)的结果)结合的DNA片段序列，即与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子的motif，因此可以对IKKB激酶过表达体系(第一蛋白样本)和野生型表达体系(第二蛋白样本)中的下游转录因子的DNA结合序列(即下游转录因子的motif)的丰度进行检测和比较，从中筛选出丰度具有显著差异的DNA结合序列作为与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列(motif)。

图3示例性示出了与IKKB激酶互作的下游转录因子NFKB2、RELA的motif的logo图，其中图3中A幅为NFKB2的motif的logo图，图3中B幅为RELA的motif的logo图。依据该图3，表明通过ChIP-seq的方法可以确定与IKKB激酶互作的下游转录因子(图3中只示例性列出了NFKB2和RELA的motif)的DNA结合序列，即其motif。

综上实施例1的结果可知，与IKKB激酶互作的下游转录因子的表达水平很低(例如表1中BirA_WCE_1至BirA_WCE_3所示)，因此，利用传统的方法很难对其进行富集、鉴定和定量，也就难以确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其结合序列。而本发明结合利用BioID和ChIP-Seq的方法能够实现细胞全蛋白中低表达的下游转录因子及与其交联的DNA结合序列的富集，因此可以同步对下游转录因子进行鉴定和定量，以及对下游转录因子的DNA结合序列进行测序、文库比对和丰度检测，实现对与目的蛋白(瞬时)互作的、弱的下游转录因子及其DNA结合序列的确定，并且本发明的方法检测范围更宽。

实施例2：药物刺激条件下确定与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子及其DNA结合序列

该实施例利用对与IKKB激酶相关的生物学通路(NF-κB经典通路)具有激活(促进更多的与IKKB激酶互作的下游转录因子磷酸化并入核，从而避免转录因子被降解)作用的药物TNFa对实施例1构建的IKKB激酶的过表达体系进行刺激，制备样本3(从经药物刺激后ChIP获取细胞全蛋白)和样本4(从经药物刺激后IKKB激酶过表达体系制备的核蛋白样本)，其中：

样本3(从经药物刺激后ChIP获取细胞全蛋白)的制备过程如下：

a)细胞固定(交联(crosslink))：取40ng/mL TNFa刺激15min、30min、60min培养的IKKB过表达稳转株Hela细胞(10cm细胞培养皿培养，细胞数量约10⁷个/皿)，向培养皿中加入9ml含终浓度1％甲醛的1×PBS，室温下置于水平摇床，轻摇10min；

b)终止交联：加入1mL 1.25M的甘氨酸使其终浓度为0.125M，室温下置于水平摇床，轻摇5min；

c)向培养皿中加入冷的1×PBS，用细胞刮收集细胞，4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀，用冷的1×PBS重悬细胞沉淀，再次4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀；

d)用ChIP细胞裂解液(50mM HEPES/KOH(PH7.5)、500mM NaCl、1％Triton X-100、0.1％脱氧胆酸纳、1mM EDTA、0.1％SDS，建议加入量为500μL/1-1.5×10⁷细胞)重悬细胞沉淀，冰上超声破碎，High挡，超声30s间歇30s，50个循环(实际总工作时间25min，初次超声不同样本需进行时间梯度预实验)；

f)14000rpm，4℃离心10min，弃沉淀，收上清，获得染色质免疫沉淀样本(Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)Sample)的细胞全蛋白，分装后用液氮速冻，于-80℃存储备用；制得样本3(作为第三蛋白样本或第四蛋白样本，也可作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本，其中用TNFa刺激15min制备的样本为样本3-1，用TNFa刺激30min制备的样本为样本3-2，用TNFa刺激60min制备的样本为样本3-3)，对照样本3为实施例1制备的样本1(作为第一蛋白样本或全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)。

样本4(从经药物刺激后IKKB激酶过表达体系制备的核蛋白样本)的制备过程如下：

a)向培养皿中加入胰蛋白酶(0.25％Trypsin-EDTA，购自Thermo Fisher)消化收集经40ng/mL TNFa刺激60min培养的IKKB激酶过表达稳转株Hela细胞(10cm细胞培养皿培养，细胞数量约10⁷个/皿)，4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀，用冷的1×PBS重悬细胞沉淀，再次4℃、1000rpm离心10min收集细胞沉淀；

c)用10倍沉淀体积的低渗溶液(10mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，10mMKCl，使用前加入1mM PMSF)重悬细胞沉淀，冰上放置30min后，4℃、3715g离心10min，弃上清；

d)用1/2沉淀体积的低盐溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，20mM KCl，0.2mM EDTA，25％Glycerol，使用前加入1mM PMSF)重悬细胞沉淀，立即涡旋震荡20s，冰上放置10min；

e)逐滴加入1/2细胞体积的高盐溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，1.5mM MgCl₂，1.2M KCl，0.2mM EDTA，25％glycerol，使用前加入1mM PMSF)，每加入一滴，立即涡旋震荡5s，之后再次加入，立即涡旋震荡5s，重复直至加完，4℃垂直混匀1h；

f)加入等体积BC0溶液(20mM Tris·HCl pH 7.3，0.2mM EDTA，20％glycerol，使用前加入1mM PMSF)，充分混匀，4℃、16000g离心40min，收集上清得到核蛋白，分装后用液氮速冻，于-80℃存储备用；制得样本4(作为核蛋白来源的第七蛋白样本)，对照样本为实施例1制备的样本2(作为核蛋白来源的第八蛋白样本)和对照样本2(从野生型表达体系制备的核蛋白样本)。

(1)与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子的确定

利用样本3(样本3-1、样本3-2或样本3-3，作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)和样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)按照实施例1中(1)的步骤1.4.4至步骤1.6的方法可以分别对样本3(作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)和样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)中的生物素化的蛋白进行富集、对富集的蛋白中的转录因子进行鉴定和定量，进而通过比较分别从样本3(作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)和样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)中获得的转录因子的定量数据，可以筛选出定量数据具有显著差异的转录因子作为与IKKB激酶互作的下游转录因子。结果表明，利用样本3(作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)和样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)也可以筛选确定出10种TF(NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2)为与IKKB激酶互作的下游转录因子，结果同实施例1。另外，也可以利用样本3(作为第三蛋白样本)和样本1(作为第一蛋白样本)获得的结果对实施例1中由样本1(作为第一蛋白样本)和对照样本1(作为第二蛋白样本)确定的结果进行验证确认。

另一方面，由于使用对与IKKB激酶相关的生物学通路(NF-κB经典通路)具有激活作用的药物(TNFa)进行刺激后，信号经级联反应传导至IKKB激酶，激活包括与IKKB激酶互作的下游转录因子在内的底物发生磷酸化，发生磷酸化的转录因子入核，避免被降解(而不入核的转录因子会被降解)，因此相对于未经过药物刺激的IKKB激酶的过表达体系，可以使得经药物刺激后的过表达体系中与IKKB激酶互作的下游转录因子进一步被显著富集。这种显著富集可以通过对全细胞蛋白样本(例如样本3，作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)中的与IKKB激酶互作的下游转录因子进行定量来体现，也可以通过对核蛋白样本(例如样本4，作为核蛋白来源的第七蛋白样本)中的与IKKB激酶互作的下游转录因子进行定量来体现，即利用核蛋白来源的样本4(作为核蛋白来源的第七蛋白样本)及其对照样本(实施例1制备的样本2，作为核蛋白来源的第八蛋白样本)按照实施例1中(1)的步骤1.4.4至步骤1.6的方法也可以筛选并确定出与IKKB激酶互作的下游转录因子。

如下表2所示，示例性示出了实施例1中确定的与IKKB激酶互作的下游转录因子NFKB1、NFKB2和RELA在核蛋白样本中的定量数据，其中NE_BirA1至NE_BirA3为对照样本2(野生型表达体系表达的核蛋白样本)中的定量数据，NE_I0_1至NE_I0_3为样本2(作为核蛋白来源的第八蛋白样本)中的定量数据，NE_IT60_1至NE_IT60_3为样本4(作为核蛋白来源的第七蛋白样本)中的定量数据。根据表2的结果可见，经过药物刺激后，确实富集并鉴定到了更高量的下游转录因子，也即是经过药物刺激后，会有更多的与目的蛋白互作的下游转录因子入核而避免被降解，从而可以被进一步显著富集。由于全细胞蛋白样本中也包括核蛋白样本，因此利用核蛋白样本验证的经药物刺激后的下游转录因子的显著富集情况也可以反映经药物刺激后的全细胞蛋白样本中的下游转录因子的显著富集情况。该实施例中利用样本4(作为核蛋白来源的第七蛋白样本)和样本2(作为核蛋白来源的第八蛋白样本)也筛选并确定出10种TF(NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2)为与IKKB激酶互作的下游转录因子，结果同实施例1。

表2：与IKKB激酶互作的下游转录因子NFKB1、NFKB2、RELA的定量数据

(2)与IKKB激酶互作的Hela细胞内下游转录因子的DNA结合序列的确定

利用样本3(样本3-1、样本3-2或样本3-3，作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)和样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)按照实施例1中(2)的步骤1)至4)的方法可以分别对样本3(作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)和样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)中的与生物素化蛋白结合的DNA片段进行富集、测序、文库比对和丰度检测，因此可以直观比较经药物刺激IKKB激酶的过表达体系后制备的样本3(作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)中和未经药物刺激IKKB激酶的过表达体系制备的样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)中富集到的DNA片段的丰度变化情况，并以此从中筛选出丰度具有显著变化的DNA片段作为与IKKB激酶互作的下游转录因子的DNA结合序列。因此利用样本3(作为全细胞蛋白来源的第七蛋白样本)和样本1(作为全细胞蛋白来源的第八蛋白样本)可以直接筛选并确定出与IKKB激酶互作的下游转录因子的DNA结合序列。另外，也可以利用样本3(作为第四蛋白样本)和样本1(作为第一蛋白样本)获得的结果对实施例1中由样本1(作为第一蛋白样本)和对照样本1(作为第二蛋白样本)确定的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的结果进行验证确认，因此可以提高本发明方法所确定的结果的可靠性。

如图4所示，为实施例1中已经确定的与IKKB激酶互作的下游转录因子RELA和NFKB2交联的DNA片段(即motif)在从经40ng/mL TNFa刺激IKKB激酶的过表达体系0min至60min所制备的样本3(0min、15min、30min、60min对应样本分别为对照样本3、样本3-1、样本3-2和样本3-3)中的丰度波动情况，其中A幅表示RELA的motif随刺激时间的丰度变化情况，B幅表示NFKB2的motif随刺激时间的丰度变化情况(图中不同的峰表示含有motif的超声断裂片段)，可见随着刺激时间的延长，下游转录因子的motif的丰度显著提高，由此可以推导出与IKKB激酶互作的下游转录因子的DNA结合序列(即motif)。

另一方面，由以上表2所列数据可知，从经药物刺激后的过表达体系制备的核蛋白来源的样本4(作为核蛋白来源的第七蛋白样本)中会富集到更高定量数据的与IKKB激酶互作的下游转录因子，同样，也可以富集到更高丰度的与IKKB激酶互作的下游转录因子的DNA结合序列，因此利用样本4(作为核蛋白来源的第七蛋白样本)及其对照样本(实施例1制备的样本2，作为核蛋白来源的第八蛋白样本)也可以直接筛选并确定出与IKKB激酶互作的下游转录因子的DNA结合序列。

另外，还可以利用样本4(作为核蛋白来源的第七蛋白样本)及其对照样本(实施例1制备的样本2，作为核蛋白来源的第八蛋白样本)直接筛选并确定出的与IKKB激酶互作的下游转录因子及其DNA结合序列的结果对实施例1中根据样本1(作为第一蛋白样本)和对照样本1(作为第二蛋白样本)确定的与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的结果进行比较确认，因此可以提高本发明方法所确定的结果的可靠性。

实施例3：应用

综上实施例的结果，可见由本发明提供的方法确定的与IKKB激酶互作的下游转录因子(NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1、TFCP2)与IKKB激酶相关的生物学通路(NF-κB经典通路)相关，因此这些转录因子可以用于制备作用于与IKKB激酶相关的生物学通路的生物制剂。由此本发明提供的方法还可以对经药物(例如对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物)刺激后下游转录因子及其DNA结合序列的变化情况进行监测(例如表2和图4所示)，因此本发明方法还可以为科学研究(例如阐述特异转录因子对靶基因的转录调控)、药物筛选等提供依据，其中药物可以是对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活(使更多的目的蛋白以及与目的蛋白互作的下游转录因子发生磷酸化并入核)或抑制(抑制目的蛋白以及与目的蛋白互作的下游转录因子发生磷酸化，减少下游转录因子的入核，导致下游转录因子更多降解)作用的药物。其中筛选对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物的方法在本发明提供的确定与目的蛋白互作的下游转录因子的方法基础上还包括以下步骤：

M1)利用候选药物对过表达目的蛋白(例如IKKB激酶)的过表达体系进行刺激(例如利用TNFa刺激IKKB激酶过表达的Hela稳转株细胞)，表达获得刺激后的目的蛋白；

M2)利用经候选药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第五蛋白样本；

M3)使用链霉亲和素磁珠富集第五蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第五样本；

M4)使用LC-MS/MS对第五样本中的蛋白中的由本发明提供的方法(例如实施例1中的(1)或实施例2中的(1))确定的与目的蛋白互作的下游转录因子进行定量，并与全细胞蛋白来源的样本1(此时第五样本也为全细胞蛋白来源)或核蛋白来源的样本2(此时第五样本也为核蛋白来源)中的蛋白中的与目的蛋白互作的下游转录因子的定量数据进行比较与判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响。

在此基础上，还可以进一步包括由以下M11)和M12)组成的验证步骤：

M11)对富集到的第五样本中的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

M12)将第五样本中的由本发明的方法(例如实施例1中的(2)或实施例2中的(2))确定的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度与全细胞蛋白来源的样本1(此时第五样本也为全细胞蛋白来源)或核蛋白来源的样本2(此时第五样本也为核蛋白来源)中的DNA结合序列的丰度进行比较和判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则进一步确认该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则进一步确认该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则进一步确认该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响。

M4)和M12)判断一致时确定该候选药物是否对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用。

另外，还可以直接通过监测经候选药物对过表达目的蛋白的过表达体系刺激后的全细胞蛋白样本中的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列(motif)的丰度波动情况监测，以判断该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路的激活或抑制情况，具体包括以下步骤：

N1)利用候选药物对过表达目的蛋白的过表达体系进行刺激，表达获得刺激后的目的蛋白；

N2)利用经候选药物刺激后的目的蛋白进行生物素化处理和ChIP交联制备第六蛋白样本；

N3)使用链霉亲和素磁珠富集第六蛋白样本中与生物素化的蛋白交联的DNA片段，作为第六样本；

N4)对所述第六样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

N5)将第六样本中的由本发明的方法(例如实施例1中的(1)或实施例2中的(2))确定的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列(motif)的丰度与全细胞蛋白来源的样本1(此时第六样本也为全细胞蛋白来源)或核蛋白来源的样本2(此时第六样本也为核蛋白来源)中的DNA结合序列的丰度进行比较和判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的非疾病诊断治疗方法，包括富集、鉴定、定量和筛选的过程，具体包括以下步骤：

1）利用过表达体系过表达目的蛋白，和野生型表达所述目的蛋白；

2）利用过表达的目的蛋白进行BioID生物素化处理和ChIP交联制备第一蛋白样本，利用野生型表达的目的蛋白进行BioID生物素化处理和ChIP交联制备第二蛋白样本；

3）使用链霉亲和素磁珠富集第一蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第一样本；使用链霉亲和素磁珠富集第二蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第二样本；

4）使用LC-MS/MS分别对步骤3）的第一样本和第二样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；

5）比较步骤4）中获得的第一样本中的转录因子和第二样本中的转录因子的定量数据，从中筛选出定量数据具有显著差异的转录因子作为与目的蛋白互作的下游转录因子；

6）分别对步骤3）的第一样本和第二样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

7）比较步骤6）中获得的第一样本和第二样本中的DNA片段的丰度，从中筛选出丰度具有显著差异的DNA片段作为步骤5）中筛选出的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括由以下T1）-T5）组成的第一验证步骤：

T1）利用药物刺激所述过表达体系，表达获得经药物刺激后的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；

T2）利用经药物刺激后的目的蛋白进行BioID生物素化处理和ChIP交联制备第三蛋白样本；

T3）使用链霉亲和素磁珠富集第三蛋白样本中生物素化的蛋白，作为第三样本；

T4）使用LC-MS/MS对第三样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；

T5）从步骤T4）中获得的第三样本中的转录因子中选取由步骤5）筛选出的下游转录因子，将其定量数据与步骤4）中获得的第一样本中的转录因子的定量数据比较，定量数据具有显著差异的转录因子经验证确定为与目的蛋白互作的下游转录因子。

3.根据权利要求1所述的方法，还包括由以下S1）-S5）组成的第二验证步骤：

S1）利用药物刺激所述过表达体系，表达获得经药物刺激后的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；

S2）利用经药物刺激后的目的蛋白进行BioID生物素化处理和ChIP交联制备第四蛋白样本；

S3）使用链霉亲和素磁珠富集第四蛋白样本中与生物素化的蛋白交联的DNA片段，作为第四样本；

S4）对所述第四样本中的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

S5）从步骤S4）中获得的第四样本中的DNA片段中选取由步骤7）筛选出的DNA结合序列，将其丰度与步骤6）中获得的第一样本中的DNA片段的丰度比较，丰度具有显著差异的DNA片段经验证确定为与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，所述第一蛋白样本、第二蛋白样本、第三蛋白样本和第四蛋白样本来源于全细胞蛋白。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白为IKKB激酶；与IKKB激酶互作的下游转录因子为NFKB1、NFKB2、REL、RELA、STAT1、STAT3、STAT5B、CSDE1、NR3C1和TFCP2。

6.一种确定与目的蛋白互作的下游转录因子及其DNA结合序列的非疾病诊断治疗方法，包括富集、鉴定、定量和筛选的过程，具体包括以下步骤：

P1）利用药物刺激过表达体系表达获得经药物刺激后的目的蛋白，利用未经药物刺激过表达体系表达获得未经药物刺激的目的蛋白；所述药物对与所述目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用；

P2）利用P1）的经药物刺激后的目的蛋白和未经药物刺激的目的蛋白分别进行BioID生物素化处理和ChIP交联制备第七蛋白样本和第八蛋白样本；

P3）使用链霉亲和素磁珠富集第七蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第七样本；使用链霉亲和素磁珠富集第八蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第八样本；

P4）使用LC-MS/MS分别对步骤P3）的第七样本和第八样本中的生物素化的蛋白进行转录因子的鉴定和定量；

P5）比较步骤P4）中获得的第七样本中的转录因子和第八样本中的转录因子的定量数据，从中筛选出定量数据具有显著差异的转录因子作为与目的蛋白互作的下游转录因子；

P6）分别对步骤P3）的第七样本和第八样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

P7）比较步骤P6）中获得的第七样本和第八样本中的DNA片段的丰度，从中筛选出丰度具有显著差异的DNA片段作为步骤P5）中筛选出的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列；

其中所述第七蛋白样本和第八蛋白样本来源于核蛋白或全细胞蛋白。

7.一种筛选对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物的非疾病诊断治疗方法，包括以下步骤：

M1）利用候选药物对过表达目的蛋白的过表达体系进行刺激，表达获得刺激后的目的蛋白；

M2）利用经候选药物刺激后的目的蛋白进行BioID生物素化处理和ChIP交联制备第五蛋白样本；M3）使用链霉亲和素磁珠富集第五蛋白样本中生物素化的蛋白及与其交联的DNA片段，作为第五样本；

M4）使用LC-MS/MS对所述第五样本中由权利要求1-6中任一项所述的方法确定的与目的蛋白互作的下游转录因子进行定量，并与权利要求6所述的方法中的第八样本中的与目的蛋白互作的下游转录因子的定量数据进行比较与判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响。

8.根据权利要求7所述的方法，其还包括由以下M11）和M12）组成的第三验证步骤：

M11）对所述第五样本中的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

M12）将所述第五样本中的由权利要求1-6中任一项所述的方法确定的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度与权利要求6所述的方法中的第八样本中的DNA结合序列的丰度进行比较和判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响；

M4）和M12）判断一致时确定该候选药物是否对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用。

9.一种筛选对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活或抑制作用的药物的非疾病诊断治疗方法，包括以下步骤：

N1）利用候选药物对过表达目的蛋白的过表达体系进行刺激，表达获得刺激后的目的蛋白；

N2）利用经候选药物刺激后的目的蛋白进行BioID生物素化处理和ChIP交联制备第六蛋白样本；

N3）使用链霉亲和素磁珠富集第六蛋白样本中与生物素化的蛋白交联的DNA片段，作为第六样本；

N4）对所述第六样本中的与生物素化的蛋白交联的DNA片段进行测序、文库比对和丰度检测；

N5）将所述第六样本中的由权利要求1-6中任一项所述的方法确定的与目的蛋白互作的下游转录因子的DNA结合序列的丰度与权利要求6所述的方法中的第八样本中的DNA结合序列的丰度进行比较和判断，判断标准为：

若前者数据显著高于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有激活作用；

若前者数据显著低于后者，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路具有抑制作用；

若两者数据无显著差异，则该候选药物对与目的蛋白相关的生物学通路没有影响。

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