CN101509003A - 肠道病毒71型基因组的序列及其应用 - Google Patents

Abstract

一种肠道病毒71型全基因组序列，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述序列可用于制备预防肠道病毒71型疫苗和用于制备抗肠道病毒71型中和抗体。该序列为进一步获得我国华南地区EV71型遗传衍化特征提供了客观依据，为进一步研制开发针对我国不同地区发病人群的血清学酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断试剂和疫苗提供了可靠的数据资料，为深入研究EV71的遗传变异规律及手足口病的致病机制提供了宝贵资源。

Description

肠道病毒71型基因组的序列及其应用

技术领域

本发明涉及肠道病毒，更具体的涉及肠道病毒71型基因组的序列及其应用。

背景技术

2008年全国大面积爆发了儿童手足口病。引起此次手足口病的罪魁祸首就是人肠道病毒71型(EV71)。截止到2008年12月16日，NCBI公布的EV71相关序列为2145个，但其中并没有EV71病毒全基因序列，因此无法得到全面资料以准确判断全球以及我国人肠道病毒71型的流行和遗传变异情况，进而无法了解目前全球手足口病的流行和遗传衍化情况。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种EV71病毒的全基因序列。

为解决上述问题，本发明一方面提供了一种肠道病毒71型全基因组序列，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明另一方面提供了所述序列及与所述序列同源性达50-95％的序列在制备用于预防肠道病毒71型疫苗和血清学诊断ELISA试剂中的用途。

本发明另一方面提供了所述序列及与所述序列同源性达50-95％的序列在制备抗肠道病毒71型中和抗体中的用途。

本发明的有益效果在于该序列为进一步获得我国华南地区EV71型遗传衍化特征提供了客观依据，为进一步研制开发针对我国不同地区发病人群的血清学ELISA诊断试剂和疫苗提供了可靠的数据资料，为深入研究EV71的遗传变异规律及手足口病的致病机制提供了宝贵资源。

附图说明

图1是用megalign中的聚类clusterW进行一个聚类后，获得的比对结果。

图2是EV71 VP1区进化树分析结果。

具体实施方式

病毒基因组核酸的提取和测序

1.采集标本：采集深圳市东湖医院收治的手足口病人的病毒分离标本，包括粪便、疱疹液、脑脊液和咽拭子，用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。

2.标本处理：

2.1粪便标本的处理

2.1.1每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠和1ml氯仿；

2.1.2在生物安全柜中从每份粪便标本中取大约2g加入到标记好的离心管中；

2.1.3将剩余的原始标本留在原容器中并在-20℃冻存；

2.1.4拧紧离心管，机械震荡器剧烈震荡20分钟；

2.1.5盖好离心机的盖子，密封离心桶，冷冻离心机在1500g离心20分钟；

2.1.6在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中；

2.1.7一管粪便悬液冻存于-20℃作为备份，另一管存于4-8℃以备接种。

2.2疱疹液标本的处理

疱疹液标本直接用于病毒分离。

2.3脑脊液标本的处理

脑脊液标本直接用于病毒分离。

2.4咽拭子标本的处理

在标本保存液中充分搅动咽拭子(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞，然后在4℃条件下，10000rpm离心20分钟，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。

3.分离病毒：

3.1显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的，一个健康的单层细胞会在传代后3天左右形成；

3.2倒掉生长液(GM)，换上1-1.2ml的维持液(MM)；

3.3每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管(包括标本的编号、日期、传代数)；

3.4每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；

3.5每支试管接种0.2ml的标本悬液，34-35℃温度培养；

3.6每天使用倒置显微镜观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应(CPE)的出现(如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等)；

3.7记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE(1+-4+)、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化(1+，<25％；2+，25％-50％；3+，50％-75％；4+，75％-100％)；

3.8如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75％的细胞发生变化(3+CPE)，然后储藏在-20℃以备二次传代。同一病例的二次传代的病毒分离物可以放到一起用于进一步的鉴定；

3.9第1代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后-20℃或-70℃冻存；

3.10一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在-20℃冰箱(二代病毒)。因第二代病毒滴度高于第一代病毒，所以选用第二代病毒进行鉴定。

3.11如果7天之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7天。盲传2代后，仍然没有出现CPE，则判定为阴性；如果接种后24小时内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。

4.提取病毒核酸：

可使用商业化试剂盒来提取RNA，例如使用QIAGENViral RNAMini Extraction Kit(QIAGEN公司)从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA：

4.1向一支1.5ml离心管中加入560μl的AVL缓冲液(含CarrierRNA)；

4.2再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充分混匀至少15秒；

4.3室温下(15℃-25℃)放置10分钟，瞬时离心；

4.4加入560μl纯乙醇，充分混匀至少15秒，瞬时离心；

4.5小心加入约630μl的混合溶液至QIAamp柱中，将QIAamp柱套在收集管上，然后8000rpm离心5秒，使液体通过滤膜；

4.6弃去收集管中的液体，重复步骤4.6；

4.7弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW1缓冲液至QIAamp柱中，8000rpm离心5秒，使液体通过滤膜；

4.8弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW2缓冲液至QIAamp柱中，8000rpm离心5秒，使液体通过滤膜；

4.9弃去收集管中的液体，13000rpm再次离心1分钟；

4.10将QIAamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中；

4.11向膜上加入40μl的EB缓冲液，然后室温静置2-5分钟；

4.128000rpm离心1分钟，离心下来的液体即为所需的核酸溶液；

4.13RNA的检测：

4.13.1将制胶用具以及电泳槽用水冲洗干净后，使用3％过氧化氢室温浸泡15分钟，最后使用1×TBE冲洗2-3次，再加入1×TBE电泳缓冲液。

4.13.2将1.2％琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，将RNA样品(2-5μl)和等体积的2×Gelloading buffer Ambion混合均匀，加到凝胶点样孔中，电泳。

4.13.3将胶在EB溶液中染色10分钟，紫外灯检测。

4.13.4Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent公司)检测RNA浓度和质量。

5基因组测序：

5.1反转录第一链的合成

5.1.1在200μl的PCR管中加入以下试剂：(试剂盒购自invitrogen公司)

mRNA                                           10μl

N6引物(1ug/μl)或oligo(dT)18-20(500ug/μl)       1μl

d NTP mix(10mM)                                2μL

5.1.2在PCR仪上65℃变性5分钟后，立即将EP管置于冰上，离心。

5.1.3按照下列的配比准备反应混合物，

5×1st strand buffer         4μL

100mM DTT                     1μL

RNAseOUT(40U/μL)              1μL

5.1.4将步骤5.1.3中的6μl混合物加入步骤1中的EP管中，混匀后如果是N6引物则逆转录室温(25℃)放置10分钟，如果是oligo(dT)则42℃放置2分钟。

5.1.5取出EP管后加入1μl Superscript II(200U/μl)，混匀，放入PCR仪，按照以下程序进行反应：

Step 1              42℃     50分钟

Step 2              70℃     15分钟

Step 3              4℃      保存

5.2保守区引物设计

在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中选取已经提交的小RNA病毒序列，通过软件比对进行保守区筛选，对保守区高的部分选取相应的序列作为引物，对于分段扩增的区域，引物扩增片段需要有200bp左右的重叠区。这里以比对软件megalign为例，列举引物设计过程。首先，从NCBI下载一系列序列，用megalign中的聚类clusterW进行一个聚类，获得比对结果，如附图1所示。黑箭头表示选取出的保守区高的区域，可以用来作为扩增引物，对于一条片断长度大的病毒，可以选取多个这样的区域，将病毒分为几个相互重叠的片段，分别进行扩增测序，选取的序列可以有个别碱基的不同，但不要出现在3’区。EV71五对序列分别设计为：

EV71F1              TTAAAACAGCTGTGGGTTG

EV71R1              CGTTTATGTATGGCACTATTAT

EV71F2              CCAGAGTATGTCATTGGGACAGT

EV71R2              TATCCACGCCCTGACGTGCTTCA

EV71F3              CCATTCATGTCACCTGCGAG

EV71R3              CGGTGTTTGCTCTTGAACTGCAT

EV71F4              TCCTGGCTCAAGAAGTTCAATGA

EV71R4              TTAACCCACTGGATCTCTCCTT

EV71F5              AAAAGTTTAGGGATATCACCAA

EV71R5              GCTATTCTGGTTATAACAAA

5.3保守区引物扩增

5.3.1配置PCR扩增体系：

根据所用酶的不同，按照扩增酶的说明书配置PCR扩增体系(根据扩增结果和扩增保真度要求改变PCR扩增体系，一般taq酶扩增就可满足要求)，taq酶扩增体系如下：

 

反应体系组成	体积	体积
			Taq酶	0.25μl	0.1μl
10 x Buffer	5μl	2μl
			dNTP(10mM)	4μl	1.6μl
上游引物(20μm)	2μl	0.8μl
			下游引物(20μm)	2μl	0.8μl
超纯水	35.75μl	14.1μl
			模板DNA(步骤2所得)	1μl	0.6μl
总体系	50μl	20μl

PCR扩增体系配置过程需在冰上完成，注意不同模板之间的区分，PCR扩增体系需混合均匀，且PCR管管盖要盖严，防止PCR体系在反应过程中蒸干。

5.3.2PCR扩增及检测

将PCR管放在PCR仪上，合上PCR仪顶盖并盖紧，根据设计的保守区引物的TM值，设置PCR反应程序，PCR程序如下：

反应完毕，取出PCR管，4℃短期存放；用2％浓度的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

5.4PCR产物回收和连接

5.4.1PCR产物胶回收

a.彻底洗净电泳槽和配胶槽，然后用纯水或1×TAE冲洗2-3遍；在洗净电泳槽中加入新的1×TAE缓冲液，并配制一块2％的琼脂糖凝胶。

b.将5μl6×溴酚蓝加入20μl DNA溶液中，混匀后加入到一个加样孔中，每个样品需要隔一个加样孔，点上相应DNA marker。

c.100V电泳2小时，电泳时环境温度不能过高。

d.将染色槽用自来水清洗干净后用纯水或1×TAE冲洗2-3遍，倒入新的1×TAE；加入适量EB，搅拌均匀，将胶放入染色槽，染色10分钟；

e.取一2ml的eppendorf管，并记录重量，备用；

f.取一张保鲜膜，将染好的胶放在膜上，放入凝胶成像仪照相并存储胶图，然后将胶连同膜放于紫外分析仪上，准备切胶；

g.以DNA marker做为参照，切取目的条带，放入称量好的eppendorf管中，每个样品用一个对应的刀片；

h.将切割后的凝胶放入凝胶成像仪照相并存储胶图；

i.称量放有胶块的eppendorf管重量，并记录；

j.用Axygene Gel Extraction Kit(Axygene公司)进行胶纯化回收，回收产物溶于20μl DHPC水。

k.取2μl电泳确定胶回收正确，并估测PCR回收产物浓度。

5.4.2连接

以目前使用的TaKaRa PMD18-T连接试剂盒(TaKaRa公司)为例：

 

反应体系组成	体积
		PCR回收产物	4.5μl
pMD 18-T vector	0.5μl
		Solution I	5μl
总体积	10μl

连接体系4℃过夜连接(通过改变PCR回收产物和pMD18-T的含量可以提高连接效率)，第二天回收连接产物，-20℃冷冻保存或者转化。

5.5化学转化

5.5.1AIX平板准备

a.用70％的乙醇擦拭洁净工作台、各移液枪，将平皿全部摊开摆放，开紫外照射。

b.从烘箱中取出LB固体培养基，并使其冷却到用手掌捂住不会感觉到太烫手，放入洁净工作台照紫外。

c.紫外照射约20分钟以后，关闭紫外，开送风排臭氧。

d.以氨苄抗生素(AMP):培养基＝1:1000的比例在培养基中加入AMP，充分摇匀，注意消除气泡。

e.往平皿中倒入培养基，等所有平板的培养基全部凝固后，收板，倒置。

f.根据平板大小配制IPTG+X-GAL的混合液(1:4)，一般的用量标准为：

9cm平板加30μl混合液，

12cm平板加45μl混合液，

15cm平板加65μl混合液。

g.将涂布器用70％的乙醇浸湿，并放在乙醇灯上灼烧杀菌后，可放在平板顶盖的内侧面上冷却至室温。

h.按加量标准在各平板中加入IPTG+X-GAL的混合液，用已冷却的涂布器将其均匀的涂布在平板表面上，至涂干。

i.涂菌时加菌液量标准同上，涂布时不要涂得太干，否则菌无法生长。

j.涂板完成后，在平板背面标记所涂内容及涂布时间。

5.5.2连接产物转化

a.将感受态细胞(CaCl₂法制备的感受态细胞)置于冰上融化；给各EB管编号，并以每管100μl的量分装感受态细胞。

b.将10μl步骤5.4所得连接产物和1-2μl质粒(阳性对照)分别加入到100μl感受态细胞中，轻柔吹打混匀，冰浴30分钟。

c.42℃热敷90秒，并立刻放回冰浴2-5分钟。

d.每PE管加入800μl的LB液体培养基，37℃200rpm摇床培养1小时。

e.5000rpm离心5分钟，弃上清700μl。

f.将PE管内剩余的约100μl菌液吹打混匀，涂平板。

g.将涂布好的平板置于培养箱中，37℃培养14-16小时。

h.第二天回收平板，观察培养状况，进行克隆鉴定。

5.6克隆鉴定

通过菌落PCR验证上述步骤转化获得的白斑克隆是否是阳性克隆，步骤如下：

5.6.1用灭过菌的牙签挑取白色斑点的单克隆溶于10μl无菌水中，从10μl菌液中吸取3μl做PCR反应，程序可以按照先前设定的目的片段扩增的程序进行。

反应体系为：

模板DNA                   3μl；

Taq酶                     0.1μl；

10x Buffer                2μl；

dNTP(10mM)                1.6μl；

上游引物(20μm)            0.8μl；

下游引物(20μm)            0.8μl；

超纯水                    11.7μl；

总体积                    20μl

5.6.2电泳检测菌落PCR结果，将阳性结果菌液接入到液体LB培养基中，37℃和200-220rpm振荡培养12-16小时。

5.7质粒提取(试剂盒购自axygen公司)

将接入LB液体培养基的菌液收集1ml保存菌种，剩余LB菌液提取质粒：

5.7.1取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液于离心管中，12000rpm离心1分钟，弃去上清。

5.7.2用250μl已加入RNase A的Buffer S1均匀悬浮细菌沉淀。

5.7.3加入250μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。

5.7.4加入350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000rpm离心10分钟。

5.7.5吸取步骤4中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，12000rpm离心1分钟。

5.7.6将制备管置回离心管，加500μl Buffer W1，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

5.7.7将制备管置回离心管，加700μl Buffer W2，12000rpm离心1分钟，弃滤液，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。

5.7.8将制备管置回2ml离心管中，12000rpm离心1分钟。

5.7.9将制备管移入新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜中心加60-80μl无菌水，室温静置2分钟，12000rpm离心1分钟。

5.7.10电泳鉴定正确。

5.8测序

将电泳鉴定质粒提取效果好的样品送样测序。将测序结果通过专业生物学软件Seqman进行拼接，通过上述软件将各个片段一一拼接，可以获得全长小RNA病毒基因组序列，通过测定多个独立克隆，可以得到准确的病毒基因组。

病毒基因组序列分析

序列一致性分析利用网站分析方法：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.ht ml，将目标序列输入到网站数据提交处，参数无特殊要求，点击运行就可获得结果。

1.病毒的生物信息学分析

Shzh/S121/08/CHN              Total number ofbases is 7404

％A＝27.30                    [2021]

％G＝23.81                    [1763]

％T＝24.55                    [1818]

％C＝24.34                    [1802]

％Ambiguous＝0.00             [0]

％A+T＝51.85                  [3839]

％C+G＝48.15                  [3565]

2.核苷酸序列分析：

SEQ ID NO：1与其他病毒株各区核苷酸水平一致性分析clastalW

 

Generegion	No.ofbasescompared	BrCr	MS	shzh98	shzh03	TW/2086/98	TW/2272/98	5865/sin/000009	CA16G10
										5’UTR	750	86	86	96	97	86	87	88	82
P1region	2586	81	83	90	94	89	87	83	68
										VP4	207	83	84	94	96	87	87	84	68
VP2	762	80	82	91	92	88	88	82	70
										VP3	726	82	82	87	94	90	89	81	72
VP1	891	82	84	92	95	89	84	83	59
										P2region	1734	77	82	90	94	79	79	81	81
2A	450	79	82	91	94	83	83	80	79

 

2B	297	73	80	78	95	73	73	80	79
										2C	987	78	83	93	94	78	79	82	82
P3region	2259	77	79	86	87	78	76	80	83
										3A	258	82	85	91	92	77	76	85	81
3B	66	68	84	90	93	72	71	84	80
										3C	549	76	78	89	90	73	71	80	82
3D	1386	77	78	84	85	80	79	79	84
										3’UTR	83	82	82	79	85	79	75	79	90

3.氨基酸序列分析：

http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.ht ml

SEQ ID NO：2与其他病毒株各区氨基酸水平一致性分析clastalW

 

Protein	No.ofaminoacidscompared	BrCr	MS	Shzh98	shzh03	TW/2086/98	TW/2272/98	5865/sin/000009	CA16G10
										P1region	862	96	97	97	99	98	97	97	79
VP4	69	100	100	100	100	100	100	100	78
										VP2	254	97	97	98	97	98	99	97	82
VP3	242	97	97	96	100	99	98	97	84
										VP1	297	94	97	96	99	98	94	97	72
P2region	578	96	95	95	98	93	93	96	97
										2A	150	96	97	98	99	97	97	98	96
2B	99	93	95	91	98	93	92	95	97
										2C	329	96	94	95	98	90	91	96	97
P3region	753	92	95	93	96	91	88	94	96
										3A	86	98	98	95	98	88	88	96	98
3B	22	86	90	95	90	90	86	95	90
										3C	183	92	95	94	98	86	80	94	96
3D	462	91	94	93	95	94	91	94	96

VP1区进化树分析

利用进化树分析软件mega3进行分析。分析结果见附图2，通过对该株病毒的VP1基因序列与已经公布的肠道病毒71型的基因序列进行核苷酸亲缘关系树分析比较，确定了其为C4亚型。

病毒基因组为7404个核苷酸的单股正链RNA，仅有一个开放阅读框(ORF)，编码2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5’和3’非编码区(UTRs)，在3’非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(polyA)。多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，P1前体蛋白可降解成VP1、VP2、VP3、VP4四个病毒外壳蛋白，抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上，而VP1蛋白是主要的病毒中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性，具有与病毒血清型完全对应遗传多样性，以及其变异快速的特点，VP1基因成了EV71基因分型的最重要的对象。所述序列可用于制备用于预防EV71型肠道病毒感染疫苗。所述序列还可用于制备肠道病毒71型中和抗体。

序列表

<110>深圳市第三人民医院

<120>肠道病毒71型基因组的序列及其应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>7404

<212>RNA

<213>人肠道病毒

<400>1

Claims (3)

1、一种肠道病毒71型全基因组序列，其特征在于，所述序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2、权利要求1所述的序列及与所述序列同源性达50-95％的序列在制备用于预防肠道病毒71型疫苗和血清学ELISA诊断试剂中的用途。

3、权利要求1所述的序列及与所述序列同源性达50-95％的序列在制备抗肠道病毒71型中和抗体中的用途。

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