CN112280902A

CN112280902A - 一种TaqMan探针荧光定量PCR检测软疣病毒的方法及应用

Info

Publication number: CN112280902A
Application number: CN202011283234.3A
Authority: CN
Inventors: 张祺; 刘芳; 刘映乐; 邬开朗; 张艳; 朱莹
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Zhejiang Anweiluo Diagnostic Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112280902B

Abstract

本发明公开了一种软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，包括实时荧光PCR检测引物对和探针；所述引物对包括：上游引物如SEQ ID NO.1所示的序列；下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列；所述探针的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。本发明软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，具有良好的特异性，且批内、批间重复性试验结果的变异系数均小于2％，具有良好的重复性；而且灵敏度大大提高，最小检出浓度为3拷贝/mL；检测快速，整个反应过程从待检品提取DNA到结果分析只要1.5h，且避免了后续电泳等步骤。

Description

一种TaqMan探针荧光定量PCR检测软疣病毒的方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物分子检测领域，尤其涉及一种软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus，MCV)是痘病毒科中以人为惟一宿主的另一类病毒。该病毒通过接触传染，感染人后在皮肤上产生良性的肿瘤样病变。主要感染儿童和青年人，也可以通过性接触在成人中传播。在免疫缺陷的病人中通常导致严重感染，常规治疗难以治愈。痘病毒科病毒感染后传染性强，危害性各异，但临床表现均出现皮肤损害，不易区分且容易引起恐慌。传统检测病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它们也有不足的地方，如病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中的潜伏感染。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，更够快速、准确且灵敏地同时检测出软疣病毒，特异性强、灵敏度高。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括实时荧光PCR检测引物对和探针；

所述引物对包括：上游引物如SEQ ID NO.1所示的序列；下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列；

所述探针的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。

优选地，所述探针的5’端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，所述探针3’端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米粒子。所述有机荧光染料为FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述有机猝灭染料为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。

优选地，所述试剂盒还包括：Enzyme Mix、5×PCR Buffer，标准品，对照品。所述阳性标准品为软疣病毒标准品；所述阴性对照品：RNase Free H₂O。

本发明目的之二在于提供一种软疣病毒的实时荧光PCR检测方法，利用所述的软疣病毒实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR扩增。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

步骤1、从样品中提取DNA为模板；

步骤2、以所述DNA为模板，利用所述的实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；

步骤3、对所述扩增曲线进行分析，并做出判断。

优选地，所述步骤2中扩增的反应体系具体包括：权利要求1所述的软疣病毒的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：95度2min；95度15sec、60度1min，40个循环。

优选地，所述步骤3中具体判断规则为：

当Ct≤35时，判断样品为软疣病毒阳性；

当35<Ct≤40时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为软疣病毒阳性，否则判断样品为软疣病毒阴性；

当无扩增曲线时，判断样品为软疣病毒阴性。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，更够快速、准确且灵敏地同时检测出软疣1型和软疣2型病毒，具有特异性强、重复性好、敏感性高、操作简便、耗时短和无污染等优点。具体地：(1)具有良好的特异性，且批内、批间重复性试验结果的变异系数均小于2％，具有良好的重复性；(2)灵敏度大大提高，最小检出浓度为2.87×10²拷贝/μL，是普通PCR的1000倍；(3)检测快速，整个反应过程从待检品提取DNA到结果分析只要1.5h；(4)同时避免了后续电泳等步骤且整个反应过程为闭管操作，减少了污染和人为操作带来的误差，不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为PCR扩增产物电泳图；

图2为标准品实时荧光定量PCR原始扩增曲线；

图3为标准品实时荧光定量PCR标准曲线；

图4为实时荧光定量PCR特异性试验图；

图5是10份MCV阳性样本、阳性对照、阴性对照的荧光定量PCR扩增曲线；

图6是5份MCV阳性样本、4个标准品、阳性对照、阴性对照的荧光定量PCR扩增曲线；

具体实施方式

实施例1

实施例1软疣病毒的实时荧光PCR试剂盒

1、试剂盒的组成

本试剂盒包括软疣病毒的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；

①软疣病毒的一对特异性引物(上游引物和下游引物如表1所示)

②软疣病毒的一条特异性荧光探针(如表1所示)

本实施例中荧光探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BQ1；在其他实施例中也可以选择其他荧光报告基团，其他荧光淬灭基团。具体地，所述荧光报告基团也可替换为VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述荧光淬灭基团也可替换为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-2和BHQ-3。

表1

③阳性对照

软疣病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤5×PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

实施例2软疣病毒的实时荧光检测方法

1、病毒核酸的提取

①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

③将标本取200μl加入此管中，充分混匀；

④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min；重复步骤⑧一次；

⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H2O，室温静置2min。12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

2、实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul DNA作为模板，同时加入20ul PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增；

表2

实时荧光定量PCR反应程序：

步骤③从60℃开始开始荧光检测。

3、检测：本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。

4、结果判断：当Ct≤35时，判断样品为软疣病毒阳性；当35<Ct≤40时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为软疣病毒阳性，否则判断样品为软疣病毒阴性；当没有扩增曲线时，判断样品为软疣病毒阴性。

实施例3软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒的性能测定

一、标准曲线的建立

1、构建重组质粒

(1)目的片段PCR扩增

采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue按照说明书步骤对软疣病毒总DNA进行提取；方法同实施例2，取5μLPCR扩增反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳；

如图1所示，电泳结果显示，扩增出一条大小约为248bp的明亮单一条带，与预期结果一致，该目的片段的序列如SEQ ID NO.4所示。

(2)质粒模板标准品的制备

将目的PCR产物电泳后，用胶回收试剂盒回收，按照目的片段与pMD-18T载体分子比5∶1的比例进行连接、并将连接产物转化入DH5α感受态细胞，同时对转化成功的菌落进行纯化培养，并进行PCR及测序鉴定，最后对阳性重组质粒进行少量提取和纯化，于-20℃保存备用。测序与预期结果一致，含有软疣病毒目的基因的重组质粒构建成功。

2、实时定量荧光PCR反应及标准曲线和回归方程的建立

将少量提取并纯化后的重组质粒在Nano Drop 2000上测得260nm/280nm比值为1.92，满足260nm/280nm值在1.8-2.0要求，测得浓度为100ng/mL，对应浓度的重组质粒拷贝数为3.04×10¹⁰拷贝/mL，将重组质粒稀释到1×10¹⁰拷贝/mL后，再进行10倍梯度稀释，取1×10²～1×10⁸拷贝数的重组质粒作为实时定量PCR的标准品；

经过优化的实时定量PCR扩增反应体系和荧光定量PCR反应条件如实施例2。

再按照模板浓度对数值与达到平台循环数(Ct值)建立标准曲线，横坐标代表质粒拷贝数的对数(x)，纵坐标为Ct值(y)；在此基础上推导出相应的回归方程为y＝-4.154x+41.48，回归方程定量结果准确度的均方误差值为0.0293(<0.2为可接受范围)，结果显示所建立检测体系的荧光曲线与靶基因浓度之间相关性好，准确性高，标准品的扩增曲线如图2所示，标准曲线结果如图3所示。

二、软疣病毒实时荧光定量PCR检测方法的特异性

用建立的荧光定量PCR方法对软疣病毒、其它15种常见皮肤病相关病原体的核酸进行扩增，以双蒸水作阴性对照。

如图4所示，软疣病毒的阳性对照在Ct值22.56处有扩增，扩增曲线均呈S形；阴性对照样品无非特异性扩增；对照组：其它病原体也均无特异性扩增，表明本发明提供的软疣病毒的实时荧光PCR试剂盒的特异性好，具体结果见表3。

表3本发明的特异性分析

阳性病原体	是否有扩增	阳性病原体	是否有扩增
				肠道病毒	无扩增	人疱疹病毒8型	无扩增
人乳头瘤病毒	无扩增	人细小病毒B19	无扩增
				单纯疱疹病毒	无扩增	伤寒沙门菌	无扩增
EB病毒	无扩增	副伤寒沙门菌	无扩增
				巨细胞病毒	无扩增	A组链球菌	无扩增
水痘带状疱疹病毒	无扩增	伯氏疏螺旋体	无扩增
				人疱疹病毒6型	无扩增	立克次氏体	无扩增
人疱疹病毒7型	无扩增

三、软疣病毒实时荧光定量PCR检测方法的灵敏性

灵敏度也即最低检测限，是指将阳性标本经过梯度稀释后，在最低稀释梯度的同一个标本上中测到靶核酸的可能性在统计学上概率>95％。用于灵敏度评估的样本在每个需评估的浓度水平检测次数应不少于20次，以至少19次出现阳性扩增信号为合格。在此，我们将软疣病毒阳性标准品按一定拷贝数倍比稀释后，每一个稀释度平均分为40个样本，用此发明的方法进行检测，出现38次及以上阳性的该拷贝数即为最低检测限，结果见表4。经验证，在3拷贝/mL浓度时，检出率为95％，低于此浓度时，检出率不足95％。由此可见，表明本发明提供的软疣病毒实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度为3拷贝/mL，证明方法具有很好的敏感性。

表4本发明的灵敏度分析

三、软疣病毒实时荧光定量PCR检测方法的重复性分析

选用1×10¹-1×10⁵拷贝/μL的阳性重组质粒作为模板，每个浓度重复3孔进行组内重复性检测；进行批间重复性检测时，同一次反应每个浓度重复3孔，重复3次反应，比较Ct值和Tm值的变化情况，验证该方法的重复性和稳定性，同时设阴性对照。由表1可知，3次批内和批间重复性试验的变异系数均小于2％，表明建立的荧光定量PCR的方法具有较好的重复性。

表5实时荧光定量PCR的批内与批间重复性试验

实施例4临床样品检测

如图5，用实施例2所述的方法对10份已确认MCV阳性标本进行检测，其中检出10份标本被检出，正确率达到100％。

如图6，用实施例2所述的方法对另外5份已确认MCV阳性的标本进行检测，同时进行定量分析，5份阳性标本均被检出，根据标准品得到的浓度方程计算这5份标本的浓度，数据如下表6，正确率100％。

表6 5份MCV阳性标本的Ct值和浓度

样品编号	Ct值	MCV浓度(拷贝数/mL)
			样品1	29.54	2.97×10<sup>4</sup>
样品2	24.96	6.21×10<sup>5</sup>
			样品3	27.42	1.22×10<sup>5</sup>
样品4	31.49	8.13×10<sup>3</sup>
			样品5	22.09	4.16×10<sup>6</sup>

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种TaqMan探针荧光定量PCR检测软疣病毒的方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gataatattt aattcctaat ttgacaaccc ct 32

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgttctgg gctcaagtct cccc 24

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actcagcgac ttccgcgccg tcttcgaagg 30

<210> 4

<211> 248

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggacagc accgccctcg agaaccacca gcagagcggc gcgctctcgg aagccatgaa 60

actcagcgac ttccgcgccg tcttcgaagg gctgaagaag agcgttcccc ttacgaattt 120

ggagatgatc aatgagtgag tgcccccctc ttcaagcggt caggccgggc gcggtagctc 180

gtgcctgtcg gcacatctct cagggcagcg aaaagtaggg gggtggggag acttgagccc 240

agaacatg 248

Claims

1.一种软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括实时荧光PCR检测引物对和探针；

所述探针的序列为如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团；

该引物和探针组合扩增的产物序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，所述探针3’端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米粒子。

3.如权利要求2所述的软疣病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述有机荧光染料为FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述有机猝灭染料为TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。

4.如权利要求1所述的软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Enzyme Mix、5×PCR Buffer，标准品，对照品。

5.如权利要求4所述的软疣病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为软疣病毒标准品；所述阴性对照品：RNase Free H₂O。

6.一种软疣病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一所述的软疣病毒实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR扩增。

7.如权利要求6所述的软疣病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、从样品中提取DNA为模板；

步骤2、以所述DNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；

步骤3、对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。

8.如权利要求7所述的软疣病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤2中扩增的反应体系具体包括：权利要求1所述的软疣病毒的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：95度2min；95度15sec、60度1min，40个循环。

9.如权利要求8所述的软疣病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤3中具体判断规则为：

当Ct≤35时，判断样品为软疣病毒阳性；

当无扩增曲线时，判断样品为软疣病毒阴性。