RU2518302C1 - Способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени - Google Patents
Способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2518302C1 RU2518302C1 RU2013100496/10A RU2013100496A RU2518302C1 RU 2518302 C1 RU2518302 C1 RU 2518302C1 RU 2013100496/10 A RU2013100496/10 A RU 2013100496/10A RU 2013100496 A RU2013100496 A RU 2013100496A RU 2518302 C1 RU2518302 C1 RU 2518302C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- pcr
- plague
- test
- microbial
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации возбудителя чумы и оценки количества микробных клеток, идентифицируемых в качестве возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, включающий следующие стадии: выделение ДНК микроорганизма из исследуемых проб, подготовка калибровочной панели, исследование выделенной ДНК в ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов с флуоресцентной меткой, идентификация исследуемой ДНК как ДНК микробного или немикробного штамма по наличию нарастания флуоресцентного свечения или его отсутствию соответственно, определение по калибровочной панели концентрации ДНК в пробе. Использование изобретения позволяет повысить эффективность идентификации исследуемой пробы и сократить сроки ее тестирования в режиме реального времени. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к медицинской биотехнологии, и может быть использовано для детекции, идентификации возбудителя чумы, а также для определения концентрации микробных клеток Yersinia peutis в исследуемой пробе.
Известна тест система «ГенПест - Тест-система для выявления ДНК Y.pestis методом ПЦР», ТУ 8895-005-01898109-2007, заключающаяся в том, что учет реакции проводят с помощью электрофоретического разделения фрагментов амплифицированной ДНК.
Однако, при этом возникает необходимость переноса амплифицированного материала на гель, что удлиняет процедуру детекции и создает условия для загрязнения реактивов и лабораторного оборудования продуктами ПЦР, что может привести к получению ложных результатов анализа.
Кроме того, недостатком является и то, что праймерами в этом методическом подходе являются олигонуклеотиды, комплементарные участкам ДНК на плазмидах, но не хромосомах, что не позволяет детектировать бесплазмидные штаммы возбудителя чумы.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ мультиплексной ПЦР с оценкой результатов в реальном времени для детекции возбудителей чумы и псевдотуберкулеза (см. Matero P, Pasanen Т, Laukkanen R, Tissari P, Tarkka E, Vaara M, Skurnik M. Real-time multiplex PCR assay for detection of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. APMIS 2009; 117:34-44), заключающийся в том, что предложенный тест включает 4 пары праймеров, два из которых специфичны для возбудителя чумы, один для возбудителя псевдотуберкулеза и один для бактериофага лямбда, при этом описанные праймеры используют как в простой, так и в мультиплексной реакции, применяя специфические зонды, меченные различными флуорохромами.
Однако в данной работе представлены данные испытания разработанных авторами праймеров и зондов для детекции возбудителя чумы на ограниченном числе штаммов (всего двух), что не может являться доказательством эффективного использования тест-системы авторов на других штаммах возбудителя чумы.
Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке новой тест-системы, в которой используют сконструированные хромосомные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, позволяющие повысить эффективность идентификации исследуемой пробы и сократить сроки ее тестирования в режиме реального времени.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, включающем выделение из микробной клетки ДНК возбудителя чумы, с последующим исследованием ее в ПЦР с использованием специфических праймеров и зонда с флуоресцентной меткой, и отличающимся тем, что флуоресцентную детекцию проводят сконструированными праймерами:
AL12for - 5'-TCCTGAATCAGGAGAGCAGATTACC-3'
AL12rev - 5'-TGAAGCCGCTCACACGATGT-3'
и флуоресцентно-меченым зондом:
Fam-AL12 - Fam-TTTGAAGGCGATAATGACGGCGGGA-HBQ1,
при этом регистрацию результатов проводят по присутствию и нарастанию флуоресцентного свечения, чем оно выше, тем больше молекул ДНК возбудителя Y.pestis в пробе, позволяя по интенсивности свечения идентифицировать возбудитель чумы от других близкородственных чуме микроорганизмов, а использование калибровочной панели дает возможность одновременно по графикам кривых флуоресценции отражать концентрацию ДНК во время амплификации в пробах, по которым оценивают количество микробных клеток в исследуемой пробе.
При этом смесь для амплификации состоит из следующих реагентов: специфические праймеры (каждый)-15 пм, зонд с флуоресцентной меткой - 15 пм, dNTP - 3 мМ, TRIS-HCl (при рН 8,6) - 84 мМ, (NH4)2SO4 - 21 мМ, MgCl2 - 3 мМ, Taq -полимераза - 5 ед.
Кроме того, ПЦР реакция проходит с соблюдением следующих температурных режимов:
нагрев: 95°С - 15 мин;
5 циклов: денатурация - 95°С - 5 с, отжиг - 60°С - 20 с, элонгация - 72°С - 15 с;
40 циклов: денатурация - 95°С - 5 с, отжиг - 60°С - 10 с, детекция флуоресценции - 60°С - 15 с, элонгация - 72°С - 15 с;
хранение - 4°С.
Способ осуществляется следующим образом.
Для проведения способа были сконструированы новые специфические для ДНК возбудителя чумы олигонуклеотидные последовательности (праймеры) и зонд с флуоресцентной меткой (см. Таблица 1).
Из материала, содержащего микробные клетки возбудителя чумы, выделяют ДНК, которую добавляют в смесь для амплификации. ДНК из клеток возбудителя чумы выделяют стандартным методом, описанным в МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II группы патогенности», - М., 2003.
В состав смеси входят следующие комплекты реагентов: помимо специфических праймеров (по 15 пМ каждого) и флуоресцентно-меченого зонда (15 пМ), 3 мМ каждого dNTP; 84 мМ TRIS-HCl (рН 8,6); 21 мМ (NH4)2SO4; 3 мМ MgCl2, а также 5 единиц Taq-полимеразы.
Затем проводят амплификацию ДНК с помощью детектирующего амплификатора в закрытых амплификационных пробирках. Режим амплификации представлен в таблице 2.
Детекция результатов проходит во время проведения ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. Анализ результатов проводится в табличной и графической формах с помощью программного обеспечения, поставляемого совместно с амплификатором. Так как зонд мечен флуорохромом Fam, то его флуоресцентное свечение фиксируется при длине волны 520 нм.
Для определения количества микробных клеток в пробе перед проведением ПЦР готовят калибровочную панель путем выделения ДНК из взвеси вакцинного штамма возбудителя чумы концентрацией 1×109 микробных клеток в 1 миллилитре (мк.кл./мл), и последовательного десятикратного разведения ДНК. Эта калибровочная панель используется при анализе проб.
Количественный анализ проводят с применением в анализе, совместно с опытной пробой, референтных проб, с различной концентрацией ДНК возбудителя чумы, эквивалентной определенным концентрациям микробных клеток.
Таким образом, сущность предлагаемого изобретения заключается в использовании новых специфических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для обнаружения хромосомных последовательностей ДНК в ПЦР с учетом результата в реальном времени. В ходе ПЦР флуоресцентно-меченый зонд, меченный молекулами флуорофора и гасителя флуоресценции, гибридизуется на специфических ампликонах и разрушается Taq-полимеразой, в результате чего флуорофор оказывается свободным от гасителя. Уровень флуоресценции в амплификационных пробирках возрастает пропорционально количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР.
Предлагаемые праймеры и зонд позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов возбудителя чумы ввиду того, что они испытаны на значительном числе как типичных, так и атипичных штаммов, выделенных в различных очагах и полученных в лабораторных условиях. В Ростовском-на-Дону противочумном институте с помощью этого способа успешно протестировано более 250 исследований штаммов возбудителя чумы и других микроорганизмов в качестве отрицательного контроля. Этот факт позволяет оценивать вероятность уклонения от детекции штаммов возбудителя чумы, у которых отсутствуют маркеры, обычно используемые для выявления клеток Y.pestis, стандартными лабораторными методами, как низкую при применении предложенных праймеров и зонда.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Идентификация штаммов возбудителя чумы.
Были проанализированы три пробы, содержащие 1 млн. м.кл. в мл: 1) взвеси микробных клеток возбудителя псевдотуберкулеза (Y.pseudotuberculosis), возбудителя, по своему генотипу, являющемуся очень близким к возбудителю чумы; 2) взвеси микробных клеток типичного штамма возбудителя чумы (Y.pestis EV1290НИИЭГ); 3) взвеси микробных клеток атипичного штамма возбудителя чумы, у которого отсутствовала плазмидная ДНК (Y.pestis 2357).
ДНК выделяют в соответствии с МУ 1.3.1794-03. Для проведения ПНР тестирования предложенных проб составляют взвеси, содержащие следующие комплекты реагентов: помимо специфических праймеров (по 15 пМ каждого) и флуоресцентно-меченого зонда (15 пМ), 3 мМ каждого dNTP; 84 мМ TRIS-HCl (рН 8,6); 21 мМ (NH4)2SO4; 3 мМ MgCl2 а также 5 единиц Taq-полимеразы. Смесь распределяют по отдельным пробиркам, предназначенным для проведения ПЦР. Выделенная ДНК из трех исследуемых образцов в отдельную пробирку добавлялась в количестве 5 мкл. Общий объем реакционной смеси составил 35 мкл. В качестве отрицательного контроля в реакционную смесь добавляют 5 мкл дистиллированной воды. Положительным контролем служит взвесь реагентов, к которую добавляли ДНК из 1 млрд м.кл. в мл штамма Y.pestis EV1290НИИЭГ. Амплификацию и детекцию проводят в детектирующем амплификаторе ДТ-322 (ДНК-технология, Россия). Режим амплификации соответствует режиму, представленному в таблице 1. Детекцию осуществляют датчиком прибора с учетом того, что флуоресценция флуорофора зонда (Fam) фиксируется при длине волны, близкой 520 нм. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения ДТ-322 v5.3, поставляемого совместно с амплификатором. Результаты тестирования проб представлены на графике (см. рис.1).
На рис.1 изображен график кривых флуоресценции, отражающих динамику накопления фрагментов специфической ДНК во время амплификации в пробах: 1) ДНК взвеси микробных клеток вакцинного штамма Y.pestis EV 1290НИИЭГ; 2) ДНК взвеси микробных клеток атипичного штамма Y.pestis 2357, у которого отсутствуют плазмиды; 3) ДНК взвеси микробных клеток возбудителя псевдотуберкулеза Y.pseudotuberculosis; 4) Отрицательный контроль: дистиллированная вода; 5) Положительный контроль: ДНК взвеси микробных клеток возбудителя чумы в количестве, эквивалентном концентрации 109 мк.кл./мл.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в пробах 1, 2 и 5, в которых присутствует ДНК возбудителя чумы, отмечено нарастание флуоресцентного свечения по мере накопления продукта амплификации, в то время, как в пробах 3 и 4, в которых были внесены ДНК псевдотуберкулеза и дистиллированная вода (отрицательный контроль), подобного сигнала не наблюдалось. Таким образом, можно констатировать, что праймеры и зонд, используемый в примере, показали возможность идентифицировать штаммы возбудителя чумы и не участвовали в амплификации и детекции ДНК штамма возбудителя псевдотуберкулеза, близкородственного чуме микроорганизма. Кроме того, в ПЦР с учетом результатов в реальном времени были идентифицированы как типичный штамм Y.pestis, с наличием плазмид, так и атипичный, в котором отсутствовали три плазмиды возбудителя чумы.
Пример 2. Определение концентрации микробных клеток возбудителя чумы в исследуемой пробе.
Исследовали взвесь культуры возбудителя чумы неопределенной концентрации. Для этого выделяют ДНК из пробы и из взвеси культуры вакцинного штамма, концентрацией 1×109 мк.кл./мл, для использования при калибровке. Готовят десятикратные разведения ДНК и получают калибровочную панель с концентрациями ДНК, эквивалентными концентрациям мк.кл./мл Y.pestis 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103. Все пробы (по 5 мкл) внесят в отдельные пробирки с реакционной смесью. В состав смеси входят следующие комплекты реагентов: помимо специфических праймеров (по 15 пМ каждого) и флуоресцентно-меченого зонда (15 пМ), 3 мМ каждого dNTP; 84 мМ TRIS-HCl (рН 8,6); 21 мМ (NH4)2SO4; 3 мМ MgCl2, а также 5 единиц Taq-полимеразы.
Режим амплификации соответствует режиму, представленному в таблице 1. Детекцию осуществляют датчиком прибора с учетом того, что флуоресценция флуорофора зонда (Fam) фиксируется при длине волны, близкой 520 нм.
Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения ДТ-322 v5.3, поставляемого совместно с амплификатором. Результаты тестирования проб представлены на графике (см. рис.2).
На рисунке 2 изображен график динамики накопления фрагментов специфической ДНК во время амплификации в пробах: 1) ДНК возбудителя чумы в концентрации, эквивалентной 109 мк.кл./мл; 2) ДНК возбудителя чумы в концентрации, эквивалентной 108 мк.кл./мл; 3) ДНК возбудителя чумы в концентрации, эквивалентной 107 мк.кл./мл; 4) ДНК ДНК возбудителя чумы в концентрации, эквивалентной 106 мк.кл./мл; 5) ДНК возбудителя чумы в концентрации, эквивалентной 105 мк.кл./мл; 6) ДНК возбудителя чумы в концентрации, эквивалентной 103 мк.кл./мл; 7) Отрицательный контроль: дистиллитрованная вода; 8) Проба с неизвестной концентрацией ДНК Yersinia pestis.
Результаты исследования показали, что концентрация ДНК возбудителя чумы в исследуемой пробе (8 на графике рис.2) эквивалентна концентрации 105 мк.кл./мл, так как кривая графика флуоресценции исследуемой пробы совпадает с графиком флуоресценции калибровочной пробы (5 на графике рис.2) данной концентрации.
Следовательно, в предложенном способе ПЦР-амплификацию проводят с использованием нового набора олигонуклеотидов, включающего специфические праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, позволяющие эффективно идентифицировать как типичные, так и атипичные штаммы возбудителя чумы.
Эффективность идентификации доказана на большом числе штаммов. Детекция результатов ПЦР проводится в закрытых амплификационных пробирках с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, что полностью исключает возможность загрязнения реактивов и оборудования продуктами ПЦР и предотвращает получение ложных результатов анализа. Детекция проводится во время самого анализа и результат анализа получают значительно раньше, что позволяет сократить сроки тестирования в режиме реального времени и принимать более оперативные решения по определению эпидемической значимости микроорганизмов и их количества, обнаруженных в исследуемой пробе.
| Таблица 1 | |||
| N | Праймеры (1, 2) и зонд (3) | Нуклеотидная последовательность праймеров и зонда | Длина фрагмента амплификации (п.н.) |
| 1 | AL12for | 5'-TCCTGAATCAGGAGAGCAGATTACC-3' | 224 |
| 2 | AL12rev | 5'-TGAAGCCGCTCACACGATGT-3' | |
| 3 | Fam-AL12 | Fam-TTTGAAGGCGATAATGACGGCGGGA-HBQ1 | |
| Таблица 2 | ||||
| Название операции | Температура | Время | Количество циклов | Примечание |
| первоначальный нагрев | 95°С | 15 мин | 1 | |
| денатурация | 95°С | 5 с | 5 | |
| отжиг | 60°С | 20 с | ||
| элонгация | 72°С | 15 с | ||
| денатурация | 95°С | 5 с | 40 | |
| отжиг | 60°С | 10 с | ||
| отжиг | 60°С | 15 с | Детекция | |
| элонгация | 72°С | 15 с | ||
| хранение | 4°С | |||
Claims (3)
1. Способ идентификации возбудителя чумы и оценки количества микробных клеток, идентифицированных в качестве возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, включающий следующие стадии:
a) выделяют ДНК микроорганизма из исследуемых проб;
b) подготавливают калибровочную панель с концентрациями ДНК, эквивалентными концентрациям мк.кл./мл вакцинного штамма (Y.Pestis) 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103;
c) исследуют выделенную ДНК в ПЦР с использованием специфических праймеров и зонда с флуоресцентной меткой:
AL12for-5′-TCCTGAATCAGGAGAGCAGATTACC-3′
AL12rev-5′-TGAAGCCGCTCACACGATGT-3′
и флуоресцентно-меченого зонда:
Fam-AL12-Fam-TTTGAAGGCGATAATGACGGCGGGA-HBQ1;
d) идентифицируют исследуемую ДНК как ДНК микробного или немикробного штамма по наличию нарастания флуоресцентного свечения или его отсутствию соответственно при длине волны 520 нм;
e) определяют по полученной на стадии (2) калибровочной панели концентрации ДНК в пробе, по которой оценивают количество клеток в исследуемой пробе.
a) выделяют ДНК микроорганизма из исследуемых проб;
b) подготавливают калибровочную панель с концентрациями ДНК, эквивалентными концентрациям мк.кл./мл вакцинного штамма (Y.Pestis) 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103;
c) исследуют выделенную ДНК в ПЦР с использованием специфических праймеров и зонда с флуоресцентной меткой:
AL12for-5′-TCCTGAATCAGGAGAGCAGATTACC-3′
AL12rev-5′-TGAAGCCGCTCACACGATGT-3′
и флуоресцентно-меченого зонда:
Fam-AL12-Fam-TTTGAAGGCGATAATGACGGCGGGA-HBQ1;
d) идентифицируют исследуемую ДНК как ДНК микробного или немикробного штамма по наличию нарастания флуоресцентного свечения или его отсутствию соответственно при длине волны 520 нм;
e) определяют по полученной на стадии (2) калибровочной панели концентрации ДНК в пробе, по которой оценивают количество клеток в исследуемой пробе.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь для амплификации состоит из следующих реагентов: специфические праймеры (каждый) - 15 пм, зонд с флуоресцентной меткой - 15 пм, dNTP - 3 мМ, TRIS-HCl (при pH 8,6) - 84 мМ, (NH4)2SO4 - 21 мМ, MgCl2 - 3 мМ, Taq-полимераза - 5 ед.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ПЦР реакция проходит с соблюдением следующих температурных режимов:
нагрев: 95°C - 15 мин;
5 циклов: денатурация - 95°C - 5 с, отжиг - 60°C - 20 с, элонгация - 72°C - 15 с;
40 циклов: денатурация - 95°C - 5 с, отжиг - 60°C - 10 с, детекция флуоресценции - 60°C - 15 с, элонгация - 72°C - 15 с;
хранение - 4°C.
нагрев: 95°C - 15 мин;
5 циклов: денатурация - 95°C - 5 с, отжиг - 60°C - 20 с, элонгация - 72°C - 15 с;
40 циклов: денатурация - 95°C - 5 с, отжиг - 60°C - 10 с, детекция флуоресценции - 60°C - 15 с, элонгация - 72°C - 15 с;
хранение - 4°C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013100496/10A RU2518302C1 (ru) | 2013-01-09 | 2013-01-09 | Способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013100496/10A RU2518302C1 (ru) | 2013-01-09 | 2013-01-09 | Способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2518302C1 true RU2518302C1 (ru) | 2014-06-10 |
Family
ID=51216330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013100496/10A RU2518302C1 (ru) | 2013-01-09 | 2013-01-09 | Способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2518302C1 (ru) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5654144A (en) * | 1995-04-24 | 1997-08-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Detection of Yersinia using the polymerase chain reaction |
| RU2204251C1 (ru) * | 2001-10-15 | 2003-05-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений | Способ обработки растений и используемая в нём композиция для защиты растений |
| WO2002095066A3 (de) * | 2001-05-18 | 2003-12-04 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Nachweis und differenzierung von mikroorganismen der spezies yersinia pestis/yersinia pseudotuberculosis |
| RU2332464C1 (ru) * | 2007-08-20 | 2008-08-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (РосНИПЧИ "Микроб") | Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба |
| RU2385941C1 (ru) * | 2008-12-01 | 2010-04-10 | Ооо "Научно-Производственная Фирма "Омикс" | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Yersinia И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ ИЕРСИНИЙ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ |
| RU2435865C2 (ru) * | 2006-01-23 | 2011-12-10 | Рочестер Инвестмент Партнерс | Способ обнаружения наличия микроорганизмов в биологическом образце |
-
2013
- 2013-01-09 RU RU2013100496/10A patent/RU2518302C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5654144A (en) * | 1995-04-24 | 1997-08-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Detection of Yersinia using the polymerase chain reaction |
| WO2002095066A3 (de) * | 2001-05-18 | 2003-12-04 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Nachweis und differenzierung von mikroorganismen der spezies yersinia pestis/yersinia pseudotuberculosis |
| RU2204251C1 (ru) * | 2001-10-15 | 2003-05-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений | Способ обработки растений и используемая в нём композиция для защиты растений |
| RU2435865C2 (ru) * | 2006-01-23 | 2011-12-10 | Рочестер Инвестмент Партнерс | Способ обнаружения наличия микроорганизмов в биологическом образце |
| RU2332464C1 (ru) * | 2007-08-20 | 2008-08-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (РосНИПЧИ "Микроб") | Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба |
| RU2385941C1 (ru) * | 2008-12-01 | 2010-04-10 | Ооо "Научно-Производственная Фирма "Омикс" | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Yersinia И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ ИЕРСИНИЙ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2017518768A5 (ru) | ||
| JP2019201658A (ja) | 非干渉性、ノイズキャンセル性のポリヌクレオチド識別タグを用いたマルチプレックスパイロシーケンシング | |
| CA2895945C (en) | Target capture system | |
| CN104046700B (zh) | 一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒 | |
| US11028431B2 (en) | Detection of short homopolymeric repeats | |
| DK3105324T3 (en) | NGS SYSTEM CONTROL AND PROCEDURES COMPREHENSIVE THESE | |
| JP2015039320A (ja) | 複数細菌の同時検出及び／又は定量方法 | |
| KR101712451B1 (ko) | 디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법 | |
| US20110200984A1 (en) | Using nucleic acids for clinical microbiology testing | |
| JP2014502510A (ja) | 分子核酸ベースの技術を使用している細胞生存度を決定する改良された方法 | |
| JP4903722B2 (ja) | ウイルスを用いることによる試料中の生細胞を検出するための方法 | |
| JP2014501494A (ja) | 核酸標的の定量的多重同定 | |
| RU2332464C1 (ru) | Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба | |
| JP2021045107A (ja) | 標的核酸の検査方法および検査装置 | |
| RU2518302C1 (ru) | Способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени | |
| RU2737775C1 (ru) | Способ идентификации yersinia pestis и yersinia pseudotuberculosis и одновременной дифференциации yersinia pestis основного и центральноазиатского подвидов методом мультиплексной пцр | |
| RU2404251C1 (ru) | Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида yersinia pestis | |
| US20130122484A1 (en) | Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv) | |
| CN102936621A (zh) | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
| RU2496882C2 (ru) | Способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции | |
| CN104032000B (zh) | 一种蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| RU2642273C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на основной и неосновные подвиды методом ПЦР в режиме реального времени | |
| CN109182599A (zh) | 用于检测草鱼出血病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒 | |
| RU2738358C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180110 |