CN113125594B - 一种肽链水解试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肽链水解试剂及其制备方法和应用,设计了一种肽链水解试剂及其制备方法,可以用于标记和水解多肽或氨基酸;并公开了上述肽链水解试剂在氨基酸检测方法的应用,具体为:利用肽链水解试剂水解多肽或蛋白质;旋蒸,再用水溶解并将pH调至中性;加入金属螯合剂后,离心,取上清液,得到上清液的总离子质量色谱图;提取离子峰得到选择离子质量色谱图,根据水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性建立关系式,得到比值;分别获得多肽或蛋白质中谷氨酸和天冬氨酸的总含量,根据比值即可计算出实际含量;优点在于可以对多肽或蛋白质中的谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸这4种氨基酸进行准确定量,偏差小于10%。

Description

一种肽链水解试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于氨基酸检测领域,尤其是涉及一种肽链水解试剂及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质在人体代谢中扮演着重要的角色,蛋白质的定量测定在食品,医学和生物学中具有重要的意义。氨基酸是既含氨基(-NH2)又含羧基(-COOH)的有机化合物的统称,是蛋白质或多肽水解的产物,蛋白质中的氨基酸进行定性定量分析也是蛋白质结构分析的基础。
目前蛋白质中氨基酸分析方法主要有酸水解法,碱水解法和酶法。酸水解法会造成谷氨酰胺和天冬酰胺的分解,色氨酸也会被破坏;碱性水解一般采用NaOH、KOH等强碱,但在该水解条件下谷氨酰胺,天冬酰胺,苏氨酸,丝氨酸,精氨酸和半胱氨酸均遭到破坏(龚天理,刘付芳,王卫,等.食品中氨基酸测试的发展[J].中国标准化,2018(S1):156-159.);酶水解氨基酸水解往往不彻底,反应时间长,而且引入干扰。
现行的氨基酸检测方法GB5009.124-2016采用酸水解法,规定了茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪进行食品中氨基酸的测定:将食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸,经离子交换柱分离后,与茚三酮溶液产生颜色反应,再通过可见分光光度检测器测定氨基酸的含量;但是利用酸水解法处理多肽时,谷氨酰胺和天冬酰胺,这两种具有重要营养价值和生理功能的氨基酸,会分别水解成谷氨酸(如附图1(a)所示)和天冬氨酸(如附图1(b)所示),造成所测得的天冬氨酸和谷氨酸的实验结果有一部分是来源于天冬酰胺和谷氨酰胺,因此无法准确检测到样品中原有的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸这四种氨基酸的真实含量,同时色氨酸在酸性条件下会被破坏,因此现行的国标法只能测定包括丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等15种氨基酸,不能同时对含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白质进行检测,因此不适用于含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白质的样品的检测。
发明内容
本发明提供了一种肽链水解试剂、制备方法及将该肽链水解试剂用于氨基酸检测方法的应用,通过制备一种新型的肽链水解试剂,将肽链水解的同时对水解产物氨基酸进行O18同位素标记,再利用液相色谱-高分辨质谱联用下水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性,可以对多肽或蛋白质样品中的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸进行检测,实现了对多种氨基酸的同时测定和准确定量。
为解决上述的技术问题,本发明采用的技术方案为:
一种肽链水解试剂,由以下物质组成:盐酸二氧六环溶液、重氧水和二价金属氯化物溶液;其中,所述盐酸二氧六环溶液、所述重氧水和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(2~4):(35~40):(0.005~0.012),所述的肽链水解试剂中的肽链含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸4种氨基酸中的一种或多种。
所述盐酸二氧六环溶液中的盐酸的浓度为1.7~2.2mol/L。
所述二价金属氯化物溶液中的所述二价金属离子可选自Mg2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Zn2 +、Cd2+、Cu2+、Pb2+、Ba2+、Sr2+、Fe2+或Sn2+
一种肽链水解试剂的制备方法,包括:
a)将盐酸二氧六环溶液和重氧水混匀,所述盐酸二氧六环溶液和所述重氧水的摩尔比为(2~4):(35~40),得到二氧六环盐酸重氧水溶液;
b)在步骤a)中的所述二氧六环盐酸重氧水溶液中加入二价金属氯化物溶液,所述重氧水溶液和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(35~40):(0.005~0.012),得到肽链水解试剂。
所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用,具体方法为:
1)称取多肽或蛋白质样品,加入所述肽链水解试剂,冷冻、抽真空、充入惰性气体后进行加热水解;
2)充分水解后,旋蒸除去溶剂,再用水溶解并将溶液的pH调至6.5~7.5;
3)加入金属螯合剂除去二价金属氯化物中的二价金属离子,离心,得到上清液;
4)对步骤3)的所述上清液进行液相色谱-高分辨质谱分析,得到所述上清液的总离子质量色谱图;
5)提取步骤4)的所述总离子质量色谱图中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸水解产物的选择离子质量色谱图,根据所述水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性建立关系式,由所述关系式得到多肽或蛋白质样品中谷氨酰胺和谷氨酸的比值、天冬酰胺和天冬氨酸的比值;
6)分别获得多肽或蛋白质样品中谷氨酸和天冬氨酸的总含量,根据步骤5)得到的所述比值,即可分别计算出多肽或蛋白质样品中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸的实际含量。
步骤1)的所述水解的温度为110℃,所述水解的时间为8~24h。
步骤3)的所述金属螯合剂与所述二价金属离子的质量比为12~24:1。
步骤5)为配制除谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸外的各个待测氨基酸的不同浓度的混合标准溶液,得到所述混合标准溶液总离子质量色谱图,提取所述混合标准溶液总离子质量色谱图中的所述各个待测氨基酸的选择离子质量色谱图,得到所述各个待测氨基酸的不同浓度对应的峰面积,分别建立所述各个待测氨基酸的峰面积与浓度的标准曲线,得到所述待测氨基酸的峰面积与浓度的线性关系式;
测量多肽或蛋白质样品的总离子质量色谱图,根据多肽或蛋白质样品的总离子质量色谱图相对应的混合标准溶液的总离子质量色谱图的色谱峰位置,获得多肽或蛋白质样品中的待测氨基酸相对应的峰面积,代入相应的所述待测氨基酸的线性关系式,得到多肽或蛋白质样品中的待测氨基酸的实际含量。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明针对谷胺酰胺和天冬酰胺在强酸条件下水解为谷氨酸和天冬氨酸而导致无法对多肽和蛋白质样品中这4种氨基酸准确检测的情况,设计了一种新型的肽链水解试剂,通过制备具有特定的摩尔比的试剂,可以用于水解多肽或蛋白质,同时对水解产物氨基酸进行标记,加入特定比例的二价金属氯化物溶液更增加了水解反应的特异性,便于后续的检测分离。
本发明利用设计的新型肽链水解试剂,通过液相色谱-高分辨质谱联用的方法,根据反应液中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸水解后产生的水解产物的重氧水同位素二级碎片离子不相等的特性,可以将谷胺酰胺和天冬酰胺水解产生的O18谷氨酸和O18天冬氨酸,与原有的天冬氨酸和谷氨酸区别开来,同等摩尔质量的谷氨酰胺和天冬酰胺分别生成同等摩尔质量的O18谷氨酸和O18天冬氨酸,谷氨酰胺和天冬酰胺在肽段中的位置不同使得生成的谷氨酸和天冬氨酸的O18的个数不同,从而实现对谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸4种氨基酸的准确定量,偏差小于10%。
本发明还可对各种多肽和蛋白质样品中的多种氨基酸进行检测,尤其适用于含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽和蛋白质样品。
附图说明
图1(a)为本发明中天冬酰胺在酸解条件下水解成天冬氨酸的化学反应方程式;
图1(b)为本发明谷氨酰胺在酸解条件下水解成谷氨酸的化学反应方程式;
图2(a)为本发明中谷氨酰胺位于肽链的N-末端;图2(b)为本发明中谷氨酰胺在肽链的中间任意位置;图2(c)为本发明中谷氨酰胺位于肽链的C-末端;
图3(a)为位于肽链的非C-末端的谷氨酰胺Gln经本发明中肽链水解试剂水解的化学方程式;图3(b)为位于肽链的C-末端的谷氨酰胺Gln经本发明中肽链水解试剂水解的化学方程式;
图4为位于肽链的非C-末端的谷氨酸Glu经本发明中肽链水解试剂水解的化学方程式;
图5为本发明中谷氨酸标准溶液的MS/MS质谱图谱;
图6为本发明中谷胺酰胺中酰氨基被水解后生成一个O18的谷氨酸的MS/MS质谱图谱;
图7为本发明中谷胺酰胺中酰氨基被水解后生成两个O18的谷氨酸的MS/MS质谱图谱;
图8为本发明中赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和色氨酸等18种氨基酸标准液的总离子质量色谱图;
图9为本发明中提取的单个氨基酸(组氨酸和精氨酸)选择离子质量色谱图;
图10为本发明中混合肽段水解产物的总离子质量色谱图。
具体实施方式
表1本发明中20种氨基酸的名称和缩写表
Figure GDA0003555682140000061
Figure GDA0003555682140000071
本发明针对谷胺酰胺和天冬酰胺在强酸条件下水解为谷氨酸和天冬氨酸导致对这4种氨基酸无法准确检测的情况,设计了一种肽链水解试剂,由以下物质组成:盐酸二氧六环溶液、重氧水和二价金属氯化物溶液;其中,盐酸二氧六环溶液、重氧水和二价金属氯化物溶液的摩尔比为(2~4):(35~40):(0.005~0.012)。
本发明还提供了一种肽链水解试剂的制备方法,包括:
a)将盐酸二氧六环溶液和重氧水混匀,盐酸二氧六环溶液和重氧水的摩尔比为(2~4):(35~40),得到二氧六环盐酸重氧水溶液;
b)在步骤a)中的二氧六环盐酸重氧水溶液中加入二价金属氯化物溶液,盐酸二氧六环溶液中的重氧水溶液和二价金属氯化物溶液的摩尔比为(35~40):(0.005~0.012),得到肽链水解试剂。
本发明还提供了所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用,具体方法为:
1)称取多肽或蛋白质样品,加入所述肽链水解试剂,冷冻、抽真空、充入惰性气体后进行加热水解;
2)充分水解后,旋蒸除去溶剂,再用水溶解并将溶液的pH调至6.5~7.5;
3)加入金属螯合剂除去二价金属氯化物中的二价金属离子,离心,得到上清液;
4)对步骤3)的所述上清液进行液相色谱-高分辨质谱分析,得到所述上清液的总离子质量色谱图;
5)提取步骤4)的所述总离子质量色谱图中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸水解产物的选择离子质量色谱图,根据所述水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性建立关系式,由所述关系式得到多肽或蛋白质样品中谷氨酰胺和谷氨酸的比值、天冬酰胺和天冬氨酸的比值。
6)分别获得多肽或蛋白质样品中谷氨酸和天冬氨酸的总含量,根据步骤5)得到的所述比值,即可分别计算出多肽或蛋白质样品中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸的实际含量。
本发明中,术语“重氧水”为含有作为氧原子的同位素的氧18原子的水分子。
本发明中,肽链经酸解时,强酸将酰胺键断裂,分别产生一个带有α-氨基的氨基酸和另一个带有α-羧基的氨基酸;例如,丙谷二肽在酸解的条件下,生成一个丙氨酸和一个谷氨酸。
一条肽链通常含有一个游离的α-氨基酸和一个游离的α-羧基酸,本发明中,术语“N-末端”为肽链中游离的α-氨基酸的一端,术语“C-末端”为肽链中游离的α-羧基酸的一端;一般地,规定肽链的氨基酸排列顺序从肽链的N-末端开始,到C-末端终止。因此,氨基酸在一条肽链中的位置可能存在三种情况,例如,谷氨酰胺Gln在肽链中的位置可能存在的三种情况如附图2所示,分别是在肽链的N-末端(如附图2(a)所示)、在肽链的中间任意位置(如附图2(b)所示)和肽链的C-末端(如附图2(c)所示)。
本发明中,术语“非C-末端”是指氨基酸在肽链的N-末端或在肽链的中间任意位置的任意一种情况。肽链经本发明中肽链水解试剂水解后,水解产物氨基酸可能存在两种情况;例如,当谷氨酰胺Gln位于肽链的非C-末端(a1)时,羧基部位需要从外部获得羟基基团,即需要从肽链水解试剂中获得,由于本发明中的肽链水解试剂中含有O18,因此位于肽链非C-末端的谷氨酰胺Gln(a1)会生成两个带有O18的羧基的谷氨酸(a2),水解方程式如附图3中的图3(a)所示;当谷氨酰胺Gln位于肽链的C-末端(b1)时,羧基部位已经具有羟基,无需从外部获得羟基基团,因此位于肽链C-末端的谷氨酰胺(b1)仅会生成一个带有O18的羧基的谷氨酸(b2),水解方程式如附图3中的图3(b)所示。同理,当谷氨酸Glu位于非C-末端(c1)时,羧基部位也从外部获得羟基基团,生成一个带有O18的羧基的谷氨酸(c2),水解方程式如附图4所示。因此,谷氨酰胺Gln位于肽链的非C-末端(a1)时,进行一级质谱分析时,分子量会比谷氨酸Glu的分子量多2Da;当谷氨酰胺Gln位于肽链的C-末端(b1)时,其分子量会与谷氨酸Glu相等;当谷氨酸Glu位于肽链的C-末端时,分子量会比谷氨酸Glu在肽链非C-末端(c1)的分子量少2Da。
本发明中,术语“总离子质量色谱图”指的是经色谱分离流出的组分不断进入质谱,质谱连续扫描进行数据采集,每一次扫描得到一张质谱图,将每一张质谱图中所有离子强度相加,得到一个总的离子流强度,以离子强度为纵坐标,时间为横坐标绘制的图为总离子质量色谱图;本发明中术语“选择离子质量色谱图”指的是同时间的提取或选择某个离子加和的质量色谱峰相叠加的质量色谱图。
基于此,本发明采用质谱多反应监测的方法,检测到谷氨酸在肽链C-末端的离子对信号峰为148.06043/102.05540,谷氨酸Glu在肽链非C-末端(c1)的离子对信号峰为150.06483/102.05540,谷氨酰胺Gln在肽链C-末端(b1)的离子对信号峰为150.06483/104.05962,谷氨酰胺在肽链非C-末端(a1)的离子对信号峰为152.06895/104.05959,样品中谷氨酰胺产生的信号为谷氨酰胺在C-末端和谷氨酰胺在非C-末端产生的叠加信号,谷氨酸产生的信号为谷氨酸在C-末端和谷氨酸在非C-末端产生的叠加信号,根据离子对之间的关系式即可计算出肽链中谷氨酰胺Gln和谷氨酸Glu的比值;再利用国标法GB5009.124-2016获得谷氨酸Glu的含量,该含量为样品中谷氨酰胺Gln和谷氨酸Glu的总含量,根据比值可分别得到谷氨酰胺Gln和谷氨酸Glu的实际含量。同样地,也能得到样品中天冬酰胺和天冬氨酸的实际含量。
为了进一步地说明本发明的方案,下面结合附图实施例对本发明进行详细地描述,但是应当理解,这些描述只是为了进一步地说明本发明的特征和优点,而不能将它们理解为对本发明保护范围的限定,本发明的权利范围以权利要求书为准。
主要试剂:重氧水(上海泰坦科技股份有限公司,99.9%),盐酸(CAS号:7647-01-0;1,4-二氧六环4M溶液,北京伊诺凯科技有限公司);
六段肽链的氨基酸序列(三个字母的缩写表示)分别为:
Gln-Gln(97.8%),记为①号;
Glu-Glu(97.2%),记为②号;
Asn-Asn(99.8%),记为③号;
Asp-Asp(99.2%),记为④号;
Ala-Cys-Phe-Gly-His-Ile-Lys-Leu(99.2%),记为⑤号;
Met-Pro-Arg-Ser-Trp-Val-Tyr-Trp(99.5%),记为⑥号;
上述肽链均购自上海生工生物工程股份有限公司;氯化钙CaCl2(上海泰坦科技股份有限公司,99.8%);氯化镁MgCl2(上海阿拉丁试剂有限公司,99.9%);金属螯合剂Chelex 100(sigma,100-200mesh);5%Chelex-100(w/v)配制:称取5克Chelex-100,加100ml灭菌纯水,放4℃保存。
主要仪器:Thermo Scientific Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统,DionexUltiMate 3000快速高效液相色谱系统,产自美国赛默飞公司。
实施例1
肽链水解试剂的制备:
a)将3mL4M盐酸二氧六环溶液和3mL重氧水混匀后,得到2M的二氧六环盐酸重氧水溶液;
b)取1.5mL2M二氧六环盐酸重氧水溶液,加入1mg二价金属氯化钙,得到肽链水解试剂。
混合肽链的水解:
精确称取肽链①号3mg、②号2mg、③号2.482mg、④号2.462mg、⑤号8.881mg、⑥号10.392mg,得到混合肽链,加入到15ml水解管中,再加入实施例1中的肽链水解试剂;将水解管放入干冰中,冷冻3min~5min,接到真空泵的抽气管上,抽真空,然后充入氮气,重复抽真空,充入氮气3次后,在充氮气状态下迅速封口或拧紧螺丝盖。
将已封口的水解管放在110℃烘箱中,水解24h后,停掉反应,冷却后,将全部反应液移入到15mL蒸发瓶内,旋转蒸发,然后再用2mL水溶解,再旋转蒸发完全挥干;最后加入少量水溶解,使用氢氧化钠溶液将样品pH调至中性7.0,使用容量瓶定容至10mL,取1ml溶液,加入1ml 5%金属螯合剂Chelex 100,震荡混合1min后高速离心12000RPM/min取上清液进行高分辨质谱分析。
仪器参数:
快速液相色谱条件:流动相A为水,含0.1%甲酸和4mmol/L甲酸铵;B为乙腈,含0.1%甲酸;梯度洗脱:0~2min,10%~40%B;2~9min,40%~85%B;9~12min,85%~100%B;12~15min,100%~10%B。进样量:5μL;流速:300μL/min;柱温:40℃;WatersACQUITY UPLC BEHC18色谱柱(1.7μm,2.1mm×100mm)。
质谱参数:采用HESI离子化方式;喷雾电压3.5kV;毛细管温度325℃;加热器温度350℃;鞘气30unit,辅助气10unit;扫描模式为Full Scan/ddMS2,采集范围为100~800m/z,正离子同时采集模式;分辨率采用MS Full Scan70000FWHM,MS/MS 17500FWHM,NCE为35eV。
谷氨酸标准溶液的MS/MS质谱图谱的测定:
准确称取5mg谷氨酸溶于水中,定容至25ml容量瓶中,得到200ug/ml谷氨酸标准溶液。取50ul200 ug/ml谷氨酸标准溶液加入到9.95ml水中,得到1ug/ml谷氨酸标准溶液,蠕动泵10uL/ml注射到质谱进行分析;得到如附图5所示的谷氨酸标准溶液的MS/MS质谱图谱,从谱图中可以得到,带一个电荷的谷氨酸的母离子为148.050,特征型碎片离子102.056为谷氨酸脱去一个CO2H2得到,故谷氨酸在C-末端的离子对特征信号为148.050/102.056。
实验数据及数据分析:
经过实施例1中的肽链水解试剂处理后的混合肽段样品的上清液,使用纯水稀释1000倍,然后通过蠕动泵10uL/ml注射到质谱进行分析,得到样品的总离子质量色谱图,再提取分子量为150.06483的选择离子质量色谱图,得到附图6;如附图6所示的谷胺酰胺Gln中酰氨基被水解后生成一个O18的谷氨酸的MS/MS质谱图谱,其中,母离子为150.06483,由在肽链非C-末端的Glu(c1)和在肽链C-末端的Gln(b1)分别生成的带一个O18的Glu(b2+c2)组成,但是这两种情况下生成的脱CO2H2碎片是不一样的,一个碎片是102.05540,一个碎片含O18的碎片是104.05962,可以通过这两个碎片的比值确定在肽链非C-末端的Glu(c1)和在肽链C-末端的Gln(b1)的含量的比值。
经过实施例1中的肽链水解试剂处理后的样品的上清液,使用纯水稀释1000倍,然后通过蠕动泵10uL/ml注射到质谱进行分析,得到样品的总离子质量色谱图,再提取分子量为152.06895的选择离子质量色谱图,得到附图7;如附图7所示的谷胺酰胺中酰氨基被水解后生成两个O18的谷氨酸的MS/MS质谱图谱,碎片离子104.05959同在肽链非C-末端的Gln的浓度成正比。
故在肽链水解试剂水解肽段的情况下,Gln在肽段的C-末端和非C-末端,生成的产物是不一样的。
假设样品中谷氨酰胺Gln摩尔浓度为X,在肽段的C-末端的谷氨酰胺(b1)摩尔浓度为X1,水解后生成的谷氨酸的m/z为150.06468;在肽段的非C-末端(a1)的谷氨酰胺浓度为摩尔X2,水解后生成的谷氨酸的m/z为152.06893;
同理,设样品中谷氨酸Glu摩尔浓度为Y,在肽段的非C-末端的谷氨酸(c1)摩尔浓度为Y1,水解后生成的谷氨酸的m/z为150.06468;在肽段的C-末端的谷氨酸浓度为摩尔Y2,水解后生成的谷氨酸的m/z为148.06043;
氨基酸和标记上O18的氨基酸在相同的碰撞能量下,质谱信号上是没有差别的,信号强度或积分面积(peak area)同浓度成正比:
Peak area(150.06468)∝(X1+Y1)
Peak area(152.06893)∝X2
Peak area(148.06043)∝Y2
其中,“∝”表示二者之间为正比的关系;
母离子150.06483由在肽链非C-末端的Glu(c1)和在肽链C-末端的Gln(b1)分别生成的带一个O18的Glu(b2+c2)组成,这两种情况下脱CO2H2都能得到102.05540和104.05962的碎片分子量,但是同一种碎片对应的断裂的位置不一样,使得碎片分子量不同。在同样的电离条件下,如附图6所示,b1左边和右边脱羧基分别得到102.05540和104.05962的碎片分子量,且碎片强度的比例为5:4,可以通过这两个碎片的比值确定在肽链非C-末端的Glu(c1)和在肽链C-末端的Gln(b1)的含量的比值,由此推导出公式一:
公式一
Figure GDA0003555682140000141
分别提取分子量(150.06468、152.06893、148.06043、150.06468/102.05495、150.06468/104.05920)的离子流,得到相应的积分面积(peak area),如表2所示;
表2谷氨酰胺与谷氨酸水解产物的分子量和相应离子流的积分面积表
m/z Peakarea
150.06468 52006678
152.06893 30914568
148.06043 19201690
150.06468/102.05495 2300456
150.06468/104.05920 2201342
从表2得到,Peak area(150.06468/102.05495)/Peak area(150.06468/104.05920)=2300456:2201342=23:22,带入公式一可以得到X1与Y1的比值为3:2;
公式二:样品中谷氨酰胺/谷氨酸=X/Y=(X1+X2)/(Y1+Y2)
将Peak area(150.06468)∝(X1+Y1)、Peak area(152.06893)∝X2、Peak area(148.06043)∝Y2、和X1:Y1=3:2带入公式二中,解得:
谷氨酰胺/谷氨酸=(52006678*0.6+30914568)/(52006678*0.4+19201690)=62118574/41906127=1.000:0.6440;
将混合肽链样品使用国标方法(GB5009.124—2016,食品中氨基酸的测定)获得谷氨酸的总含量,得到样品中谷氨酸含量为4.798mg,则根据样品中谷胺酰胺和谷氨酸的比值=1.000:0.6440,可以计算得到谷氨酰胺含量为2.918mg,谷氨酸含量为1.880mg。
理论上混合肽段样品中谷胺酰胺和谷氨酸的比值为(3*0.978/274):(2*0.972/276)=1.000:0.658;谷氨酰胺理论含量为3.104mg(谷胺酰胺二肽的摩尔数*2*谷胺酰胺分子量),谷氨酸理论含量为2.071mg(谷氨酸二肽的摩尔数*2*谷氨酸分子量);根据偏差计算公式偏差(%)=(理论含量-检测含量)/理论含量*100%;可以计算得到谷氨酰胺的偏差为5.99%,谷氨酸的偏差为9.21%。
其他氨基酸对谷氨酰胺/谷氨酸、天冬酰胺/天冬氨酸测定的干扰
本发明肽链水解试剂水解肽段生成的氨基酸的可能的高分辨质荷比,尽量排除其他氨基酸对谷氨酸和天冬氨酸(包括含O18的分子)分析的干扰,其他氨基酸在实施例1的肽链水解试剂水解下的质荷比与部分同位素丰度表如表3所示。
表3其他氨基酸在实施例1的肽链水解试剂水解下的质荷比与部分同位素丰度表
Figure GDA0003555682140000151
Figure GDA0003555682140000161
Figure GDA0003555682140000171
Figure GDA0003555682140000181
实验结论:由表3可知,其他氨基酸对谷氨酰胺/谷氨酸、天冬酰胺/天冬氨酸的测定无明显干扰,可以采用本发明的肽链水解试剂水解,再利用质谱多反应监测方法,对多肽或者蛋白质样品中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸进行测定。
实施例2
肽链水解试剂的制备
a)将4mL4M盐酸二氧六环溶液和3.2mL重氧水混匀后,得到2.2M二氧六环盐酸重氧水溶液;
b)取1.5mL2.2M二氧六环盐酸重氧水溶液,加入1.2mg二价金属氯化镁,得到肽链水解试剂。
将肽链水解“放在110℃烘箱中,水解24h后”改为“放在110℃烘箱中,水解8h后”;将“使用氢氧化钠溶液将样品pH调至中性7.0”改为“使用氢氧化钠溶液将样品pH调至中性7.5”,其余与实施例一相同。
实施例3
肽链水解试剂的制备
a)将2mL4M盐酸二氧六环溶液和2.8mL重氧水混匀后,得到1.7M二氧六环盐酸重氧水溶液;
b)取1.5mL1.7M二氧六环盐酸重氧水溶液,加入0.6mg二价金属氯化钙,得到肽链水解试剂。
将肽链水解“放在110℃烘箱中,水解24h后”改为“放在110℃烘箱中,水解12h后”;将“使用氢氧化钠溶液将样品pH调至中性7.0”改为“使用氢氧化钠溶液将样品pH调至中性6.5”,其余与实施例一相同。
实验结果
由实施例1-3分别计算得到谷氨酸和谷氨酰胺的检测含量,再计算出三次的平均值,结果如表4所示。
表4实施例1-3中谷氨酸和谷氨酰胺的测试结果表
Figure GDA0003555682140000201
其中,偏差(%)=(理论含量-检测含量)/理论含量*100%。
实施例4
测定混合肽段中18种氨基酸的含量
仪器参数:
Thermo Scientific Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统,DionexUltiMate 3000快速高效液相色谱系统,产自美国赛默飞公司:
扫描模式为Full Scan,采集范围为70~250m/z,正离子同时采集模式;其它参数同上。
流动相为0.1%(v/v)formic acid in water和0.1%(v/v)formic acidinacetonitrile.
色谱柱为Waters XBridge C18色谱柱3.5um 2.1x150mm
流动相为0.1%(v/v)formic acid
in water和0.1%(v/v)formic acid in acetonitrile.起始B相为0%,维持5分钟,10分钟升至5%。
准确称取各种氨基酸5mg溶于水中,定容至25ml容量瓶中,得到200ug/ml氨基酸标准溶液。各取50ul200 ug/ml氨基酸标准溶液加入10ml容量瓶中,定容到10ml,得到1ug/ml氨基酸混合标准溶液,得到混合标准溶液的总离子质量色谱图,如附图8所示,图8为本发明中赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和色氨酸等18种氨基酸标准液的总离子质量色谱图;
提取总离子质量色谱图中的各个待测氨基酸的选择离子质量色谱图,如提取组氨酸和精氨酸,得到的选择离子质量色谱图如附图9所示;得到各个待测氨基酸的不同浓度对应的峰面积,分别建立各个待测氨基酸的峰面积与浓度的标准曲线,得到各个待测氨基酸的线性关系式;
对实施例1的混合肽链水解进行高分辨质谱测试,得到混合肽段水解产物的总离子质量色谱图,如图10所示;
由图8和图10的总离子质量色谱图中各个氨基酸相对应的峰面积位置,获得混合肽段中各个氨基酸的峰面积,代入相应的各个氨基酸的线性关系式中,即可得到混合肽段中各个待测氨基酸的检测含量。
重复实验三次,分别得到18种氨基酸的平均检测含量,结果如表5所示。
表5本发明中18种氨基酸的平均检测含量测定表
Figure GDA0003555682140000211
Figure GDA0003555682140000221
实验结果:
从表5可以看出,除色氨酸在本发明肽链水解试剂的作用下被破坏,无法得到其检测含量外,利用液相色谱-高分辨质谱分析可以得到谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸以及其他多种氨基酸的实际含量,偏差小于10%。
以上所述仅是本发明的优选实施例方式,应当指出,对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种肽链水解试剂,其特征在于,由以下物质组成:盐酸二氧六环溶液、重氧水和二价金属氯化物溶液;其中,所述盐酸二氧六环溶液、所述重氧水和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(2~4): (35~40): (0.005~0.012),所述的肽链水解试剂中的肽链含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸4种氨基酸中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种肽链水解试剂,其特征在于,所述盐酸二氧六环溶液中的盐酸的浓度为1.7~2.2mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种肽链水解试剂,其特征在于,所述二价金属氯化物溶液中的二价金属离子可选自Mg2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+、Ba2+、Sr2+、Fe2+或Sn2+
4.根据权利要求1所述的一种肽链水解试剂的制备方法,其特征在于,包括:
a)将盐酸二氧六环溶液和重氧水混匀,所述盐酸二氧六环溶液和所述重氧水的摩尔比为(2~4):(35~40),得到二氧六环盐酸重氧水溶液;
b)在步骤a)中的所述二氧六环盐酸重氧水溶液中加入二价金属氯化物溶液,所述重氧水和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(35~40): (0.005~0.012),得到肽链水解试剂。
5.权利要求1所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用,其特征在于,具体方法为:
1)称取多肽或蛋白质样品,加入所述肽链水解试剂,冷冻、抽真空、充入惰性气体后进行加热水解;
2)充分水解后,旋蒸除去溶剂,再用水溶解并将溶液的pH调至6.5~7.5;
3)加入金属螯合剂除去二价金属氯化物中的二价金属离子,离心,得到上清液;
4)对步骤3)的所述上清液进行液相色谱-高分辨质谱分析,得到所述上清液的总离子质量色谱图;
5)提取步骤4)的所述总离子质量色谱图中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸水解产物的选择离子质量色谱图,根据所述水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性建立关系式,由所述关系式得到多肽或蛋白质样品中谷氨酰胺和谷氨酸的比值、天冬酰胺和天冬氨酸的比值。
6)分别获得多肽或蛋白质样品中谷氨酸和天冬氨酸的总含量,根据步骤5)得到的所述比值,即可分别计算出多肽或蛋白质样品中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸的实际含量。
6.根据权利要求5所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用,其特征在于,步骤1)的所述水解的温度为110℃,所述水解的时间为8~24h。
7.根据权利要求5所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用,其特征在于,步骤3)的所述金属螯合剂与所述二价金属离子的质量比为12~24:1。
8.根据权利要求5所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用,其特征在于,步骤5)为配制除谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸外的各个待测氨基酸的不同浓度的混合标准溶液,得到所述混合标准溶液总离子质量色谱图,提取所述混合标准溶液总离子质量色谱图中的所述各个待测氨基酸的选择离子质量色谱图,得到所述各个待测氨基酸的不同浓度对应的峰面积,分别建立所述各个待测氨基酸的峰面积与浓度的标准曲线,得到所述待测氨基酸的峰面积与浓度的线性关系式;
测量多肽或蛋白质样品的总离子质量色谱图,根据多肽或蛋白质样品的总离子质量色谱图相对应的混合标准溶液的总离子质量色谱图的色谱峰位置,获得多肽或蛋白质样品中的待测氨基酸相对应的峰面积,代入相应的所述待测氨基酸的线性关系式,得到多肽或蛋白质样品中的待测氨基酸的实际含量。
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