CN110950774A - 蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用。本发明提供的蛋白质定量标记试剂利用邻苯二甲醛基团及其衍生基团与氨基的高反应活性，可以实现对赖氨酸特异性识别，利用其对赖氨酸的高反应活性和不水解的特性，可以有效提高标记效率，再通过比较报告离子的相对丰度，可将其应用于对多组含有赖氨酸的蛋白质组的定量分析中，该蛋白质定量标记试剂在水溶液中稳定，可长期保存，是新一代稳定、高效、经济的等量异位标记试剂。

Description

蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及蛋白质组学研究领域，具体地说，涉及一种蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着人类基因组计划的完成，人类基因组序列被全部测定。但由于基因的表达方式非常复杂，同一个基因在不同的组织、环境状况下转录情况也不同，一个基因可以有多种mRNA形式剪接。并且虽然基因指导了蛋白质表达，但是蛋白质还存在复杂的翻译后修饰、亚细胞定位及迁移、蛋白-蛋白相互作用等现象，均无法从基因层面得到解释，而蛋白质这些动态变化又直接与生理或病理现象相联系。因此仅仅通过基因序列难以解释生理或病理变化机制。蛋白质作为生理功能的执行者，阐明蛋白质的动态变化能直接解释生理或病理变化的机制。为了进一步揭开生命的奥秘，后基因组时代到来，蛋白质组学为该时代中生命科学的主要研究内容之一。蛋白质组学的概念是根据“蛋白质”以及“基因组学”所衍生，最初于20世纪90年代被提出，旨在研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成及其变化规律。因为生物体内蛋白质的复杂性，要研究其组成和变化规律就需要实现对其细致的分离以及准确的鉴定。就蛋白质分离而言，可采用的方法主要包括多维反相液相色谱、二维凝胶电泳。其中二维凝胶电泳是常用的对全蛋白组的分析方法，但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。多维液相色谱作为一种新型分离技术，不存在相对分子质量和等电点的限制，通过不同模式的组合，消除了二维凝胶电泳的歧视效应，具有峰容量高、便于自动化等特点。就蛋白质鉴定而言，可采用免疫和质谱分析的方式。传统生化上利用抗体-抗原特异性结合的免疫方式虽然检测灵敏度较高，但是受限于其检测通量较低，难以胜任对蛋白质组的检测。相比之下质谱是最为高效的检测蛋白质组方法，通过检测特定肽段或蛋白的高分辨质量，再与肽段或蛋白的标准质量进行比对，从而实现蛋白质的鉴定。相比于传统利用免疫的方式来鉴定特定蛋白的方法，利用质谱可以实现对蛋白质组高通量的鉴定，并且高分辨质谱也保证了蛋白质鉴定的准确性。
蛋白质研究策略分为自上而下(top down)和自下而上(bottom up)两种。自上而下的策略的工作流程是：首先将蛋白质混合物进行分离，得到兴趣蛋白。分离得到的兴趣蛋白再用质谱分析，在质谱中完整蛋白经过电喷雾而离子化，在二级质谱中碎裂而生成碎片离子，碎片离子与数据库进行比对，实现对兴趣蛋白以及其翻译后修饰的鉴定。自上而下的策略中兴趣蛋白不需经过蛋白酶切，可以更好地保证样品最原始特性，如某些翻译后修饰。但自上而下的策略也存在问题：需要预先对兴趣蛋白进行分离，难以实现高通量地分析蛋白质组；某些完整蛋白的水溶性较差，进而难以进一步使用质谱进行鉴定；质谱离子化效率会随着分子量增大而降低，限制了对分子量较大的蛋白复合物的鉴定。
自下而上的策略首先将蛋白样品酶切成肽段混合物，之后肽段混合物经过反相液相色谱分离，依此进入质谱进行检测，通过一级质谱测定肽段的完整分子量，在进入串联质谱之前，质谱将进一步电离肽段成多个碎片离子，碎片离子之后进入二级质谱被检测，最终根据所获得的二级质谱图与电脑模拟的肽段碎片离子谱进行对比，确定所检测到的肽段序列组成。这种蛋白样品不经过分离而直接水解成肽段混合物进入质谱检测的方法被称为“鸟枪法”(shotgun)，由John R Yates III于1999年首次提出。该方法也是到目前被广泛使用的蛋白质组学研究方法。
自下而上策略的数据采集方式分为两种：数据依赖采集(Data DependentAcquisition，DDA)和数据独立采集(Data Independent Acquisition，DIA)。数据依赖采集模式即选择一级谱中检测到的丰度最高的母离子进行串联质谱检测，根据质谱的扫描速度的不同，质谱可选择3-20个母离子分别进行串联质谱检测，产生与母离子一一对应的二级谱，母离子与碎片离子的关联信息能够保留，且二级谱相对简单，可直接与肽段标准谱库对比，确定样品中肽段的组成。因为目前扫描速度有限，数据依赖采集模式存在一定的弊端，仅选择高丰度母离子进行串联质谱检测，而低丰度的母离子则无法被检测，这样质谱所检测到的蛋白覆盖率也就受到限制。目前可以利用深度分级的方式优化数据依赖的采集模式，即在进入质谱前先将肽段混合物根据保留时间的不同分成多个组分，再将不同组分依次进行质谱检测，提高蛋白覆盖率。
为了克服DDA模式下蛋白覆盖率较低的问题，John R Yates III于2004年首次提出DIA模式，DIA模式可以实现蛋白全覆盖，但是谱图也变得更为复杂，对复杂谱图的解析是目前DIA领域的主要难点。与DDA模式不同，数据独立采集模式不选择一级质谱中相对强度较高的母离子进行二级质谱碎裂，而是将母离子质量区间等分为多个窗口，逐一对窗口内所有母离子进行二级质谱碎裂并检测。2012年Ruedi Aebersold课题组开发的SWATH方法是目前被广泛应用的基于DIA策略的蛋白质组分析方法，他们在单次样品检测中，将质量在400-1200m/z的母离子分为32个窗口，每次通过四级杆筛选出25Da宽度的全部母离子进行二级质谱检测。这样可以无遗漏地得到全部母离子的碎片离子信息，克服了DDA策略漏失了低丰度母离子碎片信息的弊端。但是DIA策略也同时丢失了母离子与碎片离子之间的关联信息，每一张二级质谱中包含了多个母离子的碎片信息，给数据分析造成了极大的难度。在过去的二十年中，一系列策略被开发用于分析DIA数据。这些DIA数据分析策略主要分为两类：以谱图为中心的分析方法和以肽段为中心的分析方法。谱图为中心的分析方法假定碎片离子均来源于单一、被分离的母离子，采用直接将DIA数据谱图与DDA数据谱图或计算机模拟的谱图进行对比的方法，这种分析方法对于低丰度离子的鉴定存在问题，因为在复杂的DIA谱图中低丰度离子信号会被高峰度离子信号所淹没。肽段为中心的分析方法是逐一验证兴趣肽段是否存在于DIA数据中，对比的参数包括母离子信号、碎片离子信号和色谱保留时间等，将样品中所有理论存在的肽段以此方法进行分析并打分，筛选得到高置信度的结果。如SWATH方法中通过将DIA数据与已知的肽段谱图数据库分析比较，从保留时间、相对强度等信息来证明复杂的DIA数据中所包含肽段的身份。2017年Michael J MacCoss课题组开发的peptide centric analysis(PECAN)方法以肽段为中心分析DIA数据，相比于SWATH方法，不依赖于已有的肽段谱图数据库。通过计算模拟出样品中所含理论肽段的谱图数据库，再与DIA数据进行对比并打分，消除背景蛋白质组的干扰以及检测中的假阳性数据后得到高置信度的结果。
蛋白质组学旨在研究生物体中蛋白质组的组成和变化规律。数据独立采集模式(DIA)能够克服数据依赖采集模式(DDA)蛋白覆盖率较低的问题，可以无遗漏地采集所有肽段的质谱信号，因此更有利于分析蛋白质组的全部组成，目前数据独立采集模式(DIA)也主要被应用于生物标志物的开发和检测中。对于研究不同样品中蛋白质组的变化规律，需要对比不同来源的样品中蛋白的相对含量。最为直接的方式是平行测定多组样品，再通过采集到的肽段谱图数来实现半定量的对比。但是平行实验会由于实验操作误差以及仪器误差对数据可信度造成影响，而在一次质谱检测中，同时对比多组蛋白样品的相对含量可以有效克服实验误差和系统误差，但这也需要质谱能够区分来源于不同样品的质谱信号。可以利用不同的同位素标签分别标记不同样品，进而根据同位素标签质量的差异来区分出不同样品所产生的质谱信号，质谱信号的相对强度即反映了蛋白的相对含量。目前引入同位素标签的策略主要使用的是数据依赖采集模式(DDA)，因为同位素标签会成倍数增加谱图的复杂度，数据独立采集模式(DIA)因为本身谱图较为复杂，分析方法有限还不适用于该策略。同位素标签标记主要分为两种策略：基于一级质谱定量方法和基于二级质谱定量方法。
在一级质谱中肽段离子会产生较强的同位素峰簇，除了会影响相对定量的准确性，也限制了基于一级质谱定量的通量，因为为了避免轻重标质量峰的重叠，同位素标签间的质量差至少需要4Da，而标记试剂所能承载的同位素取代的数目有限，因此基于二级质谱的定量方法通常仅存在2-4个通道。为了提高质谱定量的通量，基于二级质谱的定量方法被开发出来，二级质谱定量技术因为其高通量、高定量准确度、操作简便等优点，已经成功运用于诸多研究领域，如：药物靶点发现、磷酸化蛋白质组学研究、相互作用组学研究等。以常用的串联质谱标签(TMT)为例，基于二级质谱定量的原理是：TMT试剂由三个部分组成：报告离子基团、质量平衡基团和氨基选择性反应基团。TMT试剂包括最多十个不同位置同位素取代的同分异构体，因此他们的分子质量相同，在利用氨基选择性反应基团与肽段连接后，他们在一级质谱的质量完全相同，这样也会增强肽段离子的强度，被质谱选择进行串联质谱分析，在二级质谱高能离子碎裂(HCD)模式下，报告离子基团与质量平衡基团之间的键会发生断裂。由于同位素取代位点不同，会产生不同质量的报告离子，根据报告离子的相对强度，即可得到蛋白的相对含量。
等量异位标记试剂目前商业可得的主要是两种：TMT试剂和iTRAQ试剂，他们应用的原理相似，区别主要在于报告离子基团的结构上。它们均采用氮杂六元环作为报告基团，而要在该氮杂六元环上引入同位素标记需要复杂的化学合成途径，如TMT试剂需要共13步化学合成，导致TMT和iTRAQ试剂价格昂贵(10标TMT试剂约17474元/单次实验，8标iTRAQ试剂约8542元/单次实验)。除了报告基团部分，TMT试剂和iTRAQ试剂均采用N-琥珀酰亚氨活性酯作为氨基选择性反应基团，而N-琥珀酰亚胺活性酯在水溶液中很容易发生水解，因此在使用TMT试剂和iTRAQ试剂对样品定量时，需要加入大过量的标记试剂来保证完全标记。并且一旦配成储液，需要在一周内使用完毕，否则定量准确度会大大降低。因此亟需开发新一代稳定、高效、经济的等量异位标记试剂，以克服商业化的iTRAQ和TMT试剂存在的易水解、标记效率低、氨基选择性不高等弊端。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种蛋白质定量标记试剂，所述标记试剂为如下结构通式的化合物或其药用盐：
Figure BDA0002261914270000041
其中，R1为
Figure BDA0002261914270000042
Figure BDA0002261914270000051
Figure BDA0002261914270000052
R为-OMe、-F、-Cl、-Br、-I或-CF3；n为1～3之间的整数；
R2为
Figure BDA0002261914270000053
Figure BDA0002261914270000054
本发明蛋白质定量标记试剂的工作原理与TMT相同，其中R2为报告离子和质量平衡基团部分，R1为氨基反应基团。
优选地，所述标记试剂选自如下式1～式26所示的化合物或其药用盐：
Figure BDA0002261914270000055
Figure BDA0002261914270000061
第二方面，本发明提供所述标记试剂的制备方法。首先以4-硝基邻苯二甲酸二甲酯化合物作为原料，利用钯碳氢化反应将硝基还原为氨基，再用四氢铝锂将甲酸甲酯还原为二羟基化合物，再以亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸、15N-2-13C亮氨酸为原料通过18O交换引入18O取代，通过二甲基化反应引入13C和氘原子取代的二甲基，之后与二羟基化合物发生缩合反应，经过氧化反应得到不同同位素取代的蛋白质定量标记试剂(基于邻苯二甲醛结构的定量标记试剂)。
或者，以6-硝苯酞酯作为原料与甲基锂试剂反应，再经过硼氢化钠还原得到二醇化合物，再与二甲基亮氨酸进行缩合，最后通过氧化反应得到基于2-乙酰苯甲醛结构的蛋白质定量标记试剂。
式1～式13所示化合物(基于邻苯二甲醛结构的定量标记试剂)的制备方法包括以下步骤：
(1)将4-硝基邻苯二甲酸二甲酯与1/20～1/5质量的钯碳(基于4-硝基邻苯二甲酸甲酯)置于无水甲醇中，在1-10个大气压氢气氛围中室温反应3-24小时；过滤掉固体，滤液旋干，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二甲酯化合物；
(2)室温条件下，向二甲酯化合物的无水四氢呋喃混合溶液中加入2-3倍当量的四氢铝锂(基于二甲酯化合物)，并转移至冰浴中，氩气气氛下由0℃升至室温搅拌1-16小时；然后，将反应混合物用十水合硫酸钠固体淬灭，过滤，用乙酸乙酯洗涤滤渣；收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化出二羟甲基化合物；
(3)将亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸加入到1M盐酸的18O水溶液中，20-80℃下反应1-16小时后，旋蒸去除溶剂，即得18O取代的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸；
(4)冰浴下将2-4倍当量(基于亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸)的氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠加入到水或氘水中，反应搅拌15分钟-3小时之后，向水溶液中加入1倍当量的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸，最后加入3-6倍当量的甲醛、氘代甲醛或13C取代的甲醛，在室温下反应搅拌1-12小时，旋蒸去除溶剂，得到二甲基亮氨酸或同位素衍生物，利用阳离子交换柱对二甲基亮氨酸或同位素衍生物进行分离；
(5)将二甲基亮氨酸或同位素衍生物与1.1-2倍当量的HATU[2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐](基于二甲基亮氨酸或同位素衍生物)溶解于DMF溶剂中，室温下搅拌1-12小时后，加入1.1-2倍当量的步骤(2)所得二羟甲基化合物的DMF溶液，再向溶液中加入2-4倍当量三乙胺；室温下搅拌反应1-16小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二醇化合物；
(6)将步骤(5)所得二醇化合物溶于DCM与DMF的混合溶液中，室温下加入2-5倍当量的戴斯马丁氧化剂(基于二醇化合物)，反应1-16小时后，加入饱和碳酸氢钠和/或硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，室温下搅拌10分钟到3小时；用异丙醇与CHCl3的混合液(异丙醇:CHCl3体积比1:3)萃取；收集有机相，用饱和食盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化。
式14～式26所示化合物(基于2-乙酰苯甲醛结构的定量标记试剂)的制备方法包括以下步骤：
(1)将6-硝苯酞酯溶于四氢呋喃中，冷却至-78℃，随后逐滴加入1-2倍当量的1.6M甲基锂乙醚溶液或3M甲基溴化镁的二乙醚溶液(基于6-硝苯酞酯)，-78℃反应1-16小时后，加入水淬灭过量甲基锂试剂，旋蒸去除四氢呋喃，然后用乙酸乙酯萃取水相，收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，得到粗产物；
(2)将上述粗产物溶于无水乙醇中，-78℃下加入2-5倍当量硼氢化钠固体(基于步骤(1)所得产物)，恢复到室温下搅拌1-8小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化；
(3)将步骤(2)所得产物与钯碳置于无水甲醇中，在1-10个大气压的氢气氛围中室温反应1-16小时；过滤掉固体，滤液旋干，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二羟甲基化合物；
(4)将亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸加入到1M盐酸的18O水溶液中，20-80℃下反应1-16小时后，旋蒸去除溶剂，即得18O取代的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸；
(5)冰浴下将2-4倍当量(基于亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸)的氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠加入到水或氘水中，反应搅拌15分钟-3小时之后，向水溶液中加入1倍当量的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸，最后加入3-6倍当量的甲醛、氘代甲醛或13C取代的甲醛，在室温下反应搅拌1-12小时，旋蒸去除溶剂，得到二甲基亮氨酸或同位素衍生物，利用阳离子交换柱对二甲基亮氨酸或同位素衍生物进行分离；
(6)将二甲基亮氨酸或同位素衍生物与1.1-2倍当量的HATU(基于二甲基亮氨酸或同位素衍生物)溶解于DMF溶剂中，室温下搅1-6小时后，加入步骤(3)得到的1.1-2倍当量二羟甲基化合物的DMF溶液，再向溶液中加入2-4倍当量的三乙胺；室温下搅拌反应1-16小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二醇化合物；
(7)将二醇化合物溶于DCM与DMF的混合溶液中，室温下加入2-5倍当量的戴斯马丁氧化剂(基于二醇化合物)，反应1-16小时后，加入饱和碳酸氢钠和/或硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，室温下搅拌1-6小时；用异丙醇与CHCl3的混合液(异丙醇:CHCl3体积比1:3)萃取；收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化。
第三方面，本发明提供所述标记试剂或含有所述标记试剂的试剂盒在蛋白质组学分析中的应用。
第四方面，本发明提供本发明提供所述标记试剂或含有所述标记试剂的试剂盒在蛋白质定性及定量检测中的应用。
本发明蛋白质定量标记试剂的结构示例及检测原理图分别见图1中A和B。该蛋白质定量标记试剂由三个部分组成：报告离子基团、质量平衡基团和氨基选择性反应基团。在利用胺基选择性反应基团与肽段连接后，它们在一级质谱中的质量相同，这样也会增强肽段离子的强度，被质谱选择进行串联质谱分析，在二级质谱高能离子碎裂(HCD)模式下，报告离子基团与质量平衡基团之间的键会发生断裂。由于同位素取代位点不同，会产生不同质量的报告离子，根据报告离子的相对强度，即可得到蛋白的相对含量。
本发明中，所述蛋白质为含有赖氨酸的蛋白质。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的蛋白质定量标记试剂对赖氨酸可以实现特异性识别，可将其应用于含有赖氨酸的蛋白质组学分析。
本发明提供的蛋白质定量标记试剂相比基于N-琥珀酰亚胺活性酯的TMT试剂在水溶液中更稳定，因此可以长期保存，并且也克服了因为水解而导致较低标记效率的问题。
本发明提供的蛋白质定量标记试剂具有很高的反应活性，可以对样品实现快速标记并进一步进行蛋白质组学分析。
附图说明
图1为本发明蛋白质定量标记试剂的结构示例(A)及检测原理图(B)。
图2为本发明实施例5中利用蛋白质定量标记试剂对BSA蛋白定量检测的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的化学试剂购自百灵威公司、阿尔法爱莎公司或TCI试剂公司。
如无特殊说明，全部反应均使用无水溶剂进行。丙酮使用无水CaSO4进行蒸馏，二氯甲烷(DCM/)、乙醚、四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)通过氧化铝柱干燥。
如无特殊说明，反应均在氩气保护下的干燥玻璃容器中进行。使用注射器或套管进行对空气或水蒸气敏感的试剂进行转移。除室温外反应温度均以油浴温度进行记录。使用Kieselgel 60F254预先铺制的薄层色谱板进行分析，使用254nm紫外光进行观察，或使用磷钼酸溶液进行染色。使用200-400孔的硅胶进行色谱分离。使用4.5g MACKLIN公司生产的Dowex 50WX8离子交换树脂(粒径50-100目)进行阳离子交换交换分离。如无特殊说明，产率均指色谱和光谱纯物质的产率。
关于分析用HPLC-MS：样品使用Waters公司生产的自动纯化液相色谱-质谱联用系统(3100Mass Detector,2545Binary Gradient Module,2767Sample Manager,and2998Photodiode Array(PDA)Detector)进行分析。该系统配有Waters公司生产的C18 5μmSunFire分离柱(150mm×4.6mm)，使用流速为0.3mL/min的液相色谱级水(溶剂A)和液相色谱级乙腈(溶剂B)进行平衡。
关于化合物的表征：熔点未校正，1H、13C、NMR图谱均使用Bruker DRX-400、BrukerAV-400、AV-500或AV-600MHz核磁仪进行测定。化学位移(d)使用相对于溶剂峰的兆比率(ppm)表示。简写中，s代表单峰，d代表双峰，t代表三重峰，q代表四重峰，m代表多重峰。高分辨质谱由北京大学质谱实验室提供的Bruker APEX Flash chromatography质谱仪测得。
以下实施例1～4提供的化合物在仅对原料相应基团进行替换的基础上，均采用如下方法合成得到：
步骤1：将4-硝基邻苯二甲酸二甲酯(5g,20.92mmol)与钯碳(500mg)置于无水甲醇中，置换反应瓶中氢气后，在1-10个大气压氢气氛围中室温反应3-24小时。过滤去掉其中固体，滤液旋干，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷/甲醇(100:1体积比)作为流动相进行纯化，得到二甲酯化合物。
步骤2：室温条件下，向二甲酯化合物(2.2g,10.5mmol)的无水四氢呋喃溶液(70ml)中加入2.5倍当量的四氢铝锂(2g,52.7mmol)，转移至冰浴下，氩气气氛下由0℃转为室温搅拌12小时。然后，将反应混合物用十水合硫酸钠固体淬灭，过滤，用乙酸乙酯(200ml)洗涤滤渣。有机相合并，用盐水洗涤(250ml)。洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷/甲醇(50:1到10:1体积比)作为流动相进行纯化得到二羟甲基化合物。
步骤3：将亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸(75mg)加入到1摩尔盐酸的18O水溶液(1.65ml)中，20-80℃下反应12小时后，旋蒸去除溶剂，不经过纯化即得18O取代的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸。
步骤4：冰浴下将2.5倍当量的氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠(118mg,1.87mmol)加入到水或氘水(10ml)中，反应搅拌15分钟-3小时之后，向水溶液中加入1倍当量的亮氨酸或同位素取代的亮氨酸(100mg,0.73mmol)，最后加入4.7倍当量的甲醛或氘代甲醛或13C取代的甲醛(250ul,1.307mmol)，在室温下反应搅拌1-12小时，旋蒸去除溶剂，得到二甲基亮氨酸或同位素衍生物，利用阳离子交换柱对二甲基亮氨酸或同位素衍生物进行分离。
步骤5：将二甲基亮氨酸或同位素衍生物(112mg,0.675mmol)与1.5倍当量的HATU(384mg,1.012mmol)溶解于DMF溶剂(15ml)中，室温下搅拌1小时后，加入1.2倍当量步骤2所得二羟甲基化合物(124mg,0.81mmol)的DMF溶液，再向溶液中加入三乙胺(374ul,2.7mmol)。室温下搅拌反应1-16小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷/甲醇(20:1到15:1体积比)作为流动相进行纯化。
步骤6：将二醇化合物(47mg,0.1594mmol)溶于DCM/DMF混合溶液(4.5ml/0.5ml)中，室温下加入3倍当量的戴斯马丁氧化剂(200mg,0.4722mmol)，反应1-16小时后，加入饱和碳酸氢钠(5ml)、硫代硫酸钠水溶液(5ml)淬灭反应，室温下搅拌10分钟到3小时。用异丙醇:CHCl3＝1:3(40ml)萃取。有机相合并，用饱和食盐水洗涤。洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷/甲醇(50:1到20:1体积比)作为流动相进行纯化。
实施例1式2化合物的制备
本实施例采用上述方法的步骤1，以4-硝基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行还原反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000111
表征信息如下：
淡黄色固体；3.6g,收率82％；
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.65(d,J＝8.4Hz,1H),6.71(d,J＝2.8Hz,1H),3.85(s,3H),3.78(s,3H).
13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ170.80,167.15,152.31,136.68,131.67,115.55,114.17,112.35,51.99,51.30.
在所得化合物的基础上，经步骤2反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000121
表征信息如下：
淡黄色固体；1.3g,收率81％；
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.08(d,J＝8.0Hz,1H),6.79(dd,J＝6.6,2.5Hz,1H),6.62(dd,J＝8.1,2.5Hz,1H),4.62(s,2H),4.55(s,2H).
采用上述方法的步骤3，以15N-2-13C亮氨酸为原料进行18氧交换反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000122
在所得化合物的基础上，经步骤4反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000123
在所得化合物的基础上，经步骤5反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000124
表征信息如下：
黄色液体；120mg,收率48％；
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.70(d,J＝2.3Hz,1H),7.58(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),7.39(d,J＝8.2Hz,1H),4.70(s,2H),4.66(s,2H),3.87(dt,J＝10.8,3.8Hz,1H),2.91(s,6H),2.03–1.95(m,1H),1.77(dtd,J＝8.1,4.1,2.2Hz,0H),1.63(dqt,J＝11.7,6.3,3.2Hz,1H),1.04(d,J＝6.5Hz,3H),0.99(d,J＝6.6Hz,3H).
13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ165.76,140.21,136.55,135.70,128.55,119.46,118.89,67.97(d,J＝5.0Hz),67.44(d,J＝5.0Hz),61.12,61.05,40.78,40.74,37.22,24.92,22.43.
HRMS(ESI)m/z C15H27NO2^13C^15N^18O(M+H)+的理论值为299.206254实测值为299.206334。
在所得化合物的基础上，经步骤6反应，得到式2化合物：
Figure BDA0002261914270000131
表征信息如下：
黄色液体；10.7mg,收率36％。
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ11.57(s,1H),10.60(s,1H),10.45(s,1H),8.44(d,J＝2.2Hz,1H),8.22–8.13(m,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,1H),4.43(dt,J＝11.3,4.0Hz,1H),3.07(s,8H),2.17(t,J＝12.0Hz,1H),1.86(q,J＝10.0,9.6Hz,1H),1.69(tq,J＝11.9,6.2Hz,1H),1.00(dd,J＝18.0,6.5Hz,6H).
13C NMR(101MHz,Acetone-d6)δ205.30,191.88,191.23,166.13,166.03,143.01,137.98,132.57,123.70,120.56,88.07,36.05,25.03,22.77,20.95.
HRMS(ESI)m/z C15H23NO2^13C^15N^18O(M+H)+的理论值为295.174954实测值为295.175786。
实施例2式3化合物的制备
本实施例采用上述方法的步骤3，以亮氨酸为原料进行18氧交换反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000132
在所得化合物的基础上，经步骤4反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000133
在所得化合物的基础上，经步骤5反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000134
表征信息如下：
黄色液体；100mg,收率49.7％。
在所得化合物的基础上，经步骤6反应，得到式3化合物：
Figure BDA0002261914270000135
表征信息如下：
黄色液体；17.2mg,收率20％。
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ11.50(s,1H),10.60(s,1H),10.45(s,1H),8.42(d,J＝2.1Hz,1H),8.15(dt,J＝8.4,1.6Hz,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),4.41(d,J＝10.5Hz,1H),3.07(s,5H),2.16(s,0H),1.86(s,1H),1.73–1.61(m,1H),1.00(dd,J＝16.5,6.5Hz,6H).
13C NMR(126MHz,Acetone-d6)δ191.79,191.14,166.16(d,J＝12.2Hz),142.91(d,J＝17.5Hz),138.02,132.59(d,J＝13.3Hz),123.68(d,J＝11.1Hz),120.54(d,J＝12.0Hz),66.73(d,J＝11.0Hz),35.89,25.04,22.72,20.92.
HRMS(ESI)m/z C16H21D2N2O2^18O(M+H)+的理论值为295.187118实测值为295.186524。
实施例3式9化合物的制备
本实施例采用上述方法的步骤4，以15N-2-13C亮氨酸为原料进行还原胺化反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000141
在所得化合物的基础上，经步骤5反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000142
表征信息如下：
黄色液体；115mg,收率60％；
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.69(d,J＝2.3Hz,1H),7.58(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),7.40(d,J＝8.2Hz,1H),4.71(s,2H),4.66(s,2H),2.95(s,5H),1.98(t,J＝12.1Hz,1H),1.87–1.76(m,0H),1.64(dtd,J＝10.2,6.6,3.9Hz,1H),1.05(d,J＝6.5Hz,3H),1.01(d,J＝6.6Hz,3H).
HRMS(ESI)m/z C15H25D2NO3^13C^15N(M+H)+的理论值为299.214562实测值为299.214695。
在所得化合物的基础上，经步骤6反应，得到式9化合物：
Figure BDA0002261914270000151
表征信息如下：
黄色液体；12.4mg,收率14％；
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ11.49(s,1H),10.60(s,1H),10.45(s,1H),8.43(s,1H),8.16(d,J＝8.5Hz,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,1H),4.37(d,J＝10.9Hz,1H),2.16(t,J＝12.1Hz,1H),1.85(d,J＝10.0Hz,1H),1.70(d,J＝9.7Hz,2H),1.00(dd,J＝16.0,6.5Hz,6H).
13C NMR(101MHz,Acetone-d6)δ191.87,191.22,166.27(d,J＝9.9Hz),165.31,143.07,137.98,132.58,123.68,120.98,48.87,35.96,25.04,22.77,20.92.
HRMS(ESI)m/z C15H21D2NO3^13C^15N(M+H)+的理论值为295.183262实测值为295.183762。
实施例4式11化合物的制备
本实施例采用上述方法的步骤4，以亮氨酸为原料进行还原胺化反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000152
在所得化合物的基础上，经步骤5反应，得如下产物：
Figure BDA0002261914270000153
表征信息如下：
黄色液体；105mg,收率37.5％；
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.68(d,J＝2.3Hz,1H),7.56(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),7.38(d,J＝8.3Hz,1H),4.88(s,6H),4.70(s,2H),3.62(dd,J＝10.5,3.8Hz,1H),3.40–3.27(m,4H),2.70(s,2H),1.96–1.87(m,1H),1.76–1.53(m,2H),1.00(dd,J＝16.5,6.2Hz,6H).
13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ167.55,140.14,136.80,135.41,128.55,119.47,118.84,67.59,61.12(d,J＝8.9Hz),37.49,25.02,22.44,20.73.
HRMS(ESI)m/z C16H23D4N2O3(M+H)+的理论值为299.226726实测值为299.226152。
在所得化合物的基础上，经步骤6反应，得到式11化合物：
Figure BDA0002261914270000161
表征信息如下：
黄色液体；13mg,收率28％；
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ10.59(s,1H),10.42(s,1H),10.00(s,1H),8.33(d,J＝2.2Hz,1H),8.19(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),8.03(d,J＝8.4Hz,1H),3.30–3.19(m,1H),2.31(s,3H),1.82–1.64(m,2H),1.58–1.51(m,1H),0.95(dd,J＝6.4,4.2Hz,6H).
13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ197.18,196.37,148.64,143.21,137.59(d,J＝66.6Hz),134.88,128.51,125.50,121.96,72.09,41.08,30.41,27.92,26.35,18.67,5.41.
HRMS(ESI)m/z C16H19D4N2O3(M+H)+的理论值为295.195426实测值为295.195425。
实施例5蛋白质定量标记试剂在BSA蛋白相对定量检测中的应用
利用式9和式11所示的定量标记试剂在BSA蛋白上进行定量准确性测试，向100ul的2ug/ul的BSA蛋白储液中加入100ul的100mM TEAB缓冲液，再加入2ul 1M的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液，65℃金属浴反应1小时，恢复到室温后加入7.5ul 500mM的IAA溶液，室温下震荡反应30分钟。之后加入1ml丙酮，-20℃下放置4小时，之后8000g、4℃离心10分钟，吸出上清液，用1ml 100mM的TEAB缓冲液复溶，加入20ul 0.5ug/ul的胰蛋白酶溶液，37℃下反应16小时。
用Thermo scientific的Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay测定肽段浓度，在96孔板中加入浓度分别为1000ug/ul、500ug/ul、250ug/ul、125ug/ul、62.5ug/ul、31.3ug/ul、15.6ug/ul和0ug/ul的BSA肽段标准液和未稀释、稀释一倍和稀释两倍的待测样品20ul。用2ml Colorimetric Peptide Assay Reagent A、1.92mlColorimetric Peptide Assay Reagent B和0.08ml Colorimetric Peptide AssayReagent C(Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay试剂盒，Thermoscientific公司)配置成工作液，分别加入180ul工作液到BSA肽段标准液和待测样品，将混合后的标准液和待测样品放置在37℃下孵育15分钟。测定所有样品480nm下的吸收强度，绘制出标准曲线，得到对应肽段浓度。
同时取两组40ug肽段的缓冲液，向其中分别加入0.27g式9所示化合物和式11所示化合物，室温下震荡反应15分钟后，加入2ul 85％的水合肼，震荡15分钟后。室温下8000g离心10分钟，吸取上清液并旋干溶剂后，加入千分之一的甲酸水溶液配制肽段浓度为100-500ng/ul。
分别用两种试剂对BSA肽段进行标记后，以特定比例混合两组样品并用质谱检测报告离子相对强度。
质谱条件：
液相色谱仪：Easy nLC 1000
流动相：A相：水，0.1％甲酸；B相：100％乙腈，0.1％甲酸。
60分钟梯度：
时间＝0min，流速＝200nl/min，A相＝100％，B相＝0％；
时间＝2min，流速＝200nl/min，A相＝95％，B相＝5％；
时间＝45min，流速＝200nl/min，A相＝70％，B相＝30％；
时间＝50min，流速＝200nl/min，A相＝20％，B相＝80％；
时间＝60min，流速＝200nl/min，A相＝20％，B相＝80％。
质谱：Q-Exactive质谱仪
毛细管温度275℃，喷雾电压2.1KV。采用data-dependent模式，单个循环包括一个一级扫描和十个二级扫描。一级扫描的分辨率设置为70000，二级扫描分辨率为17500。触发二级的intensity threshold为8.3e4。
图2实验结果表明，该定量试剂具备一定的定量准确性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.蛋白质定量标记试剂，其特征在于，所述标记试剂为如下结构通式的化合物或其药用盐：
Figure FDA0002261914260000011
其中，R1为
Figure FDA0002261914260000012
Figure FDA0002261914260000013
Figure FDA0002261914260000014
R为-OMe、-F、-Cl、-Br、-I或-CF3；n为1～3之间的整数；
R2为
Figure FDA0002261914260000015
Figure FDA0002261914260000016
2.根据权利要求1所述的标记试剂，其特征在于，所述标记试剂选自如下式1～式26所示的化合物或其药用盐：
Figure FDA0002261914260000021
Figure FDA0002261914260000031
3.含有权利要求1或2所述标记试剂的试剂盒。
4.根据权利要求2所述标记试剂的制备方法，其特征在于，
式1～式13所示化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)将4-硝基邻苯二甲酸二甲酯与1/20～1/5质量的钯碳置于无水甲醇中，在1-10个大气压氢气氛围中室温反应3-24小时；过滤掉固体，滤液旋干，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二甲酯化合物；
(2)室温条件下，向二甲酯化合物的无水四氢呋喃混合溶液中加入2-3倍当量的四氢铝锂，并转移至冰浴中，氩气气氛下由0℃升至室温搅拌1-16小时；然后，将反应混合物用十水合硫酸钠固体淬灭，过滤，用乙酸乙酯洗涤滤渣；收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化出二羟甲基化合物；
(3)将亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸加入到1M盐酸的18O水溶液中，20-80℃下反应1-16小时后，旋蒸去除溶剂，即得18O取代的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸；
(4)冰浴下将2-4倍当量的氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠加入到水或氘水中，反应搅拌15分钟-3小时之后，向水溶液中加入1倍当量的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸，最后加入3-6倍当量的甲醛、氘代甲醛或13C取代的甲醛，在室温下反应搅拌1-12小时，旋蒸去除溶剂，得到二甲基亮氨酸或同位素衍生物，利用阳离子交换柱对二甲基亮氨酸或同位素衍生物进行分离；
(5)将二甲基亮氨酸或同位素衍生物与1.1-2倍当量的HATU溶解于DMF溶剂中，室温下搅拌1-12小时后，加入1.1-2倍当量的步骤(2)所得二羟甲基化合物的DMF溶液，再向溶液中加入2-4倍当量三乙胺；室温下搅拌反应1-16小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二醇化合物；
(6)将步骤(5)所得二醇化合物溶于DCM与DMF的混合溶液中，室温下加入2-5倍当量的戴斯马丁氧化剂，反应1-16小时后，加入饱和碳酸氢钠和/或硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，室温下搅拌10分钟到3小时；用异丙醇与CHCl3的混合液萃取；收集有机相，用饱和食盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化。
5.根据权利要求2所述标记试剂的制备方法，其特征在于，
式14～式26所示化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)将6-硝苯酞酯溶于四氢呋喃中，冷却至-78℃，随后逐滴加入1-2倍当量的1.6M甲基锂乙醚溶液或3M甲基溴化镁的二乙醚溶液，-78℃反应1-16小时后，加入水淬灭过量甲基锂试剂，旋蒸去除四氢呋喃，然后用乙酸乙酯萃取水相，收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，得到粗产物；
(2)将上述粗产物溶于无水乙醇中，-78℃下加入2-5倍当量硼氢化钠固体，恢复到室温下搅拌1-8小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化；
(3)将步骤(2)所得产物与钯碳置于无水甲醇中，在1-10个大气压的氢气氛围中室温反应1-16小时；过滤掉固体，滤液旋干，使用硅胶色谱柱，以石油醚与乙酸乙酯的混合物，或者二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二羟甲基化合物；
(4)将亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸加入到1M盐酸的18O水溶液中，20-80℃下反应1-16小时后，旋蒸去除溶剂，即得18O取代的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸；
(5)冰浴下将2-4倍当量的氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠加入到水或氘水中，反应搅拌15分钟-3小时之后，向水溶液中加入1倍当量的亮氨酸、1,2-13C2亮氨酸或15N-2-13C亮氨酸，最后加入3-6倍当量的甲醛、氘代甲醛或13C取代的甲醛，在室温下反应搅拌1-12小时，旋蒸去除溶剂，得到二甲基亮氨酸或同位素衍生物，利用阳离子交换柱对二甲基亮氨酸或同位素衍生物进行分离；
(6)将二甲基亮氨酸或同位素衍生物与1.1-2倍当量的HATU溶解于DMF溶剂中，室温下搅1-6小时后，加入步骤(3)得到的1.1-2倍当量二羟甲基化合物的DMF溶液，再向溶液中加入2-4倍当量的三乙胺；室温下搅拌反应1-16小时，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化，得到二醇化合物；
(7)将二醇化合物溶于DCM与DMF的混合溶液中，室温下加入2-5倍当量的戴斯马丁氧化剂，反应1-16小时后，加入饱和碳酸氢钠和/或硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，室温下搅拌1-6小时；用异丙醇与CHCl3的混合液萃取；收集有机相，用盐水洗涤；洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合物作为流动相进行纯化。
6.权利要求1或2所述标记试剂或权利要求3所述试剂盒在蛋白质组学分析中的应用。
7.权利要求1或2所述标记试剂或权利要求3所述试剂盒在蛋白质定性及定量检测中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为含有赖氨酸的蛋白质。
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