CN112501357A - 一种基于rpa-lfd法检测丙肝病毒的rpa引物及其应用 - Google Patents

一种基于rpa-lfd法检测丙肝病毒的rpa引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及基于RPA‑LFD法检测丙肝病毒的RPA引物、胶体金侧流层析试纸条及其应用。所述基于RPA‑LFD法检测丙肝病毒的RPA引物由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成，RPA试剂包括上述RPA引物；试纸条包括上述RPA引物或RPA试剂；应用于检测丙肝病毒的方法为先用上述RPA引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，然后将该产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析是否为丙肝病毒。本发明针对丙肝病毒的RNA序列通过逆转录所得cDNA设计特异性扩增引物，并基于该引物建立了丙肝病毒的RPA检测方法，可对丙肝病毒进行定性检测。基于该引物建立的丙肝病毒的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义。

Description

一种基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物及其应用，具体涉及基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物、胶体金侧流层析试纸条及其应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是由包膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)丙型肝炎病毒属(Hepacivivirus)。丙型肝炎病毒感染呈全球性分布的特点，是引起人类肝脏疾病的主要疾病之一。人感染丙肝病毒后，重要的特征是感染易于慢性化，急性期后易于发展成慢性肝炎，部分感染者可进一步发展成为肝硬化或肝癌。目前认为HCV的致病机制包括对肝细胞的直接损害、宿主的免疫病理损伤以及细胞凋亡导致的肝细胞破坏三个方面，严重者可导致急性重型肝炎或肝癌。中国是HCV病毒感染大国，国家卫健委网站近日发布《2020年10月全国法定传染病疫情概况》，数据显示，2020年10月(2020年10月1日0时至10月31日24时)，全国丙型肝炎病毒发病数为20067例，其准确的病原学诊断是治疗的关键。
目前，检测丙肝病毒的方法主要有：酶联免疫吸附法(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)等。国内外已有很多利用ELISA方法检测丙肝病毒的报道，该方法灵敏度高，操作简单，但所需检测时间也在1～2天，而且抗体制备周期长，费用较高灵敏度不及FQ-PCR。利用分子生物学技术开展病原学诊断是近年来新兴的检测技术手段，已建立的HBV病毒FQ-PCR探针杂交检测等方法，该技术从传统PCR技术发展而来，其基本原理相同，主要不同之处是在PCR反应体系中加入了有特定波长的荧光染料或荧光基团，借助荧光信号的积累来判断样品中特定核酸的情况。但该方法所需时间较长，费用较高，且对实验室设备环境要求高，不具备基层快速诊断的能力。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一种新型的恒温核酸扩增技术。其主要原理为模仿T4噬菌体内的核酸复制机制，依赖重组酶uvsX和单链结合蛋白Gp32在体外恒温条件下实现DNA模板的特异性识别与结合，并通过链置换DNA聚合酶Bsu实现模板DNA的扩增。该技术可在23-45℃下连续进行反应，反应时间只需5-20min，特异性强，灵敏度高，且无需相对严苛的实验室条件，其产品具备进行基层快速诊断的能力。配合发展较成熟的胶体金侧流层析法检测扩增产物，能有效规避现有检测技术的弊端，具有很大的推广前景。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物、胶体金侧流层析试纸条及其应用。本发明提供的基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，适用范围广；基于该引物建立的丙肝病毒的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物，该引物由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成，其核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGTGGCAGAGGAGGATGAGCGGGAGGT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-CCAAGGCAGTAGATAGGGTTGATTCGGTGAGGAC-3’(SEQ ID NO.2)；
所述上游引物的5’端采用FAM进行标记，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记。
一种检测丙肝病毒的RPA试剂，包括上述RPA引物。
一种检测丙肝病毒的试剂盒，包括上述RPA引物或上述RPA试剂，以及试纸条。
进一步地，上述引物或上述试剂或上述试剂盒的新用途如下。
(1)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测丙肝病毒中的应用。
(2)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测丙肝病毒的产品中的应用。
(3)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否感染丙肝病毒中的应用。
(4)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品是否感染丙肝病毒的产品中的应用。
(5)上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在检测丙肝病毒中的应用。
(6)上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在制备检测丙肝病毒的产品中的应用。
一种检测丙肝病毒的方法，包括如下步骤。
步骤1、用上述RPA引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物。
步骤2、将步骤1中所得的RPA扩增产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析待测病毒是否为丙肝病毒，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为丙肝病毒；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有丙肝病毒。
进一步地，步骤1中所述RPA扩增的模板为待测病毒的RNA逆转录所得的cDNA。
进一步地，步骤1具体步骤如下：1)收集体液样本；2)利用ThermoFisher PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit试剂盒，提取病毒RNA，具体操作按操作说明进行；3)利用逆转录试剂盒将提取的病毒RNA逆转录成cDNA，具体操作按操作说明进行；4)应用RAP技术检测HBV特异序列：选取合适的片段设计RPA技术的上、下游引物；5)在ATP的参与下，重组酶uvsX与上游引物或下游引物相结合，形成重组酶引物复合体；复合体与基因模板上的引物同源靶序列相识别，RNA-DNA复合体解链，发生RNA聚合酶链置换反应，形成D形结构；6)单链结合蛋白Gp32与被置换的单链结合，防止单链被进一步替换；7)反应体系中加入核酸外切酶IV即nfo、nfo探针和反向引物；核酸外切酶IV识别并断开nfo的THF位点，启动延伸过程，形成FAM与生物素的双标记产物；8)重组酶uvsX离开引物3’端，链置换DNA聚合酶Bsu与引物的3’端结合启动链延伸形成互补链，最终形成完整的扩增子，形成的扩增子作为新的模板进行复制，实现目的片段的指数型扩增；9)在25℃-43℃的恒温条件下，10分钟内可有效扩增目的片段并进行检测判型。
进一步地，所述RPA扩增的温度为37℃。
进一步地，上述方法应用于检测或辅助检测丙肝病毒。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
本发明针对丙肝病毒的RNA序列，通过逆转录所得cDNA，设计特异性扩增引物，并基于该引物建立了丙肝病毒的RPA检测方法，可对丙肝病毒进行定性检测。本发明提供的检测方法将RPA技术用于丙肝病毒的检测与鉴定中，同时利用胶体金测流层析法将检测结果进行可视化呈现。保证了在非实验室条件下病毒的精准、简便、高效检测，为丙肝病毒的防控提供新思路。
本发明提供的丙肝病毒的RPA检测方法具备如下优点：1)仅需个别引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；2)本发明只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；3)反应时间仅需5-20min；4)结果易于判断；5)检测灵敏度高，可检测到唾液样本中提取的丙肝病毒DNA；6)操作简便，不需要严苛的实验室条件，便与基层普及应用。
本发明提供的RPA扩增引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，适用范围广；基于该引物建立的丙肝病毒的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义。
附图说明
图1是RPA扩增产物快速检测胶体金侧流层析试纸的结构示意图。
图2是检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明详细说明，下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明要求保护的范围。
下述实施例中的丙型肝炎病毒RNA来源为体液样本，为中国医科大学附属盛京医院提供。下述实施例中采用英国TwistDx Inc公司的
Figure BDA0002851994210000041
nfo试剂盒进行RPA扩增反应，采用Milenia公司的HybriDetect 1lateral flow strips胶体金侧流层析试纸检测结果。
实施例1RPA引物的设计。
针对丙肝病毒的保守序列，设计检测丙肝病毒的RPA引物组，产物大小为257bp，该引物由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQID NO.2所示的单链DNA分子组成，其核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGTGGCAGAGGAGGATGAGCGGGAGGT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-CCAAGGCAGTAGATAGGGTTGATTCGGTGAGGAC-3’(SEQ ID NO.2)；
所述上游引物的5’端采用FAM进行标记，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记。
实施例2检测丙肝病毒的方法。
一种检测丙肝病毒的方法，包括如下步骤。
步骤1、用实例1中RPA引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，具体操作步骤如下。
1)收集体液样本。2)利用ThermoFisher Pure Link Viral RNA/DNA Mini Kit试剂盒，提取病毒RNA，具体操作按操作说明进行。3)利用逆转录试剂盒将提取的病毒RNA逆转录成cDNA，具体操作按操作说明进行。4)应用RAP技术检测HBV特异序列：选取合适的片段设计RPA技术的上、下游引物。5)在ATP的参与下，重组酶uvsX与上游引物或下游引物相结合，形成重组酶引物复合体。复合体与基因模板上的引物同源靶序列相识别，RNA-DNA复合体解链，发生RNA聚合酶链置换反应，形成D形结构。6)单链结合蛋白Gp32与被置换的单链结合，防止单链被进一步替换。7)反应体系中加入核酸外切酶IV(endonuclease IV，即nfo)、nfo探针(含有THF位点，5’端有FAM荧光基团，3’端带有阻断物)和反向引物(本实验中为标记生物素)。核酸外切酶IV识别并断开nfo的THF位点，启动延伸过程，形成FAM与生物素的双标记产物。8)重组酶uvsX离开引物3’端，链置换DNA聚合酶Bsu与引物的3’端结合启动链延伸形成互补链，最终形成完整的扩增子，形成的扩增子作为新的模板进行复制，实现目的片段的指数型扩增。9)在25℃-43℃的恒温条件下，10分钟内可有效扩增目的片段并进行检测判型。
步骤2、将步骤1中所得的RPA扩增产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析待测病毒是否为丙肝病毒，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为丙肝病毒；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有丙肝病毒。
胶体金侧流层析技术体系：RPA扩增产物检测试纸条采用了双抗原夹心技术。它的基本原理如下：胶体金标结合垫(简称金标结合垫)经过了抗FAM抗体－胶体金复合体处理，在侧流层析垫(由硝酸纤维素膜构成)下游的检测区内，分别喷划了一条含有亲和素的检测线和一条含有FAM荧光基团的质控线，如图1所示。当样品加至样品垫上的样品孔后，样品液体将在层析力的作用下流到金标结合垫上，样品中的FAM基团先与金标结合垫上的抗FAM抗体－胶体金复合物反应形成复合体。在层析力作用下，该复合体就会沿侧流层析垫向下游移动，到达检测区时与检测线上的亲和素形成免疫复合物，通过富集效应呈现出肉眼可见的红色条带；未与FAM基团结合的游离的抗FAM抗体－胶体金复合物则继续移动，在对照区与FAM荧光基团结合，富集后呈现另一条红色质控线。出现两条阳性带则表示样品中有RPA扩增产物存在，判为阳性。若为阴性样品，则检测区的检测线不显红色，仅有一条红色的质控线，如图2所示。
实施例3用于检测丙肝病毒的RPA试剂盒及其使用方法。
1、用于检测丙肝病毒的RPA试剂及胶体金侧流层析试纸条。
用于检测丙肝病毒的RPA试剂包括实施例1中设计的引物、阳性对照质粒、RPA冻干真空包装组分(含重组酶uvsX、单链结合蛋白Gp32、核酸外切酶IV、nfo探针、链置换DNA聚合酶Bsu、生物素)、水化缓冲液、醋酸镁(初始浓度为280mM)、dNTP、模板DNA及无核酸酶纯水。胶体金侧流层析试纸条包括纳米金颗粒、吸水样品垫、金标结合垫及侧流层析垫。
2、用于检测丙肝病毒的RPA试剂盒的使用方法。
(1)实验组设置：以待测样品的cDNA为模板，采用设计的RPA引物进行扩增，得到扩增产物。其RPA扩增体系的配制方法为：将水化缓冲液29.5μl，醋酸镁(初始浓度为280mM)2.5μl，上游引物和下游引物(终浓度为0.48μmol/L)各2μl，模板DNA 2μl，dNTP 2μl，水化稀释至5pmol/μl的RPA冻干真空包装组分0.5μl，无核酸酶纯水9.5μl进行混合。RPA扩增反应条件：先将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应20min，得到RPA扩增产物；再取20μl扩增产物，与80μl分析溶液混匀后滴加于试纸条加样区，室温孵育5min，观察条带。
(2)阳性对照组设置：将步骤(1)中的RPA引物替换成阳性对照质粒，其余步骤不变。
(3)阴性对照组设置：将步骤(1)中的RPA引物替换成阳性对照质粒，其余步骤不变。
结果如图2所示，阳性对照及丙肝病毒扩增后产物滴加在试纸条上，有两条清晰条带，而阴性对照只有一条质控带。由此，即可知检测判定规则为：若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为丙肝病毒；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有丙肝病毒。
由上述内容可知，本发明提供的用于检测和/或辅助检测丙肝病毒的引物、试剂及试剂盒可以有效检测丙肝病毒。
序列表
<110> 许晏铭
<120> 一种基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TGTGGCAGAG GAGGATGAGC GGGAGGT 27
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CCAAGGCAGT AGATAGGGTT GATTCGGTGA GGAC 34

Claims (10)

1.一种基于RPA-LFD法检测丙肝病毒的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- TGTGGCAGAGGAGGATGAGCGGGAGGT-3’(SEQ ID NO .1)；
下游引物：5’- CCAAGGCAGTAGATAGGGTTGATTCGGTGAGGAC-3’(SEQ ID NO .2)；
所述上游引物的5’端采用FAM进行标记，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记。
2.一种检测丙肝病毒的RPA试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物。
3.一种检测丙肝病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂，以及试纸条。
4.权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求所述的试剂盒在检测或辅助检测丙肝病毒中的应用；
或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测丙肝病毒的产品中的应用。
5.权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否感染丙肝病毒中的应用；
或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求所3述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品是否感染丙肝病毒的产品中的应用；
或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求所3述的试剂盒在检测丙肝病毒中的应用；
或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2或所述的RPA试剂或权利要求3所述的试剂盒在制备检测丙肝病毒的产品中的应用。
6.一种检测丙肝病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、用上述RPA引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物； 步骤2、将步骤1中所得的RPA扩增产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析待测病毒是否为丙肝病毒，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为丙肝病毒；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有丙肝病毒。
7.根据权利要求6所述的检测丙肝病毒的方法，其特征在于：步骤1中所述RPA扩增的模板为待测病毒的RNA 逆转录所得的 cDNA。
8.如权利要求6或7所述的检测丙肝病毒的方法，其特征在于，步骤1具体步骤如下：1）收集体液样本；2）利用 ThermoFisher Pure Link Viral RNA/DNA Mini Kit试剂盒，提取病毒RNA，具体操作按操作说明进行；3）利用逆转录试剂盒将提取的病毒 RNA 逆转录成cDNA，具体操作按操作说明进行；4）应用RAP技术检测HBV特异序列：选取合适的片段设计RPA技术的上、下游引物；5）在ATP的参与下，重组酶uvsX与上游引物或下游引物相结合，形成重组酶引物复合体；复合体与基因模板上的引物同源靶序列相识别，RNA-DNA复合体解链，发生RNA聚合酶链置换反应，形成D形结构；6）单链结合蛋白Gp32与被置换的单链结合，防止单链被进一步替换；7）反应体系中加入核酸外切酶IV即 nfo、nfo探针和反向引物；核酸外切酶IV识别并断开nfo的THF位点，启动延伸过程，形成FAM与生物素的双标记产物；8）重组酶uvsX离开引物3’端，链置换DNA聚合酶Bsu与引物的3’端结合启动链延伸形成互补链，最终形成完整的扩增子，形成的扩增子作为新的模板进行复制，实现目的片段的指数型扩增；9）在25℃-43℃的恒温条件下，10分钟内可有效扩增目的片段并进行检测判型。
9.根据权利要求6-8所述的任一检测丙肝病毒的方法，其特征在于，所述RPA扩增的温度为37℃。
10.权利要求6所述的检测丙肝病毒的方法在检测或辅助检测丙肝病毒中的应用。
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