CN116555435A - 一种对淋巴丝虫检测的引物探针组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种对淋巴丝虫检测的引物探针组合、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对淋巴丝虫检测的引物探针组合、试剂盒及检测方法，其具体步骤如下：根据淋巴丝虫特异性基因的保守片段分别设计引物探针；根据人源核糖核苷酸酶P基因设计一对内参基因引物探针EF、ER、EP；将上述引物探针和核酸扩增液组成反应液；在反应液中加入样本核酸后利用荧光PCR扩增技术在PCR仪上扩增；根据扩增曲线判别核酸中是否含有淋巴丝虫特异性基因。

Description

一种对淋巴丝虫检测的引物探针组合、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明为体外诊断试剂领域，利用荧光PCR技术，用于定性检测淋巴丝虫的一种方法。
背景技术
淋巴丝虫病是被忽视的热带病之一，是由生活在淋巴系统中的昆虫媒介班氏丝虫和马来丝虫成虫所引起的寄生虫病，也是全世界慢性残疾的主要原因。淋巴丝虫病流行地区主要位于贫困发生率最高的地区，消除淋巴丝虫病为减少贫困和健康不平等提供了重要机会。丝虫病以蚊虫为传播媒介且人体内丝虫幼虫即微丝蚴在外周血液出现，表现出主要的夜间周期性。最常见的是引起淋巴水肿、象皮病和鞘膜积液，这可能导致严重的畸形和残疾。也有不出现明显症状而仅于血内有微丝蚴者，即所谓“丝虫感染”。
现有的淋巴丝虫检测技术包括血涂片法以及免疫学检测方法，其中血涂片法其敏感性和特异性较低。免疫学检测方法如免疫分析，以检测特定的循环寄生虫抗原和抗丝虫抗体。抗体检测如抗丝菌IgG4试验，其在横断面调查中使用有限，此外，与其他丝虫的交叉反应比较常见，因此限制了抗丝虫IgG4检测的特异性。另外抗原检测的局限性是成本高，可获得性不一致。因此，开发出一种快速、特异、灵敏的检测方法对淋巴丝虫的诊断具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一组利用实时荧光PCR技术用于定性检测人全血样本中淋巴丝虫特异性基因的引物和探针，该方法方便快捷、设计巧妙、价格低廉、方便快捷等优点，适于推广应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下所示：
本发明的第一个目的是提供一种检测淋巴丝虫的引物探针组合，所述淋巴丝虫为班氏丝虫、马来丝虫；
所述引物探针组合包括：
检测淋巴丝虫的通用引物探针PS1、PS2、PS3-F、PS4、PS5、PS6-F；
其中，用于扩增马来丝虫的通用引物和探针为PS1、PS2、PS3-F；用于扩增班式丝虫的通用引物和探针PS4、PS5、PS6-F。
用于监测反应过程的内参基因引物及探针EF、ER、EP；
所述PS1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-TTGGTTCTAATTTATCAATTTTAAT-3’；
所述PS2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-AAAGCGTATTTTAATATTTAAAC-3’；
所述PS3-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PS3-F的5’标记FAM荧光素，3’标记BHQ1荧光猝灭基团：5’-FAM-AGCTTATTTTGAACCTAATTGACTAT-BHQ1 -3’；
所述PS4核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-GGGAATTGTTTTTTTAATATTTT-3’；
所述PS5核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-CCCTCACTTACCATAAGACAAC-3’；
所述PS6-F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述PS6-F的5’标记FAM荧光素，3’标记BHQ1荧光猝灭基团：FAM-TTATTTGAATTATTTTTTTTTTTGTTTGC-BHQ1；
所述EF核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：5’-AGCATGGCGGTGTTTGCAGAT-3’；
所述ER核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：5’-AACAACTGAATAGCCAAGG-3’；
所述EP核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述EP的5’标记VIC荧光素，3’标记BHQ2荧光猝灭基团：5’-VIC-TTGGACCTGCGAGCGGGTTCT-BHQ2-3’；
本发明的第二个目的是提供一种检测淋巴丝虫的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物探针组合。
进一步的，所述试剂盒中引物探针反应终浓度为PS1：400nM、PS2：400nM、PS3-F：300nM、PS4：400nM、PS5：400nM、PS6-F：300nM、EF：400nM、ER：400nM、EP：300nM。
进一步的，所述试剂盒中还包含核酸扩增反应液、空白对照、阳性对照。
本发明对核酸扩增反应液没有特殊要求，常规市售的核酸扩增反应液均可，在某个特殊的实施例中，扩增反应液使用上海硕颖生物公司试剂(货号：AQ712)。
进一步的，所述阳性对照为人工合成基因包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的HhaI基因片段：
GCGCATAAATTCATCAGCAAAATTAATAAAACTTTCAATTAATCATGATTTTAATTCAATTT
AAGAATTTAAATTAAATTTAAATTCAAATTTAAATTTTGAATTTTTTAAAAATTTTAAAATT
TGTTATAGTTTTCTTACATTAGACAAGGAAATTGGTTCTAATTTATCAATTTTAATTTTAATT
AAGTGCCAAAACTGCTAAAAAAAGCTAAAAAAAAGCTTATTTTGAACCTAATTGACTATG
TTACGTGCATTGTACCAGTGCTGGTCGTACATTACGCTGTCATTTTATAGTTTAAATATTAA
AATACGCTTTTGTAATTAAGTTTTGCGC
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的SspI基因片段：
AGCGTGATGGCATCAAAGTAGCGTAAGGGAATTGTTTTTTTAATATTTTCAAGTATGAATG
GAATTTTTAGCAATTTTTTTGTTTATATTTTTATTTGAATTATTTTTTTTTTTGTTTGCTTGGT
ATAACCTTATTTTTTAATCTTTTTTAATTTTTTTAGTTTTTTTGTTGTCTTATGGTAAGTGAG
GGAATTC
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的核糖核苷酸酶Rnasep基因片段：
ATGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCTATCAATCATATCGTTGACTTTAAGGAAAAGAAA
进一步的，所述阳性对照按照HhaI：SspI：Rnasep＝107：107：107copies/ml进行配制，溶剂为TE缓冲液。
进一步的，所述空白对照为灭菌去RNA酶水。
本发明的第三个目的是提供前述的引物探针组合在制备淋巴丝虫和/或淋巴丝虫病检测试剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种淋巴丝虫的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)引物探针检测液配制：
将前述引物探针组合采用TE缓冲液调节引物探针在检测体系中的终浓度，配制成引物探针检测液；
(2)模板DNA提取：
提取待测生物体中的DNA，作为模板DNA；优选的，提取待测生物体血液中的DNA；
提取待测生物体中的DNA的试剂没有特殊要求，常规市售的DNA提取试剂均可，在某个特殊的实施例中，可使用硕世生物公司的细菌DNA提取试剂盒(货号：SDK60108)提取核酸，按照试剂盒说明书操作。
(3)核酸加样：
将空白对照、阳性对照、步骤2提取的模板DNA分别加入步骤1所述引物探针检测液中，加入核酸扩增反应液，获得检测体系；所述检测体系中前述引物探针组合的反应终浓度为PS1：400nM、PS2：400nM、PS3-F：300nM、PS4：400nM、PS5：400nM、PS6-F：300nM、EF：400nM、ER：400nM、EP：300nM；
加入阳性对照的检测体系中，阳性对照终浓度为HhaI：SspI：Rnasep＝107：107：107copies/ml；溶剂为TE缓冲液。
在某个特殊的实施例中，检测体系为引物探针检测液7.5μl，核酸扩增反应液12.5μl，模板DNA或空白对照、阳性对照5μl。
(4)实时荧光PCR扩增反应：将步骤(3)获得的检测体系于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
步骤①95℃×5min；1cycles
步骤②95℃×10sec，58℃×30sec；40cycles
在步骤②58℃，30s时对FAM、VIC通道的荧光信号进行采集；实时荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None；
实时荧光PCR仪，常规市售的实时荧光PCR仪均可，在某个特殊的实施例中，实时荧光PCR仪可选择ABI7500/7500fast、QuantStudioTM 5、Bio-Rad CFX96TM、上海宏石SLAN-96P/S、Roche LightCycler480Ⅱ等荧光定量PCR仪。
(5)结果判读：
FAM通道表示淋巴丝虫特异性基因检测结果、VIC通道表示内参基因检测结果；
当质控品检测要求：阳性对照FAM通道Ct≤30，VIC通道Ct≤30；空白对照FAM通道与VIC通道均不显示Ct值，为质控品检测正常；
当质控品检测正常且：
(5-1)模板DNA检测结果FAM通道Ct≤35且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期，则该待测生物体为淋巴丝虫阳性样本；
(5-2)模板DNA检测结果FAM通道Ct＞38或者未检出，则该待测生物体为淋巴丝虫阴性样本；
(5-3)模板DNA检测结果FAM通道35＜Ct≤38，则该待测生物体为疑似样本，需要重新提取疑似样本模板DNA，重新复检，如重新复检Ct值仍在此区间内，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期时，可判读为阳性，否则判读为阴性。
(5-1)至(5-3)中，模板DNA检测结果VIC通道检测结果应Ct≤35，否则需要重新提取模板DNA，重新复检；当样本判读为阳性时，如内标Ct＞38或未检出，结果仍可信。
本发明的有益效果：
本发明方法方便快捷，能在60min内鉴别出检测样本是否为淋巴丝虫阳性的样本；相比较其他常规PCR产品，提高了产品的检测性能。与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体(盘尾丝虫、非洲锥虫)以及人类白细胞的总核酸无交叉反应；检测灵敏度高，最低可检测出1000copies/ml的淋巴丝虫核酸。
附图说明
图1为阳性对照、空白对照检测的荧光PCR扩增曲线图，其中，图1A为淋巴丝虫阳性对照检测的荧光PCR扩增曲线图，图1B为空白对照检测的荧光PCR扩增曲线图；
图2为特异性分析荧光PCR扩增曲线图。
图3为模拟样本与人全血样本荧光PCR扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1引物、探针设计
通过NCBI查找淋巴丝虫特异性基因、人源核糖核苷酸酶P基因序列，通过BioEdit进行序列比较，Primer Express 3.0.1设计引物和探针，BLAST确认引物探针特异性，得到淋巴丝虫引物探针、内参基因引物探针：
(1)检测马来丝虫的通用引物探针：
PS1：5’-TTGGTTCTAATTTATCAATTTTAAT-3’(SEQ ID NO.1)；
PS2：5’-AAAGCGTATTTTAATATTTAAAC-3’(SEQ ID NO.2)；
PS3-F：5’-FAM-AGCTTATTTTGAACCTAATTGACTAT-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)；
(2)检测班式丝虫的通用引物探针：
PS4：5’-GGGAATTGTTTTTTTAATATTTT-3’(SEQ ID NO.4)；
PS5：5’-CCCTCACTTACCATAAGACAAC-3’(SEQ ID NO.5)；
PF6-F：5’-FAM-TTATTTGAATTATTTTTTTTTTTGTTTGC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.6)；
(3)用于监测反应过程的内参基因引物及探针：
EF：5’-AGCATGGCGGTGTTTGCAGAT-3’(SEQ ID NO.7)；
ER：5’-AACAACTGAATAGCCAAGG-3’(SEQ ID NO.8)；
EP：5’-VIC-TTGGACCTGCGAGCGGGTTCT-BHQ2-3’(SEQ ID NO.9)。
实施例2引物探针检测液和试剂盒核酸扩增反应液的配制
将实施例1所述引物探针组合采用TE缓冲液调节引物探针在检测体系中的终浓度，配制成引物探针检测液；本实施例中引物探针及TE缓冲液用量如表1所示：
表1引物探针检测液配制
实施例3模板准备
对已知淋巴丝虫病患者进行全血样本的采集，具体采集方法如下：使用含EDTA抗凝剂的采血管采集血液标本2ml，采集后颠倒混匀，使采血管内壁上的抗凝剂充分与血液混合。将上述采集好的全血样本按照核酸提取试剂盒说明书进行提取，作为模板DNA，标注样品编号为S3、S4；对健康样本采用同样方法进行全血样本的采集，标注样品编号为S5。本实施例使用以下提取试剂盒：硕世生物公司的细菌DNA提取试剂盒(货号：SDK60108)。
本次实施例提取人工合成的假病毒，具体包括马来丝虫假病毒和班氏丝虫假病毒，将其溶于正常人全血样本中，获得两种模拟阳性样本，即马来丝虫假病毒模拟阳性样本S1和班氏丝虫假病毒模拟阳性样本S2，以防止假阴性出现，进行全程监测。
质控品配制：淋巴丝虫阳性对照配制方案按照在检测体系中的终浓度为HhaI：SspI：Rnasep＝107：107：107copies/ml进行配制，溶剂为TE缓冲液。空白对照为灭菌的去RNA酶水。
实施例4核酸加样：
将核酸扩增反应液、实施例3提取的模板DNA和阳性对照以及空白对照分别按照表2所示体积分别加入反应管内的实施例2所述引物探针检测液中，获得检测体系，封盖离心。
表2检测体系
所述检测体系中引物探针组合的反应终浓度为PS1：400nM、PS2：400nM、PS3-F：300nM、PS4：400nM、PS5：400nM、PS6-F：300nM、EF：400nM、ER：400nM、EP：300nM；所述检测体系中阳性对照的终浓度为HhaI：SspI：Rnasep＝107：107：107copies/ml。
实施例5实时荧光PCR扩增程序
将实施例4得到的模板DNA检测体系、阳性对照检测体系、空白对照检测体系于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
(1)95℃×5min；1cycles
(2)95℃×10sec，58℃×30sec；40cycles
在第(2)步骤58℃，30s时对FAM、VIC通道的进行荧光信号采集；ABI7500实时荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。ABI 7500、ABI Q7、ABI Q5：反应结束自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(可以根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阀值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
实施例6结果判读
FAM通道表示淋巴丝虫特异性基因检测结果、VIC通道表示内参基因检测结果；
质控品检测要求：阳性对照FAM通道Ct≤30，VIC通道Ct≤30；空白对照FAM通道与VIC通道均不显示Ct值，为质控品检测正常；
当质控品检测正常且：
(1)模板DNA检测结果FAM通道Ct≤35且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期，则该待测生物体为淋巴丝虫阳性样本；
(2)模板DNA检测结果FAM通道Ct＞38或者未检出，则该待测生物体为淋巴丝虫阴性样本；
(3)模板DNA检测结果FAM通道35＜Ct≤38，则该待测生物体为疑似样本，需要重新提取疑似样本模板DNA，重新复检，如重新复检Ct值仍在此区间内，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期时，可判读为阳性，否则判读为阴性。
(1)至(3)中，模板DNA检测结果VIC通道检测结果应Ct≤35，否则需要重新提取模板DNA，重新复检；当样本判读为阳性时，如内标Ct＞38或未检出，结果仍可信。
实施例7质量控制
以阳性对照为模板，进行荧光PCR扩增检验，观察荧光PCR扩增结果，其结果呈S型且具有明显的指数增长期，阳性对照FAM与VIC通道Ct值均为23-30，即满足阳性对照FAM通道Ct≤30，VIC通道Ct≤30；。空白对照FAM与VIC通道无扩增。
本实施例对阳性对照及空白对照进行检测，其FAM表示淋巴丝虫特异性基因、VIC通道表示内参基因，荧光PCR结果图如图1所示，结果显示：阳性对照FAM通道Ct值为23左右，VIC通道Ct值为24左右，均满足FAM通道Ct≤30，VIC通道Ct≤30；空白对照FAM通道与VIC通道均未扩增，不显示Ct值；表示试剂盒阳性对照性能较好。
实施例8实验结果分析
以提取的阳性样本马来丝虫假病毒S1和班氏丝虫假病毒S2、人全血样本S3、S4、S5、阳性对照及空白对照为例进行结果分析，其荧光结果图为图3所示：阳性对照FAM通道Ct值为23左右，VIC通道Ct值为24左右，马来丝虫假病毒S1和班氏丝虫假病毒S2的FAM通道Ct值为23左右，即FAM通道Ct≤35且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期，VIC通道Ct值为25左右，人全血样本S3、S4的FAM通道Ct值与阳性对照Ct值相差较小，即FAM通道Ct≤35且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期，其荧光值与阳性对照比较低，VIC通道差别不大，即VIC通道Ct值均≤35，判定为淋巴丝虫阳性样本，S5和空白对照FAM通道与VIC通道均没扩增，表示为阴性样本，符合质量控制接受准则。
实施例9性能研究
(1)特异性分析
分别对与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体(盘尾丝虫、非洲锥虫)及其人总核酸采用硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取，作为模板DNA进行检测，除模板DNA替换以外，其他操作与实施例2～6相同。检测结果如表3所示，荧光PCR扩增曲线图如图2所示。
表3：特异性分析
样本名称 检测结果
盘尾丝虫 阴性
非洲锥虫 阴性
人总核酸 阴性
淋巴丝虫 阳性
结果显示：淋巴丝虫FAM通道的Ct值为22左右，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期；且人总核酸VIC通道的Ct值在28左右，说明扩增体系正常。而盘尾丝虫与非洲锥虫以及人总核酸的FAM通道均未发生扩增，说明该引物探针特异性较好。
(2)检测限确认
基于实时荧光PCR检测的淋巴丝虫最低检出限的确认，采用硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取淋巴丝虫核酸，作为模板DNA，然后将确定浓度的核酸稀释至10000copies/ml、8000copies/ml、5000copies/ml、1000copies/ml、800copies/ml进行检测，每个梯度做20个重复。
表4：最低检测限确认：
针对每个梯度进行20个重复检测，10000copies/ml、8000copies/ml、5000copies/ml的20个重复皆检出，且Ct值都在35-38左右，而1000copies的20个重复检出18个，其检出的Ct值也在35-38左右，因此本发明最低检测限规定为1000copies/ml，更优为5000copies/ml。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测淋巴丝虫的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：
检测淋巴丝虫的通用引物探针PS1、PS2、PS3-F、PS4、PS5、PS6-F；
用于监测反应过程的内参基因引物及探针EF、ER、EP；
所述PS1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述PS2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述PS3-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PS3-F的5’标记FAM荧光素，3’标记BHQ1荧光猝灭基团；
所述PS4核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述PS5核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述PS6-F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述PS6-F的5’标记FAM荧光素，3’标记BHQ1荧光猝灭基团；
所述EF核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述ER核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述EP核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述EP的5’标记VIC荧光素，3’标记BHQ2荧光猝灭基团。
2.一种检测淋巴丝虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物探针组合。
3.根据权利要求2所述检测淋巴丝虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物探针反应终浓度为PS1：400nM、PS2：400nM、PS3-F：300nM、PS4：400nM、PS5：400nM、PS6-F：300nM、EF：400nM、ER：400nM、EP：300nM。
4.根据权利要求2所述检测淋巴丝虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含核酸扩增反应液、空白对照、阳性对照。
5.根据权利要求4所述检测淋巴丝虫的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的HhaI基因片段、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的SspI基因片段、核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的核糖核苷酸酶Rnasep基因片段。
6.根据权利要求5所述检测淋巴丝虫的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照按照终浓度为HhaI：SspI：Rnasep＝107：107：107copies/ml进行配制，溶剂为TE缓冲液。
7.根据权利要求4所述检测淋巴丝虫的试剂盒，其特征在于，所述空白对照为灭菌去RNA酶水。
8.权利要求1所述的引物探针组合在制备淋巴丝虫和/或淋巴丝虫病检测试剂中的应用。
9.一种淋巴丝虫的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)引物探针检测液配制：
将权利要求1所述引物探针组合采用TE缓冲液调节引物探针在检测体系中的终浓度，配制成引物探针检测液；
(2)模板DNA提取：
提取待测生物体中的DNA，作为模板DNA；优选的，提取待测生物体血液中的DNA；
(3)核酸加样：
将空白对照、阳性对照、步骤2提取的模板DNA分别加入步骤1所述引物探针检测液中，分别加入核酸扩增反应液，获得检测体系；所述检测体系中权利要求1所述引物探针组合的反应终浓度为PS1：400nM、PS2：400nM、PS3-F：300nM、PS4：400nM、PS5：400nM、PS6-F：300nM、EF：400nM、ER：400nM、EP：300nM；
(4)实时荧光PCR扩增反应：
将步骤(3)获得的检测体系于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
步骤①95℃×5min；1cycles
步骤②95℃×10sec，58℃×30sec；40cycles
在步骤②58℃，30s时对FAM、VIC通道的荧光信号进行采集；实时荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None；
(5)结果判读：
FAM通道表示淋巴丝虫特异性基因检测结果、VIC通道表示内参基因检测结果；
质控品检测要求：阳性对照FAM通道Ct≤30，VIC通道Ct≤30；空白对照FAM通道与VIC通道均不显示Ct值，为质控品检测正常；
当质控品检测正常且：
(5-1)模板DNA检测结果FAM通道Ct≤35且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期，则该待测生物体为淋巴丝虫阳性样本；
(5-2)模板DNA检测结果FAM通道Ct＞38或者未检出，则该待测生物体为淋巴丝虫阴性样本；
(5-3)模板DNA检测结果FAM通道35＜Ct≤38，则该待测生物体为疑似样本，需要重新提取疑似样本模板DNA，重新复检，如重新复检Ct值仍在此区间内，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期时，可判读为阳性，否则判读为阴性；
(5-1)至(5-3)中，模板DNA检测结果VIC通道检测结果应Ct≤35，否则需要重新提取模板DNA，重新复检；当样本判读为阳性时，如内标Ct＞38或未检出，结果仍可信。
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