CN110512003A - 用于检测nudt15基因多态性的检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒及其使用方法，检测试剂盒包括针对NUDT15基因C415T和G416A位点的正向引物、反向引物、野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，415位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，416位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。该检测试剂盒在检测的过程中，引物和探针同时杂交到DNA扩增模板上才能有效进行PCR扩增反应，产生指数扩增荧光信号，极大地提高了检测灵敏度，而且当探针与模板有单碱基差异时，会直接影响探针与模板的杂交稳定性，最终影响荧光信号的Ct值，具有较强的特异性。

Description

用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
硫嘌呤类药物如6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)和硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)等是一类具有免疫抑制作用的抗代谢药，主要通过干扰嘌呤代谢，影响嘌呤核苷酸的合成，进而抑制细胞DNA、RNA及蛋白质的合成。临床上，硫嘌呤类药物被用来治疗炎症性肠病、儿童急性淋巴性白血病、急性非淋巴性白血病、类风湿关节炎等，也可作为免疫抑制剂使用以防止肾移植排斥反应，但以白细胞减少为主的骨髓抑制不良反应一直是困扰临床安全用药的难题。FDA已批准在6-巯基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤(AZA)的药品说明书中增加在用药前检查硫嘌呤甲基转移酶(thiopurine S-methyltransferase，TPMT)基因型，对基因突变者应避免使用或在严密监测下减量使用。TPMT基因型检查预测骨髓抑制的特异性很高，但灵敏性低(尤其在汉族人群中)。研究显示，NUDT15基因多态性检测对预测包括我国在内的亚洲人群使用硫嘌呤药物产生骨髓抑制的灵敏性与特异性高。NUDT15是一种Nudix水解酶，被认为能使硫嘌呤药物的活性代谢物TdGTP和TGTP脱磷酸，进而防止其掺入DNA或RNA并负面影响硫嘌呤药物的细胞毒性作用。如果NUDT15基因第139位密码子发生了Arg139Cys(R139C，415C>T)或Arg139His(R139H，416G>A)的突变，则NUDT15酶活性降低，会导致硫嘌呤药物的细胞毒性增强。因此检测急性淋巴细胞白血病、炎症性肠病等患者NUDT15基因多态性有助于指导硫嘌呤类药物安全和个体化用药。
发明内容
基于此，有必要提供一种灵敏度高、特异性强的用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒。
一种用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒，包括针对NUDT15基因C415T和G416A位点的正向引物、反向引物、野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述415位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述416位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在其中一个实施例中，所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针的5’端均连接有荧光报告基团，且所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针的荧光报告基团互不相同，所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针的3’端均连接有荧光淬灭基团。
在其中一个实施例中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团为NFQ-MGB。
在其中一个实施例中，所述野生型探针的5’端连接有FAM基团，所述415位点突变型探针的5’端连接有HEX基团，所述416位点突变型探针的5’端连接有CY5基团。
在其中一个实施例中，还包括Taq DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基酶、反应缓冲液和dNTPs中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述正向引物的使用浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述反向引物的使用浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述野生型探针的使用浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述415位点突变型探针的使用浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述416位点突变型探针的使用浓度为200nmol/L～600nmol/L。
本发明还提供了一种上述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
获取待测DNA样本；
使用所述正向引物、所述反向引物、所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针与所述待测DNA样本配制得到PCR反应体系，然后进行荧光定量PCR反应；
收集并分析荧光定量PCR数据。
在一个具体示例中，在所述PCR反应体系中，所述正向引物的浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述反向引物的浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述野生型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述415位点突变型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述416位点突变型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L。
在一个具体示例中，所述分析荧光定量PCR数据的方法包括以下步骤：获取所述野生型探针的Ct值、所述415位点突变型探针的Ct值和所述416位点突变型探针的Ct值，并根据Ct值的大小判断所述待测DNA样本的NUDT15 C415T和G416A基因型。
在一个具体示例中，所述根据Ct值的大小判断所述待测DNA样本的NUDT15 C415T和G416A基因型的方法为：当所述野生型探针的Ct＜25、所述415位点突变型探针的Ct＞25、所述416位点突变型探针的Ct＞25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415CC型和416GG型；当所述野生型探针的Ct＜25、所述415位点突变型探针的Ct＜25、所述416位点突变型探针的Ct＞25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415CT型和416GG型；当所述野生型探针的Ct＞25、所述415位点突变型探针的Ct＜25、所述416位点突变型探针的Ct＞25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415TT型和416GG型；当所述野生型探针的Ct＜25、所述415位点突变型探针的Ct＞25、所述416位点突变型探针的Ct＜25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415CC型和416GA型；当所述野生型探针的Ct＞25、所述415位点突变型探针的Ct＞25、所述416位点突变型探针的Ct＜25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415CC型和416AA型；当所述野生型探针的Ct＞25、所述415位点突变型探针的Ct＜25、所述416位点突变型探针的Ct＜25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415TT型和416AA型。
本发明的上述检测试剂盒及其使用方法通过荧光定量PCR反应对NUDT15基因的C415T和G416A单核苷酸多态性位点进行分型检测，其主要检测原理为：当探针与人NUDT15基因模板完全互补时，PCR扩增时探针与模板结合，引物在Taq DNA聚合酶作用下的延伸过程中遇到与模板结合的探针，由于Taq DNA聚合酶5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使探针荧光基团和淬灭基团分离，产生的荧光信号被荧光检测系统接收；当探针与人NUDT15基因模板存在碱基错配时，PCR扩增时探针不与模板结合、不会被Taq DNA聚合酶切断，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不产生荧光信号。因此，可根据荧光检测系统形成的扩增曲线在特定阈值时循环数(Ct值)的大小来判断NUDT15 C415T、G416A位点基因型，无需荧光定量PCR系统配备“基因分型(Genotyping)”分析模块，适用范围更广。在检测的过程中，引物和探针同时杂交到DNA扩增模板上才能有效进行PCR扩增反应，产生指数扩增荧光信号，从而极大地提高了检测灵敏度。而且当探针与模板有单碱基差异时，会直接影响探针与模板的杂交稳定性，最终影响了荧光信号的Ct值，从而具有较强的特异性。可以采用八联管或96孔PCR板，实现待测样本的高通量检测，减少检测误差，整个操作过程只需要一次加样过程，操作过程简单快速，检测成本低。
附图说明
图1为实施例2中4个样本的NUDT15基因野生型探针荧光PCR扩增曲线图；
图2为实施例2中4个样本的NUDT15基因415位点突变型探针荧光PCR扩增曲线图；
图3为实施例2中4个样本的NUDT15基因416位点突变型探针荧光PCR扩增曲线图；
图4为1号样本的NUDT15基因C415T、G416A位点测序图；
图5为2号样本的NUDT15基因C415T、G416A位点测序图；
图6为3号样本的NUDT15基因C415T、G416A位点测序图；
图7为4号样本的NUDT15基因C415T、G416A位点测序图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的一种用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒，包括针对NUDT15基因C415T和G416A位点的正向引物、反向引物、野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针。具体参见下表，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，415位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，416位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
本实施例的上述检测试剂盒包括一对引物和三条探针，可通过荧光定量PCR反应对NUDT15基因的C415T和G416A单核苷酸多态性位点进行分型检测，其主要检测原理为：当探针与人NUDT15基因模板完全互补时，PCR扩增时探针与模板结合，引物在Taq DNA聚合酶作用下的延伸过程中遇到与模板结合的探针，由于Taq DNA聚合酶5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使探针荧光基团和淬灭基团分离，产生的荧光信号被荧光检测系统接收；当探针与人NUDT15基因模板存在碱基错配时，PCR扩增时探针不与模板结合、不会被Taq DNA聚合酶切断，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不产生荧光信号。因此，可根据荧光检测系统形成的扩增曲线在特定阈值时循环数(Ct值)的大小来判断NUDT15 C415T和G416A位点基因型，无需荧光定量PCR系统配备“基因分型(Genotyping)”分析模块，适用范围更广。在检测的过程中，引物和探针同时杂交到DNA扩增模板上才能有效进行PCR扩增反应，产生指数扩增荧光信号，从而极大地提高了检测灵敏度。而且当探针与模板有单碱基差异时，会直接影响探针与模板的杂交稳定性，最终影响了荧光信号的Ct值，从而具有较强的特异性。可以采用八联管或96孔PCR板，实现待测样本的高通量检测，减少检测误差，整个操作过程只需要一次加样过程，操作过程简单快速，检测成本低。
在一个具体示例中，野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针的5’端均连接有荧光报告基团，且野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针的荧光报告基团互不相同，野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针的3’端均连接有荧光淬灭基团。
在一个具体示例中，荧光报告基团选自FAM、HEX、CY5或ROX，荧光淬灭基团为NFQ-MGB。如此，探针3’端的淬灭基团为具有小沟结合物(minor groove binding，MGB)的无荧光淬灭基团(non-fluorescent quencher，NFQ)，可以大大稳定探针与模板的结合，使较短的探针同样能达到较高的Tm值，同时可大大降低本底信号干扰，对单碱基突变检测更敏感。三条探针5’端标记不同的荧光基团，使得检测一个多态性位点只需一管PCR反应，操作简单，节约标本。
在一个具体示例中，野生型探针的5’端连接有FAM基团，415位点突变型探针的5’端连接有HEX基团，416位点突变型探针的5’端连接有CY5基团。
在一个具体示例中，上述检测试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基酶(UDG)、反应缓冲液(含2.0～3.5mM Mg2+)、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP混合物)和水(无核酸酶)中的一种或多种，dUTP/UDG系统的应用能有效防止PCR产物污染，提高准确性。可以理解，这些组分也可以单独销售或购买。
本发明一实施例的一种上述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤S1～S3：
S1、获取待测DNA样本。
S2、使用上述正向引物、反向引物、野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针与上述待测DNA样本配制得到PCR反应体系，然后进行荧光定量PCR反应。
S3、收集并分析荧光定量PCR数据。
在一个具体示例中，在PCR反应体系中，正向引物的浓度为200nmol/L～800nmol/L，反向引物的浓度为200nmol/L～800nmol/L，野生型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L，415位点突变型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L，416位点突变型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L，dNTPs的浓度为50μmol/L～500μmol/L，Taq DNA聚合酶的浓度为0.04U/μL～0.12U/μL，尿嘧啶DNA糖基酶的浓度为0.01U/μL～0.04U/μL。
在一个具体示例中，分析荧光定量PCR数据的方法包括以下步骤：获取野生型探针的Ct值、415位点突变型探针的Ct值和416位点突变型探针的Ct值，并根据Ct值的大小判断待测DNA样本的NUDT15 C415T和G416A基因型。
具体地，根据Ct值的大小判断待测DNA样本的NUDT15 C415T和G416A基因型的方法为：当野生型探针的Ct＜25、415位点突变型探针的Ct＞25、416位点突变型探针的Ct＞25时，待测DNA样本为NUDT15 415CC型和416GG型；当野生型探针的Ct＜25、415位点突变型探针的Ct＜25、416位点突变型探针的Ct＞25时，待测DNA样本为NUDT15 415CT型和416GG型；当野生型探针的Ct＞25、415位点突变型探针的Ct＜25、416位点突变型探针的Ct＞25时，待测DNA样本为NUDT15 415TT型和416GG型；当野生型探针的Ct＜25、415位点突变型探针的Ct＞25、416位点突变型探针的Ct＜25时，待测DNA样本为NUDT15 415CC型和416GA型；当野生型探针的Ct＞25、415位点突变型探针的Ct＞25、416位点突变型探针的Ct＜25时，待测DNA样本为NUDT15415CC型和416AA型；当野生型探针的Ct＞25、415位点突变型探针的Ct＜25、416位点突变型探针的Ct＜25时，待测DNA样本为NUDT15 415TT型和416AA型。
在一个具体示例中，荧光定量PCR反应的条件为：37℃尿嘧啶DNA糖基酶作用5min～10min，94℃预变性2min～10min；94℃变性5s～15s，58℃～63℃退火和延伸30s～60s，共进行30～45次循环，并实时采集荧光信号。
综上所述，本实施例的检测试剂盒是一种简便实用的NUDT15基因多态性检测试剂盒，使用该检测试剂盒进行NUDT15基因C415T和G416A位点检测具有操作简单、灵敏度高、特异性强、适用范围广等优点。
以下为具体实施例。
实施例1NUDT15基因分型PCR反应体系配制
将正向引物、反向引物、野生型探针、415位点突变型探针、416位点突变型探针、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基酶(UDG)、反应缓冲液(含Mg2+)、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP混合物)和无核酸酶水混合，配制得到用于检测人NUDT15基因多态性的PCR反应体系。每人份PCR反应体系为25uL，包含2.5μL反应缓冲溶液(含2.5mM Mg2+)，1.5μL正向引物溶液(600nM)，1.5μL反向引物溶液(600nM)，1μL野生型探针溶液(400nM)，1μL 415位点突变型探针溶液(400nM)，1μL 416位点突变型探针溶液(400nM)，2.5μL dNTPs溶液(dATP、dUTP、dCTP、dGTP各200μM)，0.5μL Taq DNA聚合酶溶液(0.1U/μL)，0.5μL UDG溶液(0.02U/μL)，2μL待测DNA样本溶液(1～100ng)和11μL无核酸酶水。其中，各引物和探针的结构如下所示：
正向引物NUDT15-F：5′-AGCCAAGCAAATGCAAAGC-3′
反向引物NUDT15-R：5′-TCTCGGCCACCTAGAGATGA-3′
野生型探针NUDT15 415C/416G：5′-FAM-TGTTCTTTTAAACAACGCAGT–NFQ-MGB-3′
415位点突变型探针NUDT15 415T：5′-HEX-TTCTTTTAAACAACACAGTCC–NFQ-MGB-3′
416位点突变型探针NUDT15 416A：5′-CY5-TTCTTTTAAACAATGCAGTCC–NFQ-MGB-3′
实施例2对4份不同的人全血样本进行NUDT15基因多态性检测
提取基因组DNA模板
采用商业化的血液基因组DNA提取试剂盒(如天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒或北京金豪制药股份有限公司的通用型核酸快速提取试剂盒等)提取得到DNA样本。
PCR反应体系
按照实施例1中的PCR反应体系进行配制，具体操作步骤如下：在八联管或96孔PCR板孔中加入2.5μL反应缓冲溶液(含2.5mM Mg2+)，1.5μL正向引物溶液(600nM)，1.5μL反向引物溶液(600nM)，1μL野生型探针溶液(400nM)，1μL 415位点突变型探针溶液(400nM)，1μL416位点突变型探针溶液(400nM)，2.5μL dNTPs溶液(dATP、dUTP、dCTP、dGTP各200μM)，0.5μL Taq DNA聚合酶溶液(0.1U/μL)，0.5μL UDG溶液(0.02U/μL)，2μL待测DNA样本溶液(约20ng)和11μL无核酸酶水。
荧光PCR检测
将上述反应体系置于ABI7500荧光定量PCR仪，于37℃下UDG作用5min；94℃预变性4min；94℃变性10s，60℃退火和延伸45s，共进行45次循环，前10次循环不采集荧光，之后35次循环的退火和延伸阶段仪器实时测定溶液的荧光信号，并给出FAM通道、VIC通道和CY5通道的Ct值。
结果判读
NUDT15 C415T和G416A位点基因型判读：当FAM通道Ct＜25、VIC通道Ct＞25、CY5通道Ct＞25时，为NUDT15 415CC型和416GG型；当FAM通道Ct＜25、VIC通道Ct＜25、CY5通道Ct＞25时，为NUDT15 415CT型和416GG型；当FAM通道Ct＞25、VIC通道Ct＜25、CY5通道Ct＞25时，为NUDT15 415TT型和416GG型；当FAM通道Ct＜25、VIC通道Ct＞25、CY5通道Ct＜25时，为NUDT15 415CC型和416GA型；当FAM通道Ct＞25、VIC通道Ct＞25、CY5通道Ct＜25时，为NUDT15415CC型和416AA型；当FAM通道Ct＞25、VIC通道Ct＜25、CY5通道Ct＜25时，为NUDT15 415TT型和416AA型。
如附图1所示是4个样本NUDT15基因野生型探针FAM通道荧光定量PCR扩增曲线图，如附图2所示是与附图1相同的4个样本NUDT15基因415位点突变型探针VIC通道荧光定量PCR扩增曲线图，如附图3所示是与附图1相同的4个样本NUDT15基因416位点突变型探针CY5通道荧光定量PCR扩增曲线图。根据这4个样本的FAM通道Ct值、VIC通道Ct值和CY5通道Ct值，判断这4个样本NUDT15 C415T和G416A基因型，结果如下表所示：
(注：若FAM、VIC或CY5通道无扩增信号时，结果显示为“Undetermined”，定义其Ct值为35。)
如附图4所示为1号样本NUDT15基因C415T和G416A位点测序图，测序结果显示该样本为NUDT15 415CC和416GG，与本实施例检测结果一致。如附图5所示为2号样本NUDT15基因C415T和G416A位点测序图，测序结果显示该样本为NUDT15 415CT和416GG，与本实施例检测结果一致。如附图6所示为3号样本NUDT15基因C415T和G416A位点测序图，测序结果显示该样本为NUDT15 415TT和416GG，与本实施例检测结果一致。如附图7所示为4号样本NUDT15基因C415T和G416A位点测序图，测序结果显示该样本为NUDT15 415CC和416GA，与本实施例检测结果一致。
本实施例的检测结果均经过测序法验证，测序结果与本实施例的检测结果一致，证明本发明检测试剂盒的检测结果准确可靠、特异性强。
实施例3最低检测限验证试验
将提取的上述2号样本和4号样本的DNA，使用nanodrop测定浓度后，分别稀释至10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL和0.5ng/μL，采用与上述样本检测同样的试验条件进行最低检测限验证。
结果显示样本浓度为0.5ng/μL时，本检测方法仍然可以检测到扩增信号。由此说明，本发明检测试剂盒的最低检测限不高于0.5ng/μL，检测灵敏度高。
具体结果参见下表：
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 上海科新生物技术股份有限公司
<120> 用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒及其使用方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agccaagcaa atgcaaagc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctcggccac ctagagatga 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttctttta aacaacgcag t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcttttaaa caacacagtc c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcttttaaa caatgcagtc c 21

Claims (10)

1.一种用于检测NUDT15基因多态性的检测试剂盒，其特征在于，包括针对NUDT15基因C415T和G416A位点的正向引物、反向引物、野生型探针、415位点突变型探针和416位点突变型探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述415位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述416位点突变型探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针的5’端均连接有荧光报告基团，且所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针的荧光报告基团互不相同，所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针的3’端均连接有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团为NFQ-MGB。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述野生型探针的5’端连接有FAM基团，所述415位点突变型探针的5’端连接有HEX基团，所述416位点突变型探针的5’端连接有CY5基团。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括Taq DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基酶、反应缓冲液和dNTPs中的一种或多种。
6.根据权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物的使用浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述反向引物的使用浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述野生型探针的使用浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述415位点突变型探针的使用浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述416位点突变型探针的使用浓度为200nmol/L～600nmol/L。
7.一种权利要求1～6任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取待测DNA样本；
使用所述正向引物、所述反向引物、所述野生型探针、所述415位点突变型探针和所述416位点突变型探针与所述待测DNA样本配制得到PCR反应体系，然后进行荧光定量PCR反应；
收集并分析荧光定量PCR数据。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，在所述PCR反应体系中，所述正向引物的浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述反向引物的浓度为200nmol/L～800nmol/L，所述野生型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述415位点突变型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L，所述416位点突变型探针的浓度为200nmol/L～600nmol/L。
9.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述分析荧光定量PCR数据的方法包括以下步骤：获取所述野生型探针的Ct值、所述415位点突变型探针的Ct值和所述416位点突变型探针的Ct值，并根据Ct值的大小判断所述待测DNA样本的NUDT15 C415T和G416A基因型。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述根据Ct值的大小判断所述待测DNA样本的NUDT15 C415T和G416A基因型的方法为：当所述野生型探针的Ct＜25、所述415位点突变型探针的Ct＞25、所述416位点突变型探针的Ct＞25时，所述待测DNA样本为NUDT15415CC型和416GG型；当所述野生型探针的Ct＜25、所述415位点突变型探针的Ct＜25、所述416位点突变型探针的Ct＞25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415CT型和416GG型；当所述野生型探针的Ct＞25、所述415位点突变型探针的Ct＜25、所述416位点突变型探针的Ct＞25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415TT型和416GG型；当所述野生型探针的Ct＜25、所述415位点突变型探针的Ct＞25、所述416位点突变型探针的Ct＜25时，所述待测DNA样本为NUDT15415CC型和416GA型；当所述野生型探针的Ct＞25、所述415位点突变型探针的Ct＞25、所述416位点突变型探针的Ct＜25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415CC型和416AA型；当所述野生型探针的Ct＞25、所述415位点突变型探针的Ct＜25、所述416位点突变型探针的Ct＜25时，所述待测DNA样本为NUDT15 415TT型和416AA型。
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