CN106442833A - 一种非同位素标记肽段加入法结合mrm的蛋白质定量方法 - Google Patents

一种非同位素标记肽段加入法结合mrm的蛋白质定量方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非同位素标记肽段加入法结合质谱多反应监测技术(MRM)的蛋白质定量方法，包括以下步骤：S1：MRM‑MS方法的建立与优化；首先通过UNIPROT数据库获取蛋白的全部序列，然后通过Skyline软件建立和优化MRM质谱监测的肽段和监测方法；S2：非同位素标记肽段加入法结合MRM技术的绝对定量新方法建立；(1)标准肽段标准溶液制备：合成选好的标准肽段，将蛋白的标准肽段干粉用30‑35％的乙腈、0.1‑0.5％的甲酸和70‑75％的水溶液溶解配置成为100‑110pmol/L的储备液；(2)血清样本制备：用Agilent亲和小柱去除高丰度蛋白；(3)配置适量浓度的标准肽段标准溶液和内标多肽，加入血清样品中，用MRM‑MS的方法进行检测并使用标准外推法计算蛋白含量。

Description

一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法
技术领域
本发明涉及蛋白质绝对定量技术领域，尤其涉及一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法。
背景技术
规模化的蛋白质定量技术主要分为四大类：(1)基于双向电泳光密度的定量；(2)基于稳定同位素标记与质谱分析的定量；(3)基于质谱分析的无标记定量；(4)基于免疫印迹和蛋白质芯片的定量，近年来质谱多反应监测技术正逐步受到蛋白质组学研究者们关注，成为定量蛋白质组学研究中的重要技术。
但现有技术中，相对定量分析只能比较各组蛋白质之间量的变化，无法确定其真正的蛋白浓度，传统的蛋白质绝对定量最常用酶联免疫吸附剂测定其抗体的种类有限且价格昂贵，并非所有蛋白都能进行定量，而且该方法每次只能对一个蛋白进行定量，难以适应蛋白质组学高通量分析的要求，同位素标记法与MRM技术相结合的蛋白质绝对定量需要合成昂贵的同位素标记肽段，应用前提是被选择作为内标肽段模板的肽段是唯一肽段，且目标蛋白的酶解要充分，对于多个的蛋白标记物验证需要合成多个标记肽段，其费用也相对较高。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法。
本发明提出的一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法，包括以下步骤：
S1：MRM-MS方法的建立与优化；首先通过UNIPROT数据库获取蛋白的全部序列，然后通过Skyline软件建立和优化MRM质谱方法；
S2：非同位素标记肽段加入法结合MRM技术的绝对定量新方法建立；(1)标准肽段标准溶液制备：将蛋白的标准肽段干粉用十万分之一电子天平精密称量，然后用30-35％的乙腈、0.1-0.5％的甲酸和70-75％的水溶液溶解配置成为100-110pmol/L的储备液；(2)血清样本制备：首先取血清10-15μL，然后加入190-200μL的AgilentBuffeA，混匀，接着将其置于超滤管中，离心10-15min，将滤液加入至Hu-7HC小柱上，离心30-40s，收集滤液，再加入Agilent BuffeA，离心1-1.5min，收集滤液，计算滤液体积，合并后的滤液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后根据测得溶液的蛋白浓度吸取50-60μg的蛋白溶液，置于超滤管中，离心15-20min，接着加入200-210μL的Urea和100-110μL的DTT，在37-42℃下于混匀仪中搅拌60-70min，接着加入20-25μL的IAA，暗反应30-35min，离心10-15min，滤去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37-42℃下酶切过夜，离心10-15min后冻干；3)分析方法验证；定量标准曲线：首先配制混合标准肽段血清样品溶液：取10-15pmol/μL的混合同位素标记肽段储备液和10-15pmol/μL的混合非标记肽段储备液等体积混合，然后用流动相A稀释成标准肽段水溶液，接着加入等体积的1-3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分别配成标准肽段血清样品溶液，在标准肽段血清样品溶液中分别加入100-110fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，然后用建立的MRM-MS方法进行测定；方法精密度：分别配制1-5、10-15和50-55fmol/μL的低中高三种浓度的混合标准肽段血清样品溶液，然后分别加入50-55fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，用建立的MRM-MS方法进行测定，用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度，用外推法血清中标准多肽的浓度，并计算各浓度值的RSD值，考察方法的定量精密度；(4)用建立的MRM-MS方法对各样品进行液相色谱分离和质谱分析,每份样品均加入三种不同浓度的标准多肽和内标多肽β半乳糖苷酶酶切产物，加入的标准多肽浓度为样品浓度的1、2、4倍。用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度。以测出的各标准多肽浓度汇制一条曲线，曲线外推至横轴所得浓度即为样本浓度。
优选地，所述S1中，通过Skyline软件建立和优化MRM质谱方法的步骤为：(1)多肽选择初步建立MRM质谱方法；(2)离子对选择；(3)碰撞能量CE选择；(4)DP选择；(5)结合建立优化后的MRM质谱方法，并验证之。
优选地，所述S2中，(1)标准肽段标准溶液制备：将蛋白的标准肽段干粉用十万分之一电子天平精密称量，然后用31-34％的乙腈、0.2-0.4％的甲酸和71-74％的水溶液溶解配置成为101-109pmol/L的储备液。
优选地，所述S2中，(2)血清样本制备：首先取血清11-14μL，然后加入191-199μL的Agilent BuffeA，混匀，接着将其置于超滤管中，离心11-14min，将滤液加入至Hu-7HC小柱上，离心31-39s，收集滤液，再加入Agilent BuffeA，离心1.1-1.4min，收集滤液，计算滤液体积，合并后的滤液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后根据测得溶液的蛋白浓度吸取51-59μg的蛋白溶液，置于超滤管中，离心16-19min，接着加入201-209μL的Urea和101-109μL的DTT，在38-41℃下于混匀仪中搅拌61-69min，接着加入21-24μL的IAA，暗反应31-34min，离心11-14min，滤去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在38-41℃下酶切过夜，离心11-14min后冻干。
本发明中，该非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法能够利用高灵敏度质谱进行目标蛋白的特异性选择而不需进行特异性抗体的合成，简便、经济、选择性好、准确度高，能有效地去除基质的干扰。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例一
本实施例提出的一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法，包括以下步骤：
S1：MRM-MS方法的建立与优化；首先通过UNIPROT数据库获取蛋白的全部序列，然后通过Skyline软件建立和优化MRM质谱方法；
S2：非同位素标记肽段加入法结合MRM技术的绝对定量新方法建立；(1)标准肽段标准溶液制备：将蛋白的标准肽段干粉用十万分之一电子天平精密称量，然后用30％的乙腈、0.1％的甲酸和70％的水溶液溶解配置成为100pmol/L的储备液；(2)血清样本制备：首先取血清10μL，然后加入190μL的Agilent BuffeA，混匀，接着将其置于超滤管中，离心10min，将滤液加入至Hu-7HC小柱上，离心30s，收集滤液，再加入Agilent BuffeA，离心1min，收集滤液，计算滤液体积，合并后的滤液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后根据测得溶液的蛋白浓度吸取50μg的蛋白溶液，置于超滤管中，离心15min，接着加入200μL的Urea和100μL的DTT，在37℃下于混匀仪中搅拌60min，接着加入20μL的IAA，暗反应30min，离心10min，滤去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37℃下酶切过夜，离心10min后冻干；(3)进行液相色谱分离和质谱分析；(4)分析方法验证；定量标准曲线：首先配制混合标准肽段血清样品溶液：取10pmol/μL的混合同位素标记肽段储备液和10pmol/μL的混合非标记肽段储备液等体积混合，然后用流动相A稀释成标准肽段水溶液，接着加入等体积的1μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分别配成标准肽段血清样品溶液，在标准肽段血清样品溶液中分别加入100fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，然后用建立的MRM-MS方法进行测定；方法精密度：分别配制1、10和50fmol/μL的低中高三种浓度的混合标准肽段血清样品溶液，然后分别加入50fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，用建立的MRM-MS方法进行测定，计算各浓度值的RSD值，考察方法的定量精密度。
实施例二
本实施例提出的一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法，包括以下步骤：
S1：MRM-MS方法的建立与优化；首先通过UNIPROT数据库获取蛋白的全部序列，然后通过Skyline软件建立和优化MRM质谱方法；
S2：非同位素标记肽段加入法结合MRM技术的绝对定量新方法建立；(1)标准肽段标准溶液制备：将蛋白的标准肽段干粉用十万分之一电子天平精密称量，然后用35％的乙腈、0.5％的甲酸和75％的水溶液溶解配置成为110pmol/L的储备液；(2)血清样本制备：首先取血清15μL，然后加入200μL的Agilent BuffeA，混匀，接着将其置于超滤管中，离心15min，将滤液加入至Hu-7HC小柱上，离心40s，收集滤液，再加入Agilent BuffeA，离心1.5min，收集滤液，计算滤液体积，合并后的滤液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后根据测得溶液的蛋白浓度吸取60μg的蛋白溶液，置于超滤管中，离心20min，接着加入210μL的Urea和110μL的DTT，在42℃下于混匀仪中搅拌70min，接着加入25μL的IAA，暗反应35min，离心15min，滤去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在42℃下酶切过夜，离心15min后冻干；(3)进行液相色谱分离和质谱分析；(4)分析方法验证；定量标准曲线：首先配制混合标准肽段血清样品溶液：取15pmol/μL的混合同位素标记肽段储备液和15pmol/μL的混合非标记肽段储备液等体积混合，然后用流动相A稀释成标准肽段水溶液，接着加入等体积的3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分别配成标准肽段血清样品溶液，在标准肽段血清样品溶液中分别加入110fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，然后用建立的MRM-MS方法进行测定；方法精密度：分别配制5、15和55fmol/μL的低中高三种浓度的混合标准肽段血清样品溶液，然后分别加入55fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，用建立的MRM-MS方法进行测定，用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度，用外推法血清中标准多肽的浓度，并计算各浓度值的RSD值，考察方法的定量精密度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种非同位素标记肽段加入法结合质谱多反应监测技术(MRM)的蛋白质定量方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：MRM-MS方法的建立与优化；首先通过UNIPROT数据库获取蛋白的全部序列，然后通过Skyline软件建立和优化MRM质谱监测的肽段和监测方法；
S2：非同位素标记肽段加入法结合MRM技术的绝对定量新方法建立；(1)标准肽段标准溶液制备：合成选好的标准肽段，将蛋白的标准肽段干粉用十万分之一电子天平精密称量，然后用30-35％的乙腈、0.1-0.5％的甲酸和70-75％的水溶液溶解配置成为100-110pmol/L的储备液；(2)血清样本制备：首先取血清10-15μL，然后加入190-200μL的Agilent BuffeA，混匀，接着将其置于超滤管中，离心10-15min，将滤液加入至Hu-7HC小柱上，离心30-40s，收集滤液，再加入Agilent BuffeA，离心1-1.5min，收集滤液，计算滤液体积，合并后的滤液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后根据测得溶液的蛋白浓度吸取50-60μg的蛋白溶液，置于超滤管中，离心15-20min，接着加入200-210μL的Urea和100-110μL的DTT，在37-42℃下于混匀仪中搅拌60-70min，接着加入20-25μL的IAA，暗反应30-35min，离心10-15min，滤去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37-42℃下酶切过夜，离心10-15min后冻干；3)分析方法验证；定量标准曲线：首先配制混合标准肽段血清样品溶液：取10-15pmol/μL的混合非标记肽段储备液等体积混合，然后用流动相A稀释成系列标准肽段水溶液(2.5、5、10、20、50、100fmol/μL)，接着加入等体积的1-3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分别配成标准肽段血清样品溶液，在标准肽段血清样品溶液中分别加入50-55fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，然后用建立的MRM-MS方法进行测定，用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度；方法精密度：分别配制1-5、10-15和50-55fmol/μL的低中高三种浓度的混合标准肽段血清样品溶液，然后分别加入50-55fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，用建立的MRM-MS方法进行测定，用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度，用外推法血清中标准多肽的浓度，并计算各浓度值的RSD值，考察方法的定量精密度。(4)用建立的MRM-MS方法对各样品进行液相色谱分离和质谱分析,每份样品均加入三种不同浓度的标准多肽和内标多肽β半乳糖苷酶酶切产物，加入的标准多肽浓度为样品浓度的1、2、4倍。用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度。以测出的各标准多肽浓度汇制一条曲线，曲线外推至横轴所得浓度即为样本浓度。
2.根据权利要求1所述的一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法，其特征在于，所述S1中，通过Skyline软件建立和优化MRM质谱方法的步骤为：(1)多肽选择初步建立MRM质谱方法；(2)离子对选择；(3)碰撞能量CE选择；(4)DP选择；(5)结合建立优化后的MRM质谱方法，并验证之。
3.根据权利要求1所述的一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法，其特征在于，所述S2中，(1)标准肽段标准溶液制备：将蛋白的标准肽段干粉用十万分之一电子天平精密称量，然后用31-34％的乙腈、0.2-0.4％的甲酸和71-74％的水溶液溶解配置成为101-109pmol/L的储备液。
4.根据权利要求1所述的一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法，其特征在于，所述S2中，(2)血清样本制备：首先取血清11-14μL，然后加入191-199μL的Agilent BuffeA，混匀，接着将其置于超滤管中，离心11-14min，将滤液加入至Hu-7HC小柱上，离心31-39s，收集滤液，再加入Agilent BuffeA，离心1.1-1.4min，收集滤液，计算滤液体积，合并后的滤液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后根据测得溶液的蛋白浓度吸取51-59μg的蛋白溶液，置于超滤管中，离心16-19min，接着加入201-209μL的Urea和101-109μL的DTT，在38-41℃下于混匀仪中搅拌61-69min，接着加入21-24μL的IAA，暗反应31-34min，离心11-14min，滤去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在38-41℃下酶切过夜，离心11-14min后冻干。
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