JP5650887B2 - 生物サンプル中の微生物の存在の高スループット試験 - Google Patents
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Description
(a)前記生物サンプルを第1位置において固体基質上および/又は固体基質内に固定する工程と、
(b)前記固定された生物サンプルを、少なくとも第2位置へと移し、前記固体基質上および/又は固体基質内に固定された微生物DNAを抽出するべく前記固体基質に対して抽出工程を実行する工程と、
(c)工程(b)にて抽出された微生物DNAに対して核酸増幅を実行する工程、ここで、前記増幅工程は、単数又は複数種の微生物から、少なくとも一種の高度に保存された配列を増幅するように構成され、増幅された配列が標的配列として指定される、
(d)前記標的配列を、診断マルチプレックスパネル(DMP)から構成される複数のプライマー配列と組み合わせる工程、ここで、各プライマー配列は前記標的配列の遺伝子型決定を容易にする、
(e)前記工程(d)における前記標的配列とDMPとの組み合わせに対してプライマー伸長反応を行い、それによって、DMP反応産物を作り出す、そして
(f)前記反応産物中に存在する標的配列の遺伝子型を決定し、前記本能産物中の標的配列の遺伝子型を前記生物サンプル中に存在する特定の微生物の固体識別と相関させる工程、とを有する。
図1−1〜2は、高度に保存されたDNAコンセンサス配列の概略を図示している−前記コンセンサス配列は、同じ種の複数の株の比較によって作り出された-前記増幅又はプライマー伸長反応のためのプライマーが本発明のDMP中における使用のために選択される位置が図示されている。各プライマーにおいて、最初の二つの文字は微生物を示し、その後の文字は前記種(1−3)のための標的配列を示す、第1PCRPは第1PCRプライマーを示し、第2PCRPは第2PCRプライマーを示し、E1又はE2は伸長プライマーを示し、ウレアプラズマについては、前記プライマーが指定された(UU1とUU2)二つの部位が存在する。これらプライマーの独自性が表1−1〜4に示されている。前記生物体は:(a)カンジダ・アルビカンス(Candida albicans);(b)クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis);(c)ガードネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis);(d)マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitallium);(e)マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis);(f)ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoea);(g)トレポネーマ・パリヅム(Treponema pallidum);(h)トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis);(f)ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)である。
本発明を記載するに当たって、本発明の理解を助ける多くの定義が提供される。疑念を回避するために、ここに挙げられる全ての参考文献の全体をここに合体させる。特に定義されない限り、ここに使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般的な分子生物学的技術が記載される場合、当業者はそのような技術について、例えば、サムブルック,ジェイ(Sambrook J.)他, (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYなどの標準的テキストから知識をうるものと予想される。
・Whatman FTA Elute(登録商標)ペーパーは、ヒト尿サンプルに由来する細菌、ウイルス、原生生物および/又は真菌病原体の適切な媒体であること。
・Whatman FTA Elute(登録商標)ペーパー内に存在する化合物も尿も、下流側の酵素試験処理の障害とはならないこと。
・前記新規STIMPは、DMPとして機能し、病原体混合物からの個々の病原体を検出可能であること。
全部で44サンプルを、ウクライナにある私設GUM(泌尿器医療)クリニックに通う患者から得た。
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)
クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)
ガードネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)
マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitallium)
マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)
トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)
トレポネーマ・パリヅム(Treponema pallidum)
ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)
DNA抽出
DNA濃度の違いに対応するために(account for)、各Whatman FTA Elute(登録商標)サンプルカードから6枚の6mmのサンプルディスクを、各2mlチューブにつき1×サークル、各2mlチューブにつき2×サークル、各2mlチューブにつき3×サークルの順序で手持ち式穿孔装置を使用して切断した。各サンプルカードの切断後、クリーンなフィルタペーパーを3回穿孔し、その後、70% EtOHに漬けたフィルタペーパーを3回穿孔することによって穿孔装置を洗浄した。相互汚染を明らかにするために、次に、クリーンなWhatman FTA Elute(登録商標)カードを一回穿孔し、DNAを下記のように抽出した(チューブ番号4)。
国際寄託当局(NCTC)から得た下記の細胞株を陽性対照として使用した。
細胞株番号 種
NC12700 N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)
NC11148 N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)
NC08448 N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)
NC10177 U. ウレアリチカム(U. urealyticum)
NC10111 M. ホミニス(M. hominis)
NC10915 G. バギナリス(G. vaginalis)
NCPF3179 C. アルビカス(C. albicans)
NC10195 M. ゲニタリウム(M. genitallum)
NC12700 N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)
NC10177 U. ウレアリチカム(U. urealyticum)
NC10111 M. ホミニス(M. hominis)
NC10915 G. バギナリス(G. vaginalis)
NCPF3179 C. アルビカス(C. albicans)
NC10195 M. ゲニタリウム(M. genitallum)
NC11148 N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)
NC10177 U. ウレアリチカム(U. urealyticum)
NC10111 M. ホミニス(M. hominis)
NC10915 G. バギナリス(G. vaginalis)
NCPF3179 C. アルビカス(C. albicans)
NC10195 M. ゲニタリウム(M. genitallum)
NC08448 N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)
NC10177 U. ウレアリチカム(U. urealyticum)
NC10111 M. ホミニス(M. hominis)
NC10915 G. バギナリス(G. vaginalis)
NCPF3179 C. アルビカス(C. albicans)
NC10195 M. ゲニタリウム(M. genitallum)
DMPアッセイ構成は、対象種の異なる株間において高度に保存されたDNA配列に基づくものである。大きな変動性に対処するために、各病原体に対して3つのアッセイを構成するために保存領域の3つの異なる領域を使用した。全ての病原体に関して、選択された保存領域は、選択された保存領域が18S rRNA遺伝子であったC. アルビカンス(C. albicans)を除いて、16S rRNA遺伝子であった(図1を参照)。
C. アルビカンス(C. albicans)
C. トラコマチス(C. trachomatis)
G. バギナリス(G. vaginalis)
M. ゲニタリウム(M. genitallium)
M. ホミニス(M. hominis)
N. ゴノレア(N. gonorrhoea)
T. バギナリス(T. vaginalis)
T. パリヅム(T. pallidum)
U. ウレアリチカム(U. urealyticum)
PCR増幅を、1.25×HotStar(登録商標) PCRバッファー、1.625 mM MgCl2、0.04mM の各dNTP、0.1μMの各プライマー、そして0.1UのHotStarTaq(登録商標)を含む5μlの反応量中で行った。サイクルパラメータは下記の通りである。
95℃ 15分
94℃ 20秒
56℃ 30秒
72℃ 1分、を45サイクル
72℃ 3分
4℃ 5分
15℃ 恒久的
PCR増幅後、下記を各チューブに添加した。1.53μlのH2O、0.17μlのTSバッファー、そして0.30μlのSAP。反応は下記のパラメータを使用して行われた。
37℃ 20分
85℃ 5分
4℃ 恒久的
プライマー伸長を、iPLEX(登録商標)プロトコル(Sequenom Inc., San Diego、CA、USA)に従って行った。インキュベーション後、1×iPLEXバッファー、1×iPLEX終結混合物、0.625μMの各伸長プライマー、そして1×iPLEX酵素、を含むiPLEXプライマー伸長混合物2μlを各チューブに添加した。iPLEX反応は下記のパラメーターを使用して行われた。
94℃ 30秒
94℃ 5秒
52℃ 5秒
80℃ 5秒
工程3へ進む×5回
工程2へ進む×40回
72℃ 3分
4℃ 恒久的
16μlのH2Oと6mgのSpectroCLEAN(登録商標)樹脂を上記混合物に添加し、円形シェーカで30分間回転させ、その後、5分間3,000gで遠心分離して前記樹脂を沈殿させた。
9ナノリットルの各サンプルを、MassARRY(登録商標) Nanospotterロボットを製造業者の指示に従って使用して384 SpectroCHIP(登録商標)上にスポッティングした。次に、各チップをMALDI-TOF質量分析計、MassARRY(登録商標) Compact Analyser上で読み取り、Typer v.3.3(又はその上位機種)を使用してデータを収集し、データベースに保存した。
それぞれのアッセイ(DNA標的)において、ある特定の競合配列が、人工的に導入された一塩基遺伝子多型(SNP)において標的DNAと異なるように設計された。後者は、遺伝子型同定ソフトウエアによってMUT(変異)遺伝子型として指定された。病原性SNPは、C(対照)遺伝子型として指定された。競合配列と標的DNAとの両方が反応中に存在する場合は、前記ソフトウエアによって、C. MUT又はMUT.Cと命名された異型接合性の遺伝子型としてスコアされた。前記異型接合性遺伝子型中の対立遺伝子の順序は、反応中にける対応のDNAの相対的比率を反映している。
Whatman FTA Elute(登録商標)ペーパー
Whatman FTA Elute(登録商標)ペーパー又は尿内に存在する任意の化合物が、下流側の酵素処理に干渉しうるか否かを調べるために、既知の良質なDNAの一定分量を含有する一連の偽サンプルを、1、2又は3枚のサンプルディスクの抽出後に得られた溶出液、又は新鮮な尿、の何れかと1:1で希釈した。次に、これらのサンプルを、PCRと他の下流側の酵素反応に使用した。全てのサンプルにつき、良質なPCR産物と質量スペクトルが得られた(データ提供無し)。このことは、選択した抽出法と洗浄プロトコルとがMALDI-TOF分析用として適当であったこと、そして、ヒトの尿中の物質が、DMP分析の信頼性に大きく影響しないこと、を示している。
全てのサンプルを、競合対照配列を含む、又は含まない反応において試験した。競合配列が含まれる実験では、陽性対照を含める大半のケースで、競合DNAに対するシグナルが生成された。
STIMP/DMP法が病原体混合物からの個々の病原体を検出するために使用可能であるか否かを確認するために、NCTCから得た性感染病原を混合することによって得られた三つの陽性対照を、媒体として尿を使用して作成した(上記を参照)。これら陽性対照サンプルを、尿サンプルとTFA Elute(登録商標)ペーパーサンプルとの両方として分析した(表3)。全てのケースにおいて、サンプル内の各病原体の存在は、その性質とは独立して検出された。陽性対照は、それらの内部にN. ゴノレア(N. gonorrhoeae)の株が存在することにおいて異なっていた。この種の全てのアッセイにおいて、前記STIMP/DMP法は、株タイプから独立して、N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)の存在を検出することができた。このことは、前記N. ゴノレア(N. gonorrhoeae)アッセイを開発するために選択されたDNAの領域は株依存特異性を示さず、サンプル中の既知のN. ゴノレア(N. gonorrhoeae)種の存在を検出するために使用可能である、ということを示している。
臨床サンプルを分析するとき、STIMP/DMPラボ結果によって、すべてのケースにおいてクリニックから独立的に得られ分析された結果を確認した(表2)。又、複数のサンプルが、試験研究所によって検出されなかった感染症について陽性であると同定された。しかし、前記病原体は全てのアッセイによっては検出されず、又、1つ(稀に二つ)のDNAサンプルだけが、陽性シグナルを有していたことから、これらの結果はこのパイロット研究の人工産物として処理されるべきである。大半のケースにおいて、これは、そのサンプルが予め穿孔されていたサンプルカード上にあった患者が特定の病原体について陽性であった(例えば、患者2及び3−U. ウレアリチカム(U. urealyticum)、患者11及び12−M. ゲニタリウム(M. genitallum)等)場合に起こった。これらの人工産物の最もありそうな説明は、前のサンプルからのDNAの持ち込みである。これは、患者サンプル間において使用された汚染対照サンプル(クリーンなWhatman ETA Elute(登録商標)カード)も、同じ感染症について陽性であることが判ったという事実によって裏付けられる。明らかに、このことは、本発明のDMPの高い感度を示すものであり、相互汚染を回避するために将来の実験手順は最適化されることになるであろう。
Claims (25)
- 潜在的に微生物を含む生物サンプル内に2以上の種の特定の微生物が存在するか否かを決定するための方法であって、以下の工程、(a)前記生物サンプルを第1位置において
固体基質上および/又は固体基質内に固定する工程、
(b)前記固定された生物サンプルを、少なくとも第2位置に移行させ、前記固定基質上および/又は固体基質内に固定された任意の微生物DNAを抽出するべく前記固定基質に対して抽出工程を実行する工程、
(c)前記工程(b)にて抽出された微生物DNAに対して核酸増幅を実行する工程、ここで、この増幅工程は、2以上の種の特定の微生物から、複数の高度に保存された配列の増幅に向けられた複数の増幅プライマーを含み、増幅された配列が標的配列として指定される、
(d)前記標的配列を診断マルチプレックスパネル(DMP)内に含まれる複数のプライマー配列と組み合わせる工程、ここで、各プライマー配列は前記標的配列の遺伝子型決定を容易にする、
(e)工程(d)に存在する前記標的配列と前記DMPとの組み合わせに対してプライマー伸長反応を行い、それによって、DMP反応産物を作り出す工程、そして、
(f)存在する任意の標的配列の遺伝子型を決定するべく前記反応産物を分析し、前記反応産物中の前記標的配列の遺伝子型を、前記生物サンプル中に存在する特定の微生物の個体識別と相関させる工程を含み、そして、
前記特定の微生物が、マイコプラズマ(Mycoplasma)属、クラミジア(Chlamydia)属、ウレアプラズマ(Ureaplasma)属、ナイセリア(Neisseria)属、ガードネレラ(Gardnerella)属、トリコモナス(Tricomonas)属、及びトレポネーマ(Treponema)属、カンジダ・アルビカンス(Candidaalbicans)から成る単数又は複数の群から選択され、そして、
前記DMPが、配列番号31〜45から選択される単数又は複数のプライマー配列及び/又は配列番号76〜90から選択される単数又は複数のプライマー配列を含む、方法。 - 前記第1位置が、前記第2位置から離間している請求項1に記載の方法。
- 前記生物サンプルは、尿、唾液、血液、痰、精液、便、鼻のスワブ、涙、膣スワブ、直腸スワブ、頸部スミア、組織生検、及び尿道スワブから成る群から選択される少なくとも1つである請求項1又は2に記載の方法。
- 前記生物サンプルが、前記第1位置において固定基質上および/又は固体基質内に固定され、前記第2位置において、この固体基質に対して抽出工程を実行して前記固定基質上および/又は固体基質内に固定された微生物DNAを抽出する請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記固体基質が、前記生物サンプル中に存在する任意の微生物を固定し不活性化するように作用する単数又は複数の試薬によって含浸された吸収性繊維材を含む請求項4に記載の方法。
- 前記固体基質が、セルロース性ペーパー、微細繊維膜、ガラス繊維材、ポリマー繊維材、織布、不織布、から選択される材料を含む請求項5に記載の方法。
- 前記固体基質が、WhatmanFTA(登録商標)又はWhatmanFTA(登録商標)Elute試薬を含む請求項5又は6に記載の方法。
- 前記固体基質が、WhatmanFTA(登録商標)Eluteペーパーを含む請求項5又は6に記載の方法。
- 前記生物サンプル中に2以上の複数の特定の微生物が存在する場合、前記プライマー伸長反応によって、そのそれぞれが互いに異なる既知の所定の分子量の少なくとも二つの延長プライマー配列を含むDMP反応産物が作り出される請求項1〜8に記載の方法。
- 前記DMP反応産物が、それらの分子量に応じて伸長プライマー配列を解離する技術を使用して分析させる請求項9に記載の方法。
- 前記DMP反応産物が、MALD-TOF質量分光分析法、及び/又はキャピラリー電気泳動から選択される技術を使用して分析される請求項10に記載の方法。
- 前記プライマー伸長反応が、もし前記生物サンプル中に単数又は複数の特定の微生物が存在するならば、前記プライマー伸長反応によって、標識試薬が前記プライマー伸長産物に取り込まれ、それによって、前記標識試薬を含むDMP反応産物が作り出されるように構成された、プライマー標識試薬を含む請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
- 前記プライマー標識試薬が、放射物質標識、蛍光標識、及び抗原から選択される標識である請求項12に記載の方法。
- 前記DMP反応産物が、前記プライマー伸長産物中の取り込まれた標識試薬の存在を同定する技術を使用して分析される請求項12又は13に記載の方法。
- 前記技術が、SNPstream(登録商標)及び/又はSNPlex(登録商標)から選択される請求項14に記載の方法。
- 前記DMP内に構成された前記複数のプライマー配列が、固体基質上に固定される請求項1〜15の何れか一項に記載の方法。
- 前記固体基質が、ガラス及びシリコンの何れかから選択される請求項16に記載の方法。
- 前記核酸増幅工程が、単数又は複数の特定の微生物から複数の高度保存配列を増幅するように構成された複数の増幅プライマーを含む請求項1〜17の何れか一項に記載の方法。
- 前記複数の増幅プライマーが、配列番号1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、及び29/30から成る群から選択される単数又は複数のプライマー対を含む請求項18に記載の方法。
- 前記複数の増幅プライマーが、配列番号46/47、48/49、50/51、52/53、54/55、56/57、58/59、60/61、62/63、64/65、66/67、68/69、70/71、72/73、及び74/75から成る群から選択される単数又は複数のプライマー対を含む請求項18に記載の方法。
- 前記(c)の核酸増幅工程の前に、単数又は複数の対照競合配列が前記標的配列と組み合わされ、ここで、各競合配列が、前記競合配列が対応の標的配列に対して、特定位置において配列バリエーションを含むことを除いて対応標的配列と同じである請求項1〜20の何れか一項に記載の方法。
- 前記配列バリエーションが、人工的に導入されたSNPを含む請求項21に記載の方法。
- 前記(c)の核酸増幅工程の前に、単数又は複数の対照配列が前記標的配列と組み合わされ、ここで、前記単数又は複数の対照配列が、前記生物サンプルの種とは無関係の種、試験対象の前記微生物(単数又は複数)と無関係の種、合成DNA配列、から選択されるDNAの配列を含み、そして、前記核酸増幅工程と前記DMPが、前記単数又は複数の対照配列のそれぞれと特異的にハイブリダイズする対応のプライマー配列を含む請求項1〜22の何れか一項に記載の方法。
- 前記生物サンプルが、ヒトから得られる請求項1〜23の何れか一項に記載の方法。
- 前記生物サンプルが、ヒト以外の動物、植物、及び食物から成る群から選択される何れかから得られる請求項1〜23の何れか一項に記載の方法。
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