CN105087829A - 一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法 - Google Patents

一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法 Download PDF

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胡晓星
冯悦
彭杰
刘丽
张阿梅
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Abstract

本发明公开了一种C型EV71病毒的？TaqMan荧光实时定量PCR检测方法，以克隆EV71-2010FJLY008株型病毒VP1基因并体外转录成RNA为标准品，在此基础上建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法；该方法包括选择EV71？C基因型病毒保守区VP1基因设计引物和探针，设计实验找到最优条件下的退火温度、引物浓度和探针浓度；在引物外围设计一对克隆引物，并扩增片段，用该片段构建重组质粒，以构建好的重组质粒线性化后作为模板，转录获得RNA，系列稀释后作为标准品，进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；经验证该检测体系具有较好的重复性，特异性和灵敏性，能够准确、快速、便捷的定量检测EV71？C型病毒。

Description

一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。
背景技术
肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病的主要病原体之一，已在世界范围内引起多次暴发与流行，该病常见于学龄前儿童和婴幼儿，可引起发热和手足口腔等部位的皮疹和溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿和无菌性脑膜炎等并发症甚至死亡。EV71是于1969年首次从美国加利福尼亚州一名九个月大的脑炎患儿脑脊液中分离出来，在1972年分出血清型并于1974年首次被报道。自报道以来，该病毒在世界范围内引起多次暴发与流行，因而受到了人们的广泛关注。
EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员，含有7408个核苷酸，病毒颗粒为直径27nm的二十四面体立体对称的球形结构。病毒由外层衣壳和RNA核心构成，病毒的衣壳含有四个结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），其中VP1是最主要的结构蛋白，决定着肠道病毒71型的血清型和病毒中和作用。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势。根据我国卫生部的最近数据，2009至2011年全国（不含港、澳、台地区）共报道手足口病发病455万例，死亡1767例，占丙类传染病的首位。然而手足口病的相关科研工作比较薄弱，至今在临床上没有有效的疫苗和药物对EV71进行有效的预防和控制。因此建立一种快速有效的检测EV71的方法对控制疾病的传播以及疫苗和药物的研制有着重大的作用。
肠道病毒71型的检测方法目前有病毒分离培养法、血清学方法以及免疫组化法，这些方法操作比较繁琐，试验周期长，并且灵敏性低，特异性差；普通PCR检测技术虽然比较快速便捷，但不能精确测定病毒核酸的量，而且容易污染造成假阳性。
近年来发展起来的实时荧光定量PCR检测技术与其他检测技术相比具有很强的优势，它综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术以及数码显象技术，具有较高的灵敏性，并且能够使用特异性探针对定量分子进行识别；具有很高的准确性，引物和探针双重控制靶序列，特异性好、假阳性低；线性关系好、线性范围宽，通过荧光信号检测可以直接对产物进行定量，定量范围可在100-1010copies/μL；操作简单、安全、污染率低、自动化程度高。因而实时荧光定量PCR技术得到了广泛的应用，已成为目前很多病毒核酸定量测定的主要方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法，以EV71-2010FJLY008株型病毒VP1基因为靶点，构建重组质粒体外转录成RNA为标准品的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，具有稳定性强、特异性好、灵敏度高的特点。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
（1）将EV71-2010FJLY008株型病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板，采用如下克隆引物扩增基因片段：上游引物：5’-CGCAAGCTTTCATCAAATGCTAGTGAYGAG-3’，下游引物：5’-CACGAATTCCCCGTATTCAAGYTCTTTCTC-3’；
（2）将基因片段构建重组质粒并进行纯化，纯化后的克隆载体线性化后进行体外转录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化并测其OD值，并根据如下公式换算成RNA拷贝数：拷贝数（copise/μl）=质粒浓度（g/μl）×阿式常数/RNA分子量；阿式常数=6.02×1023，RNA分子量=一个碱基的分子量（340）×重组RNA总长度（bp）；
（3）将已知拷贝数的RNA做10倍梯度稀释，配制拷贝数为103～109copies∕μl的溶液，在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；
（4）收集培养的EV71病毒上清样本，并提取样本的RNA；
（5）按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中EV71病毒的含量，其中定量检测的引物和探针为：
上游引物：5’-TGGAGCCCCTAAGCCAGATT-3’，
下游引物：5’-CTCGCAGGTGACATGAATGG-3’，
探针probe：5’(FAM)-CCTTGCATGGCAAACCGCCACTAAC-(TAMRA)3’。
所述构建重组载体所使用的质粒是PCDNA3.1+。
荧光定量PCR检测采用试剂盒为OneStepPrimeScriptRTPCRKit（TaKaRa，RR064A），反应体系为：
2×onestepRT-PCRBufferⅢ10μL
TakaraExTaqHS0.4μL
PrimeScriptRTenzymeMixⅡ0.4μL
RoxReferenceDyeⅡ0.5μL
上游引物（10μM）0.6μL（300nM）
下游引物（10μM）0.6μL（300nM）
Probe（5μM）0.8μL（200nM）
RNaseFreedH2O1.7μL
模板5μL
总体积20μl
荧光定量PCR扩增条件为：
42℃5min，95℃10s；95℃5s，56℃45s，45个循环扩增。
本发明的优点和技术效果如下：
荧光定量PCR技术作为一种新兴的分子检测技术,不仅操作便捷,而且还具有较高的稳定性、灵敏性和特异性。荧光定量中运用的体外转录RNA标准品，能够很好地对待测样品进行处理并对反转录过程进行有效的控制，此外，标准品RNA不易对实验仪器和环境造成交叉污染而导致假阳性结果。因此，荧光定量PCR检测技术适用于EV71样品的大批量检测，为EV71的诊断、检疫、食品安全检验和病原生物学、分子流行病学研究提供了一种新的方法。
附图说明
图1为EV71-2010FJLY008株型保守区段VP1基因克隆引物扩增片段电泳检测结果；
图2为不同退火温度条件下特异性引物扩增片段电泳检测结果；
图3为不同引物浓度下特异性引物扩增片段电泳检测结果；
图4为不同探针浓度扩增曲线；
图5为以103～109拷贝数为模板建立Ct/LogCopynumber工作曲线；
图6为组间重复性检测扩增曲线；
图7为以EV71-2010FJLY008株型、柯萨奇A16、柯萨奇B1、轮状病毒、疱疹病毒为模板建立的TaqManPCR检测方法特异性分析曲线；
图8为TaqManPCR检测方法灵敏性分析曲线；
图9为不同时间所收获的EV71病毒样品TaqManPCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的仪器试剂均为常规市售产品。
实施例1：PCR引物的设计及PCR扩增
EV71-2010FJLY008株型病毒（购自武汉大学中国典型培养物保藏中心）属于C基因型病毒，PCR克隆引物是根据NCBI中下载的二十余条C基因型EV71病毒株，通过MEGA5软件对其进行了同源性比对后找到了特异保守序列，通过Primerpremier5.0设计引物，引物由大连宝生物有限公司合成，引物扩增片段长度为507bp具体过程如下：
1、设计的RT-PCR扩增引物
上游引物:5’-CGCAAGCTTTCATCAAATGCTAGTGAYGAG-3’（163bp-183bp）
下游引物:5’-CACGAATTCCCCGTATTCAAGYTCTTTCTC-3’（669bp-649bp）
2、EV71-2010FJLY008株型病毒RNA的提取
EV71-2010FJLY008株型病毒RNA的提取采用病毒RNA提取试剂盒（天根），具体操作过程如下：
（1）用移液器将500μLCarrierRNA工作液加入一个干净的1.5mL离心管中；
（2）向离心管中加入100μL的病毒上清液，涡旋振荡15秒混匀；
（3）室温（15-25）℃孵育10分钟；
（4）简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
（5）加入500μL的无水乙醇，盖上管并涡旋振荡15秒；
（6）简短离心以收集附着再管壁及管盖上的液体；
（7）仔细将离心管中的630μL液体转移至RNase-Free吸附柱CR2（吸附柱放在收集管中），盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
（8）重复步骤7；
（9）小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD，盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
（10）小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW,盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
（11）将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3分钟；
（12）将吸附柱放回2mL收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；
（13）将吸附柱放入一个RNase-Free离心管（1.5mL）中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入45μLRNase-FreeddH2O，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟。
3、PCR扩增
以提取的EV71-2010FJLY008株型病毒RNA为模板，用普通PCR仪（ABI-2720）逆转录成cDNA，过程如下：逆转录酶缓冲液（1×）4ｕL，随机引物2ｕL，RNase抑制剂（20U/ｕl）0.5ｕL，碱基混合液（1mM）2ｕL，逆转录酶（10U/ｕL）0.5ｕL，下游引物（10μM）1ｕL，RNA模板5ｕl，DEPCWater5ｕL，以20ｕL的反应体系，在25℃10min，55℃30min条件下进行逆转录反应。以逆转录好的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为PremixTaq10ｕL，DEPCWater6ｕL，上游引物（10μM）1ｕL，下游引物（10μM）1ｕL，cDNA模板2ｕL，共20ｕL的反应体系，按以下反应条件进行反应：94℃3min，94℃30sec，50℃30sec，72℃1min；72℃7min，40个循环扩增。
本实验获得的目的片段作为后续重组质粒构建时选用的目的基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测，能检测出一条大小为507bp且清晰的目的条带（如图1所示）。
实施例2：重组质粒的构建
双酶切后的PCR产物和pcDNA3.1+质粒分别通过DNA产物纯化和胶回收产物纯化后，将目的片段连接到PCDNA3.1+载体中，并将其转化进大肠杆菌JM109感受态细胞中，筛选阳性克隆子，提取重组质粒进行测序验证。具体操作过程如下：
1、双酶切目的片段和质粒载体
目的片段和PCDNA3.1+质粒载体分别在HindIII1μL、EcoRI1μL、Mbuffer2μL以及目的片段或质粒16ul共20μL的酶切体系下37℃酶切过夜。
2、双酶切后PCR产物目的片段的纯化
使用普通DNA产物纯化试剂盒（天根）进行纯化，具体操作过程如下：
(1)向吸附柱CB2中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放回收集管中；
(2)向PCR反应液中加入100μL结合液PB，充分混匀；
(3)将上一步的溶液加入吸附柱CB2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂白液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(5)重复操作4步骤；
(6)将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底晾干；
(7)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μL洗脱液EB，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。
3、双酶切后的质粒载体的纯化
使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根）进行纯化，具体操作过程如下：
(1)配制1%琼脂糖凝胶，将上述步骤所得质粒载体点样，120伏电压电泳15min；
(2)紫外灯下切下含有目的DNA琼脂糖胶块，放入新的1.5ml离心管中；
(3)向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(4)向胶块中加入3倍体积的PN，50℃水浴放置10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)将上一步所得的溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
(6)向吸附柱CA2中加入600μL漂白液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
(7)重复操作6步骤；
(8)将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干；
(9)将吸附柱CA2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱液EB，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。
4、纯化好的PCR产物目的片段和质粒载体链接
纯化好的酶切目的片段6ul以及质粒载体3μL，在T4连接酶1.2μL和buffer2μL的连接体系下，16℃连接过夜。
5、转化感受态细胞JM109
(1)将100ulJM109感受态细胞与10μL连接反应轻轻混合均匀；
(2)冰浴30min，然后42℃热激活90sec，再冰浴2min；
(3)加400ul37℃预热的LB液体培养基，于37℃摇床振荡150rpm培养45min；
(4)取培养菌液涂布含100μg/mlAmp的LB固体培养基；
(5)将培养平皿放置于37℃培养12-16h后，挑取若干（4-6个/样品）长出的单菌落进行PCR快速鉴定。
6、阳性重组子的筛选和鉴定
(1)挑取在Amp选择培养基上长出的菌落若干个（4-6个/样品），先置于含有100μg/mlAmp的LB液体培养基中培养1ml，37℃振荡过夜培养；
(2)取3μL菌悬液，以此作为模板，用外围引物进行PCR扩增和电泳检测，检测到特异性条带即为阳性克隆；
（3）挑选阳性克隆置于50ml含有100μg/mlAmp的LB液体培养基中进行扩大培养。
7、阳性重组质粒的提取
使用质粒小提试剂盒（天根）完成阳性重组质粒的提取。具体操作步骤如下：
（1）向吸附柱CP3（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
（2）取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；
（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
（4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
（5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀；
（6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
（7）向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；
（8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
（9）重复操作步骤（8）；
（10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；
（11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
本实验构建好的重组质粒分别菌落PCR检测、质粒酶切鉴定、序列测定和比对，序列测定结果（如SEQIDNO:1所示），表明该质粒构建成功。本研究中重组质粒的核苷酸序列测定均委托云南昆明中云美生物技术有限公司完成测序工作。
实施例3：TaqManPCR检测体系的建立
1、引物探针的设计与合成：根据重组质粒所插入的测序出的核苷酸序列，利用PrimerExpress3.0设计特异性引物和探针，目的片段长度123bp，序列情况如下：
上游引物:5’-TGGAGCCCCTAAGCCAGATT-3’（272bp-291bp）
下游引物:5’-CTCGCAGGTGACATGAATGG-3’（394bp-375bp）
探针Probe：5’(FAM)-CCTTGCATGGCAAACCGCCACTAAC-(TAMRA)3’（302bp-326bp）
引物和探针均由大连宝生物有限公司合成。特异性引物扩增的目的片段大小为123bp，其核苷酸序列（如SEQIDNO:2所示）。
2、PCR扩增及退火温度的确定
根据本引物和探针的特点分别设计退火温度52℃、54℃、56℃、58℃确定其最佳退火温度（Tm值）。采用下述反应体系和条件，以构建好的重组质粒为模板应用普通PCR仪（ABI-2720）进行扩增：PremixTaq酶25μL、DEPC处理水16μL、上下游引物（10uM）各2μL、模板5μL混合均匀。循环次数为40个，94℃3min；94℃30sec，（52℃、54℃、56℃、58℃）30sec，72℃30sec；4℃备用。扩增产物1%琼脂糖电泳检测。通过电泳检测结果可知：不同退火温度下都能得到123bp的扩增片段，但52℃和54℃条件下有明显的非特异性扩增，56℃条件下电泳条带清晰并且条带位置正确无非特异性扩增，因此本检测体系确定退火温度Tm值为56℃（如图2所示）。
3、引物浓度和探针浓度的确定
（1）引物浓度：以相同条件下能够检测到的模板浓度最低，扩增产物条带单一、清晰为引物选择标准。以100nM、200nM、300nM、400nM，4个不同浓度的TaqManPCR上下游引物浓度，分别用于同一浓度重组质粒为模板，共分为4个反应系列组，用荧光定量PCR仪（ABI-7500）同时进行PCR扩增。反应体系为25μL：RealtimePCRMasterMix12.5μL，不同浓度引物，模板2.5μL，DEPC补足25μL混合均匀。循环次数为40个，94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，72℃7min扩增，4℃备用。扩增产物1%琼脂糖电泳检测。不同引物浓度下电泳显示：引物300nM条件下为最低浓度，该浓度能很好的扩增目的片段（如图3所示）。
（2）探针浓度：以相同模板浓度下循环阈值（Ct）最小，荧光信号比（Rn）活度最大，为探针标准。采用100nM、200nM、300nM3个不同探针浓度，分别用于同一浓度重组质粒为模板，进行TaqManPCR检测。反应体系20ul：2×onestepRT-PCRBufferⅢ10μL、TakaraExTaqHS0.4μL、PrimeScriptRTenzymeMixⅡ0.4μL、RoxReferenceDyeⅡ0.5μL、上下游引物各300nM、不同浓度Probe、RNA模板5μL、RNaseFreedH2O补充到20μL，混合均匀。42℃5min，95℃10sec，95℃5sec，56℃45sec，45个循环扩增，观察扩增曲线和检测报告。通过不同探针浓度扩增曲线和Ct值显示（如表1所示），该检测体系在200nM条件下Ct=18.46，Rn最大扩增曲线良好（如图4、表1所示）。
表1不同探针浓度扩增曲线的Ct值
。
4、标准品的建立及拷贝数的测定
（1）质粒线性化及纯化
将上述构建好的重组质粒用xhoI做单酶切线性化，酶切体系为xhoI3μL，Hbuffer2μL，重组质粒15μL，共20μL的体系，37℃条件下酶切6h。然后将线性化后的质粒通过普通DNA产物纯化试剂盒（天根）进行纯化，过程同实施例2中双酶切后PCR产物目的片段的纯化过程。
（2）体外转录
利用T7体外转录试剂盒进行体外转录实验，反应体系为10×T7RNAPolymerseBuffer2μL，50MMDTT2μL，NTP各2μL，RNase抑制剂0.5μL，线性化质粒模板4μL，T7RNAPolymerse1μL，dH2O2.5μL，共20μL体系，42℃条件下放置2-3h。然后利用DNaseⅠ酶除去转录后的RNA中可能的DNA污染，分别吸取10×DNaseⅠBuffer5μl，RNase抑制剂0.5μL，DEPC-treatedwater补足至50μL，37℃20-30min。
（3）RNA纯化
吸取经体外转录后的RNA样品加入RNase-Free水补足至100μl，加入溶液RK（使用前加入β-巯基乙醇）350μl，充分混匀；加入250μl无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步；将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液；向吸附柱CR2中加入500μl漂洗液RW（加入无水乙醇），室温放置2min后，12000rpm离心30sec，弃废液，将CR2放入收集管中；重复操作上一步；12000rpm离心5min，去除残余液体；将吸附柱CR2转入一个新的离心管中，加入14-20μlRNase-FreedH2O，室温放置2min后，12000rpm离心2min；用紫外分光光度计分别测定260nm、280nm波长时的OD值。
（4）拷贝数的计算
纯化后的RNA测其A260/A280(1.8-2.0),根据以下公式计算拷贝数。
拷贝数（copies/μL）=RNA浓度（g/μL）×阿氏常数/RNA分子量。阿氏常数（copies/mol）=6.02×1023；RNA分子量（g/mol）=340×RNA总长度（507bp）
拷贝数（copies/μL）=8.0×1011
（5）TaqManPCR标准曲线的建立
将已知拷贝数的RNA按照1×103～1×109拷贝数浓度进行10倍系列梯度稀释，得到7个不同分子含量的阳性RNA浓度样品，用荧光定量PCR仪（ABI-7500）分别进行TaqManPCR分析，根据反应结果中样品的分子数的对数值及其Ct值得对应关系绘制出定量标准曲线。
检测体系标准曲线扩增曲线标准，线性关系良好，其斜率为-3.335，截距为43.11,R2=1，扩增效率为99.453%。可得本检测体系线性方程为：Y=-3.335X+43.11（如图5所示）
实施例4：TaqManPCR检测体系的评价
1、检测体系重复性评价
该检测体系重复性从批间和组间两个方面设计实验进行验证。
批间：不同批次间配置的同浓度重组质粒，10倍稀释拷贝数为103~108copies各批间不同时间检测3次（每2天检测一次），分别计算它们各自曲线相关系数的变异系数。不同批次每隔2天测定标准曲线的相关系数的变异系数为0.329%，远小于5%，可见该检测体系变异系数小，稳定性高（如表2所示）。
表2不同批次间配置的同浓度重组质粒各自曲线相关系数的变异系数
组间：不同浓度（108copies、106copies、104copies）各3个重复同时进行检测，计算它们各自Ct值变异系数。三次检测结果Ct值的变异系数结果均小于0.5%（如表3所示），变异系数小重复性好（如图6所示）。
表3不同浓度重组质粒组间重复的变异系数
；
2、检测体系特异性的评价
分别用等量的EV71病毒、柯萨奇A16、柯萨奇B1、轮状病毒、疱疹病毒检测特异性,检测结果显示只有EV71C型病毒呈阳性反应（如图7所示）,表明该检测体系特异性好。
3、检测体系灵敏性的评价
将计算得到的标准组RNA做10倍梯度稀释，1-7（如图8所示）分别为106、105、104、103、102、101、100copies，得到动力学曲线，以Ct值>35个循环为下限验证该检测体系的灵敏性。通过扩增曲线图可知本检测体系可检测到102拷贝数级别（如图8、表4所示）。
表4灵敏性试验检测结果
。
4、对待测样品中EV71病毒RNA的量进行检测
待测样品为病毒在培养的第0、1、2、3、4、5天所收获的EV71病毒上清，对该样品进行病毒RNA的提取（采用天根病毒RNA提取试剂盒,过程同实施例1中EV71病毒RNA的提取），进行病毒载量的测定。通过定量测定可确定该病毒为C基因型EV71病毒，通过扩增曲线可知在病毒培养第3天时所收获的EV71病毒载量最大，可达到4.8×106copies/μL（如图9所示）,表明该检测体系能够对待测样品进行快速、准确的定量。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法
<160>6
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>428
<212>DNA
<213>EV71-2010FJLY008株型病毒
<400>1
gtgttcttaactcgcacagtacagctgagaccactcttgatagtttcttcagcagggcgg60
gattagttggagagatagatctccctcttaagggcacgactaacccaaatggttatgcca120
attgggacatagatataacaggttacgcgcaaatgcgtagaaaggtagagctatttacct180
acatgcgctttgatgcagagttcacttttgttgcgtgcacgcccaccggggaaattgtcc240
cacaattgctccaatatatgttcgtgccacctggagcccctaagccagattctagggaat300
cccttgcatggcaaaccgccactaacccctcagtttttgtcaagctgtcagaccctccag360
cgcaggtttcagtgccattcatgtcacctgcgagtgcttatcaatggttttatgacggat420
atcccaca428
<210>2
<211>83
<212>DNA
<213>EV71-2010FJLY008株型病毒
<400>2
ctagggaatcccttgcatggcaaaccgccactaacccctcagtttttgtcaagctgtcag60
accctccagcgcaggtttcagtg83
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cgcaagctttcatcaaatgctagtgaygag30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cacgaattccccgtattcaagytctttctc30
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tggagcccctaagccagatt20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ctcgcaggtgacatgaatgg20
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccttgcatggcaaaccgccactaac25

Claims (2)

1.一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）将EV71-2010FJLY008株型病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板，采用如下克隆引物扩增基因片段：上游引物：5’-CGCAAGCTTTCATCAAATGCTAGTGAYGAG-3’，下游引物：5’-CACGAATTCCCCGTATTCAAGYTCTTTCTC-3’；
（2）将基因片段构建重组质粒并纯化，纯化后的克隆载体线性化后进行体外转录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化，测其OD值，通过OD值计算RNA拷贝数；
（3）将已知拷贝数的RNA做10倍梯度稀释，配制拷贝数为103～109copies∕μl的溶液，在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；
（4）收集培养的EV71病毒上清样本，并提取样本的RNA；
（5）按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中EV71病毒的含量，其中定量检测的引物和探针为：
上游引物：5’-TGGAGCCCCTAAGCCAGATT-3’，
下游引物：5’-CTCGCAGGTGACATGAATGG-3’，
探针probe：5’(FAM)-CCTTGCATGGCAAACCGCCACTAAC-(TAMRA)3’。
2.根据权利要求1所述的C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法，其特征在于：构建重组载体所使用的质粒是PCDNA3.1+。
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