CN109593854A - 适于肿瘤类药物相关基因snp位点检测的核酸组以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组以及应用，涉及基因多态性检测技术领域。该核酸组包括引物组合1‑引物组合15中的一种或多种的组合。采用该核酸组可以同时对9个肿瘤类药物相关基因的15个SNP位点的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，SNP位点之间无干扰等特点。

Description

适于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组以及应用
技术领域
本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体而言，涉及一种适于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组以及应用。
背景技术
肿瘤已经成为我国的高发疾病，药物治疗是目前肿瘤治疗的主要临床手段，但是药物疗效和不良反应也呈现较明显的个体差异。出现差异的原因，除了病理、生理、性别、年龄、身高、体重、依从性等外，遗传因素是影响药物反应差异的重要因素。
研究发现，用于肿瘤治疗药物的疗效与多种基因表型相关，基因表型不同，药物的治疗效果就存在显著差异。近年来，药物基因组学得到了飞速发展，已有多种肿瘤用药对应了相应的药物基因组学信息，如疏嘌呤类，铂类和5-FU类药物。因此为取得最佳治疗效果，医生应依据患者的基因型资料选取合适的药物和剂量，即根据个体遗传特征(基因型)，选择有效的治疗方案。实现“基因导向型”个体化药物治疗和“量体用药”。
传统的检测方法主要为sanger测序、片段分析或是单碱基延伸技术，每个反应仅检测1个或是几个基因位点。其存在检测效率低，通量低的问题。传统的检测方法完成一次检测周期较长，需要实验人员较多；同时检测配套试剂中，需要荧光标记引物或ddNTP或长片段引物，成本较高。由于药物代谢基因在基因组中存在有较多重复序列，传统的检测方法对基因难扩增、难检测。传统的检测方法实验流程长，样品孔反复开盖、加样次数多；同时同一反应内多个基因位点竞争性扩增，相关干扰大。传统检测方法得到的原始结果均无法在仪器上直观显示检测结果，需要实验员自行设置参数分析，结果判读复杂。传统的检测方法需要用到荧光标记的引物或ddNTP或是长片段引物，在室温或是光照条件下暴露较长时间，或是反复冻融次数过多极易导致检测失败，失败率高。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组，采用该核酸组可以同时对9个肿瘤类药物相关基因的15个SNP位点的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，SNP位点之间无干扰等特点。
本发明的另一目的在于提供一种用于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的试剂盒，采用该试剂盒可以同时对9个肿瘤类药物相关基因的15个SNP位点的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，SNP位点之间无干扰等特点。
本发明的另一目的在于提供上述核酸组在检测肿瘤类药物相关基因SNP位点中的应用，可以同时对9个肿瘤类药物相关基因的15个SNP位点的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，SNP位点之间无干扰等特点。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种适于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组，其包括引物组合1-引物组合15中的一种或多种的组合；
其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1-2所示的扩增引物和SEQ ID NO.31所示的检测引物；
引物组合2包括：SEQ ID NO.3-4所示的扩增引物和SEQ ID NO.32所示的检测引物；
引物组合3包括：SEQ ID NO.5-6所示的扩增引物和SEQ ID NO.33所示的检测引物；
引物组合4包括：SEQ ID NO.7-8所示的扩增引物和SEQ ID NO.34所示的检测引物；
引物组合5包括：SEQ ID NO.9-10所示的扩增引物和SEQ ID NO.35所示的检测引物；
引物组合6包括：SEQ ID NO.11-12所示的扩增引物和SEQ ID NO.36所示的检测引物；
引物组合7包括：SEQ ID NO.13-14所示的扩增引物和SEQ ID NO.37所示的检测引物；
引物组合8包括：SEQ ID NO.15-16所示的扩增引物和SEQ ID NO.38所示的检测引物；
引物组合9包括：SEQ ID NO.17-18所示的扩增引物和SEQ ID NO.39所示的检测引物；
引物组合10包括：SEQ ID NO.19-20所示的扩增引物和SEQ ID NO.40所示的检测引物；
引物组合11包括：SEQ ID NO.21-22所示的扩增引物和SEQ ID NO.41所示的检测引物；
引物组合12包括：SEQ ID NO.23-24所示的扩增引物和SEQ ID NO.42所示的检测引物；
引物组合13包括：SEQ ID NO.25-26所示的扩增引物和SEQ ID NO.43所示的检测引物；
引物组合14包括：SEQ ID NO.27-28所示的扩增引物和SEQ ID NO.44所示的检测引物；
引物组合15包括：SEQ ID NO.29-30所示的扩增引物和SEQ ID NO.45所示的检测引物。
采用本发明提供的核酸组，结合飞行时间质谱技术可以同时对9个肿瘤类药物相关基因例如TPMT、NUDT15、XRCC1、ERCC1、ERCC2、GSTP1、GSTT1、DPYD和MTHFR的15个多态性位点即rs1800462、rs1800460、rs1142345、rs116855232、rs25487、rs13181、rs11615、rs1695、rs3918290、rs55886062、rs1801265、rs67376798、rs1801131、rs1801133和GSTT1整个基因缺失的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，各SNP位点检测结果之间无干扰等特点。
其中，上述9个肿瘤类药物相关基因与15个SNP位点的位置关系加下表1。
表1
注：*GSTT1(谷胱甘肽硫转移酶T1)在一些个体中常伴有整个基因的缺失，进而导致相关蛋白无法表达而影响药物疗效。在本发明中通过检测GSTT1特有的一段基因序列是否存在判断GSTT1基因是否缺失。因此在此处无固定rs编号代表。
上述的引物组合1-引物组合15的扩增引物的序列见下表2。
表2
注：F：扩增用上游引物；R：扩增用下游引物上述的引物组合1-引物组合15的检测引物的序列以及检测的SNP见下表3。
表3
上述的引物组合1-引物组合15的检测引物以其扩增产物的分子量大小的峰位置及其对应的SNP位点基因型见下表4。
表4
注：表中*0代表缺失突变，*1代表野生型。
另一方面，本发明提供了一种肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的试剂盒，其包括上述的核酸组。
采用本发明提供的试剂盒，结合飞行时间质谱技术可以同时对9个肿瘤类药物相关基因例如TPMT、NUDT15、XRCC1、ERCC1、ERCC2、GSTP1、GSTT1、DPYD和MTHFR的15个多态性位点即rs1800462、rs1800460、rs1142345、rs116855232、rs25487、rs13181、rs11615、rs1695、rs3918290、rs55886062、rs1801265、rs67376798、rs1801131、rs1801133和GSTT1整个基因缺失的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，各SNP位点检测结果之间无干扰等特点。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，试剂盒还包括有如下组分：Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
另一方面，本发明提供了如上所述的核酸组在检测肿瘤类药物相关基因SNP位点中的应用，其包括如下步骤：
(1)使用上述核酸组中的扩增引物对样品进行PCR扩增，得到第一扩增产物；
(2)使用上述核酸组中的检测引物对经碱性磷酸酶处理后的第一扩增产物进行单碱基延伸反应，得到第二扩增产物；
(3)采用飞行时间质谱技术分析所述第二扩增产物的多态性。
判断结果时，根据检测引物扩增的分子量大小和峰位置，各确定各SNP位点的基因型。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(1)中，进行PCR扩增的体系含有：引物组合1-引物组合15的扩增引物、Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(1)中，所述扩增引物在体系中的浓度为0.8-1.2μM。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(1)中，进行PCR扩增的程序的退火温度为：55-57℃。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(2)中，进行单碱基延伸反应的体系含有：引物组合1-引物组合15的检测引物和第一扩增产物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述检测引物在单碱基延伸反应的体系中的总浓度为13-15μM。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，引物组合1-引物组合15的各检测引物在单碱基延伸反应的体系中的浓度分别为：1.052μM、1.063μM、1.036μM、0.681μM、0.664μM、0.790μM、1.125μM、0.653μM、0.976μM、1.125μM、0.983μM、1.005μM、0.808μM、0.907μM以及1.078μM。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(2)中，进行单碱基延伸反应的程序的退火温度为：51-53℃，退火时间为：4-6s。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，进行单碱基延伸反应的程序的延伸温度为79-81℃，时间为4-6s。
采用本发明提供的检测方法，结合飞行时间质谱技术可以同时对9个肿瘤类药物相关基因例如TPMT、NUDT15、XRCC1、ERCC1、ERCC2、GSTP1、GSTT1、DPYD和MTHFR的15个多态性位点即rs1800462、rs1800460、rs1142345、rs116855232、rs25487、rs13181、rs11615、rs1695、rs3918290、rs55886062、rs1801265、rs67376798、rs1801131、rs1801133和GSTT1整个基因缺失的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，各SNP位点检测结果之间无干扰等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1中的对照引物对1的检测结果。
图2为实验例1中的引物组合1的检测结果。
图3为实验例2中的对照引物对2的检测结果。
图4为实验例2中的引物组合2的检测结果。
图5为实验例3中的对照引物对3的检测结果。
图6为实验例3中的引物组合3的检测结果。
图7为实验例4中的对照引物对4的检测结果。
图8为实验例4中的引物组合4的检测结果。
图9为实验例5中的对照引物对5的检测结果。
图10为实验例5中的引物组合6的检测结果。
图11为实验例6中的对照引物对6的检测结果。
图12为实验例6中的引物组合7的检测结果。
图13为实验例7中的对照引物对7的检测结果。
图14为实验例7中的引物组合9的检测结果。
图15为实验例8中的对照引物对8的检测结果。
图16为实验例8中的引物组合15的检测结果。
图17为实验例9中的对照引物对9的检测结果。
图18为实验例9中的引物组合12的检测结果。
图19为实验例10中的对照引物对10的检测结果。
图20为实验例10中的引物组合11的检测结果。
图21为实验例11中的对照引物对11的检测结果。
图22为实验例11中的引物组合14的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的试剂盒，其包括用于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组，该核酸组包括如下引物组合1-引物组合15。
其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1-2所示的扩增引物和SEQ ID NO.31所示的检测引物；
引物组合2包括：SEQ ID NO.3-4所示的扩增引物和SEQ ID NO.32所示的检测引物；
引物组合3包括：SEQ ID NO.5-6所示的扩增引物和SEQ ID NO.33所示的检测引物；
引物组合4包括：SEQ ID NO.7-8所示的扩增引物和SEQ ID NO.34所示的检测引物；
引物组合5包括：SEQ ID NO.9-10所示的扩增引物和SEQ ID NO.35所示的检测引物；
引物组合6包括：SEQ ID NO.11-12所示的扩增引物和SEQ ID NO.36所示的检测引物；
引物组合7包括：SEQ ID NO.13-14所示的扩增引物和SEQ ID NO.37所示的检测引物；
引物组合8包括：SEQ ID NO.15-16所示的扩增引物和SEQ ID NO.38所示的检测引物；
引物组合9包括：SEQ ID NO.17-18所示的扩增引物和SEQ ID NO.39所示的检测引物；
引物组合10包括：SEQ ID NO.19-20所示的扩增引物和SEQ ID NO.40所示的检测引物；
引物组合11包括：SEQ ID NO.21-22所示的扩增引物和SEQ ID NO.41所示的检测引物；
引物组合12包括：SEQ ID NO.23-24所示的扩增引物和SEQ ID NO.42所示的检测引物；
引物组合13包括：SEQ ID NO.25-26所示的扩增引物和SEQ ID NO.43所示的检测引物；
引物组合14包括：SEQ ID NO.27-28所示的扩增引物和SEQ ID NO.44所示的检测引物；
引物组合15包括：SEQ ID NO.29-30所示的扩增引物和SEQ ID NO.45所示的检测引物。
各引物组合的扩增引物和检测引物的序列以及所检测的SNP位点见前文表2-表4。
当然，需要说明的是，在其他的实施例中，核酸组包括引物组合1-引物组合15中的任意1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种或14种的组合。在本发明公开了上述引物组合的基础上，本领域技术人员可以根据检测目的基因的类别和数量，从引物组合1-引物组合15中进行任意组合。无论是何种的组合方式，只要其是选自引物组合1-引物组合15，即属于本发明的保护范围。
本实施例的试剂盒可以同时对9个肿瘤类药物相关基因即TPMT、NUDT15、XRCC1、ERCC1、ERCC2、GSTP1、GSTT1、DPYD和MTHFR的15个多态性位点即rs1800462、rs1800460、rs1142345、rs116855232、rs25487、rs13181、rs11615、rs1695、rs3918290、rs55886062、rs1801265、rs67376798、rs1801131、rs1801133和GSTT1整个基因缺失的多态性进行检测，具有成本低、结果判读简单，各SNP位点检测结果之间无干扰等特点。
采用该试剂盒进行检测的方法如下：
(1)使用上述核酸组中的扩增引物对样品进行PCR扩增，得到第一扩增产物；
PCR扩增体系如下：
试剂 体积(μL) 终浓度
ddH<sub>2</sub>O 0.8 n/a
10x PCR buffer 0.5 1x
MgCl<sub>2</sub> 0.4 2mM
dNTP Mix 0.1 500μM
Primer Mix 1.0 1μM
PCR Enzyme 0.2 0.2U/μL
DNA样品 2.0 10-20ng
total 5.0 n/a
注：1.本发明中所有检测用试剂均购自Agena Bioscience(基纳生物技术(上海)有限公司)，下同；
2.Primer Mix为所有扩增引物以1:1的浓度比例配置成的混合物，反应时所有引物的终浓度为1μM(即每条扩增引物的终浓度为1μM)；
3.n/a表示此项无意义。
PCR扩增程序如下：
(2)使用上述核酸组中的检测引物对经碱性磷酸酶处理后的第一扩增产物进行单碱基延伸反应，得到第二扩增产物；
单碱基延伸反应体系如下：
其中，IPLEX Primer Mix为所有检测引物的混合物，检测引物配置表(以配置100μL为例，余量用ddH2O补足至100μL)如下：
单碱基延伸反应程序如下：
(3)采用飞行时间质谱技术分析所述第二扩增产物的多态性。
根据检测引物及其第二扩增产物的分子量大小的峰位置可确定SNP位点的基因型，见表4。
实施例2
采用实施例1的试剂盒和方法，对已知SNP位点基因型的6份样品(均来自临床，样品类型为全血或口腔拭子)进行检测，结果如下表5-7所示。
表5
表6
表7
其中，表5-7中的已知结果为使用传统方法(片段分析，单碱基延伸和sanger测序)检测的样本结果统计，右侧检测结果为使用实施例1的核酸组检测的结果。结果显示使用实施例1的核酸组和检测方法的结果与传统方法结果一致。
实验例1
rs1800462位点前后存在众多SNP位点，在距离3个碱基范围内，存在有rs771921981和rs190484211共2个SNP位点，在10个碱基范围内则存在10个SNP位点，在20个碱基范围内有SNP位点16个。此外在rs1800462位点上游27bp处存在有一断片段缺失突变(ra750040431),极易导致样本扩增失败，同时亦有可能造成检测失败。此外，基因组中存在有假基因，极容易扩增得到非目的片段，故在引物设计中一般策略为扩增尽可能长的片段，再检测，易造成单一检测位点少，通量少(如测序分析、片段分析)；若降低扩增长度，易检测失败。这些原因说明本发明核酸组的各种引物的设计是需要付出创造性劳动的。
基于此，针对rs12248560位点，设计对照引物对1：
F(代表上游引物，下同):CCCTCTATTTAGTCATTTGAAA；
R(代表下游引物，下同):AAAACTTTTGTGGGGATATGG。
使用对照引物对1可得到扩增产物241bp。对产物进行质谱分析结果如图1所示。图中rs1800462代表检测引物，右侧标黑的C/G代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果中由于无产物峰，无法判断样本基因型。结果难以判断，分型失败。
而使用本发明实施例1提供的针对rs1800462位点的引物组合1的扩增引物对：
F:ACTCTAATATAACCCTCTA；
R:ACCAACTACACTGTGTCCCC。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图2所示。图中左侧rs1800462代表检测引物，右侧标黑的C/G代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果样本基因型为CC纯合。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例2
rs1800460位点前后3个碱基范围内存在有1个插入型SNP位点rs1419856318，该位点是设计rs1800460检测引物的主要难题，极大程度上会引起目标位点的检测假阳性与假阴性，而相距目标位点10个碱基范围内有SNP位点5个，有12个SNP位点在rs4986893位点前后20个碱基之间，其中包括一个高频突变位点rs2842934。
针对rs1800460位点，设计对照引物对2：
F:GGGACGCTGCTCATCTTCT；
R:TTCAAACTCATAGAAGTCTAAGCTGAT。
使用对照引物对2扩增可得到扩增产物242bp。对产物使用质谱分析的结果如图3所示。图中左侧rs1800460代表检测引物，右侧C/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示可能同时存在有3种基因型。结果存在假阳性，产物峰不明显，但又高于背景值，不易确定样本确切的基因型，因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs1800460位点的引物组合2的扩增引物对：
F:CTGGTAGGACAAATATTGGC；
R:ACTTACCATTTGCGATCACC。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图4所示。图中左侧rs1800460代表检测引物，右侧C/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示为C纯合基因型。结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例3
rs1142345位点的相连碱基均是已知的SNP位点rs1333327023和rs1455177009，由于样本此处的多态性位点的碱基型未知，故在检测引物检测时极易由于最关键的3端末尾碱基无法形成配对而导致检测失败，此外在相距目标位点20个碱基范围内还含有10个SNP位点。
针对rs1142345位点，设计对照引物对3：
F:GAATCCCTGATGTCATTCTTCA；
R:CATTACATTTTCAGGCTTTAGCA。
使用对照引物对3扩增可得到扩增产物248bp。对产物使用质谱分析的结果如图5所示。图中左侧rs1142345代表检测引物，右侧C/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示检测失败。结果检测失败，因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs1142345位点的引物组合3的扩增引物对：
F:CAAAAACATGTCAGTGTGAT；
R:TAAAAGTTGGGGAATTGACTG。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图6所示。图中左侧rs1142345代表检测引物，右侧C/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示为T纯合基因型。结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例4
rs116855232位点前后3个碱基范围内有rs1199238822、rs1026010382、rs147390019和rs1436122860共4个点突变SNP位点，rs749170586和rs770524351共2个插入型SNP位点，在检测引物检测时极易由于最关键的3端末尾碱基无法形成配对而导致检测失败。而在距离rs1057910位点10个碱基范围内有SNP位点12个，同时包含4个插入型SNP位点。在20个碱基之内有17个SNP位点。
针对rs116855232位点，设计对照引物对4：
F:TGGGTTCCTTGGGAAGAACTA
R:ATCCCACCAGA TGGTTCAGAT。
使用对照引物对4扩增可得到扩增产物112bp。对产物使用质谱分析的结果如图7所示。图中左侧rs116855232代表检测引物，右侧C/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示检测失败。结果检测失败，因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs116855232位点的引物组合4的扩增引物对：
F:AAGAACTACCTCCCCTGGAC；
R:TATCCCACCAGATGGTTCAG。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图8所示。图中左侧rs116855232代表检测引物，右侧C/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示为C纯合基因型。结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例5
rs11615位点的相连碱基是已知的SNP位点rs749201799，且在相距10个碱基范围内有10个SNP位点，由于样本此处的多态性位点多且相应的碱基型未知，故在检测引物检测时极易由于最关键的3端末尾碱基无法形成配对而导致检测失败，此外在相距目标位点20个碱基范围内还含有19个SNP位点。
针对rs11615位点，设计对照引物对5：
F:AGGACCACAGGACACGCAGA；
R:CATAGAACAGTCCAGAACAC。
使用对照引物对5扩增可得到扩增产物525bp。对产物使用质谱分析的结果如图9所示。图中rs11615代表检测引物，右侧标黑的G/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果中由于检测引物还有大量存在，产物峰与背景值极为接近，存在假阳性可能，无法判断样本基因型。结果存在假阳性，产物峰低，扩增效率差。因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs11615位点的引物组合6的扩增引物对：
F:AATCCCGTACTGAAGTTCGT；
R:ACCTGAGGAACAGGGCACA。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图10所示。图中左侧rs11615代表检测引物，右侧标黑的G/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果样本基因型为GG纯合。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例6
rs13181位点处在缺失突变的rs1255854032中，若发生缺失突变则无法检测目的基因位点，此外rs13181相连碱基均为SNP位点，前者为rs781762321，后为rs201248108，极大程度上会引起目标位点的检测失败，此外相距3个碱基范围之内还有SNP位点如rs1182084610和rs1226085679，而相距目标位点10个碱基范围内有SNP位点14个，其中缺失突变的位点4个，有26个SNP位点在rs4986893位点前后20个碱基之间，其中缺失突变的位点6个。
针对rs13181位点，设计对照引物对6：
F:TCAAACATCCTGTCCCTACT
R:CTGCGATTAAAGGCTGTGGA。
使用对照引物对6扩增可得到扩增产物344bp。对产物使用质谱分析的结果如图11所示。图中左侧rs13181代表检测引物，右侧G/T/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果中无产物峰生成，无法判断样本基因型。
结果产物峰低，扩增效率差。因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs13181位点的引物组合7的扩增引物对：
F:AGCAGCTAGAATCAGAGGAG
R:CACCAGGAACCGTTTATGGC。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图12所示。图中左侧rs13181代表检测引物，右侧G/T/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示为TT纯合基因型。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例7
针对GSTT1基因的缺失，设计对照引物对7：
F:TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC；
R:TCACCGGATCATGGCCAGCA。
使用对照引物对7扩增可得到扩增产物480bp。对产物使用质谱分析的结果如图13所示。图中左侧GSTT1代表检测引物，右侧*0代表缺失突变，*1代表野生型，根据峰的有无可判定成多种不同基因型，如图所示结果显检测引物峰有大量剩余，产物峰不明显，不能确定样本基因型。
结果分型失败，无产物峰，说明扩增效率差。因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对GSTT1的引物组合9的扩增引物对：
F:TTGTGTCACTCAGCGTTGTG；
R:TCCCAGCCAATTGTTCAAGC。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图14所示。图中左侧GSTT1代表检测引物，右侧*0代表缺失突变，*1代表野生型，根据峰的有无可判定成不同基因型，如图所示结果显示为野生型。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例8
rs1801133位点前后3个碱基范围内有rs150847674、rs776956662和rs1057519362共3个SNP位点，在距离rs1801133位点10个碱基范围内有SNP位点9个，在20个碱基之内有17个SNP位点,，由于有多达3个高频率的插入缺失和4个高频率的点突变位点，对目的基因的检测极易造成检测失败。
针对rs1801133位点，设计对照引物对8：
F:CCTTGAACAGGTGGAGGCC；
R:CAAAGAAAAGCTGCGTGAT。
使用对照引物对8扩增可得到扩增产物158bp。对产物使用质谱分析的结果如图15所示。图中rs1801133代表检测引物，右侧标黑的G/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果中由于产物峰与背景值极为接近，存在假阳性可能，无法判断样本基因型。
结果存在假阳性，产物峰低，扩增效率差。因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs13181位点的引物组合15的扩增引物对：
F:GTGCATGCCTTCACAAAGCG；
R:CACTTGAAGGAGAAGGTGTC。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图16所示。图中左侧rs1801133代表检测引物，右侧标黑的G/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果样本基因型为GA杂合。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例9
rs1801265位点的相连碱基均是已知的SNP位点rs528768620和rs1397008025，且在相距10个碱基范围内有10个SNP位点，由于样本此处的多态性位点多且相应的碱基型未知，故在检测引物检测时极易由于最关键的3端末尾碱基无法形成配对而导致检测失败，此外在相距目标位点20个碱基范围内还含有16个SNP位点。
针对rs1801265位点，设计对照引物对9：
F:GTCTAATTTCTTGGCCGAAG；
R:GTCTTTAGAGTATCCTGGC。
使用对照引物对9扩增可得到扩增产物80bp。对产物使用质谱分析的结果如图17所示。图中左侧rs1801265代表检测引物，右侧G/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果中由于产物峰与背景值极为接近，存在假阳性可能，无法判断样本基因型。结果存在假阳性，产物峰低，扩增效率差。因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs1801265位点的引物组合12的扩增引物对：
F:CTTGTCTAATTTCTTGGCCG；
R:ATCCTGGCTTTAAATCCTCG。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图18所示。图中左侧rs1801265代表检测引物，右侧G/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示为AA纯合基因型。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例10
rs55886062位点前2个碱基中存在有1个高频率突变的SNP位点rs1057516968，该位点是设计rs55886062检测引物的主要难题，极大程度上会引起目标位点的检测失败，此外相距3个碱基范围之内还有SNP位点如rs201615754和rs1314015254，而相距目标位点10个碱基范围内有SNP位点11个，有17个SNP位点在rs4986893位点前后20个碱基之间，其中目前已有研究报道的高频次位点有11个。
针对rs13181位点，设计对照引物对10：
F:GAGAAAGTTTTGGTGAGGGC；
R:TGGTCTTGCTAGCGCAACTC。
使用对照引物对10扩增可得到扩增产物92bp。对产物使用质谱分析的结果如图19所示。图中左侧rs55886062代表检测引物，右侧T/C/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成多种不同基因型，如图所示结果显检测引物峰有大量剩余，产物A峰不明显，与背景值差异不大，不能确定样本基因型。
结果存在假阳性，产物峰低，说明扩增效率差。因此使用此引物检测该位点结果不准确。
而使用本发明实施例1提供的针对rs55886062位点的引物组合11的扩增引物对：
F:TCCTTTTGGTCTTGCTAGCG；
R:CAAAACCCCATCCAGCTTCA。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图20所示。图中左侧rs55886062代表检测引物，右侧T/C/A代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示为AA纯合基因型。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
实验例11
rs1801131位点的周围10个碱基中存在有2个高频率突变的SNP位点rs149533586和rs765619217，该两个位点是设计rs55886062检测引物的主要难题，极大程度上会引起目标位点的检测失败，此外相距20个碱基范围之内还有SNP位点16个，其中有一长片段缺失突变(rs1334349459)，该位点的存在是设计目的基因扩增引物的困难所在，可能导致目的基因检测的假阳性的产生。
针对rs1801131位点，设计对照引物对11：
F:GCAAGTCCCCCAAGGAGG；
R:GGTCCCCACTTCCAGCATC。
使用对照引物对11扩增可得到扩增产物145bp。对产物使用质谱分析的结果如图21所示。图中左侧rs1801131代表检测引物，右侧G/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示检测失败。根据质谱结果中最左边引物峰的有无(高度)来判断第一轮扩增用的引物是否有效：有较高的引物峰且没有产物峰则表明基因扩增失败，即扩增引物不可用。本实验例中检测引物表3中的rs1801131-E无扩增即表明基因扩增失败，因此使用此引物不能用于检测该位点。
而使用本发明实施例1提供的针对rs1801131位点的引物组合14的扩增引物对：
F:AGAGCAAGTCCCCCAAGGAG；
R:TCTCCCGAGAGGTAAAGAAC。
进行扩增，对产物进行质谱分析结果如图22所示。图中左侧rs1801131代表检测引物，右侧G/T代表检测产物，根据峰的有无可判定成3种不同基因型，如图所示结果显示为T纯合基因型。
结果显示检测结果较好，基因分型清晰，无假阳性产物生成。表示使用此引物检测该位点，可以成功分型。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域医学检验集团股份有限公司 广州金域医学检验中心有限公司
<120> 适于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组以及应用
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actctaatat aaccctcta 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accaactaca ctgtgtcccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggtaggac aaatattggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acttaccatt tgcgatcacc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaaaacatg tcagtgtgat 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taaaagttgg ggaattgact g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aagaactacc tcccctggac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tatcccacca gatggttcag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atcgtgcgta aggagtgggt 20
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caggataagg agcagggttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aatcccgtac tgaagttcgt 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acctgaggaa cagggcaca 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agcagctaga atcagaggag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caccaggaac cgtttatggc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggtggacat ggtgaatgac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tggtgcagat gctcacatag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttgtgtcact cagcgttgtg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcccagccaa ttgttcaagc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aacattcacc aacttatgcc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcactgaact aaaggctgac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tccttttggt cttgctagcg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
caaaacccca tccagcttca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cttgtctaat ttcttggccg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atcctggctt taaatcctcg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcaacgtaga gcaagttgtg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cttacctggt agccagaatc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agagcaagtc ccccaaggag 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tctcccgaga ggtaaagaac 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gtgcatgcct tcacaaagcg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cacttgaagg agaaggtgtc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ggtgtatgat tttatgcagg ttt 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gtgacatgat ttgggataga gga 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tcatttactt ttctgtaagt aga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gcttttctgg ggactg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gggcggctgc cctccc 16
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cccgaagttc gtgcgcaa 18
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gggagagaat cagaggagac gctg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cctccgctgc aaatac 16
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aaggtgagag tagtgacaga g 21
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggttttagat gttaaatcac actta 25
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gcatccacca gcacatcaat ga 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aattgcttgg ccgaagtgga ac 22
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
aagttgtggc tatgattg 18
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ctcggagctg accagtgaag 20
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cccccctgcg tgatgatgaa atcg 24

Claims (9)

1.一种适于肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的核酸组，其特征在于，其包括引物组合1-引物组合15中的一种或多种的组合；
其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1-2所示的扩增引物和SEQ ID NO.31所示的检测引物；
引物组合2包括：SEQ ID NO.3-4所示的扩增引物和SEQ ID NO.32所示的检测引物；
引物组合3包括：SEQ ID NO.5-6所示的扩增引物和SEQ ID NO.33所示的检测引物；
引物组合4包括：SEQ ID NO.7-8所示的扩增引物和SEQ ID NO.34所示的检测引物；
引物组合5包括：SEQ ID NO.9-10所示的扩增引物和SEQ ID NO.35所示的检测引物；
引物组合6包括：SEQ ID NO.11-12所示的扩增引物和SEQ ID NO.36所示的检测引物；
引物组合7包括：SEQ ID NO.13-14所示的扩增引物和SEQ ID NO.37所示的检测引物；
引物组合8包括：SEQ ID NO.15-16所示的扩增引物和SEQ ID NO.38所示的检测引物；
引物组合9包括：SEQ ID NO.17-18所示的扩增引物和SEQ ID NO.39所示的检测引物；
引物组合10包括：SEQ ID NO.19-20所示的扩增引物和SEQ ID NO.40所示的检测引物；
引物组合11包括：SEQ ID NO.21-22所示的扩增引物和SEQ ID NO.41所示的检测引物；
引物组合12包括：SEQ ID NO.23-24所示的扩增引物和SEQ ID NO.42所示的检测引物；
引物组合13包括：SEQ ID NO.25-26所示的扩增引物和SEQ ID NO.43所示的检测引物；
引物组合14包括：SEQ ID NO.27-28所示的扩增引物和SEQ ID NO.44所示的检测引物；
引物组合15包括：SEQ ID NO.29-30所示的扩增引物和SEQ ID NO.45所示的检测引物。
2.一种肿瘤类药物相关基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的核酸组。
3.权利要求1所述的核酸组在检测肿瘤类药物相关基因SNP位点中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)使用所述核酸组中的扩增引物对样品进行PCR扩增，得到第一扩增产物；
(2)使用所述核酸组中的检测引物对经碱性磷酸酶处理后的第一扩增产物进行单碱基延伸反应，得到第二扩增产物；
(3)采用飞行时间质谱技术分析所述第二扩增产物的多态性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，进行PCR扩增的体系含有：引物组合1-引物组合15的扩增引物、Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，进行PCR扩增的程序的退火温度为：55-57℃。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述扩增引物在体系中的浓度为0.8-1.2μM。
7.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，进行单碱基延伸反应的体系含有：引物组合1-引物组合15的检测引物和第一扩增产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测引物在单碱基延伸反应的体系中的总浓度为13-15μM。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，引物组合1-引物组合15的各检测引物在单碱基延伸反应的体系中的浓度分别为：1.052μM、1.063μM、1.036μM、0.681μM、0.664μM、0.790μM、1.125μM、0.653μM、0.976μM、1.125μM、0.983μM、1.005μM、0.808μM、0.907μM以及1.078μM。
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