CN116333061A - 一种用于检测新型冠状病毒奥密克戎株的特异性肽段和检测方法 - Google Patents
一种用于检测新型冠状病毒奥密克戎株的特异性肽段和检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒奥密克戎株的特异性肽段和检测方法，其氨基酸序列选自由以下组成的组中：针对BA.1变异株的ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)；针对BA.4和BA.5变异株的TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)、GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)。所述检测方法包括检测样品中是否存在特异性肽段SEQ ID NO：1‑3。该方法可使奥密克戎株新型冠状病毒灭活疫苗被特异性鉴别，而其它株系不能被鉴别。该方法检测准确率高，特异性好，对疫苗的研发和质量控制有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于新型冠状病毒奥密克戎(Omicron)株检测技术领域，特别是涉及新型冠状病毒灭活疫苗及其中间产品中新型冠状病毒奥密克戎株BA.1、BA.4和BA.5变异株特异性肽段的检测方法，尤其涉及利用液相色谱串联质谱筛选检测新型冠状病毒奥密克戎株特异性肽段和特异性离子对。
背景技术
冠状病毒是最大的RNA病毒，相比于DNA的双链结构，RNA的单链结构更不稳定，因此更容易发生突变。随着COVID-19的大流行，病毒在持续传播的同时，不断发生进化和变异，多种变异毒株被相继发现，并有持续进化发展的趋势。冠状病毒主要有4种结构蛋白，分别为S(棘突)蛋白、N(核衣壳)蛋白、M(膜)蛋白、E(包膜)蛋白。其中，S蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引起免疫应答的重要抗原，是疫苗设计的关键靶点。
从2021年5月起，WHO就开始用希腊字母为新型冠状病毒毒株命名，到目前已命名11种变异毒株，包括Alpha(阿尔法)、Beta(贝塔)、Gamma(伽玛)和Delta(德尔塔)、奥密克戎(Omicron)等。由于基因组突变可能影响病毒的传播能力、对疫苗的敏感性和对人的致病性，这些毒株被称为值得关注的变异株(variants of concern，VOC)，目前全世界最关注的当属奥密克戎突变株。最早于2021年11月9日在南非首次检测到。奥密克戎变异株同时具有前4个VOC变异株Alpha(阿尔法)、Beta(贝塔)、Gamma(伽玛)和Delta(德尔塔)刺突蛋白的重要氨基酸突变位点，包括增强细胞受体亲和力和病毒复制能力的突变位点。基因组中有50多个突变，包括约37个棘突糖蛋白(S蛋白)突变，28个是唯一的，9个与其他变体重叠。
研究发现，奥密克戎变异株突变的区域主要集中在S蛋白的高变异区。该变种病毒很可能出现在免疫功能低下的患者身上，传播速度更快，且会感染新型冠状病毒疫苗接种者与感染康复者，奥密克戎毒株主要影响上呼吸道而不是肺部。
疫苗作为狙击和预防新型冠状病毒的一种有效方式，成为全球药物研发的关注焦点。
灭活疫苗是针对新发突发传染病最有效的疫苗研发途径。具有生产工艺成熟、质量标准可控、保护范围广等优点，可用于大规模接种，并且有国际通行标准来判断疫苗的安全性和有效性。灭活疫苗中特异性肽段检测，对于疫苗是否有针对性和特异性有着十分重要的意义。基于当下流行的新型冠状病毒变异毒株均为奥密克戎分支，针对奥密克戎变异株的下一代新型冠状病毒疫苗研发正在急速展开，区别与其他株型疫苗，针对奥密克戎株特异性鉴别的检测尤为关键。
传统方法检测灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白需要依靠免疫学分析方法，如双抗体夹心酶联免疫法检测。采用酶联免疫技术检测新型冠状病毒中的S蛋白，利用重组表达S蛋白抗原，通过基础免疫和加强免疫小鼠或家兔，制备单克隆或多克隆抗体。将纯化后抗S蛋白抗体包被固相载体如酶联反应板，封闭干板后，加入待测产品，进行孵育洗板操作后，加入酶标记的抗S蛋白抗体，形成标记后的免疫复合物，通过洗涤，将未被结合的酶结合物以及其它物质去除。通过显色或者发光等方式对标记物进行检测，通过标准曲线可以定量检测待测产品中SARS-CoV-2的S蛋白含量。利用酶联法检测S蛋白的技术需要大量时间通过动物免疫过程制备特异性抗体，且对抗体质量要求较高，不仅需要极高的特异性，而且抗体一般需要较高的亲和力。酶联免疫实验在检测过程中易受检测样本中其它成分干扰影响测定结果，造成定量不准确。酶联免疫技术实验操作过程复杂，需要进行3～5步骤孵育和酶联反应板洗涤操作，人为因素对实验影响较大，而且去反应过程易受环境因素影响，故其稳定性和重复性较差。由于酶联免疫法线性范围较窄，一般为102，对于未知浓度样品需要进行预实验或样品稀释，才能将样品落在最佳线性范围内得到准确测定，而过多的稀释过程一般会造成的样品检测的不准确。
近年来，液相色谱串联质谱技术在蛋白质的检测分析方面具有高选择性和高灵敏度等优点，非常适用于复杂生物基质中靶向蛋白质的定性研究。
发明内容
为了快速、可靠检测新型冠状病毒奥密克戎株，本发明人经过深入研究，发现了奥密克戎株不同变异株的特异性肽段，该肽段特异性强、响应值高、在新型冠状病毒奥密克戎株原液中序列稳定性强，基于其能够灵敏、特异的区分奥密克戎株与其他毒株，例如Alpha、Beta、Gamma、Delta。此外，本发明人对现有技术中检测新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白的方法进行了改善，提出了一种新型冠状病毒奥密克戎株的检测方法，其准确度高，具有高选择性和高灵敏度。
因此，本发明的第一目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒奥密克戎株BA.1、BA.4和BA.5变异株的特异性肽段；本发明的第二目的在于提供一种新型冠状病毒奥密克戎株灭活疫苗的鉴别检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一方面，本发明提供一组用于检测新型冠状病毒奥密克戎株的特异性肽段，其氨基酸序列选自由以下组成的组：
针对BA.1变异株的ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)；
针对BA.4和BA.变异株的TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)和GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)。
在一个实施方式中，在高效液相色谱串联质谱进行检测时，3种特异性肽段的离子对分别为：SEQ ID NO：1特异性肽段的母离子的质荷比为1235.6112，子离子的质荷比为786.4175和1247.6375；SEQ ID NO：2特异性肽段的母离子的质荷比为602.7833，子离子的质荷比为975.4530和888.4207；SEQ ID NO：3特异性肽段的母离子的质荷比为1120.537，子离子的质荷比为1440.6766和1511.7115。
另一方面，本发明提供一种新型冠状病毒奥密克戎株灭活疫苗及中间产品的鉴别检测方法，其包括检测样品中是否存在下述特异性肽段中的一种或多种：针对BA.1变异株的ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)；和/或针对BA.4和BA.5变异株的TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)、GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)。
在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：取样品进行孵育以及酶解处理，将酶解后的上清液进样，采用液相色谱串联质谱检测是否存在所述特异性肽段。
在一个实施方式中，所述样品为新型冠状病毒奥密克戎株的灭活疫苗及中间产品。
在一个实施方式中，所述孵育的过程包括：向待测样品中等体积加入蛋白酶解表面活性剂RapiGEST，于70～90℃条件下孵育20～60min后，接着加入二硫苏糖醇至终浓度为25mmol/L，于65℃条件下孵育60min，温度降至室温后加入碘代乙酰胺溶液至终浓度为50mmol/L，避光室温孵育20～60min，
孵育后进行酶解处理的过程包括：
向220μL孵育后的待测样品中加入NH4HCO3溶液至体积为480μL，接着加入胰蛋白酶溶液20μL，于37℃条件下过夜酶解，酶解反应完成后，加入1μL的甲酸以使胰蛋白酶失活，即结束酶解反应。
在一个实施方式中，液相色谱检测条件如下：
色谱柱：C18柱，优选选用ACQUITY UPLC PEPTIDE BEH C18(2.1mm×100mm)，进样量为5～10μL，色谱柱温度为60℃；
流动相组成：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B在0～20min内含量从0～45％变化进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
在一个实施方式中，质谱检测条件如下：
离子传输管温度为320℃，鞘气流速35arb，质谱分析范围是200～2000，最大离子注入时间100ms，目标离子数目2e5，分辨率70000。
在所述液相色谱串联质谱中，如果存在质荷比为1235.6112的母离子且质荷比为786.4175和1247.6375的子离子，则表明存在奥密克戎BA.1变异株特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)。如果存在质荷比为602.7833的母离子且质荷比为975.4530和888.4207的子离子，则表明存在奥密克戎BA.4、BA.5变异株特异性肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)；如果存在质荷比为1120.537的母离子且质荷比为1440.6766和1511.7115的子离子，则表明存在奥密克戎BA.4、BA.5变异株特异性肽段GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)。
又一方面，本发明提供上述特异性肽段在鉴别检测新型冠状病毒奥密克戎株中的用途。
本发明的鉴别肽段具有特异性强、响应值高、在新型冠状病毒奥密克戎株疫苗及其原液中序列稳定性强等优点。
本发明采用上述的特异性肽段及其特异性离子对，将其应用到液相色谱串联质谱鉴别新型冠状病毒奥密克戎株疫苗及其原液的鉴别检测方法中，具有特异性好，灵敏度高的特点，避免了新型冠状病毒原液样品中病毒蛋白结构变化、蛋白修饰及基质效应等对检测的影响，能够用于新型冠状病毒奥密克戎株灭活疫苗及其原液的鉴别。
本发明的有益效果：
(1)本发明的特异性肽段具有特异性强、响应值高、在新型冠状病毒奥密克戎株疫苗及其原液中序列稳定性强等优点。
(2)将本发明的特异性肽段及其离子对应用到液相色谱串联质谱鉴别检测新型冠状病毒奥密克戎株原液方法中，具有特异性强、灵敏度高等特点。
(3)本发明的3种特异性肽段，BA.1变异株特异性肽段序列ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)在目前新型冠状病毒奥密克戎株BA.1型中稳定存在；BA.4、BA.5变异株特异性肽段序列：TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)、GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)在目前新型冠状病毒奥密克戎株BA.4、BA.5型中均稳定存在，3种肽段均为新型冠状病毒奥密克戎株稳定突变序列，可应用于不同型别新型冠状病毒奥密克戎株灭活疫苗鉴别检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中筛选获得的新型冠状病毒奥密克戎株BA.1变异株S蛋白中的特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK的离子流图。
图2为本发明实施例1中筛选获得的新型冠状病毒奥密克戎株BA.1变异株S蛋白中的特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK的二级碎片质谱图。
图3为本发明实施例1中筛选获得的新型冠状病毒奥密克戎株BA.4、BA.5变异株S蛋白中的特异性肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK的离子流图。
图4为本发明实施例1中筛选获得的新型冠状病毒奥密克戎株BA.4、BA.5变异株S蛋白中的特异性肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK的二级碎片质谱图。
图5为本发明实施例1中筛选获得的新型冠状病毒奥密克戎株BA.4、BA.5变异株S蛋白中的特异性肽段GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK的离子流图。
图6为本发明实施例1中筛选获得的新型冠状病毒奥密克戎株BA.4、BA.5变异株S蛋白中的特异性肽段GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK的二级碎片质谱图。
图7为本发明实施例2中酶解后的不同株型新型冠状病毒疫苗原液上清液，已有专利申请202110052933.5中新型冠状病毒S蛋白定性肽段的PRM图谱。
图8为本发明实施例2中酶解后的不同株型新型冠状病毒疫苗原液上清液，BA.1变异株的S蛋白特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK的PRM图谱。
图9为本发明实施例2中酶解后的不同株型新型冠状病毒疫苗原液上清液，BA.4、BA.5变异株的S蛋白特异性肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK的PRM图谱。
图10为本发明实施例2中酶解后的不同株型新型冠状病毒疫苗原液上清液，BA.4、BA.5变异株的S蛋白特异性肽段GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK的PRM图谱。
图11为本发明实施例2中奥密克戎株BA.1原液稀释100倍，BA.1变异株的S蛋白特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK的PRM图谱。
图12为本发明实施例2中奥密克戎株BA.4、BA.5变异株原液稀释100倍，BA.4、5变异株的S蛋白特异性肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK的PRM图谱。
图13为本发明实施例2中奥密克戎株BA.4、BA.5变异株原液稀释100倍，BA.4、5变异株的S蛋白特异性肽段GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK的PRM图谱。
图14为本发明实施例2中新型冠状病毒奥密克戎株灭活疫苗(BA.1)成品，BA.1变异株S蛋白特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK的PRM图谱。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1本发明特异肽段及特异离子对筛选过程：
首先利用生物信息学分析对新型冠状病毒奥密克戎株不同变异株(BA.1、BA.4、BA.5)S蛋白中的突变肽段进行筛选，共筛选出9个特异性S蛋白突变的肽段。如表1：
利用高效液相色谱串联四极杆-静电轨道阱质谱仪对新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株不同变异株原液样品进行高分辨质谱分析(Full MS/dd MS2),筛选特征性肽段的一级母离子和二级产物离子信息，具体过程如下：
1、筛选用到的试剂：
50mmol/L的NH4HCO3溶液：称取0.04g的NH4HCO3加入10mL超纯水中溶解获得。
500mmol/L的DTT溶液：称取0.37mg的DTT，采用50mmol/L的NH4HCO3溶液定容至4.0mL获得。
1mol/L碘代乙酰胺溶液：称取0.37g的碘代乙酰胺，采用50mmol/L的NH4HCO3溶液定容至4.0mL获得。
0.1％的RapiGEST溶液：称取1mg的RapiGEST，加入1mL的50mmol/L的NH4HCO3溶液溶解获得。
胰蛋白酶溶液：称取20μg的胰蛋白酶溶解液于200μL的50mmol/L的NH4HCO3溶液中获得。
2、新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株原液样品处理：
取待测的新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株原液样品，等体积加入0.1％的RapiGEST溶液，于70℃条件下孵育40min，然后加入500mmol/L的DTT溶液至终浓度为25mmol/L，于65℃条件下孵育40min，温度降至室温后加入1mol/L的碘代乙酰胺溶液至终浓度为50mmol/L，室温避光反应30min。接着向220μL样品溶液中加入50mmol/L的NH4HCO3溶液至体积为480μL，每份样品加入胰蛋白酶溶液20μL，于37℃条件下过夜酶解，酶解反应完成后，加入1μL甲酸以使胰蛋白酶失活，即结束酶解反应。
3、新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株原液样品(上述酶解后获得的上清液)的质谱检测分析：
采用Thermo高效液相色谱串联四极杆-静电轨道阱质谱仪(QE PLUS)进行检测。
液相色谱检测操作如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC PEPTIDE BEH C18(2.1mm×100mm)；流动相组成：流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为含0.1％的甲酸的乙腈溶液；色谱柱温度为60℃，样品的进样量为10μL，流动相B在0～70min内含量从0～45％变化进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
质谱检测操作如下：
UHPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS高分辨质谱仪来检测特异性肽段，采用Full MS/dd-MS2(TopN)模式分析，采集和分析软件为BioPharma Finder，离子传输管温度为320℃，鞘气流速35arb，质谱分析范围是200～2000，最大离子注入时间100ms，目标离子数目3e6，分辨率70000。
通过进样分析，得到了上述S蛋白序列的5个突变肽段所对应的母离子及10对离子对质谱信息(如下表2所示，还参见图1-图6)。
表2：
4、本发明特异性肽段和特异性离子对的筛选：
筛选策略：首先肽段应当属于S蛋白特征性序列，其次要保证特异性肽段及其对应的特异离子对仅在对应新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株变异株原液中有较高的响应，这样才可以达到检测目的。发明人创造性的利用液相色谱串联质谱方法检测不同株型的新型冠状病毒灭活疫苗原液，依据不同肽段的质谱信号响应情况，综合筛选得到适用于鉴别新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株原液的特异性肽段和其特异性离子对。本发明的筛选方法区别于传统仅依靠质谱打分数据选择确定特异性肽段和特异性离子对。
利用Thermo高效液相色谱串联四极杆-静电轨道阱质谱仪(QE PLUS)对最初筛选出的奥密克戎株S蛋白中的5个肽段进行再次筛选，样品处理与液相色谱检测操作与上方相同，质谱检测操作如下：
采用PRM模式分析，采集和分析软件为BioPharma Finder，离子传输管温度为320℃，鞘气流速35arb，质谱分析范围是200～2000，最大离子注入时间100ms，目标离子数目2e5，分辨率70000，离子对的NCE＝30；
结果显示(如表3)新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株BA.1变异株对肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK离子对检测出现信号峰，结果为阳性；BA.4、BA.5变异株对肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK和GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK离子对检测出现信号峰，结果为阳性；而其余株型新型冠状病毒疫苗原液对肽段FDNPVLPFNDGVYFASIEK、CVNFNFNGLK的离子检测中也出现信号峰，由此排除以上两个肽段，将肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK定为新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株BA.1变异株原液鉴别的特异性肽段，将肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK和GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK定为新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株BA.4、5变异株原液鉴别的特异性肽段。
表3：
实施例2新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株鉴别分析
本实施例利用已有专利申请202110052933.5中新型冠状病毒S蛋白定性肽段(GWIFGTTLDSK(SEQ ID NO：10))离子对和本申请实施例1中的奥密克戎株S蛋白的特异性肽段和特异性离子对(BA.1变异株特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)，离子对中母离子的质荷比为1235.6112，子离子的质荷比为786.4175和1247.6375；BA.4、BA.5变异株特异性肽段(TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)，离子对中母离子的质荷比为602.7833，子离子的质荷比为975.4530和888.4207；BA.4、BA.5变异株特异性肽段(GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)，离子对中母离子的质荷比为1120.537，子离子的质荷比为1440.6766和1511.7115，结合UHPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS高分辨质谱仪，检测新型冠状病毒灭活疫苗原型株、BETA株、DELTA株、奥密克戎株(BA.1/BA.4/BA.5)原液。四个株系均能检测到已有专利申请202110052933.5中新型冠状病毒S蛋白定性肽段(GWIFGTTLDSK(SEQ ID NO：10)离子对；奥密克戎株(BA.1/BA.4/BA.5)原液均能检测到上述对应的奥密克戎株S蛋白的特异性肽段和特异性离子对，而上述奥密克戎株S蛋白特异性肽段在新型冠状病毒灭活疫苗原型株、BETA株、DELTA株中无法被检测到。
本实施例中涉及到的高效液相色谱检测条件如下：
色谱柱：C18柱，优选选用ACQUITY UPLC PEPTIDE BEH C18(2.1mm×100mm)，进样量为10μL，色谱柱温度为60℃；
流动相组成：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B在0～20min内含量从0～45％变化进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
本实施例中涉及到的质谱检测条件如下：
UHPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS高分辨质谱仪来检测特异性肽段，采用PRM模式分析，采集和分析软件为BioPharma Finder，离子传输管温度为320℃，鞘气流速35arb，质谱分析范围是200～2000，最大离子注入时间100ms，目标离子数目2e5，分辨率70000，离子对的NCE＝30。
具体操作如下：
取待测的新型冠状病毒灭活疫苗原型株、Delta株、Beta株、奥密克戎株变异株原液样品、稀释100倍的奥密克戎株原液样品以及新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株成品，进行孵育并进行酶解处理，具体如下：
向待测的灭活原液样品中加入0.1％的RapiGEST，于70℃条件下孵育40min后，接着加入500mmol/L的DTT至终浓度为25mmol/L，于65℃条件下孵育60min，温度降至室温后加入1mol/L碘代乙酰胺溶液至终浓度为50mmol/L，避光室温孵育30min。接着向220μL孵育后的待测的灭活疫苗样品中加入50mmol/L的NH4HCO3至体积为480μL，接着加入胰蛋白酶溶液20μL，于37℃条件下过夜酶解，酶解反应完成后，加入1μL的甲酸以使胰蛋白酶失活，即结束酶解反应。
将酶解后的上清液进样检测，进样量为5μL，根据以下标准：
1、新型冠状病毒S蛋白定性肽段离子对：新型冠状病毒灭活疫苗各株系均应出现阳性信号峰；
2、奥密克戎株BA.1变异株特异性肽段离子对：奥密克戎株BA.1变异株样品应出现阳性信号峰，其余株型均不出现信号峰。
奥密克戎株BA.4、5变异株特异性肽段离子对：奥密克戎株BA.4、5变异株样品应出现阳性信号峰，其余株型均不出现信号峰。
对新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株进行鉴定分析。
结果如图7-图10显示，新型冠状病毒灭活疫苗原型株、Delta株、Beta株原液对奥密克戎株BA.1变异株特异性肽段离子对检测均未出现信号峰，结果为阴性，新型冠状病毒S蛋白定性肽段离子对均出现信号峰，结果为阳性。而奥密克戎株新型冠状病毒疫苗BA.1原液对奥密克戎株BA.1特异性肽段离子检测对均出现信号峰，结果为阳性，对新型冠状病毒S蛋白定性肽段离子对出现信号峰，结果为阳性；奥密克戎株新型冠状病毒疫苗BA.4、5原液对奥密克戎株BA.4、BA.5特异性肽段离子检测对均出现信号峰，结果为阳性，对新型冠状病毒S蛋白定性肽段离子对出现信号峰，结果为阳性，显示该鉴别方法对新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株原液的特异性良好。如图11-图14所示，奥密克戎株新型冠状病毒疫苗原液稀释100倍后样品以及新型冠状病毒奥株成品，对奥密克戎株特异性肽段离子检测对均出现信号峰，结果均为阳性，显示该鉴别方法对新型冠状病毒灭活疫苗奥密克戎株的鉴别灵敏度良好。
Claims (9)
1.一种用于检测新型冠状病毒奥密克戎株的特异性肽段，其氨基酸序列选自由以下组成的组：针对BA.1变异株的ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)；针对BA.4和BA.5变异株的TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)和GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)。
2.根据权利要求1所述的特异性肽段，其中，在高效液相色谱串联质谱进行检测时，所述ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)特异性肽段的离子对中母离子的质荷比为1235.6112，子离子的质荷比为786.4175和1247.6375；所述TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ IDNO：2)特异性肽段的离子对中母离子的质荷比为602.7833，子离子的质荷比为975.4530和888.4207；所述GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)特异性肽段的离子对中母离子的质荷比为1120.537，子离子的质荷比为1440.6766和1511.7115。
3.一种鉴别新型冠状病毒奥密克戎株疫苗的检测方法，其包括检测样品中是否存在下述特异性肽段中的一种或多种：针对BA.1变异株的ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1和/或针对BA.4和BA.5变异株的TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)和GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
取样品进行孵育以及酶解处理，将酶解后的上清液进样，采用液相色谱串联质谱检测是否存在所述特异性肽段。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，所述样品为新型冠状病毒奥密克戎株的灭活疫苗及中间产品。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其中，
所述孵育的过程包括：
向待测样品中等体积加入蛋白酶解表面活性剂RapiGEST，于70～90℃条件下孵育20～60min后，接着加入二硫苏糖醇至终浓度为25mmol/L，于65℃条件下孵育60min，温度降至室温后加入碘代乙酰胺溶液至终浓度为50mmol/L，避光室温孵育20～60min，
孵育后进行酶解处理的过程包括：
向220μL孵育后的待测样品中加入NH4HCO3溶液至体积为480μL，接着加入胰蛋白酶溶液20μL，于37℃条件下过夜酶解，酶解反应完成后，加入1μL的甲酸以使胰蛋白酶失活，即结束酶解反应。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其中，液相色谱检测条件如下：
色谱柱：C18柱，优选选用ACQUITY UPLC PEPTIDE BEH C18(2.1mm×100mm)，进样量为5～10μL，色谱柱温度为60℃；
流动相组成：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B在0～20min内含量从0～45％变化进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其中，质谱检测条件如下：
离子传输管温度为320℃，鞘气流速35arb，质谱分析范围是200～2000，最大离子注入时间100ms，目标离子数目3e6，分辨率70000。
9.根据权利要求4～8中任一项所述的检测方法，其中，如果存在质荷比为1235.6112的母离子且质荷比为786.4175和1247.6375的子离子，则表明存在BA.1变异株特异性肽段ISNCVADYSVLYNLAPFFTFK(SEQ ID NO：1)；如果存在质荷比为602.7833的母离子且质荷比为975.4530和888.4207的子离子，则表明存在BA.4或BA.5变异株特异性肽段TQSYTNSFTRGVYYPDK(SEQ ID NO：2)；如果存在质荷比为1120.537的母离子且质荷比为1440.6766和1511.7115的子离子，则表明存在BA.4和BA.5变异株特异性肽段GNEVSQIAPGQTGNIADYNYK(SEQ ID NO：3)。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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