CN102262134A - CryIAb蛋白标准物质定值的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种CryIAb蛋白标准物质定值的方法，BT晶体蛋白具有高特异的杀虫活性，是近年来应用最为广泛的生物杀虫剂。在实际检测工作中，经常需要对待检测转基因作物进行CryIAb蛋白定性和定量检测，但是对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白，提供一种CryIAb蛋白标准物质定值的方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。

Description

CryIAb蛋白标准物质定值的方法
技术领域
本发明涉及一种标准物质的定值方法，尤其是涉及一种杀虫晶体蛋白CryIAb标准物质定值的方法。
背景技术
对通过均匀性、稳定性检验合格样料的特性值进行测量，在标准物质技术领域称为表征化(原文为characterize，即对材料特性进行测量)；由计量权威部门对表征化获得的样料特性的量值进行计量学溯源性(以下简称溯源性)确认和相应测量不确定度评定合理性确认，在标准物质技术领域称为定值(原文为certify，即对测量获得的结果进行认证确认，在其它技术领域一般称为认证)。因此，对有证标准物质的定值，实际上应分为两步：首先是对经过均匀性、稳定性检验合格的样料特性值进行测量，也就是表征化；然后是对测量结果的溯源性和测量不确定度评定的合理性进行有效性确认。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中(贾士荣等，2001)。1901年，日本学者石渡从染病的家蚕体液中首次分离出Bt菌，并证明部分Bt对鳞翅目昆虫有杀虫活性。1915年，Berliner注意到Bt在芽胞形成过程中，其一端出现小的包含物，但不知杀虫活性与此有关。二十世纪50年代，人们才发现Bt菌的杀虫活性与伴胞晶体有关(Hannay，1953)，并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成(Hannay and Fitz-James，1955)。这种蛋白通常被称作δ-内毒素(δ-endotoxins)或杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。1989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已经发表的42种晶体蛋白分为5群14亚类。其中具有溶血溶细胞作用的27kDa晶体蛋白基因被命名为Cyt基因，其他只有杀虫活性的13亚类命名为狭义的晶体蛋白基因，即Cry基因。Cry基因可划分四群，即CryI为鳞翅目特异性，CryII为鳞翅目和双翅目特异性，CryIII为鞘翅目特异性，CryIV双翅目特异性。CryI是研究的最多的一类Bt杀虫晶体蛋白，目前常见的转Bt基因是CryIA(b)、(c)，Cry9c。BT晶体蛋白具有高特异的杀虫活性，是近年来应用最为广泛的生物杀虫剂。在实际检测工作中，经常需要对待检测转基因作物进行CryIAb蛋白定性和定量检测，但是对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。
发明内容
本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白，提供一种CryIAb蛋白标准物质定值的方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。
上述定值方法，包括以下步骤：
(1)合成三条特异性肽段：LIGNYTDHAVR、TLSSTLR、IVAQLGQGVYR用于进行CryIAb蛋白定量；
(2)同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段；
(3)以亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量；
(4)按400μL溶液中所含CryIAb蛋白质量，根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段；
(5)准确称量400μL CryIAb蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液；使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为1∶1；
(6)离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理；10min后加入2μL 1M的二硫苏糖醇(DTT)溶液在60摄氏度水浴中加热60min；然后加入2μL 1M的碘乙酰胺(IAA)，在暗处反应40min；加入6μL 1M的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL0.5mg/mL的胰蛋白酶(Trypsin)溶液进行酶切，每24小时补充2μL的Trypsin；酶切96小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量；
(7)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线；计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中CryIAb蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
其中本发明中使用的CryIAb标准物质制备过程：
(1)配制浓度为0.1％的氨水溶液，用于溶解经过纯化的CryIAb。
(2)配制浓度为50μg/g CryIAb溶液。
(3)将CryIAb溶液分装至500μL冻存管中，每只冻存管中分装400μL溶液，分装好的标准物质在-80摄氏度冰箱中冷冻保存。
采用上述技术方案，本发明可以达到的技术效果是：
(1)采用氨水溶解制备CryIAb标准物质，提高了CryIAb溶解度，保证了标准物质的均匀性；
(2)采用同位素稀释质谱基准方法对标准肽段和CryIAb蛋白质含量进行测定，保证了定值结果的准确；
(3)在采用同位素稀释质谱法对标准肽段定量时同时选用多个氨基酸定量结果的平均值；在采用同位素稀释质谱法对CryIAb定量时同时选用三条酶切肽段定量结果的平均值，提高了定值结果的可靠性。
(4)标准物质定值结果可最终溯源到SI单位。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
实施例1：
(一)CryIAb标准物质制备过程：
(1)配制浓度为0.1％的氨水溶液，用于溶解经过纯化的CryIAb。
(2)配制浓度为50μg/g CryIAb溶液。
(3)将CryIAb溶液分装至500μL冻存管中，每只冻存管中分装400μL溶液，分装好的标准物质在-80摄氏度冰箱中冷冻保存。
(二)标准物质定值：
(1)选择检测LIGNYTDHAVR，TLSSTLR，IVAQLGQGVYR三条特异性肽段进行CryIAb蛋白定量。
(2)合成上述三条肽段，同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段。
(3)以国家亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量。
(4)按400μL溶液中所含CryIAb蛋白质量，根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段。
(5)准确称量400μL蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液。使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比尽量为1∶1。
(6)离心干燥加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理。10min后加入2μL 1M的二硫苏糖醇(DTT)溶液在60摄氏度水浴中加热60min。然后加入2μL 1M的碘乙酰胺(IAA)，在暗处反应40min。加入6μL 1M的DTT还原多余的IAA。用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL 0.5mg/mL的Trypsin溶液进行酶切，每24小时补充2μL的Trypsin。酶切96小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量。
(7)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线。计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中CryIAb蛋白的浓度作为标准物质的定值结果，每批标准物质的定值结果不一样，本实施例的定值结果为48.9μg/g，本发明采用的同位素稀释质谱法经过国际比对的验证，方法达到国际等效。
(三)实施例中使用的仪器
(1)分析天平
(Sartorius BS323S型，最大称量为320g，精度为0.001g，德国)
(Sartorius ME235S型，最大称量为230g，精度为0.01mg，德国)
(METTLER TOLEDO XP26型，最大称量为22g，精度为0.001mg，瑞士)
(METTLER TOLEDO UMX2型，最大称量为2.1g，精度为0.1μg，瑞士)
(2)超低温冰箱(Deep Freezer VXE570型，Thermo Electron Corporation，法国)
(3)恒温摇床(S16R-2型，SHEL LAB，美国)
(4)冷冻干燥器(日立，日本)
(5)烘箱(UFE500型，MEMMERT，美国)
(6)液相色谱-质谱联用仪(Agilent 6410Triple Quard LC/MS，Agilent，美国)
(7)超纯水系统(Milli-Q型，MILLIPORE，美国)
(8)pH计(3STAR型，Thermo Electron Corporation，法国)
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种CryIAb蛋白标准物质定值的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)合成三条特异性肽段：LIGNYTDHAVR、TLSSTLR、IVAQLGQGVYR用于进行CryIAb蛋白定量；
(2)同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的三条同位素标记肽段；
(3)以亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的三条标准肽段进行准确定量；
(4)按400μL溶液中所含CryIAb蛋白质量，根据三条肽段的纯度计算酶切后所得三条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段；
(5)准确称量400μL CryIAb蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液；使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为1∶1；
(6)离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理；10min后加入2μL 1M的二硫苏糖醇溶液在60摄氏度水浴中加热60min；然后加入2μL 1M的碘乙酰胺，在暗处反应40min；加入6μL 1M的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL 0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液进行酶切；酶切96小时后采用同位素稀释质谱法对三条肽段进行准确定量；
(7)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线；计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中CryIAb蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
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