CN109762935A - 一种检测侵染当归jhmv病毒的ic-rt-lamp试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒JHMV的IC‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法。试剂盒主要包括JHMV抗体IgG、RT反向引物JHMV‑R、LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；本发明特异性强，灵敏度达到了0.28 pg/mL，比普通PCR高100倍，且无需提取RNA，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，为日本金鱼藻花叶病毒的检测提供了新的技术平台，可用于监控中药材当归JHMV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

Description

一种检测侵染当归JHMV病毒的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测 方法

技术领域

本发明涉及一种特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。

背景技术

当归（Angelica sinensis），别名岷当归、干归、马尾当归、马尾归、云归、西当归、金当归、土当归，属伞形科多年生草本植物。当归常以根入药，具补血、活血、止痛、润肠之功效；含基本内酯(ligusiilide)、正丁烯酞内酯(n-butylidene phthalide)、阿魏酸、维生素B12、维生素E、烟酸、蔗糖和多种氨基酸，以及倍半萜类化合物等。由于成份独特，其药用价值很高，有“十方九归”之说，除补血、活血、调经止痛、润燥通便外，还有镇静大脑、护肤、减少色素沉积、抗辐射和调节非特异性免疫功能的作用，对冠心病、脉管炎、脑血管病及白细胞减少有显著疗效，对肿瘤疾病有较好的防治作用。欧洲医学界称其为“中国的妇科人参”，已受到国际上医学界重视。对当归多糖的研究结果表明，当归多糖可以通过诱导造血微环境的成纤维细胞分泌某些造血生长因子，从而促进造血组细胞增殖分化。

当归在国内多省均有分布，如云南、贵州、四川、甘肃和青海等地，特别是甘肃省岷县当归种植历史悠久，品质极佳，产量第一，素有“中国当归之乡”和“千里药乡”之称。目前国家已在甘肃岷县建立了优质当归生产基地，当归种植已成为当地的支柱产业，种植面积逐年扩大。

随着人工种植规模和地域的不断扩大，病害对当归生产的影响日益突出。如麻口病、根腐病，其主要致病原因为真菌和线虫。病毒病也时有发生，主要危害叶片，发病初期，仅上部叶片现轻微花叶，后逐渐出现不规则的黄绿疱斑花叶，且叶片略变硬变脆，部分叶片叶缘呈不规则锯齿状，有少数叶片变细呈蕨叶状，部分叶片正常，但叶面产生疱状，叶面稍现畸形。目前已报到的侵染当归的主要病毒是日本金鱼藻花叶病毒（Japanese hornwortmosaic virus，JHMV）。

JHMV为马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，病毒粒子为弯曲线状，长度在700-900nm之间，JHMV 外壳蛋白（CP）基因由795nt的核苷酸组成，翻译264氨基酸，分子量大小约为30kDa。当前防治当归病毒病首先依靠准确的病毒检测、病株移除以及无毒种苗生产等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此JHMV的检测对于当归病毒病的防治具有重要的意义。

目前，针对当归JHMV的检测方法主要有电镜技术和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），但这两种技术都存在一些缺陷。

传统的电镜技术能直接观察病毒生物大分子的亚基单位，适用于一些未知病毒，以及难以提纯的病毒材料的观察检测等，但由于病毒颗粒易于降解常常影响正确诊断，并且电镜设备昂贵，难以普及，故电镜技术的应用大大受到限制，一般只能用于研究。

RT-PCR方法检测特异性强、灵敏度高，但与本发明相比，需要提取高质量的RNA，操作复杂，所需试剂昂贵，对检测人员的技术水平要求高，除此之外，还必须依赖PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备，推广普及应用受到很大限制。

DNA环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上多个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。

与常规检测的PCR方法相比，LAMP技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。

本发明将免疫捕获IC与LAMP技术有机结合，成功建立了IC-RT-LAMP技术特异检测日本金鱼藻花叶病毒的方法。

IC-RT-LAMP结合了血清学和LAMP两种方法的优点，不用提取RNA，操作简便、特异性强、灵敏度达到了0.28 pg/mL，比普通PCR高100倍、且检测成本低、不需要PCR仪等分子生物学仪器设备，在恒温水浴中（如水浴锅）即能完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接观测，非常适合当归等中药材的病毒检测，为JHMV病毒的高效防治提供可靠的技术依据。

发明内容

发明目的：针对现有技术中日本金鱼藻花叶病毒JHMV检测方法操作复杂、对操作人员技术水平要求高、所需仪器设备昂贵的问题，本发明的目的是提供一种侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒JHMV的IC-RT-LAMP特异性检测引物组合物；本发明的另一目的是提供上述日本金鱼藻花叶病毒JHMV的IC-RT-LAMP检测试剂盒；本发明的另一目的是提供上述日本金鱼藻花叶病毒JHMV的IC-RT-LAMP检测方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP检测引物组合物：由RT反向引物JHMV-R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：

JHMV-R：5’-TTGTCGGAATGTGGGTGA-3’；

F3：5’- GATTATGAATATGAGCCACCTC -3’；

B3：5’- CCGTTTATATTTGGGGAGGT -3’；

FIP：5’- ACCATCGAGCAAACTGATTCTGATAACCCAGAGCAGACAGAT -3’；

BIP：5’- TCGACGGCATCAAAGGAGATTATTTCAATGCACCACACGAC -3’；

LF：5’- TGTTGCTCTTGTGTTGGCTAG -3’；

LB：5’- GGTCTGAATGATGCGGAAATGG -3’。

所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物在检测日本金鱼藻花叶病毒中的应用。

一种特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒，包括JHMV抗体IgG、RT反向引物JHMV-R、LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，其中特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，上述特异性RT反向引物JHMV-R以及LAMP引物组的序列如下：

JHMV-R：5’-TTGTCGGAATGTGGGTGA -3’；

F3：5’- GATTATGAATATGAGCCACCTC -3’；

B3：5’- CCGTTTATATTTGGGGAGGT -3’；

FIP：5’- ACCATCGAGCAAACTGATTCTGATAACCCAGAGCAGACAGAT -3’；

BIP：5’- TCGACGGCATCAAAGGAGATTATTTCAATGCACCACACGAC -3’；

LF：5’- TGTTGCTCTTGTGTTGGCTAG -3’；

LB：5’- GGTCTGAATGATGCGGAAATGG -3’。

除此之外，所述第一链cDNA合成试剂由10mM dNTPs、 5×M-MLV 反应缓冲液、30U/μL RNase抑制剂、200U /μL M-MLV反转录酶和DEPC-H2O 组成；所述LAMP扩增反应试剂由10mM dNTPs、10×Thermpopol反应缓冲液、100mM MgSO4、8U/μL Bst DNA polymerase和ddH2O组成。

本发明的试剂盒还包括JHMV抗体IgG包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。其中，所述抗体包被缓冲液CB为碳酸盐缓冲液，其浓度为0.05M，PH为9.6；所述磷酸缓冲液（PBS）和磷酸洗涤缓冲液（PBST）的浓度为0.02M，PH值为7.4；所述荧光染料检测液为1000×SYBR Green I；所述阴性对照品为ddH2O；所述阳性对照品为当归 JHMV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：

当归JHMV CP基因标准品：

CGCCAAAGAAGGATAAAGGGAAGGGACCTGAATCCTCGAACACACAAGATGACAATCAGTTGGCGCAAGCAAGCAAAGACAGAGATATTGATATGGGCACTAGTGGCACATTTGCTGTACCTAGATACAAGATTTTTAAATCCAAATTGAGGTTCCCAATGGTTAGGGGCAGGAAGATTATGAATATGAGCCACCTCGCACAATATAACCCAGAGCAGACAGATCTAGCCAACACAAGAGCAACACAGAATCAGTTTGCTCGATGGTTCGACGGCATCAAAGGAGATTATGGTCTGAATGATGCGGAAATGGACGTCATGTTGAATGGGCTTGTCGTGTGGTGCATTGAAAATGGAACCTCCCCAAATATAAACGGATTGTGGACTATGATGGATGGAGAGGAACAAGTTGAGTATCCAATTAAACCATTAATAGATCATGCGTCACCCACATTCCGACAA。

所述的特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒在检测日本金鱼藻花叶病毒中的应用。

一种特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP检测方法：包括以下步骤：

步骤①抗体制备：纯化JHMV病毒粒子，用其免疫动物，获得特异性的JHMV抗体IgG；

步骤②免疫捕获IC：将步骤①获得的特异性的JHMV抗体IgG包被在反应容器中，捕获待测样品中的JHMV粒子；

步骤③反转录RT：以步骤②捕获的JHMV粒子为模板，利用JHMV的RT反向引物JHMV-R和第一链cDNA合成试剂进行反转录RT反应获得第一链cDNA；

步骤④LAMP扩增：以步骤③得到的第一链cDNA作为模板，用LAMP特异性引物组和LAMP扩增反应试剂进行LAMP扩增；并以ddH2O作为阴性对照，以当归JHMV CP基因标准品作为阳性对照；

步骤⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得LAMP扩增反应产物判断待测样品中是否含有日本金鱼藻花叶病毒。

其中：步骤①所述JHMV抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体，可以自制或从商业途径获得。

步骤④所述LAMP扩增的反应体系（以反应体系12.5μL为例）如下：50ng cDNA 0.5μL、10×Thermpopol buffer 1.25μL、100mM MgSO₄ 0.75μL、10mM dNTPs 1.75μL、10 μM B3和F3 Primer 各0.25μL、 10μM FIP 和BIP Primer 各2.0μL、10 μM LF和LB Primer各0.5μL、8U/μL Bst DNA polymerase 0.5μL、和ddH₂O 补至12.5μL。

步骤④所述LAMP扩增的反应条件为：60-70℃恒温水浴中扩增60-100 min，随后80℃变性10 min，终止反应。

步骤⑤所述根据扩增结果判断病毒粒子是否为日本金鱼藻花叶病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法或琼脂糖凝胶电泳检测技术。

其中荧光染料肉眼观察法为：取SYBR Green I 荧光染料反应液加入步骤④所述LAMP扩增的反应产物中，采用肉眼直接观察，若扩增产物出现绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有JHMV；若扩增产物颜色为橙色则为阴性反应，表示样品中不含JHMV。

其中琼脂糖凝胶电泳检测技术为：将步骤④所述LAMP扩增的产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，若凝胶中存在明亮的弥散阶梯状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有JHMV；若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含JHMV。

本发明IC-RT-LAMP方法的检测对象是完整的病毒粒子，通过固相化的特异抗体捕获特定的病原物抗原，再利用病原物基因组序列特异的引物进行扩增，通过对扩增产物的检测和分析达到对完整病原物的检测。IC-RT-LAMP检测方法将血清学方法和分子生物学方法有机地结合起来，特异性强，灵敏度达到了0.28 pg/mL，比普通PCR高100倍，且无需提取RNA，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：

（1）操作方便：本发明提供的特异性检测日本金鱼藻花叶病毒的IC-RT-LAMP方法克服了现有技术中日本金鱼藻花叶病毒的生物学检测方法繁琐，费时费力及PCR检测技术需要提取RNA，还需要热循环仪器，无法快速检测日本金鱼藻花叶病毒的问题。本发明将血清学和LAMP扩增技术有机地结合，充分发挥两种检测方法的优越性，直接以捕获的JHMV病毒粒子作为检测对象进行RT-LAMP扩增，避免了RNA抽提，降低了实验难度；

（2）准确性高：本发明利用高质量的JHMV抗体IgG捕获待测样品中的JHMV粒子，提高了检测的特异性，减少了假阳性。LAMP反应通过6条引物（F3、B3、FIP、BIP、LF、LB）特异性识别靶基因（JHMV CP）的8个序列，特异性强，灵敏度比普通PCR高100倍；

（3）适用性好：本发明摆脱了对热循环仪器的依赖，LAMP反应只需在恒温水浴中就可以发生，极大的扩展了该方法的使用范围。反应结束后可通过颜色变化用肉眼可以直接判断结果，使检测结果更直观，从而增加了检测的应用价值；

（4）本发明为当归病毒病检测提供了新的技术平台，可用于日本金鱼藻花叶病毒的高灵敏度快速检测，也能够用于监控JHMV病毒的发生、扩散和流行，非常适合在基层推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例IC-RT-LAMP检测日本金鱼藻花叶病毒的特异性显色图；图中：1：阴性对照；2-6分别对应：LSV感病组织；CMV感病组织；LMoV感病组织；ArMV感病组织；当归JHMV感病组织；

图2为本发明实施例电泳分析IC-RT-LAMP检测日本金鱼藻花叶病毒的特异性；图中：M：600bp Marker；1：阴性对照；2-6分别对应：LSV感病组织；CMV感病组织；LMoV感病组织；ArMV感病组织；当归JHMV感病组织；

图3为本发明实施例日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP反应温度优化试验结果的电泳检测图；图中：M： 600bp Marker；1：阴性对照；2-8分别对应：56℃；58℃；60℃；62℃；65℃；68℃；70℃；

图4为本发明实施例日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP反应时间优化试验结果的电泳检测图；图中：M： 600bp Marker；1：阴性对照；2-6分别对应：20 min；40 min；60 min；80 min；100 min；

图5为本发明实施例IC-RT-LAMP检测日本金鱼藻花叶病毒的灵敏性显色图；图中：1：阴性对照； 2-8分别对应JHMV CP基因标准品浓度：原倍（2.8×105 ng/mL）；10-1（2.8×104ng/mL）；10-3（2.8×102 ng/mL）；10-5（2.8 ×100 ng/mL）；10-7（2.8×10-2 ng/mL）；10-9（2.8×10-4 ng/mL）；10-10（2.8×10-5 ng/mL）；

图6为本发明实施例电泳分析IC-RT-LAMP检测日本金鱼藻花叶病毒的灵敏性；图中：M：600bp Marker；1：阴性对照；2-8分别对应JHMV CP基因标准品浓度：原倍（2.8×105 ng/mL）；10-1 （2.8×104 ng/mL）；10-3 （2.8×102 ng/mL）；10-5（2.8 ×100 ng/mL）；10-7（2.8×10-2 ng/mL）；10-9（2.8×10-4 ng/mL）；10-10（2.8×10-5 ng/mL）；

图7为本发明实施例电泳分析RT-PCR检测日本金鱼藻花叶病毒的灵敏性；图中：M：600bp Marker；1：阴性对照；2-7分别对应JHMV CP基因标准品浓度：原倍（2.8×105 ng/mL）；10-1（2.8×104 ng/mL）；10-3（2.8×102 ng/mL）；10-5（2.8 ×100 ng/mL）；10-7（2.8×10-2 ng/mL）；10-8（2.8×10-3 ng/mL）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1 ：阳性对照品的获得

1、总RNA的提取

将50-100mg感染JHMV的岷县当归叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒提取感病组织的总RNA ；

2、引物设计与合成

根据GenBank上登录的当归JHMV CP基因序列（GenBank登录号：EF157843）设计并合成了1对特异性正向（JHMV-F）和反向引物（JHMV-R）；其中上述引物序列如下：

JHMV-F：5’- CGCCAAAGAAGGATAAAGG -3’

JHMV-R：5’- TTGTCGGAATGTGGGTGA -3’；

3、阳性对照品的制备

1）RT反应

利用当归JHMV反向引物JHMV-R和 M-MLV反转录酶进行RT反应，合成cDNA第一链；

10μL RT反应体系如下: 总RNA 2μL，10μM JHMV特异性反向引物JHMV-R 1μL，DEPC-H₂O3μL，70℃变性10 min，迅速置冰上急冷2 min；再加入5×M-MLV buffer 2μL，10mM dNTPs 1μL，30U/μL RNase抑制剂0.34μL，200U /μL M-MLV反转录酶0.35μL和DEPC-H₂O 0.31μL；混合后42℃水浴1h，70℃保温15 min，置冰上待用；

2）PCR反应

利用上述cDNA第一链为模板，在Ex Taq DNA聚合酶作用下进行JHMV CP基因的PCR扩增；

PCR反应体系为12.5μL，包括：50ng cDNA 0.5μL， 5 U/μL Ex Taq DNA聚合酶0. 1μL，10×PCR buffer 1.25μL，2.5mM dNTPs 1μL，10μM正向引物JHMV-F 0.25μL，10μM 反向引物JHMV-R 0.25μL，和ddH2O 9.15 μL；

PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；94℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，循环扩增30次，最后72℃延伸10 min；

PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，利用克隆载体试剂盒将目的片段连接在pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄LB培养基上，37℃摇菌12～16h；使用质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取2µL质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增；将PCR检测得到的阳性重组质粒测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为标准品，当归JHMV CP基因对应的片段长度分别为461 bp；用NanoDrop ND-1000 核酸/蛋白分析仪测定标准品的OD260 nm和OD280nm值，根据OD260nm和OD280nm值计算质粒浓度；

4、结果：

经测序，上述设计的标准品与预期完全相符，回收的标准品片段序列如下：

当归JHMV CP基因标准品序列：

CGCCAAAGAAGGATAAAGGGAAGGGACCTGAATCCTCGAACACACAAGATGACAATCAGTTGGCGCAAGCAAGCAAAGACAGAGATATTGATATGGGCACTAGTGGCACATTTGCTGTACCTAGATACAAGATTTTTAAATCCAAATTGAGGTTCCCAATGGTTAGGGGCAGGAAGATTATGAATATGAGCCACCTCGCACAATATAACCCAGAGCAGACAGATCTAGCCAACACAAGAGCAACACAGAATCAGTTTGCTCGATGGTTCGACGGCATCAAAGGAGATTATGGTCTGAATGATGCGGAAATGGACGTCATGTTGAATGGGCTTGTCGTGTGGTGCATTGAAAATGGAACCTCCCCAAATATAAACGGATTGTGGACTATGATGGATGGAGAGGAACAAGTTGAGTATCCAATTAAACCATTAATAGATCATGCGTCACCCACATTCCGACAA。

实施例2：一种用于特异性检测当归JHMV的IC-RT-LAMP检测试剂盒

该试剂盒由JHMV抗体IgG、抗体包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、RT反向引物JHMV-R、LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品组成，其中特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，上述特异性RT反向引物JHMV-R以及LAMP引物组的序列如下：

JHMV-R：5’-ATAAGCTTGATGGCGCGAACACCCAT-3’；

F3：5’- GATTATGAATATGAGCCACCTC -3’；

B3：5’- CCGTTTATATTTGGGGAGGT -3’；

FIP：5’- ACCATCGAGCAAACTGATTCTGATAACCCAGAGCAGACAGAT -3’；

BIP：5’- TCGACGGCATCAAAGGAGATTATTTCAATGCACCACACGAC -3’；

LF：5’- TGTTGCTCTTGTGTTGGCTAG -3’；

LB：5’- GGTCTGAATGATGCGGAAATGG -3’；

第一链cDNA合成试剂由10mM dNTPs、5×M-MLV 反应缓冲液、30U/μL RNase抑制剂、200U /μL M-MLV反转录酶和DEPC-H₂O 组成；

LAMP扩增反应试剂由10mM dNTPs、10×Thermpopol反应缓冲液、100mM MgSO4、8U/μLBst DNA polymerase和ddH2O组成；

抗体包被缓冲液CB为碳酸盐缓冲液，其浓度为0.05M，PH为9.6；所述磷酸缓冲液（PBS）和磷酸洗涤缓冲液（PBST）的浓度为0.02M，PH值为7.4；

所述荧光染料检测液为1000×SYBR Green I；所述阴性对照品为ddH2O；所述阳性对照品为当归 JHMV CP基因标准品。

实施例3：免疫捕获IC-RT-LAMP检测当归JHMV方法的建立

1、本发明中兔抗JHMV多克隆抗体IgG的制备方法：

1）JHMV病毒粒子的纯化：取50g冰冻的JHMV感病当归叶片，加200mL 0.5M，PH7.0的含0.1% β-巯基乙醇和0.01M EDTA的磷酸钾缓冲液，在冰冻研钵中研磨至匀浆，4层纱布过滤，取滤液；向滤液中加入200mL氯仿，搅拌15 min；5000g离心15 min，保留上清，弃沉淀；向上清液中加入7.5% PEG 6000（W/V）和4% 氯化钠（W/V）搅拌溶解静置30 min；8000g离心20min；保留沉淀，重悬于0.5M，PH7.0的含0.1%β-巯基乙醇，0.01M EDTA和2%Triton X-100的磷酸钾缓冲液中，4℃过夜；10000g离心20 min，保留上清；加入6%PEG 6000（W/V）和3%氯化钠（W/V）搅拌溶解静置30 min；8000g离心20 min；保留沉淀，重悬于0.5M，PH7.0的含0.1%β-巯基乙醇，0.01M EDTA和2%Triton X-100的磷酸钾缓冲液中搅拌20 min；10000g离心20min，保留上清；25000g 4℃离心，3h；保留沉淀，将沉淀重悬于0.5M，PH7.0的含0.1%β-巯基乙醇和0.01 M EDTA的磷酸钾缓冲液中搅拌1h；5000g离心10 min，取上清液经RT-PCR验证，,确定为JHMV病毒粒子后用于免疫实验；

2）多克隆抗体IgG的制备：用上述纯化的1mg/mL JHMV病毒粒子作为免疫原免疫新西兰大白兔；

初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；两周后进行加强免疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；以后每两周加强免疫一次，在第4次加强免疫后的5～7 d颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02%的叠氮钠，-20℃保存；所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化而获得兔抗JHMV多克隆抗体IgG；

2、免疫捕获IC：

1）取100mg感染JHMV的当归组织，加1mL PBS研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000 rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；

2）用0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液将JHMV多克隆抗体IgG稀释后混合，使JHMV抗体IgG的终浓度为5μg/mL；取100μL上述稀释的JHMV多克隆抗体 IgG加入0.2mL PCR管中，37℃孵育2h；

3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3 min; 加入100μL上述感病组织粗提液，37℃孵育2h；

4）弃去感病组织粗提液，用 PBST洗3次，ddH2O洗1次，短暂离心，吸去残液；

3、RT反应：

1) 在上述免疫捕获PCR管中加入浓度为10 μM的JHMV特异性反向引物JHMV-R 1μL，DEPC-H2O 4μL，混合后于70℃保温10 min，之后迅速冰浴2 min；

2）向上述PCR管中加入5×M-MLV buffer 2μL、10mM dNTPs 1μL、30U/μL RNase抑制剂0.34μL、200U /μL M-MLV反转录酶0.35μL、DEPC-H₂O 补足至10μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到cDNA第一链用于后续LAMP扩增；

4、LAMP扩增反应：

取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行LAMP扩增，反应体系为12.5μL，包括50ngcDNA 0.5 μL、10×Thermpopol buffer 1.25μL、100mM MgSO₄ 0.75μL、10mM dNTPs 1.75μL、 10 μM B3 和 F3 Primer 各0.25μL、10 μM FIP 和 BIP Primer 各2.0μL、10 μM LF和LB Primer各0.5μL、8U/μL Bst DNA polymerase 0.5μL、ddH₂O 2.25μL；并以ddH₂O作为阴性对照，以当归JHMV CP基因标准品作为阳性对照；

LAMP的反应条件为: 60-70℃扩增60-100 min，随后80℃变性10 min，终止反应；

5、分析判断反应产物：

LAMP反应结束后，在PCR管内侧加 1μL 1000× SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管，上下颠倒混匀，采用肉眼直接观察PCR管内混合液的颜色变化：

若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有JHMV；

若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含JHMV；

或者，结果的观察也可以采用琼脂糖凝胶电泳检测技术：取5μL LAMP反应产物进行2.0% 琼脂糖凝胶电泳，在1×TAE缓冲液环境中，100V稳压电泳30 min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果：

若凝胶中存在明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有JHMV；

若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含JHMV。

实施例4：免疫捕获IC-RT-LAMP检测当归JHMV的特异性

为了分析免疫捕获IC-RT-LAMP检测当归JHMV的特异性，以感染百合、和当归的5个主要病毒（百合隐症病毒-LSV、百合黄瓜花叶病毒-CMV、百合斑驳病毒-LMoV、南芥菜花叶病毒-ArMV和日本金鱼藻花叶病毒-JHMV）的感病叶片为样品，分别用JHMV多克隆抗体IgG捕获病毒粒子，用上述实施例中的IC-RT-LAMP检测体系进行反应。以健康当归叶片为阴性对照，实验重复3次；

SYBR Green I荧光染料肉眼观察法结果显示，只有感染JHMV的当归叶片的扩增产物出现绿色，其余感病叶片的扩增产物与健康当归叶片的扩增产物均为橙色（图1）；琼脂糖凝胶电泳结果也证实，除了感染JHMV的当归叶片能够扩增出弥散状核酸泳带外，其余样品均没有扩增出核酸泳带（图2）。这表明本发明建立的IC-RT-LAMP方法对JHMV病毒有很高的特异性。

实施例5：免疫捕获IC-RT-LAMP检测当归JHMV的灵敏性

为了分析免疫捕获IC-RT-LAMP检测当归JHMV的灵敏性，以上述实施例1中当归JHMV CP基因标准品为样品，经NanoDrop ND-1000 核酸/蛋白分析仪测定其标准品浓度（2.8×105ng/mL）后，再用DEPC-H2O对上述标准品进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各稀释液1.0μL作为模板，加入上述实施例中的LAMP反应试剂进行LAMP扩增，反应程序为65℃扩增100 min；

作为对比检测，将上述10倍比稀释后的各稀释液利用上述实施例1中的PCR反应进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；94℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸1min，循环扩增30次，最后72℃延伸10 min；

LAMP和PCR反应结束后，分别取5μL扩增产物上样，SYBR Green I荧光染料肉眼观察法和琼脂糖凝胶电泳结果显示LAMP对当归JHMV CP基因标准品的反应灵敏度为2.8×10-4ng/mL， 即0.28 pg/mL (图5-图6），PCR对当归JHMV CP基因标准品的反应的灵敏度为2.8×10-2 ng/mL，即28 pg/mL (图7），可见免疫捕获IC-RT-LAMP检测JHMV的灵敏性是普通PCR的100倍。

实施例6：当归田间样品中JHMV的免疫捕获IC-RT-LAMP检测

取田间当归叶片样品，用JHMV多克隆抗体IgG捕获病毒粒子，再用上述实施例中的IC-RT-LAMP检测体系进行RT反应合成cDNA再进行LAMP扩增；若荧光染料肉眼观察法显示橙色，或琼脂糖凝胶电泳扩增出弥散状核酸泳带，说明样品中含有日本金鱼藻花叶病毒；若荧光染料肉眼观察法显示绿色，或琼脂糖凝胶电泳没有扩增出弥散状核酸泳带，说明样品中没有感染日本金鱼藻花叶病毒。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包括一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所

<120> 一种检测侵染当归JHMV病毒的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法

<130> 2019

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttgtcggaat gtgggtga 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gattatgaat atgagccacc tc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccgtttatat ttggggaggt 20

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

accatcgagc aaactgattc tgataaccca gagcagacag at 42

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tcgacggcat caaaggagat tatttcaatg caccacacga c 41

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgttgctctt gtgttggcta g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ggtctgaatg atgcggaaat gg 22

<210> 8

<211> 461

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cgccaaagaa ggataaaggg aagggacctg aatcctcgaa cacacaagat gacaatcagt 60

tggcgcaagc aagcaaagac agagatattg atatgggcac tagtggcaca tttgctgtac 120

ctagatacaa gatttttaaa tccaaattga ggttcccaat ggttaggggc aggaagatta 180

tgaatatgag ccacctcgca caatataacc cagagcagac agatctagcc aacacaagag 240

caacacagaa tcagtttgct cgatggttcg acggcatcaa aggagattat ggtctgaatg 300

atgcggaaat ggacgtcatg ttgaatgggc ttgtcgtgtg gtgcattgaa aatggaacct 360

ccccaaatat aaacggattg tggactatga tggatggaga ggaacaagtt gagtatccaa 420

ttaaaccatt aatagatcat gcgtcaccca cattccgaca a 461

Claims (8)

1.一种用于特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP检测引物组合物，其特征在于：由RT反向引物JHMV-R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：

JHMV-R：5’-TTGTCGGAATGTGGGTGA-3’；

F3：5’- GATTATGAATATGAGCCACCTC -3’；

B3：5’- CCGTTTATATTTGGGGAGGT -3’；

FIP：5’- ACCATCGAGCAAACTGATTCTGATAACCCAGAGCAGACAGAT -3’；

BIP：5’- TCGACGGCATCAAAGGAGATTATTTCAATGCACCACACGAC -3’；

LF：5’- TGTTGCTCTTGTGTTGGCTAG -3’；

LB：5’- GGTCTGAATGATGCGGAAATGG -3’。

2.权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物在检测日本金鱼藻花叶病毒中的应用。

3.一种采用如权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒的IC-RT-LAMP试剂盒，所述试剂盒由JHMV抗体IgG、权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂组成；

其特征在于：所述试剂盒还包括JHMV抗体IgG包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBR Green I荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品为ddH₂O；所述阳性对照品为当归 JHMV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：

当归JHMV CP基因标准品：

CGCCAAAGAAGGATAAAGGGAAGGGACCTGAATCCTCGAACACACAAGATGACAATCAGTTGGCGCAAGCAAGCAAAGACAGAGATATTGATATGGGCACTAGTGGCACATTTGCTGTACCTAGATACAAGATTTTTAAATCCAAATTGAGGTTCCCAATGGTTAGGGGCAGGAAGATTATGAATATGAGCCACCTCGCACAATATAACCCAGAGCAGACAGATCTAGCCAACACAAGAGCAACACAGAATCAGTTTGCTCGATGGTTCGACGGCATCAAAGGAGATTATGGTCTGAATGATGCGGAAATGGACGTCATGTTGAATGGGCTTGTCGTGTGGTGCATTGAAAATGGAACCTCCCCAAATATAAACGGATTGTGGACTATGATGGATGGAGAGGAACAAGTTGAGTATCCAATTAAACCATTAATAGATCATGCGTCACCCACATTCCGACAA。

4.权利要求3所述的特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒在检测日本金鱼藻花叶病毒中的应用。

5.一种采用如权利要求3所述的IC-RT-LAMP试剂盒特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

①抗体制备：纯化JHMV病毒粒子，用其免疫动物，获得特异性的JHMV抗体IgG；

②免疫捕获IC：将步骤①获得的特异性的JHMV抗体IgG包被在反应容器中，捕获待测样品中的JHMV粒子；

③反转录RT：以步骤②捕获的JHMV粒子为模板，利用JHMV的RT反向引物JHMV-R和第一链cDNA合成试剂进行反转录RT反应获得第一链cDNA；

④LAMP扩增：以步骤③得到的第一链cDNA作为模板，用LAMP特异性引物组和LAMP扩增反应试剂进行LAMP扩增；并以ddH₂O作为阴性对照，以当归JHMV CP基因标准品作为阳性对照；

⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得LAMP扩增反应产物判断待测样品是否含有日本金鱼藻花叶病毒。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤①所述JHMV抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品是否含有JHMV的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：取SYBRGreen I 荧光染料反应液加入步骤④所述LAMP扩增的反应产物中，采用肉眼直接观察，若扩增产物出现绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有JHMV；若扩增产物颜色为橙色则为阴性反应，表示样品中不含JHMV；所述JHMV为日本金鱼藻花叶病毒。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品是否含有JHMV的具体方法也可采用琼脂糖凝胶电泳检测技术；所述琼脂糖凝胶电泳检测技术为：将步骤④所述LAMP扩增的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有JHMV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含JHMV；所述JHMV为日本金鱼藻花叶病毒。