ES2308865T3

ES2308865T3 - Medio solido y procedimiento para el almacenamiento y la rapida purificacion de acido nucleico.

Info

Publication number: ES2308865T3
Application number: ES99973772T
Authority: ES
Inventors: Martin A. Smith; Mridula Iyer; Daqing Qu; James C. Davis
Original assignee: Whatman Inc
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2019-09-17
Also published as: AU6048199A; DE69938976D1; US20010000149A1; ATE399215T1; US6645717B1; US20010007746A1; EP1173623A4; EP1173623B1; WO2000053807A1; EP1173623A1

Abstract

Un procedimiento de almacenamiento de un material genético y posterior análisis del material genético mediante las etapas; (a) aplicar una muestra que comprende células que contienen material genético a un soporte, en el que el soporte comprende una membrana de filtro que comprende fibras de vidrio, teniendo la membrana de filtro un revestimiento químico que comprende un agente desnaturalizante de proteínas y una trampa de radicales libres sorbida sobre la misma, mediante lo cual las células se lisan para liberar el material genético que está estabilizado mediante el soporte, (b) eluir el material genético en agua calentada en el intervalo de temperatura de 65ºC a 100ºC, mediante lo cual el material genético se libera en el agua calentada para generar una fracción genética soluble, y (c) analizar el material genético eluido.

Description

Medio sólido y procedimiento para el almacenamiento y la rápida purificación de ácido nucleico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para el almacenamiento y la posterior purificación de ácidos nucleicos o material genético procedente de células completas. En particular, la invención se refiere al almacenamiento y la purificación de ácidos nucleicos a partir de una mezcla biológica de moléculas en una fase fluida sobre un soporte. El ácido nucleico purificado puede utilizarse entonces para una variedad de análisis tales como amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich (ed) Stockton Press 1989), genotipado, secuenciación (Sanger et al (1977) DNA Sequencing with Chain Terminating Inhibitors P. N. A. S. 74: 5463), cuantificación por densidad óptica, transferencia de tipo Southern y Northern, detección fluorescente, preparación de sondas moleculares y clonación (Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989)).

Descripción de la técnica anterior

El genotipado es la disciplina de identificación el genoma de un individuo con relación a alelos y/o mutaciones específicos de enfermedad que se producen como un efecto del ligamiento parental. La rápida purificación del ADN genómico humano es una parte esencial de un procedimiento de genotipado; siendo el ADN genómico de un individuo la unidad estructural para la secuencia completa del ADN de cada alelo expresado.

El ADN genómico humano no puede secuenciarse directamente. Con el fin de llevar a cabo el análisis de la secuencia en regiones de los cromosomas que pueden contener partes de secuencias específicas de enfermedad o mutación, se amplifican partes seleccionadas mediante PCR y se secuencian los productos amplificados. Las partes seleccionadas de los cromosomas que se amplifican están dictadas por la secuencia específica de los cebadores usados en la amplificación por PCR. Los conjuntos de cebadores que se usan en los estudios de genotipado están comercialmente disponibles y son representativos para el cromosoma que se está examinando. Por tanto, si los estudios de ligamiento identifican que una secuencia que porta una enfermedad está en un cromosoma particular, entonces se utilizarán muchos conjuntos de cebadores a través de ese cromosoma con el fin de obtener el material genético para su secuenciación. Los productos de PCR resultantes pueden representar bien el cromosoma completo que se está examinando. Debido a la gran longitud de los cromosomas, muchas reacciones de PCR se llevan a cabo en el molde de ADN genómico de un único paciente.

El ADN genómico humano se purifica mediante una variedad de procedimientos (Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989)). En consecuencia, muchos fabricantes de kits comerciales proporcionan productos para tales técnicas, por ejemplo: AmpReady^{TM} (Promega, Madison, Wisconsin), DNeasy^{TM} (Qiagen, Valencia, California) y Split Second^{TM} (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, Indiana). Estos productos se basan en el uso de sistemas de tampón o matrices especializados para el rápido aislamiento de la molécula de ADN genómico.

Más recientemente, han surgido técnicas basadas en filtros microporosos como herramientas para la purificación del ADN genómico así como de innumerables ácidos nucleicos. La ventaja de las marices basadas en filtros es que pueden diseñarse en muchos formatos que incluyen tubos, tubos de centrifugación, láminas y placas de micropocillos. Las membranas de filtro microporoso como matrices de soporte de purificación tienen otras ventajas dentro de la técnica. Proporcionan un sistema compacto y fácil de manipular que permite la captura de la molécula deseada y la eliminación de los componentes no deseados en una fase fluida con rendimiento superior y tiempos de procesamiento más rápidos de lo que era posible con la cromatografía en columna. Esto se debe a las rápidas tasas de difusión posibles en las membranas de filtro.

Las moléculas de ácido nucleico se han capturado sobre membranas de filtro, generalmente a través de adsorción simple o bien a través de una reacción química entre grupos reactivos complementarios presentes en la membrana de filtro o en un ligando unido al filtro que da como resultado la formación de un enlace covalente entre el ligando y el ácido nucleico deseado.

Los materiales porosos de las membranas de filtro usados para la inmovilización no covalente de ácidos nucleicos han incluido materiales tales como nailon, nitrocelulosa, poli(fluoruro de vinilideno) hidrófobo (PVDF) y microfibra de vidrio. También se han desarrollado varios procedimientos y reactivos para permitir también el acoplamiento directo de los ácidos nucleicos sobre soportes sólidos, tales como oligonucleótidos y cebadores (por ejemplo, J. M. Coull et al., Tetrahedron Lett. vol. 27, página 3991; B. A. Conolly, Nucleic Acids Res., vol. 15, página 3131, 1987; B. A. Conolly y P. Rider, Nucleic Acids Res., vol. 12, página 4485, 1985; Yang et al P.N.A.S. vol. 95: 5462-5467). También se ha notificado el entrecruzamiento del ADN por UV (Church et al., PNAS, vol. 81, página 1991, 1984), el kit Generation Capture Column (Gentra Systems, Minneapolis, MN) y el ARN (Khandjian, et al., Anal. Biochem, vol. 159, páginas 227, 1986) a membranas de nailon.

Se han utilizado muchos procedimientos químicos para la inmovilización de moléculas tales como ácidos nucleicos sobre membranas de filtro. Por ejemplo, papel activado (Trans-Bind. TM, Schleicher & Schuell Ltd., Keene, N.H.) membrana de PVDF revestida con hidrogel activada por carbodimidazol (Immobilin-IAV^{TM}, Millipore Corp., Bedford, Mass.), papel MAP (Amersham, Littlechalfont Bucks, Wisconsin), nailon activado (BioDyne^{TM}, Pall Corp., (Glen Cove, N.Y.), nitrocelulosa activada por bromuro de cianógeno y DVS. También se conocen membranas unidas con ligandos específicos tales como la membrana de captura de biotina SAM2^{TM} (Promega) que se une a moléculas biotiniladas basándose en su afinidad por la estreptavidina o el sistema de membrana de afinidad MAC (proteína A/G) (Amicon, Bedford, Massachusetts). Algunas de las desventajas de la unión covalente de biomoléculas sobre membranas activadas son:

a): La inmovilización de las moléculas a menudo es lenta requiriéndose 20-180 minutos para la finalización de la reacción.

b): Se necesita una alta concentración de ligandos y biomoléculas para la rápida inmovilización.

c): Se necesita la agitación constante durante el procedimiento de inmovilización lo que puede dar como resultado la desnaturalización y la desactivación de las biomoléculas.

d): Una vez completo el procedimiento de inmovilización, a menudo se requiere una etapa de bloqueo (rematado) para eliminar la capacidad de unión covalente residual.

e): Las moléculas unidas covalentemente no pueden recuperarse de la membrana de filtro.

Existe la necesidad de un procedimiento de inmovilización de ácido nucleico que muestre la alta especificidad de la inmovilización covalente sobre la membrana de filtro sin el uso de reacciones químicas rigurosas ni tiempos de incubación largos. En particular existe la necesidad de la captura y la separación de ácidos nucleicos a partir de una mezcla en una fase fluida sobre una matriz de membrana de filtro. De especial interés es la capacidad para almacenar o archivar los ácidos nucleicos unidos sobre la matriz de membrana de filtro. El documento WO 90/03959 describe un procedimiento de almacenamiento de un material genético sobre una membrana de papel que comprende un revestimiento químico constituido por un agente desnaturalizante de proteínas y un remate de radicales libres y el posterior análisis del material genético tras su elución de la membrana o bien de una forma unida a la membrana.

Más recientemente, microfibra de vidrio, que se ha demostrado que se une específicamente a ácidos nucleicos de una variedad de fuentes que contienen ácidos nucleicos muy eficazmente (por ejemplo véase: Itoh et al (1997) Simple and rapid preparation of plasmid template by filtration method using microtiter filter plates. NAR, vol. 25, Nº 6: 1315-1316; Andersson, B. et al (1996) Method for 96-well M13 DNA template preparations for large-scale sequencing. BioTechniques vol. 20: 1022-1027). Bajo las condiciones correctas de sal y tamponación, los ácidos nucleicos se unirán al vidrio y a la sílice con alta especificidad.

Basándose en las patentes estadounidenses 5.496.562, 5.756.126 y 5.807.527, se ha demostrado que los ácidos nucleicos o el material genético pueden inmovilizarse en un filtro o soporte sólido seco basado en material celulósico (filtro FTA). El soporte sólido descrito está condicionado con una composición química que puede llevar a cabo varias funciones: (i) lisar material celular intacto al ponerse en contacto con él, liberando el material genético, (ii) permitir y posibilitar las condiciones que facilitan la inmovilización del material genético al soporte sólido (probablemente mediante una combinación de condiciones mecánicas y caotrópicas), (iii) mantener el material genético inmovilizado en un estado estable sin dañarse debido a la degradación, actividad de endonucleasas, interferencia con UV y ataque microbiano, y (iv) mantener el material genético como una molécula unida al soporte que no se separa del soporte sólido durante cualquier procesamiento posterior (tal como demuestran Del Rio et al (1995) BioTechniques. Vol. 20: 970-974).

Se ha ilustrado la utilidad del material de filtro celulósico denominado FTA descrito en las patentes estadounidenses 5.496.562, 5.756.126 y 5.807.527 para varias técnicas con ácidos nucleicos tales como ribotipado bacteriano (Rogers, C & Burgoyne, L (1997) Anal. Biochem. Vol. 247: 223-227), detección de diferencias individuales en bases en ADN viral y humano (Ibrahim et al (1998) Anal. Chem. Vol. 70: 2013-2017), obtención de bases de datos de ADN (Ledray et al (1997) J. Emergency Nursing. Vol. 23, Nº 2: 156-158), procesamiento automatizado para electroforesis de STR (repeticiones cortas en tándem) (Belgrader, B & Marino, M (1996) L.R.A. vol. 9: 3-7, Belgrader et al (1995) BioTechniques. Vol. 19, Nº 3: 427-432) y ensayo de acoplamiento de oligonucleótidos para diagnósticos (Baron et al (1996) Nature Biotech. Vol 14: 1279-1282).

Se ha demostrado que el ácido nucleico o el material genético aplicado a, e inmovilizado en, filtros FTA no puede separarse o eluirse de manera sencilla del soporte sólido una vez unido (Del Rio et al (1995) BioTechniques. Vol. 20: 970-974). Esto constituye una desventaja principal para aplicaciones en las que se requieren varios procedimientos posteriores de la misma muestra, tales como genotipado y obtención de perfiles de STR.

En la actualidad, se aplica material celular a un medio de filtro FTA y generalmente el material celular, una vez aplicado, forma una mancha sobre el filtro FTA. A partir de esta mancha, pueden tomarse pequeños fragmentos troquelados; cada pequeño fragmento troquelado tendrá inmovilizado en él ácido nucleico o material genético suficiente para facilitar un único procedimiento posterior tal como una reacción de PCR. Dado que los dos cebadores administrados a una reacción de PCR se presentan en disolución, no tiene importancia que el molde de ácido nucleico celular esté inmovilizado en el filtro. Todos los amplicones se formarán en disolución. El amplicón puede separarse entonces fácilmente de la reacción mediante la aspiración de la fase líquida del fragmento troquelado del filtro sólido FTA. Por tanto, para el procesamiento múltiple a partir de una única muestra, deben tomarse muchos fragmentos troquelados. La obtención de múltiples fragmentos troquelados lleva mucho tiempo y todavía no se ha prestado a la automatización simplificada.

Es mucho más deseable proporcionar ácidos nucleicos como una fracción soluble a partir de la que pueden dispensarse fácilmente alícuotas a tantas reacciones como se requiera. El manejo automatizado de líquidos de este tipo es una técnica fundamental dentro de la industria farmacéutica y otras (por ejemplo véase: Armstrong et al (1998) J. Biomolecular Screening. Vol. 3, Nº 4: 271-275).

Sumario de la invención

En el presente documento se describe un medio para el almacenamiento y el posterior análisis de un material genético, incluyendo el medio un soporte para inmovilizar un material genético en el mismo y para permitir la elución posterior del material genético del mismo. Un revestimiento está funcionalmente asociado con el soporte para permitir la lisis celular y liberar el material genético de las células lisadas mientras se estabiliza el material genético liberado inmovilizado. La presente invención proporciona un procedimiento para almacenar el material genético y analizar posteriormente el material genético incluye las etapas de inmovilizar el material genético sobre el soporte mientras se permite la lisis celular y se libera el material genético de las células lisadas. Se estabiliza el material genético liberado inmovilizado. Entonces se eluye el material genético para generar una fracción soluble de material genético. Posteriormente se analiza el material genético eluido.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación digital de un gel que muestra el efecto de diferentes regímenes de elución por calor sobre ADN genómico de sangre unido a la membrana de filtro descrita con respecto a la amplificación por PCR de amelogenina; indicándose los productos de PCR en 218 pb, carril 1: disco de filtro de 1 mm con sangre depositada con incubación de 10 minutos a 82ºC, carril 2: fracción eluida a 82ºC, carril 3: disco de filtro de 1 mm con sangre depositada con incubación de 10 minutos a 95ºC, carril 4: fracción eluida a 95ºC, carril 5: sin control de ADN;

la figura 2 es una representación digital de un gel que muestra los resultados de un protocolo de elución completa para ADN genómico de sangre unido a la membrana de filtro descrita con respecto a la amplificación por PCR de amelogenina, indicándose los productos de PCR en 218 pb, carril 1: disco de filtro de 1 mm con sangre depositada procesado sin etapa de elución, carril 2: disco de filtro de 1 mm con sangre depositada procesado con una etapa de elución, carril 3: fracción eluida, carril 4: etapa de lavado 1, carril 5: etapa de lavado 2;

la figura 3a muestra la curva patrón de ADNss genómico con sonda fluorescente OliGreen;

la figura 3b muestra las unidades de fluorescencia relativas (UFR) y los rendimientos calculados de ADNss genómico eluido de sangre depositada en el material de filtro descrito y la tarjeta de filtro FTA celulósico;

la figura 4a muestra los rendimientos totales calculados promedios del ADN genómico eluido a partir de diferentes cantidades de saliva aplicada a la membrana de filtro descrita;

la figura 4b muestra una representación digital de una amplificación por PCR de amelogenina de seis purificaciones individuales de ADN genómico a partir de saliva femenina usando la membrana de filtro descrita, esperándose un producto de PCR de 218 pb, carril MW: marcadores de peso molecular de pGEM, carriles 1-6: muestras individuales de ADN genómico de saliva femenina;

la figura 5a es una representación digital de un gel que muestra tipado tisular usando cebadores de HLA-A en muestras individuales de sangre masculina. Se espera que se amplifique un producto de PCR de 900 pb, carril MW: marcadores de peso molecular de pGEM, carriles 1-6: muestras individuales de ADN genómico de sangre masculina;

la figura 5b muestra una representación digital de un gel de tipado tisular usando cebadores de HLA-B en muestras individuales de sangre masculina, se espera que se amplifique un producto de PCR de 1090 pb, carril MW: marcadores de peso molecular de pGEM, carril 1-6: muestras individuales de ADN genómico de sangre masculina;

la figura 6a es una representación digital de un gel que muestra los resultados de la amplificación por PCR de amelogenina de ADN purificado a partir de 6 muestras individuales de saliva usando la membrana de filtro descrita en el formato de un disco de flotación libre de 7 mm en un microtubo, carril MW: marcadores de peso molecular de pGEM, carriles 1-6: ADN genómico individual de saliva;

la figura 6b muestra la amplificación por PCR de amelogenina de ADN purificado a partir de 7 muestras individuales de sangre usando la membrana de filtro descrita en el formato de cesta giratoria de microcentrífuga, carril MW: marcadores de peso molecular de pGEM, carriles 1-7: ADN genómico individual de sangre;

la figura 6c muestra la amplificación por PCR de amelogenina de ADN purificado a partir de una muestra de frotis bucal usando la membrana de filtro descrita en el formato de una escobilla, carril 1: escobilla tras la etapa de elución, carril 2: fracción eluida, carril 3: sin control de PCR de ADN;

la figura 7a es una tabla de las etapas del protocolo y el tiempo total requerido para el ADN genómico preparado a partir de sangre usando kits comercialmente disponibles en comparación con la membrana de filtro descrita;

la figura 7b es una tabla de los rendimientos del ADN genómico preparado a partir de sangre usando kits comercialmente disponibles en comparación con la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención;

la figura 7c es una representación digital de un gel que muestra la amplificación por PCR de amelogenina de ADN genómico purificado a partir de sangre usando kits comercialmente disponibles en comparación con la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención, carril 1 membrana de filtro, carril 2: kit de Roche, carril 3: kit de Promega;

la figura 8a es una representación digital de un gel que muestra la amplificación por PCR de amelogenina de ADN genómico purificado a partir de sangre depositada en el día 1 usando la membrana de filtro, carril 1: disco de filtro de 1 mm con sangre depositada procesado sin etapa de elución, carril 2: disco de filtro de 1 mm con sangre depositada tras una etapa de elución, carril 3: fracción eluida;

la figura 8b muestra la amplificación por PCR de amelogenina de ADN genómico purificado a partir de sangre depositada de 19 semanas usando la membrana de filtro descrita, carril MW: marcadores de peso molecular de pGEM, carril 1: fracción eluida, carril 2: disco de filtro de 1 mm con sangre depositada tras una etapa de elución;

la figura 9 es una vista en sección transversal de una membrana de filtro descrita; y

la figura 10 es una sección transversal de un dispositivo.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se describe un medio para el almacenamiento y posterior análisis del material genético, incluyendo generalmente el medio un soporte para inmovilizar un material genético sobre el mismo y permitir la posterior elución del material genético del mismo. Un revestimiento está asociado funcionalmente con el soporte para permitir la lisis celular y liberar el material genético de las células lisadas mientras se estabiliza el material genético liberado inmovilizado. La presente invención proporciona un procedimiento de almacenamiento de un material genético que incluye lo más generalmente las etapas de inmovilizar un material genético sobre el soporte lo que permite la posterior elución del material genético y lisar las células y liberar el material genético de las células lisadas mientras se estabiliza el material genético liberado inmovilizado. El material genético puede analizarse entonces en disolución en contraposición a estar inmovilizado sobre el soporte.

La composición química del soporte facilita la lisis de las células completas y la posterior captura de los ácidos nucleicos liberados. La composición química ayuda además en su almacenamiento a largo plazo. La composición del soporte es de tal manera que puede llevarse a cabo la rápida purificación del ácido nucleico capturado. Es decir, el propio soporte permite la liberación del ácido nucleico mediante una etapa de elución proporcionando de esta manera una fracción soluble de ácido nucleico. Según se trata en más detalle a continuación y se ejemplifica en los ejemplos siguientes, la presente invención es lo más eficaz con respecto a la elución del ADN total procedente de la muestra.

Preferiblemente, el soporte es un material poroso en la forma de una membrana de filtro según se describe y se define a continuación.

Inesperadamente, ahora se ha descubierto que un soporte, cuando se usa en un procedimiento según la invención, proporciona varias ventajas y aplicaciones según se describe a continuación en el presente documento con respecto a la técnica anterior tratada anteriormente. Por tanto, el uso del procedimiento de la presente invención proporciona ahora ventajas de procesamiento más rápido de fluidos biológicos que contienen ácidos nucleicos así como de procesamiento múltiple de fluidos.

El medio, mostrado generalmente en 10 en la figura 9, incluye los componentes siguientes:

(i) un soporte adecuado, preferiblemente una membrana 12 de filtro; y

(ii) un revestimiento 14 químico.

La reacción de la membrana de filtro con la disolución de revestimiento químico produce la membrana de filtro usada en la invención. Si la membrana es fibrosa, este revestimiento es un revestimiento de las fibras de filtro, no de la superficie del filtro.

La expresión "membrana de filtro" tal como se usa en el presente documento significa un medio de filtro o material poroso formado, pero sin limitarse a, completa o bien parcialmente de vidrio, sílice o cuarzo incluyendo sus fibras o derivados de los mismos. Otros materiales de los que puede estar compuesta la membrana de filtro también incluyen polímeros hidrófilos basados en celulosa (papeles de nitrocelulosa o carboximetilcelulosa) incluyendo polímeros hidrófilos sintéticos (por ejemplo, polímeros de poliéster, poliamida e hidratos de carbono), politetrafluoroetileno y materiales cerámicos porosos.

El medio usado para la membrana de filtro usada en la invención incluye cualquier material que no inhibe la sorción de la disolución de revestimiento químico y que no inhibe el almacenamiento, la elución y el posterior análisis del material que contiene ácidos nucleicos añadido a ella. Esto incluye matrices secas planas o una matriz combinada con un aglutinante. Se prefiere que la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención sea de una naturaleza porosa para facilitar la inmovilización de los ácidos nucleicos. A diferencia de los soportes de la técnica anterior, el soporte usado en el procedimiento de la presente invención permite la elución del material genético del mismo en un estado que permite el análisis posterior. Inesperadamente, tal elución es una etapa que ahorra tiempo proporcionando así un análisis casi inmediato.

La expresión "disolución de revestimiento químico" tal como se usa en el presente documento significa una composición química que puede sorberse en la membrana de filtro mencionada anteriormente. La composición de la disolución de revestimiento químico es según se describe y se refiere a la explicada en las patentes estadounidenses 5.756.126, 5.807.527 y 5.496.562. La adsorción de la disolución de revestimiento químico a la membrana de filtro seleccionada da como resultado la formación de la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención.

Más específicamente, la disolución de revestimiento químico incluye un agente desnaturalizante de proteínas y una trampa de radicales libres. El reactivo desnaturalizante puede ser un tensioactivo que desnaturalizará las proteínas y la mayoría de los microorganismos patógenos en la muestra. Los detergentes aniónicos son ejemplos de tales reactivos desnaturalizantes. La disolución química puede incluir una base débil, un agente quelante y el detergente o tensioactivo aniónico, y opcionalmente ácido úrico y sal de urato según se trata en detalle en la patente estadounidense 5.807.527 citada anteriormente. Más preferiblemente, la base débil puede ser un Tris, trishidroximetil metano, como una base libre o bien como el carbonato, y el agente quelante puede ser EDTA y el detergente aniónico puede ser dodecilsulfato de sodio. También pueden utilizarse otros revestimientos que tienen función similar según la presente invención.

La expresión "funcionalmente asociado con" significa que el revestimiento está dispuesto, sorbido o asociado de otro modo con el soporte de manera que el soporte y el revestimiento funcionan juntos para inmovilizar el ácido nucleico sobre los mismos a través de una acción de lisis celular de las células presentadas en el soporte. Es decir, el revestimiento puede adsorberse, absorberse, revestirse sobre o disponerse de otro modo en relación funcional con el medio. Por ejemplo, el soporte, en la forma de una membrana de filtro, puede estar dispuesto en una disolución que contiene la disolución química. Según se estableció anteriormente, el soporte es preferiblemente un medio de filtro poroso y puede estar en la forma de un medio seco y plano. El medio puede combinarse con un aglutinante, siendo ejemplos de aglutinantes bien conocidos en la técnica polivinilacrilamida, poli(acrilato de vinilo), poli(alcohol vinílico), gelatina, por ejemplo.

Resulta crítico que el soporte usado en la presente invención pueda liberar el material genético inmovilizado en el mismo mediante una elución por calor. Preferiblemente, una elución por calor de este tipo se lleva a cabo mediante la exposición del soporte que tiene el material genético almacenado en el mismo a agua calentada, estando el agua libre de nucleasas. Esta capacidad para permitir la elución caracteriza los diversos materiales de soporte usados en la presente invención.

La expresión "membrana de filtro" según se usa en el presente documento significa matrices o soportes sólidos funcionales que permiten la inmovilización específica del ácido nucleico, a través de una acción de lisis celular. El ácido nucleico puede presentarse en ella en la forma de material que contiene ácidos nucleicos tal como sangre, células de mamífero en cultivo, saliva, orina, células bacterianas en cultivo, levadura, tejido sólido, heces, líquido linfático, líquido amniótico, tejido vegetal y similares. La membrana de filtro es de manera que el ácido nucleico inmovilizado en ella puede permanecer así de una forma estable, no mostrando degradación, corte, digestión por endonucleasas ni daño por UV.

La membrana de filtro usada en la invención es de manera que en cualquier punto durante un régimen de almacenamiento, permite la rápida purificación del ácido nucleico inmovilizado. La invención es de manera que el ácido nucleico inmovilizado se recoge en la forma de una fracción soluble tras un proceso de elución simplificado, durante el que se libera el ácido nucleico inmovilizado de la membrana de filtro de la invención. La membrana de filtro proporciona ácido nucleico de calidad suficiente que no afecta a los análisis posteriores tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), PCR iniciada por transcriptasa inversa, técnicas de hibridación de ADN o ARN, secuenciación y similares.

El ácido nucleico inmovilizado en un soporte de filtro sólido, aunque es un molde adecuado para reacciones de PCR singulares, no puede medirse ni detectarse mediante técnicas tradicionales tales como densidad óptica o fluorescencia. El ácido nucleico tiene que estar en disolución para estas técnicas. Otras técnicas tras la purificación en las que se desea ácido nucleico en la forma soluble incluyen: clonación, ensayo de protección para hibridación, transformación bacteriana, transfección en mamíferos, amplificación mediada por transcripción y similares. El procedimiento de la presente invención proporciona ácidos nucleicos en una forma soluble de este tipo.

La membrana de filtro usada en la invención puede poseer el mismo componente químico que FTA lo que permite la acción de la lisis celular y la liberación del ácido nucleico con la aplicación de la muestra. El componente químico garantiza la estabilidad del ácido nucleico mediante agentes desnaturalizantes de proteínas, una trampa de radicales libres e inhibidores virales/microbianos. La diferencia entre los soportes sólidos con FTA de la técnica anterior y la membrana de filtro usada en la invención es que el soporte sólido de base, o el filtro, se han cambiado en comparación con el descrito para los productos con FTA. Este cambio en el material sólido de soporte, o el filtro, ha permitido, con una etapa de elución por calor simplificada, que el ácido nucleico unido se separe de la membrana de filtro mientras que no puede eliminarse del soporte sólido con FTA (véase Del Rio et al (1995) BioTechniques. Vol. 20: 970-974). El ácido nucleico liberado de la membrana de filtro se presenta así como una fracción soluble de la que pueden tomarse alícuotas fácilmente para múltiples procedimientos posteriores tales como amplificación por PCR. El ácido nucleico soluble eluido también puede incorporarse en técnicas en las que el ácido nucleico soluble es una necesidad, tales como análisis de densidad óptica, detección de fluorescencia, clonación, transformación y similares. Esta técnica añadida de elución permite regímenes de procesamiento múltiples de alto rendimiento, tales como genotipado.

Tal como se trata más adelante en la sección experimental, puede ser ventajoso proporcionar un dispositivo para el almacenamiento y el posterior análisis del material genético en el que puede recogerse una muestra, tal como una muestra fluida en la forma de sangre o saliva. Según se muestra en la figura 10, el dispositivo puede incluir un recipiente, tal como un tubo 16, que contiene el medio 10 construido según la presente invención. El recipiente no debe ser reactivo con el material genético. Los ejemplos de tales recipientes pueden ser un tubo 16 hecho de un polímero seleccionado del grupo constituido por polipropileno común, pero también polisulfona. Según se muestra en la figura 10, se ha dispuesto una muestra 18 dentro del tubo 16 exponiendo así el disco de medio, de una forma en flotación libre dentro del tubo 16, a la muestra. Según se trata más adelante en mayor detalle en la sección experimental, el procedimiento de la presente invención puede utilizarse para inmovilizar material genético procedente de la muestra en el medio 10.

La presente invención proporciona, lo más generalmente, un procedimiento para almacenar el material genético y analizar posteriormente el material genético mediante las etapas de inmovilizar el material genético sobre el soporte mientras se permite la lisis celular y la liberación del material genético de las células lisadas. El revestimiento químico sobre el soporte, en la forma del medio de filtro, permite el lisado del material genético y la estabilización del material genético liberado inmovilizado. El soporte permite eluir el material genético para generar la fracción soluble del material genético, permitiendo así el análisis posterior del material genético, según se trató anteriormente.

La etapa de elución puede llevarse a cabo mediante el calentamiento del soporte que tiene la muestra genética inmovilizada sobre el mismo, liberando el soporte el material genético calentado a partir del mismo y hacia la disolución, preferiblemente en un agua libre de nucleasas. Lo más preferiblemente, esto se lleva a cabo disponiendo el soporte que tiene el material genético inmovilizado sobre el mismo en agua calentada, calentándose el agua preferiblemente entre 65ºC y 100ºC.

Según se trata en mayor detalle en los ejemplos a continuación, pueden realizarse diversos lavados en diversos tipos de tampones. Preferiblemente, los tampones de lavado pueden seleccionarse del grupo que incluye Tris/EDTA; etanol al 70%; STET; SSC; reactivo de purificación SSPE FTA, y similares.

La presente invención puede encontrar utilidad en muchas áreas de materiales genómicos. Por ejemplo, la presente invención proporciona la capacidad de eluir material genético unido para la rápida purificación del material genético que va a utilizarse en cualquiera de las diversas aplicaciones forenses, tales como identificación, identificación de la paternidad/maternidad y en la escena de un crimen.

Se requiere que los prisioneros de muchos países faciliten una muestra genética (muestra de sangre o bucal) para fines de obtención de huella de ADN. El procedimiento de la presente invención proporciona un medio para el almacenamiento a largo plazo del material genético del prisionero. Si es necesario, el material genético puede someterse a prueba en cuando se toma o muchos años tras el almacenamiento. El material genético puede obtenerse como una fracción soluble o bien en fase sólida una vez aislado en el medio de filtro de la presente invención.

La presente invención puede utilizarse para la identificación de la paternidad/maternidad teniendo un uso particular para una madre u hospital en el que se ha perdido un recién nacido en el hospital. La rápida capacidad de la presente invención para proporcionar una muestra genética purificada proporciona incluso una mayor utilidad en casos tales en los que lo más indicado debería ser una rápida identificación de un niño perdido.

La presente invención es una contribución significativa a la metodología actual para la preparación de material genético soluble que, en caso contrario, lleva mucho tiempo y a menudo da como resultado un molde inadecuado que resulta dañado o contaminado. La presente invención proporciona un alto rendimiento del material genético purificado de calidad superior en menos de veinte minutos de tiempo de laboratorio. El material genético purificado rápidamente puede utilizarse para cualquiera de las diversas aplicaciones alimenticias/agrícolas, tales como seguimiento, reproducción, identificación y clonación.

La eficacia con la que los fabricantes de alimentos detectan un brote patógeno en tanto su ganado como su producto terminado es una medida de una compañía de éxito. El uso de la presente invención como una escobilla que puede presionarse simplemente contra el alimento o el uso de una tarjeta en la que puede depositarse sangre de canal, permite usos de la presente invención para aislar y detectar rápidamente la presencia de material genético patógeno. Si se utiliza el procedimiento de la presente invención no es necesario realizar las técnicas de ensayo de la técnica anterior que llevaban mucho tiempo y que implicaban preparaciones de ácido nucleico. El ácido nucleico patógeno recogido puede usarse como una fracción soluble o una fracción en fase sólida con la elección de una etapa de elución.

El seguimiento del material de canal, ya sea para temas legales o sanitarios, permite a los fabricantes mantener el control de sus productos. En el momento de la matanza en el matadero, puede unirse al canal una tarjeta que utiliza la presente invención en la que se ha depositado su sangre. Al mismo tiempo, puede depositarse en una segunda tarjeta la misma sangre y mantenerla como un archivo en el matadero. Si se produce un tema de identificación de ciertos canales, pueden utilizarse registros genéticos tanto sobre el canal como sobre el matadero. Si la tarjeta del canal se elimina inadvertidamente, todavía puede llevarse a cabo la identificación simplemente presionando carne de canal sobre tal tarjeta.

La identificación de los genes y las características deseados que se requiere para una generación posterior de una planta o un animal requiere la generación fidedigna y con ahorro de tiempo del ácido nucleico de los progenitores potenciales. El procedimiento de la presente invención puede usarse para el aislamiento de material genético soluble o bien en fase sólida para proporcionar resultados eficaces y fidedignos para una necesidad de este tipo. Asimismo, puede usarse el medio en la forma de microplacas, un tubo o un chip, para la generación y la detección del material genético. El procedimiento de la presente invención proporciona la metodología para el archivo rentable y con tiempo de preparación del molde superior (ya sea soluble o sólido).

Al presionar un medio, en la forma de una escobilla o de otro tipo, se permite que el usuario recoja cualquier microbio contaminado en productos alimenticios de cualquier tipo. El material genético aislado del medio puede utilizarse entonces para cualquier forma de procedimiento de diagnóstico, dependiendo de si se requiere material genético soluble o en fase sólida. Este análisis puede realizarse de manera eficaz casi inmediatamente, en contraposición con las técnicas de la técnica anterior.

Mediante el uso de técnicas de manipulación genética, se ha producido piensos con un aumento del tamaño, sabor, maduración y contenido en azúcar. Muchos países prohíben la venta de productos alimenticios modificados genéticamente y por tanto se requiere llevar a cabo pruebas. Dado que se están buscando los genes específicos que generan estas características, se requiere el material genético. La presente invención puede usarse para proporcionar la rápida purificación del material genético tanto soluble como en fase sólida.

En vista de lo anterior, la presente invención encuentra utilidad en diversas áreas de la economía.

La presente invención puede utilizarse además en las áreas de purificación a partir de la sangre completa de un paciente. En la actualidad, el ADN genómico se purifica normalmente a partir de la sangre completa de un paciente, el material genético presente en la población de leucocitos. Los procedimientos de extracción del ADN genómico a menudo implican muchas etapas e implican varios tampones y matrices de purificación. Recientemente, se han hecho disponibles varias metodologías nuevas para la extracción del ADN genómico. Una es el aislamiento FTA 31 ET explotado por Fitzco - Whatman. Otra es el procedimiento descrito por Cambridge Molecular Technologies Ltd., RU (CMT), usando material Whatman F58301 (GF/L). El procedimiento de Fitzco - Whatman utiliza un revestimiento con FTA sobre un material celulósico 31 ET que lisa espontáneamente los leucocitos que liberan el ADN genómico. Esto potencia la integración y la unión con el medio. El ADN se fija permanentemente al medio ya que no se determinó ninguna metodología para la elución del ADN a partir de 31 ET revestido con FTA de la técnica anterior. Para muchas aplicaciones, el hecho de que no puede eluirse el ADN genómico unido al medio de 31 ET media no plantea absolutamente ningún problema. PCR y RFLP se realizan fácilmente sobre el molde unido. Sin embargo, para el genotipado experimental en el que se llevan a cabo muchas reacciones de PCR sobre la misma población de ADN, el procedimiento de tener que troquelar un fragmento de diferentes discos de 1 milímetro para cada conjunto de cebador usado lleva mucho tiempo para que sea eficaz.

La presente invención proporciona una solución ideal permitiendo la elución del ADN proporcionando así un ADN soluble para cada una de las reacciones realizadas.

Específicamente, el procedimiento de CMT utiliza fibra de vidrio Whatman GF/L que se ha demostrado que captura específicamente leucocitos de la aplicación de sangre completa. Con la captura celular, se introduce un tampón de lisis y el ADN genómico liberado se une al GF/L. La unión del ADN genómico - GF/L es una interacción suficientemente fuerte para resistir varias etapas de lavado. Tras el lavado, el ADN genómico unido a GF/L se eluye con la aplicación de agua o tampón TE al filtro preferiblemente a 82ºC. Tal como se trató anteriormente, puede usarse una variedad de temperaturas y tampones. El medio GF/L garantiza la captura de leucocitos de la sangre completa. El revestimiento descrito en el presente documento potencia la lisis de las células sin la adición de etapas y tampones de lisis inconvenientes. El ADN genómico permanece unido al medio GF/L durante las etapas de lavado. La elución completa del ADN genómico unido se logra con la adición de agua o tampón a la temperatura adecuada, preferiblemente 80ºC.

Con el ADN genómico en un formato soluble, pueden llevarse a cabo muchas reacciones de PCR de la misma población de ADN simplemente tomando alícuotas del molde en lugar de con el engorroso troquelado de fragmentos. Asimismo, puede incorporarse una matriz de GF/L revestida con FTA en un único tubo, según se trató anteriormente, de un dispositivo de microplaca dependiendo del grado de rendimiento requerido.

Los ejemplos anteriores muestran las diversas utilidades de la presente invención y no pretenden ser limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Elución por calor

Se depositaron varias gotas de sangre recién extraída por punción capilar en la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención y se dejaron secar al aire durante dos minutos. Una vez secas se tomaron dos fragmentos troquelados de 1 mm de diámetro de la mancha de sangre seca y se aplicaron a tubos de PCR individuales de polipropileno de 200 ul. A cada tubo que contenía un único fragmento troquelado con sangre de 1 mm, se añadieron 200 ul de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Por 500 ml: 0,29 g de NaCl; 5 ml de Tris 1 M pH 7,5; 1 ml de EDTA 0,5 M; 2,5 ml de Triton x-100. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de los tubos. Se añadió a cada tubo una segunda alícuota de 200 ul de reactivo de purificación FTA. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de ambos tubos. Después se añadieron 200 ul de tampón TE (Tris-HCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Entonces se aspiró completamente el tampón TE de ambos tubos, dejando el disco ahora lavado de 1 mm en el fondo de cada tubo. Se aplicaron entonces 20 ul de agua libre de nucleasas a ambos tubos. Un tubo se incubó a 82ºC durante 10 minutos; el otro se incubó a 95ºC durante 10 minutos en un termociclador Biometra. Tras las incubaciones con calor se aspiraron los 20 ul de agua libre de nucleasas de cada tubo y se conservaron. Se preparó una mezcla maestra de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega), con una alícuota de 25 ul aplicada a ambos tubos que contenían los fragmentos troquelados de 1 mm, y una alícuota de 5 ul aplicada a ambas muestras de agua libre de nucleasas de 20 ul. Se llevó a cabo la PCR siguiendo los parámetros descritos por el fabricante del conjunto de cebador de amelogenina (Promega). Tras la PCR, se visualizaron 10 ul de cada reacción de PCR en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio.

Puede observarse a partir de los resultados de la amplificación de la amelogenina (figura 1), que el ácido inmovilizado en la membrana de filtro no se separa fácilmente del soporte sólido tras la incubación con calor a 82ºC. El producto de amplificación se observa a partir del fragmento troquelado sólido de 1 mm, pero no está presente en la fracción de agua libre de nucleasas de 20 ul. En la incubación con calor a 95ºC se observa que el ácido se eluye de la membrana de filtro. El producto de amplificación no se detecta a partir del fragmento troquelado sólido de 1 mm, pero está presente en la fracción de agua libre de nucleasas.

Ejemplo 2

Protocolo de elución completa

Se depositaron varias gotas de sangre recién extraída por punción capilar en la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención y se dejaron secar al aire durante dos minutos. Una vez secas, se tomaron dos fragmentos troquelados de 1 mm de la mancha de sangre seca y se aplicaron a tubos de PCR individuales de polipropileno de 200 ul. A cada tubo que contenía un único fragmento troquelado con sangre de 1 mm, se añadieron 200 ul de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró del tubo el reactivo de purificación FTA, se conservaron 20 ul del aspirado. Se añadió a cada tubo una segunda alícuota de 200 ul de reactivo de purificación FTA. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de ambos tubos, se conservaron 20 ul del aspirado. Después se añadieron 200 ul de tampón TE a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Entonces se aspiró completamente el tampón TE de ambos tubos, dejando el disco ahora lavado de 1 mm en el fondo de cada tubo.

A uno de los tubos, se aplicaron entonces 20 ul de agua libre de nucleasas, y después se incubaron a 95ºC durante 10 minutos en un termociclador Biometra. No se añadió nada al otro tubo que contenía un fragmento troquelado de 1 mm. Tras calentar la incubación de uno de los tubos; se aspiraron los 20 ul de agua libre de nucleasas y se conservaron. Se preparó una mezcla maestra de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega), con una alícuota de 25 ul aplicada al tubo que contenía el fragmento troquelado de 1 mm que no se había sometido a la incubación con calor, y también el fragmento troquelado de 1 mm que se había sometido a la incubación con calor. Se aplicó una alícuota de 5 ul de la mezcla maestra a las muestras de agua libre de nucleasas de
20 ul del fragmento troquelado de incubación con calor, así como a las alícuotas de 20 ul tomadas de ambas incubaciones con reactivo de purificación FTA. Se llevó a cabo la PCR siguiendo los parámetros descritos por el fabricante del conjunto de cebador de amelogenina (Promega). Tras la PCR se visualizaron 10 ul de cada reacción de PCR en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio.

Puede observarse a partir de los resultados de la amplificación de la amelogenina (figura 2) que el ácido de una fuente de células completas se inmoviliza en la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención y no se eluye del soporte sólido durante las etapas de lavado. Esto se ilustra con el producto de amplificación detectado a partir del fragmento troquelado de 1 mm procesado sin etapa de elución por calor, y la falta de producto de amplificación detectada en ambas etapas de lavado con reactivo de purificación FTA. La elución completa, o la liberación, del ácido nucleico inmovilizado tras la incubación con calor se ilustra mediante el producto de amplificación detectado en el aspirado de agua libre de nucleasas de 20 ul, y ninguno detectado a partir del fragmento troquelado de 1 mm sometido a incubación con calor. El ejemplo 2 indica que todo el ácido nucleico que se ha inmovilizado inicialmente en la membrana de filtro permanece unido durante las etapas de lavado y se recupera completamente en una fracción soluble tras la incubación con calor a 95ºC.

Ejemplo 3

Comparación de elución

El ADN monocatenario puede detectarse fácilmente con el uso de OliGreen^{R} (Molecular Probes, Inc), una sonda fluorescente específica para la molécula monocatenaria. Mediante el uso de OliGreen, puede determinarse el ADN monocatenario total eluido de la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención, así como otros procedimientos de purificación de ADN monocatenario. Se construyó una curva patrón para el ADN genómico monocatenario según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Inc) (véase la figura 3a).

Se depositaron 5 ul de sangre recién extraída por punción capilar en un disco de 7 mm de la membrana de filtro, compuesto de una membrana de filtro de microfibras de vidrio porosa revestida químicamente, y también en un disco de 7 mm del soporte sólido con FTA comercialmente disponible. Se permitió que ambas manchas se secaran al aire durante dos minutos. Una vez secas, se aplicaron los fragmentos troquelados a tubos Eppendorf individuales de polipropileno de 1,5 ml. A cada tubo que contenía un único fragmento troquelado con sangre de 7 mm, se añadió 1 ml de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc).

Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de ambos tubos. Se añadió una segunda alícuota de 1 mm de reactivo de purificación FT a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación, se aspiró el reactivo de purificación FTA de ambos tubos. Entonces se añadió 1 ml de tampón TE a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Entonces se aspiró completamente el tampón TE de ambos tubos, dejando los fragmentos troquelados de 7 mm ahora lavados en el fondo de cada tubo. A ambos tubos, se aplicaron 200 ul de agua libre de nucleasas y después se incubaron a 100ºC durante diez minutos en un baño de agua.

Tras la incubación con calor, se aspiró la fracción de agua libre de nucleasas de ambos tubos y se enfrió inmediatamente en hielo. Entonces se sometieron 50 ul de la fracción de agua libre de nucleasas de ambas muestras a cuantificación fluorométrica OliGreen según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Inc). Se tomaron las unidades de fluorescencia relativas (UFR) para cada muestra y con el uso de la curva patrón (la figura 3a) se calcularon los rendimientos totales del ADN eluido (el factor de dilución para la cuantificación es de 4 veces, el volumen total del eluato es de 200 ul).

Normalmente, a partir de 5 ul de sangre completa pueden esperarse entre 35.000 y 50.000 glóbulos blancos; conteniendo cada célula aproximadamente 7 pg de ADN genómico (A. Eisenberg, comunicación personal). Tomando el límite superior, se esperan 350 ng de ADN genómico total a partir de 5 ul de sangre completa. A partir de los datos de la cuantificación OliGreen (figura 3b) puede observarse que se recuperan 300 ng de ADN genómico total de la membrana de filtro lo que representa casi el 100% del rendimiento esperado. Se recuperan 60,2 ng de ADN genómico total a partir de 5 ul de sangre completa depositada en el soporte sólido con FTA. El ejemplo 3 ilustra que la membrana de filtro muestra una característica de elución de ácido nucleico que no es evidente para el soporte sólido con FTA. Además, a partir de 5 ul de sangre completa, puede aislarse aproximadamente el 100% del ADN genómico disponible presente dentro de las células de muestra como una fracción soluble.

Ejemplo 4

Preparación de ADN genómico a partir de saliva

Puede purificarse fácilmente ADN genómico a partir de muchas fuentes celulares diferentes. Una de las fuentes más comunes, particularmente en medicina forense y para su recogida no invasiva, es la saliva que contiene células epiteliales bucales. Aunque es fácil de recoger, la saliva muestra algunas dificultades para la purificación de ADN genómico porque es extremadamente viscosa y no se aplica fácilmente en cromatografía en columna. Además están presentes inhibidores de PCR dentro de la mucosa de la saliva.

Se aplicaron 5 ul, 10 ul, 50 ul y 100 ul de saliva femenina a fragmentos troquelados individuales de 7 mm de la membrana de filtro. Los fragmentos troquelados de 7 mm con saliva depositada se secaron al aire durante dos minutos. Una vez secos, se aplicaron los fragmentos troquelados a tubos Eppendorf individuales de polipropileno de 1,5 ml. Se añadió a cada tubo que contenía un único fragmento troquelado de 7 mm con saliva, 1 ml de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación, se aspiró el reactivo de purificación FTA de los tubos. Se añadió una segunda alícuota de 1 ml de reactivo de purificación FTA a cada tubo.

Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de ambos tubos. Entonces se añadió 1 ml de tampón TE a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después se aspiró completamente el tampón TE de los tubos, dejando los fragmentos troquelados de 7 mm ahora lavados en el fondo de cada tubo. Se aplicaron a ambos tubos 200 ul de agua libre de nucleasas y después se incubaron a 100ºC durante diez minutos en un baño de agua. Tras la incubación con calor, se aspiró la fracción de agua libre de nucleasas de todos los tubos y se enfriaron inmediatamente en hielo. Entonces se sometieron 50 ul de la fracción de agua libre de nucleasas de todas las muestras a cuantificación fluorométrica OliGreen según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Inc). Se tomaron las unidades de fluorescencia relativas (UFR) para cada muestra y con el uso de la curva patrón (3 a) se calculó el rendimiento total del ADN eluido (el factor de dilución para la cuantificación es de 4 veces, el volumen total del eluato es de 200 ul). Se utilizaron 10 ul de la fracción de agua libre de nucleasas de seis muestras (5 ul) de saliva femenina depositadas en la membrana de filtro y sometidas a las mismas etapas de procesamiento que anteriormente, como el molde para la amplificación por PCR de amelogenina de un volumen de reacción de 25 ul según las instrucciones del fabricante (Promega).

Puede observarse (figura 4a) que el ADN genómico puede aislarse como una fracción soluble a partir de saliva depositada en la membrana de filtro mediante el procedimiento de la invención. Se facilita la relación entre el volumen inicial de saliva y el rendimiento total de ADN. El aumento del rendimiento del ADN genómico soluble no muestra una relación lineal con respecto el volumen inicial de saliva, esto se debe probablemente a que la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención llega a saturarse con el volumen de saliva, alcanzando la capacidad un máximo a aproximadamente 50 ul.

La amplificación por PCR de amelogenina puede demostrarse para todas las fracciones de elución de agua libre de nucleasas de 5 ul de saliva inicial depositadas en la membrana de filtro usada en el procedimiento de la invención (figura 4b).

Ejemplo 5

Uso posterior de ADN eluido

El tipado tisular es una técnica de genotipado genérica que es una práctica común dentro de la comunidad clínica. A menudo se extrae sangre de un posible donante y se determina su tipo tisular mediante una combinación de PCR específica de alelo seguida por hibridación.

Se aplicaron 5 ul de sangre completa masculina recientemente obtenida a seis fragmentos troquelados de 7 mm de la membrana de filtro. Después se aplicaron los fragmentos troquelados a tubos Eppendorf de polipropileno de
1,5 ml. A los tubos que contenían un único fragmento troquelado con sangre de 7 mm se le añadió 1 ml de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de los tubos. Se añadió a los tubos una segunda alícuota de 1 ml de reactivo de purificación FTA. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de los tubos. Después se añadió 1 ml de tampón TE. Después se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Entonces se aspiró el tampón TE completamente de los tubos, dejando los fragmentos troquelados de 7 mm ahora lavados en el fondo. Se aplicaron 200 ul de agua libre de nucleasas y se incubaron entonces los tubos a 100ºC durante 10 minutos en un baño de agua. Tras la incubación con calor se aspiró la fracción de agua libre de nucleasas de los tubos y se usaron
10 ul de cada uno para la amplificación por PCR de HLA-A o bien para la amplificación por PCR de HLA-B. Ambas amplificaciones por PCR se llevaron a cabo según las indicaciones del fabricante (Lifecodes, Inc). Se visualizaron
10 ul de cada reacción de amplificación sobre un gel de agarosa al 1,5% con tinción de bromuro de etidio.

Todas las fracciones de agua libre de nucleasas obtenidas de las muestras de sangre depositadas en la membrana de filtro y tratadas según el procedimiento de la invención dan un producto de amplificación por PCR para HLA-A (figura 5a), y HLAB (figura 5b). El ejemplo 5 ilustra la validez de la purificación de ADN genómico soluble a partir de sangre usando la membrana de filtro de la invención, proporcionando un fracción de ADN soluble que puede utilizarse para reacciones de amplificación de genotipado típicas. La generación de un producto de amplificación de 1 kb ilustra la alta calidad de la fracción de ADN genómico soluble aislado.

Ejemplo 6

Formatos de membrana de filtro

Una ventaja principal de la membrana de filtro descrita es que se fabrica en forma de un rollo de papel de filtro. Al papel de filtro fabricado de este modo puede dársele formato para una variedad de dispositivos. A otros medios de purificación de ADN genómico tales como resina polimérica, por ejemplo, no puede dárseles formato del mismo modo. Por ejemplo, es adecuado para un material de filtro que va a diseñarse en una configuración de escobilla (sería extremadamente difícil proponer el mismo formato para la resina cromatográfica). El formato deseado para la membrana de filtro depende de la aplicación.

La saliva representa una muestra muy difícil porque es un líquido viscoso. La cromatografía en columna tradicional o los tubos de centrifugación no son dispositivos para manejarla. Para este fin, se dio formato a la membrana de filtro descrita en la configuración de un disco de 7,5 mm de flotación libre contenido dentro de un tubo Eppendorf de 2 ml. Con un dispositivo de este tipo, puede administrarse directamente saliva de la boca del donante. Ya que la membrana de filtro es de flotación libre dentro del tubo, no habrá cambio en la obstrucción del filtro que da como resultado una escasa recuperación.

Se administraron directamente seis muestras de saliva de aproximadamente 100 ul cada una a tubos individuales que contenían un disco de flotación libre de la membrana de filtro. A cada tubo que contenía un único disco de saliva de 7,5 mm se le añadió 1 ml de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de los tubos. Se añadió una segunda alícuota de 1 ml de reactivo de purificación FTA a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación, se aspiró el reactivo de purificación FTA de los tubos. Después se añadió 1 ml de tampón TE a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Entonces se aspiró completamente el tampón TE de los tubos, dejando los discos de 7,5 mm ahora lavados en el fondo de cada tubo.

A todos los tubos se les aplicaron 200 ul de agua libre de nucleasas y después se incubaron a 100ºC durante 10 minutos en un baño de agua. Tras la incubación con calor se aspiraron las fracciones de agua libre de nucleasas de todos los tubos y se aplicaron 10 ul de cada eluato a 25 ul de reacciones de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega). Se visualizaron 10 ul de cada reacción sobre un gel de agarosa al 1,5% y tinción con bromuro de etidio (figura 6a). Puede utilizarse el disco de flotación libre para la membrana de filtro para muestras difíciles tales como la saliva.

La membrana de filtro puede darse formato para un dispositivo de microcentrífuga. Un dispositivo de este tipo ha demostrado ser una herramienta extremadamente rápida para aislar ácidos nucleicos (véase el catálogo de Qiagen). Se configuraron tres capas de discos de 7,4 mm de la membrana de filtro dentro en la cesta giratoria de siete dispositivos de microcentrífuga. Se aplicaron 5 ul de siete muestras individuales de sangre masculina al disco de filtro de cada cesta giratoria. Se añadieron 0,5 ml de reactivo de purificación FTA (Fitzco Inc.) a la cesta. Entonces se centrifugaron los tubos de microcentrífuga que contenían la cesta a 6000 xg durante un minuto. Se desecharon los filtrados resultantes de los tubos de microcentrífuga. Se añadieron de nuevo 0,5 ml de reactivo de purificación FTA a las cestas de filtro y se centrifugaron de nuevo los tubos a 6000 xg durante un minuto. Tras la eliminación de los filtrados de los tubos de microcentrífuga se añadieron 0,5 ml de tampón TE a la cestas. A esto le siguió el mismo régimen de centrifugación descrito anteriormente. Tras la etapa de centrifugación con tampón TE se añadieron 200 ul de agua libre de nucleasas a las cestas de los tubos de microcentrífuga. Después se incubaron los tubos de microcentrífuga a 100ºC durante quince minutos en un baño de agua. Tras la incubación con calor se centrifugaron los tubos de microcentrífuga a 12.000 xg durante dos minutos para recuperar las fracciones de agua libre de nucleasas. Se aplicaron 10 ul de cada fracción de agua libre de nucleasas a 25 ul de reacciones de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega). Se visualizaron 10 ul de cada reacción sobre un gel de agarosa al 1,5% y tinción con bromuro de etidio (figura 6b).

El dispositivo de microcentrífuga que contiene la membrana de filtro puede utilizarse para aislar ADN genómico soluble de sangre completa usando el procedimiento de la invención en menos de 20 minutos. La calidad del ADN genómico aislado se demuestra con la amplificación por PCR al 100% de las muestras evaluadas.

Con frecuencia se usan los frotis bucales como un medio para la recogida de muestras que contienen ácido nucleico tales como células epiteliales, particularmente en estudios de campo de población tales como la identificación de delincuentes. A la membrana de filtro puede dársele formato en la configuración de una escobilla que puede administrarse directamente dentro de la boca del donante. Realizando frotis con la escobilla por todo el interior de la mejilla del donante pueden recogerse células epiteliales sobre la membrana de filtro de la invención. Otras herramientas de purificación de ADN genómico tales como la resina cromatográfica no pueden configurarse fácilmente para dar escobillas que se apliquen a la boca del donante.

Se configuró un trozo pequeño de la membrana de filtro dentro del vástago de una escobilla oral comercialmente disponible (Fitzco Inc). Se colocó la escobilla dentro de la boca de un donante masculino y se realizó un frotis por todo el interior de la mejilla durante diez segundos. Tras el frotis se colocó la membrana de filtro que constituía la cabeza de la escobilla dentro de un tupo Eppendorf de 1,5 ml. Al tubo que contenía la cabeza de escobilla se le añadió 1 ml de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Se incubó el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA del tubo. Se añadió una segunda alícuota de 1 ml de reactivo de purificación FTA a cada tubo. Se incubó el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA del tubo. Entonces se añadió 1 ml de tampón TE al tubo. Se incubó el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después se aspiró completamente el tampón TE del tubo, dejando la cabeza de escobilla ahora lavada en el fondo de cada tubo. Se aplicaron a todos los tubos 200 ul de agua libre de nucleasas y entonces se incubaron a 100ºC durante diez minutos en un baño de agua. Tras la incubación con calor se aspiró la fracción de agua libre de nucleasas del tubo y se aplicaron 10 ul del eluato a 25 ul de la reacción de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega). Se tomo un fragmento troquelado de 1 mm de la cabeza de escobilla tras la incubación con calor y se aplicó a 25 ul de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega). Se visualizaron 10 ul de cada reacción sobre un gel de agarosa al 1,5% y tinción con bromuro de etidio (figura 6c). La membrana de filtro puede configurarse en la forma de un escobilla que puede utilizarse para purificar ADN genómico de frotis bucales usando el procedimiento de la invención. El ADN genómico soluble aislado es adecuado para la amplificación por PCR.

Ejemplo 7

Comparaciones de productos

Hay muchos sistemas de purificación de ADN genómico que están comercialmente disponibles. Para ilustrar la validez de la membrana de filtro, se comparó el dispositivo directamente con los kits de purificación de ADN genómico disponibles de Roche Molecular Biochemicals (Split Second^{TM}) y Promega (AmpReady^{TM}).

Se aplicaron 5 ul de sangre recién extraída por punción capilar a ambos los kits comerciales y la membrana de filtro descrita. Se siguió el procedimiento según las indicaciones del fabricante para los dos kits comerciales. Se depositaron 5 ul de sangre recién extraída por punción capilar en un disco de 7 mm de la membrana de filtro. Se aplicó el fragmento troquelado a un tubo Eppendorf de polipropileno de 1,5 ml. Al tubo que contenía un único fragmento troquelado de sangre de 7 mm se le añadió 1 ml de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Se incubó el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA del tubo. Se añadió una segunda alícuota de 1 ml de reactivo de purificación FTA al tubo. Se incubó el tubo durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar.

Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA del tubo. Entonces se añadió 1 ml de tampón TE al tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después se aspiró completamente el tampón TE del tubo, dejando los fragmentos troquelados de 7 mm ahora lavados en el fondo del tubo.

Se aplicaron al tubo 200 ul de agua libre de nucleasas y después se incubó a 100ºC durante diez minutos en un baño de agua. Tras la incubación con calor se aspiró la fracción de agua libre de nucleasas de ambos tubos y se enfriaron inmediatamente en hielo. Entonces se sometieron 50 ul de la fracción de agua libre de nucleasas a cuantificación fluorométrica OliGreen según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Inc).

Se llevó a cabo la misma cuantificación OliGreen para las dos muestras de ADN genómico purificado de Roche Molecular Biochemical y Promega. Se tomaron las unidades de fluorescencia relativas (UFR) para todas las muestras y con el uso de la curva patrón (3 a) se calculó el rendimiento total del ADN eluido (el factor de dilución para la cuantificación es de 4 veces, el volumen total del eluato es de 200 ul) (véase la figura 7b). Se aplicó una alícuota de 10 ul del ADN genómico producido a partir de cada protocolo a 25 ul de reacciones de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega). Se visualizaron 10 ul de cada reacción sobre un gel de agarosa al 1,5% y tinción con bromuro de etidio.

Se ha construido una tabla que explica las diversas etapas para cada protocolo (figura 7a) e ilustra que la membrana de filtro requiere menos manipulación y puede completarse en una cantidad de tiempo similar, o más rápido, que los kits comerciales.

La amplificación por PCR de amelogenina es exitosa para todas las metodologías evaluadas (figura 7c). La membrana de filtro usando el procedimiento de la invención de la invención proporciona un procedimiento para aislar ADN genómico que es comparable a los kits comercialmente disponibles en cuanto a la velocidad, el rendimiento y la calidad de molde de PCR.

Ejemplo 8

Archivo de muestras de sangre

La capacidad para archivar muestras que contienen ácido nucleico tales como sangre o clones de plásmido bacteriano es extremadamente importante para procedimientos en los que han fallado los procedimientos posteriores, cuando se requieren regímenes de tipo "look-back" (retroactivos) en la medicina de transfusión, o se necesita un genotipado de un paciente que ya no está vivo. Se ha demostrado en las patentes estadounidense 5.496.562; 5.756.126; y 5.807.527 que las muestras de sangre aplicadas a un soporte sólido con FTA puede mantenerse estable sin dañar el ácido nucleico a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongados. La característica se debe en parte a la composición química de la matriz sólida. La membrana de filtro descrita en el presente documento está compuesta por una composición química exacta a la del soporte sólido con FTA, pero difiere de FTA con respecto al material de filtro base. El siguiente experimento demuestra que la membrana de filtro mantiene la capacidad de archivo de los filtros de la técnica anterior mientras que permite mejoras inesperadas cuando se usa en el procedimiento de la presente invención.

Se depositaron varias gotas de sangre recién extraída por punción capilar en la membrana de filtro y se dejaron secar al aire durante dos minutos. Una vez secas, se tomaron inmediatamente dos fragmentos troquelados de 1 mm de diámetro de la mancha de sangre seca y se aplicaron a tubos individuales para PCR de polipropileno de 200 ul. El resto de la mancha de sangre se colocó dentro de una bolsa hermética de polipropileno y se almacenó a temperatura ambiente en una mesa de laboratorio durante 19 semanas.

Tras 19 semanas de almacenamiento, se tomó un fragmento troquelado de 1 mm de la mancha de sangre y se aplicó a un tubo para PCR de polipropileno de 200 ul. Se añadieron a cada tubo que contenía un único fragmento troquelado de 1 mm de sangre, 200 ul de reactivo de purificación FTA (Fitzco, Inc). Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar.

Tras la incubación, se aspiró el reactivo de purificación FTA del tubo. Se añadió una segunda alícuota de 200 ul de reactivo de purificación FTA a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Tras la incubación se aspiró el reactivo de purificación FTA de los tubos. Se añadieron entonces 200 ul de tampón TE a cada tubo. Se incubaron los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después se aspiró completamente el tampón TE de ambos tubos, dejando el disco de 1 mm ahora lavado en el fondo de cada tubo. Después se aplicaron 20 ul de agua libre de nucleasas a ambos tubos. Entonces se incubaron los tubos a 95ºC durante 10 minutos. Tras las incubaciones con calor se aspiraron 20 ul de agua libre de nucleasas de cada tubo y se conservaron.

Se preparó una mezcla maestra de amplificación por PCR de amelogenina según las instrucciones del fabricante (Promega), aplicando una alícuota de 25 ul a ambos tubos que contenían los fragmentos troquelados de 1 mm y aplicando una alícuota de 5 ul a muestras de agua libre de nucleasas de 20 ul. Se llevó a cabo la PCR siguiendo los parámetros descritos por el fabricante del conjunto de cebador de amelogenina (Promega). Tras la PCR, se visualizaron 10 ul de cada reacción de PCR sobre un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio y se fotografiaron usando una cámara Polaroid.

El ejemplo 8 ilustra que el aislamiento y la amplificación por PCR de ADN genómico soluble puede llevarse a cabo a partir de sangre fresca depositada en la membrana de filtro en el día 1 (figura 8a). La misma muestra de sangre depositada en la membrana de filtro también puede tratarse para dar ADN genómico soluble aislado que es adecuado para la amplificación por PCR (figura 8b). La membrana de filtro muestra las mismas características de archivo de muestras que el soporte sólido con FTA. Junto con la característica de archivo demostrada, la membrana de filtro descrita difiere del soporte sólido con FTA en que puede liberarse fácilmente el ácido nucleico inmovilizado de la matriz de filtro sólida usando el procedimiento de la invención.

La invención se ha descrito de manera ilustrativa y ha de entenderse que la terminología que se ha usado pretende incluirse en la naturaleza de las palabras de la descripción en lugar ser de una limitación.

Claims

1. Un procedimiento de almacenamiento de un material genético y posterior análisis del material genético mediante las etapas;

(a) aplicar una muestra que comprende células que contienen material genético a un soporte, en el que el soporte comprende una membrana de filtro que comprende fibras de vidrio, teniendo la membrana de filtro un revestimiento químico que comprende un agente desnaturalizante de proteínas y una trampa de radicales libres sorbida sobre la misma, mediante lo cual las células se lisan para liberar el material genético que está estabilizado mediante el soporte,

(b) eluir el material genético en agua calentada en el intervalo de temperatura de 65ºC a 100ºC, mediante lo cual el material genético se libera en el agua calentada para generar una fracción genética soluble, y

(c) analizar el material genético eluido.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho soporte es una membrana de filtro de microfibras de vidrio.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho medio de soporte está constituido esencialmente por un material tejido.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho medio de soporte está constituido esencialmente por un medio seco plano.

5. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha etapa de elución se define además como exponer el soporte al agua, calentar el agua que contiene el soporte que tiene la muestra genética inmovilizada sobre el mismo y liberar el material genético calentado del soporte calentado y hacia la disolución en el agua.

6. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho revestimiento químico incluye además una base débil, un agente quelante, un tensioactivo y opcionalmente ácido úrico o una sal de urato.

7. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el agua incluye un tampón.

8. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el agua está libre de nucleasas.

9. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que incluye además la etapa de lavar el soporte que tiene el material genético inmovilizado en el mismo antes de dicha etapa de elución.

10. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que incluye además las etapas de colocar la muestra que comprende células que contienen material genético en un recipiente que contiene el soporte; poner en contacto el soporte con el material genético y realizar dichas etapas de inmovilización y elución dentro del recipiente.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la muestra es saliva.

12. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que incluye además las etapas de depositar una muestra de sangre sobre el soporte; secar la muestra de sangre en el mismo; y posteriormente inmovilizar el material genético procedente de la muestra de sangre sobre el soporte.

13. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que incluye además las etapas de depositar una muestra de saliva sobre el soporte; secar la muestra de saliva sobre el soporte; y posteriormente inmovilizar el material procedente de las células epiteliales bucales contenidas en la saliva sobre el soporte.

14. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el soporte está en la forma de una escobilla.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que la muestra es una muestra bucal.

16. Un procedimiento según la reivindicación 14, que incluye además la etapa de frotar alimentos sobre el soporte, definiéndose además dicha etapa de análisis como la detección de patógenos sobre el soporte.

17. Un procedimiento según la reivindicación 14, que incluye además la etapa de frotar un material de canal, definiéndose además dicha etapa de análisis como la identificación del canal.

18. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa (c) se define además como la amplificación del material genético soluble y la visualización del material genético amplificado.

19. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho material genético amplificado se visualiza marcándolo con una sonda fluorescente.

20. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el soporte está dispuesto dentro de una cesta giratoria de un dispositivo de microcentrífuga, hacer girar la cesta, desechar un filtrado producido y posteriormente realizar la etapa de elución (b).

21. Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que la etapa de elución (b) se define además como la adición de agua calentada a la cesta que contienen el soporte posteriormente a dicha etapa de desechado, hacer girar la cesta y recoger el agua que contiene el ácido nucleico eluido en la misma.