CN114622038A - 微滴式数字pcr检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用，属于禽圆环病毒2型检测技术领域，所述引物组包括上游引物AGV2‑F和下游引物AGV2‑R，探针为AGV2‑P，检测过程为参考GenBank中AGV2的VP基因保守序列，设计筛选了特异性探针和引物，通过对反应条件的优化，评估特异性、敏感性和重复性试验。本发明对其他常见鸡病病原体进行检测，均为阴性，且灵敏度达到了3.2个拷贝/反应，是荧光PCR和普通PCR的10倍和100倍，具有很高的敏感性，满足病毒快速检测的要求。
Description
技术领域
本发明涉及禽圆环病毒2型检测技术领域，尤其涉及微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用。
背景技术
禽圆环病毒2型AGV2是2011年Rijsewijk等人首次在巴西的病鸡中发现的一种新发传染病。AGV2是鸡传染性贫血病毒(CAV)相关的环形病毒。同年，与AGV2序列同源性较高的一种人类病毒(HGyV)在法国人群的皮肤中被检出。2015年，新型环形病毒AGV2首次在中国内地的鸡群和健康的人群中发现。Bullenkamp等研究表明AGV2的VP3蛋白与CAV的VP3蛋白结构类似，能诱导癌细胞凋亡。AGV2已经在不同的地区(如意大利、南非、美国、巴西和荷兰)被检测到，这表明该病毒分布范围比较广。此外，一项检测市场销售的家禽疫苗是否被AGV2污染的研究中发现，巴西、加拿大和荷兰产的32株活性疫苗中发现有9株疫苗含有AGV2，这可能是造成AGV2分布范围比较广的原因。越来越多的证据表明AGV2对鸡和人均具有感染性，这不仅对家禽业而且对人类的健康也构成了巨大的潜在威胁。
目前，针对AGV2的检测方法很多，其中，鸡胚病毒分离与鉴定是确诊该病的“金标准”，但病毒分离培养操作繁琐，所需要的时间较长，影响其有效分离到病毒的因素较多；PCR和荧光定量PCR方法较为常用，但其灵敏度仍有待提高，特别是在病毒含量极低时常会出现假阴性或可疑结果的情况，所以有必要建立一种灵敏度更高、更准确的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组、探针及应用，解决背景技术中提到的技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针，所述引物组和探针的核苷酸序列如下所示：
上游引物AGV2-F：5’GACGATGGAGGAGTCACTGGTT 3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物AGV2-R：5’GTCCGTCTGGGTYTCCTGTGT 3’(SEQ IDNO：2)；
探针AGV2-P：5’FAM-CAGGAGGCTAGTGGACT-BHQ13’(SEQ ID NO：3)。
进一步地，所述上游引物AGV2-F、下游引物AGV2-R和探针AGV2-P的摩尔比为9:9:5。
微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，退火温度为54.0℃。
微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，总的扩增体系为20μL：dd PCRTMSupermix forProbe 10μL，设置6个不同引物探针组合，浓度为600、600、900、900、1200、1200nmol/L上下游引物各1μL，对应浓度梯度为150、300、250、500、350、600nmol/L的探针1μL，模板2μL，最后用ddH2O补足20μL反应体系。
进一步地。在PCR扩增中，ddPCR反应程序为：95℃预变性10min；94℃30s，退火温度60.0～50.0℃，40个循环，98℃固化10min，4℃结束反应，升降温度设置2.0℃/s。
进一步地。在PCR扩增中，Real-time PCR反应体系为20μL：Probe qPCR Mix，withUNG 10μL，浓度为900nmol/L，探针0.8μL，浓度为900nmol/L，ROX Reference Dye 0.4μL，模板2μL，ddH2O 6μL。
进一步地。在PCR扩增中，反应程序：95℃预变性30s；95℃5s，退火温度60℃34s，40个循环；4℃结束反应。
微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，只用于检测病毒，所述方法包括如下步骤：
步骤1：设计上述的引物组和探针，准备标准品制备参考文献引物AGV2-376F和AGV2-376R；
步骤2：DNA/RNA抽提及反转录，参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取AGV2、CIAV和ChPV的DNA，同时抽提ANV、AIV-H9、NDV和IBV的RNA，使用反转录试剂按说明书将RNA反转录成cDNA，产物均保存于-30℃冰箱备用；
步骤3：制备质粒标准品，将质粒标准品倍比稀释至107-10-3拷贝/μL，然后以其为模板，分别进行ddPCR。
步骤4：设计上述的反应体系；
步骤5：特异性试验，在已优化的ddPCR反应条件基础上，对AGV2、CIAV、ANV、ChPV、AIV-H9、NDV和IBV待检DNA/cDNA样品进行检测，同时检测阴性对照，评估特异性；
步骤6：敏感性试验，使用NanDrop ND-2000微量核酸检测仪对AGV2的标准品进行测定，对已知浓度的质粒标准品倍比稀释至107-10-3拷贝/μL，然后以其为模板，分别进行ddPCR、Real-time PCR和普通PCR，评估灵敏性；
步骤7：重复性试验，在步骤4中的体系中加入相同的阳性模板，分3个标本同时检测，通过计算变异系数CV来验证ddPCR的批内重复性，三天后重复检测保存于-30℃的模板DNA，来验证dd PCR的批间重复性。
进一步地，步骤3的具体过程为，将步骤1中的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL，含25μL PCR Mix、1μmol/L引物AGV2-376F和AGV2-376R、19μLddH2O、4μL DNA模板，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，55℃60s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，得到376bp PCR产物，将该PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到AGV2-376质粒，测序AGV2-376质粒，该质粒中含有的PCR产物大小为376bp,测序结果经序列比对分析，扩增的目的片段均与相应序列同源性高达100％，说明为阳性质粒，含有禽圆圈病毒2型的保守序列。
进一步地，步骤1中的最佳探针浓度为500nmol/L，最佳上下游浓度均为900nmol/L，步骤4中的反应体系退火温度为54.0℃。
微滴式数字PCR(droplet digital PCR，dd PCR)技术属于第3代PCR技术，该技术不仅可以对病原体定性，还能对病原体核酸序列进行绝对定量，可以说敏感性和准确性均比传统荧光定量PCR方法高。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，定量估算起始模板浓度，并对基因表达进行绝对定量。本研究建立并优化了AGV2 ddPCR检测方法，为AGV2的准确检测和科学研究提供了一种新的技术手段。
本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明灵敏度达了3.2个拷贝/反应，是荧光PCR和普通PCR的10倍和100倍，对常见鸡病病原体进行检测，且灵敏度荧光定量PCR和普通重PCR相比，并不受影响，具有很高的敏感性，满足病毒快速检测的要求。
附图说明
图1是本发明AGV2 ddPCR温度优化试验结果图；
图2是本发明AGV2 ddPCR特异性试验结果图；
图3是本发明AGV2 ddPCR敏感性试验结果图；
图4是本发明AGV2荧光定量PCR敏感性试验结果图；
图5是本发明AGV2普通PCR敏感性试验结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
实施例1：
材料准备：
主要病原体，禽圆环病毒2型(Avian Gyrovirus 2，AGV2)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽肾炎病毒(aviannephritis virus，ANV)、鸡细小病毒(chicken parvovirus，ChPV)、禽流感病毒H9亚型(Avian Influenza Virus H9 sutype，AIV-H9)、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(Avian InfectiousBronchitis，IBV)等，如表1，由本实验室保存。
表1病原体来源
主要试剂，DNA/RNA提取试剂盒购于PerkinElmer公司(美国)；2×Taq PCR Mix、胶回收试剂盒均购自全式金生物技术有限公司(北京)；Probe qPCR Mix，with UNG、反转录试剂、pMD 18TVector、1000bp Marker、ddH2O购自宝生物工程有限公司(大连)；ddPCRTMSupermix forProbe、微滴生成油、微滴生成卡槽及胶垫、96孔板、封口膜等均购自伯乐公司(美国)。
主要仪器，全自动核酸提取仪购自PerkinElmer公司(美国)；生物安全柜，购自Baker公司(美国)；PCR扩增仪、凝胶成像系统、微滴式数字PCR系统QX200，购自Bio-Rad公司(美国)；高速离心机，购自贝克曼公司(美国)；NanDrop ND-2000微量核酸检测仪，AppliedBiosystems QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪均购自赛默飞公司(美国)；移液枪，购自吉尔森公司(法国)。
引物的设计与合成，根据GenBank中AGV2的VP基因保守序列，采用Primer Express3.0软件设计引物、DNAStar软件以及NCBI的Blast进行比对筛选，以FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团，由生工生物工程股份有限公司(上海)合成了一对AGV2 ddPCR特异性引物AGV2-F、AGV2-R和探针AGV2-P(表2)。标准品制备参考文献引物AGV2-376F和AGV2-376R。
表2 AGV2特异性引物序列
DNA/RNA抽提及反转录，参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取CIAV和ChPV的DNA；同时抽提ANV、AIV-H9、NDV和IBV的RNA，使用反转录试剂按说明书将RNA反转录成cDNA。上述产物均保存于-30℃冰箱备用。
质粒标准品的制备，以上述得到的AGV2的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含25μL PCR Mix、1μmol/L引物(AGV2-376F和AGV2-376R)、19μLddH2O、4μL DNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，55℃60s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min。得到376bp PCR产物，将该PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到AGV2-376质粒；测序AGV2-376质粒，该质粒中含有的PCR产物大小为376bp,测序结果经序列比对分析，扩增的目的片段均与相应序列同源性高达100％，说明为阳性质粒，含有禽圆圈病毒2型保守序列。将质粒标准品倍比稀释至107-10-3拷贝/μL，然后以其为模板，分别进行ddPCR。
反应条件的优化，总的扩增体系为20μL：dd PCRTMSupermix forProbe 10μL，设置6个不同引物探针组合，浓度为600、600、900、900、1200、1200nmol/L上下游引物各1μL，对应浓度梯度为150、300、250、500、350、600nmol/L的探针1μL，，模板2μL，最后用ddH2O补足20μL反应体系。dd PCR反应程序为：95℃预变性10min；94℃30s，退火温度60.0～50.0℃，40个循环，98℃固化10min，4℃结束反应，升降温度设置2.0℃/s。Real-time PCR反应体系为20μL：Probe qPCR Mix，with UNG 10μL，浓度为900nmol/L，探针0.8μL，浓度为900nmol/L，ROXReference Dye 0.4μL，模板2μL，ddH2O 6μL。反应程序：95℃预变性30s；95℃5s，退火温度60℃34s，40个循环；4℃结束反应。
特异性试验，在已优化的ddPCR反应条件基础上，对AGV2、CIAV、ANV、ChPV、AIV-H9、NDV和IBV待检DNA/cDNA样品进行检测，同时检测阴性对照，评估所建立的ddPCR方法的特异性。
敏感性试验，使用NanDrop ND-2000微量核酸检测仪对AGV2的标准品进行测定，对已知浓度的质粒标准品倍比稀释至107-10-3拷贝/μL，然后以其为模板，分别进行ddPCR、Real-time PCR和普通PCR。评估本研究AGV2 dd PCR方法的灵敏性。
重复性试验，采用优化好的AGV2微滴式数字PCR方法，在相同体系中加入相同的阳性模板，分3个标本同时检测。通过计算C变异系数(CV)来验证dd PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-30℃的模板DNA，来验证ddPCR的批间重复性。
临床样品检测试验，对从2021年11月至2021年12月南宁活禽市场采集的40份棉拭子样品，应用所建立的dd PCR和Real-time PCR方法分别进行检测，试验重复两次。
实施例2：
该实施例与实施例1不同的是探针引物浓度均为500nmol/L；最佳退火温度为54.0℃，其它实施过程相同。
通过对AGV2 ddPCR的引物探针比例、TM值等的优化，最佳探针浓度为500nmol/L，最佳上下游引物浓度均为900nmol/L；最佳反应条件：95℃预变性10min；94℃30s，退火温度54.0℃，40个循环，98℃固化10min，4℃结束反应，升降温度设置2.0℃/s，如图1所示，1-7的温度为：59.4℃、58.1℃、56.2℃、54℃、52.1℃、50.7℃、50℃，N：阴性对照。
特异性试验结果，AGV2微滴数字RT-PCR方法的特异性验证结果表明，除AGV2出现特异性扩增以外，其余检测项目均为阴性(图2)。说明该方法特异性良好，与常见禽源病毒无交叉反应。图2中，P:阳性对照；N：阴性对照；1-6：AIV-H9、NDV、ChPV、ANV、CIAV、IBV。
敏感性试验结果，将已知浓度的AGV2质粒标准品进行10倍梯度稀释107～10-3拷贝/μL，应用优化的AGV2 dd PCR、Real-time PCR和普通PCR对各稀释梯度的模板进行检测。结果表明，本研究建立的AGV2 dd PCR检测方法最低能检测到3.2拷贝/反应(图3)，荧光定量PCR最低能检测到101拷贝/μL，普通PCR最低能检测到102拷贝/μL。图3中，N：阴性对照；1-7：103、102、101、100、10-1、10-2、10-3拷贝/μL。图4中AGV2荧光定量PCR敏感性试验结果图，N：阴性对照；1-7：107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL。图5中AGV2普通PCR敏感性试验结果图，M：1000bp Marker N：阴性对照：N；1-7：107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL。
重复性试验结果，针对两组不同浓度的模板，同一份样品进行三次AGV2微滴数字PCR反应，检测结果分别为145、146和154拷贝/μL，25.8、26.8和24.9拷贝/μL，其变异系数CV为2.79％和3.68％。三天后重复检测这两组保存于-30℃的阳性模板，检测结果分别为145、140和138拷贝/μL，28.7、26.6和26.0拷贝/μL，其变异系数CV为2.56％和5.23％。说明该方法批内与批间重复性好，稳定度高，检测结果准确可靠。
临床样品检测结果，40份鸡棉拭子样品结果显示，AGV2 dd PCR、Real-time PCR均检出5份的AGV2阳性，其余35份棉拭子样品均为阴性，重复检测结果一致。
传统病毒鉴定方法耗时长，敏感性也不高，无法实现快速检测。微滴式数字PCR(droplet digital PCR，dd PCR)技术属于第3代PCR检测技术，是一种基于水-油乳化液滴新型检测技术。该方法在近几年逐渐应用在人和动植物病原微生物的检测，也应用于转基因分析、肿瘤相关基因检测等多个领域。数字PCR检测方法无需建立标准曲线，不仅能对病原体进行定性，还可以对其核酸序列进行绝对定量，灵敏度和准确度均优于传统PCR和real-time PCR方法，不仅节省了人力物力，提高了检测效率，大大缩短了检测时间，还有利于预防、控制和消除此类疫病。本研究根据AGV2的保守基因序列设计和筛选出探针及特异性引物，通过对反应条件和体系的优化，确定最佳探针浓度为500nmol/L，最佳上下游浓度均为900nmol/L。54.0℃为本研究建立的ddPCR方法最佳退火温度。
通过评估所建立AGV2微滴式数字PCR的特异性、敏感性和重复性实验，该方法能特异性检测AGV2病毒，而对常见的鸡病包括ANV、CIAV、AIV-H9、NDV、ChPV和IBV等进行检测，均没有出现特异性目的条带。且灵敏度荧光定量PCR和普通重PCR相比，并不受影响，最低能检出3.2拷贝/μL，具有很高的敏感性，满足病毒检测的要求，完全能够达到快速检测样品病毒目的。
利用本研究建立的AGV2 dd PCR检测方法，对从2021年11月至2021年12月的采集的40份鸡棉拭子进行检测，与荧光定量PCR和测序方法得出的结果相符合。因此，本研究建立AGV2 dd PCR检测方法可用于快速检测的AGV2感染，具有很高的临床实用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针，其特征在于：所述引物组和探针的核苷酸序列如下所示：
上游引物AGV2-F：5’GACGATGGAGGAGTCACTGGTT 3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物AGV2-R：5’GTCCGTCTGGGTYTCCTGTGT 3’(SEQ ID NO：2)；
探针AGV2-P：5’FAM-CAGGAGGCTAGTGGACT-BHQ1 3’(SEQ ID NO：3)。
2.根据权利要求1所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针，其特征在于：所述上游引物AGV2-F、下游引物AGV2-R和探针AGV2-P的摩尔比为9:9:5。
3.根据权利要求1所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，其特征在于：退火温度为54.0℃。
4.微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，其特征在于：总的扩增体系为20μL：dd PCRTMSupermix for Probe 10μL，设置6个不同引物探针组合，浓度为600、600、900、900、1200、1200nmol/L上下游引物各1μL，对应浓度梯度为150、300、250、500、350、600nmol/L的探针1μL，模板2μL，最后用ddH2O补足20μL反应体系。
5.根据权利要求4所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，其特征在于：dd PCR反应程序为：95℃预变性10min；94℃30s，退火温度60.0～50.0℃，40个循环，98℃固化10min，4℃结束反应，升降温度设置2.0℃/s。
6.根据权利要求5所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，其特征在于：Real-time PCR反应体系为20μL：Probe qPCR Mix，with UNG 10μL，上下游引物各0.4μL，浓度为900nmol/L，探针0.8μL，浓度为900nmol/L，ROX ReferenceDye 0.4μL，模板2μL，ddH2O 6μL。
7.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用，其特征在于：反应程序：95℃预变性30s；95℃5s，退火温度60℃34s，40个循环；4℃结束反应。
8.微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1：设计权利要求1的引物组和探针，准备标准品制备参考文献引物AGV2-376F和AGV2-376R；
步骤2：DNA/RNA抽提及反转录，参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取AGV2、CIAV和ChPV的DNA，同时抽提ANV、AIV-H9、NDV和IBV的RNA，使用反转录试剂按说明书将RNA反转录成cDNA，产物均保存于-30℃冰箱备用；
步骤3：制备质粒标准品，将质粒标准品倍比稀释至107-10-3拷贝/μL，然后以其为模板，分别进行ddPCR。
步骤4：设计权利要求4的反应体系；
步骤5：特异性试验，在已优化的ddPCR反应条件基础上，对AGV2、CIAV、ANV、ChPV、AIV-H9、NDV和IBV待检DNA/cDNA样品进行检测，同时检测阴性对照，评估特异性；
步骤6：敏感性试验，使用NanDrop ND-2000微量核酸检测仪对AGV2的标准品进行测定，对已知浓度的质粒标准品倍比稀释至107-10-3拷贝/μL，然后以其为模板，分别进行ddPCR、Real-time PCR和普通PCR，评估灵敏性；
步骤7：重复性试验，在步骤4中的体系中加入相同的阳性模板，分3个标本同时检测，通过计算变异系数CV来验证dd PCR的批内重复性，三天后重复检测保存于-30℃的模板DNA，来验证dd PCR的批间重复性。
9.根据权利要求8所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的方法，其特征在于：步骤3的具体过程为，将步骤1中的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL，含25μL PCR Mix、1μmol/L引物AGV2-376F和AGV2-376R、19μLddH2O、4μL DNA模板，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，55℃60s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，得到376bp PCR产物，将该PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到AGV2-376质粒，测序AGV2-376质粒，该质粒中含有的PCR产物大小为376bp，测序结果经序列比对分析，扩增的目的片段均与相应序列同源性高达100％，说明为阳性质粒，含有禽圆圈病毒2型保守序列。
10.根据权利要求8所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的方法，其特征在于：步骤1中的最佳探针浓度为500nmol/L，最佳上下游浓度均为900nmol/L，步骤4中的反应体系最佳退火温度为54.0℃。
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