CN107586871A - 转基因玉米HiII‑NGc‑1的外源插入片段的右边界侧翼序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转基因玉米HiII‑NGc‑1外源插入片段的右边界侧翼序列、其应用、引物对、试剂盒及其使用方法。所述右边界侧翼序列能够特异性地指示转基因玉米HiII‑NGc‑1，所述引物对、试剂盒及其使用方法基于所述右边界侧翼序列能够快速、准确地检测待测样品是否为转基因玉米HiII‑NGc‑1，对提高转基因玉米HiII‑NGc‑1的鉴定效率、转基因产品的管理与检测以及种质资源的鉴定具有重要的意义。

Description

转基因玉米HiII-NGc-1的外源插入片段的右边界侧翼序列

技术领域

本发明涉及转基因玉米领域，具体而言，涉及转基因玉米HiII-NGc-1的外源插入片段的右边界侧翼序列。

背景技术

近年来，我国玉米种植面积稳步增加。随着玉米种植面积的增大，玉米螟在北方春玉米区发生偏重到大。2014年，我国玉米种植面积达到5.53亿亩，玉米螟发生面积为3.53亿亩次，发生区域主要集中在东北、华北、黄淮海地区。我国每年因虫害损失玉米3000万吨以上。由于虫害的严重性，使玉米品种的丰产性不能正常发挥，导致产量降低，农药使用量的逐渐增加，土壤残留严重等生态问题也日益凸显。

培育抗虫玉米品种是解决这一问题最优的有效途径。这种途径已经提供了一种对抗选择性害虫的有效手段，并且表达杀虫毒素的转基因植物已经商业化了，使得农民减少应用化学杀虫剂。抗除草剂玉米可以大幅度降低防治杂草所需要的农业劳动力，降低劳动力投入，减少杂草对玉米产量的影响。培育抗虫抗除草剂玉米对能有效解决我省虫害严重的影响、有效减少农药的使用量，维持生态平衡。

转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转入到植物体内可以得到多个转化事件，每个转化事件是独特的。不同转化事件受外源基因在染色质的结构或前后调节原件不同的影响。相同基因在不同转化事件中的分子、蛋白表达水平具有很大的差异。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。每个转化事件由于插入植物基因组的位点不同而具有独特性，利用插入的异源DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列和插入的异源DNA的片段进行特异性PCR可有效区分转化事件。

cryNGc基因是由吉林省农业科学院自主研发的抗虫基因，bar基因为抗除草剂基因。转基因玉米HiII-NGc-1是通过外源转化事件转入cryNGc和bar基因的转基因玉米，表现出稳定的世代遗传性、高抗虫性和优良的耐除草剂草铵膦强等性状，具有广泛的应用前景。因此，将转基因玉米HiII-NGc-1与非转基因玉米或其他转基因玉米区分的方法对于评价所述转基因玉米的价值和进一步推广应用具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供转基因玉米HiII-NGc-1的右边界侧翼序列，所述右边界侧翼序列为转基因玉米HiII-NGc-1所特有，能够特异性地鉴定所述转基因玉米。

本发明的第二目的在于提供上述右边界侧翼序列在检测转基因玉米HiII-NGc-1中的应用，所述应用基于所述右边界侧翼序列可以快速、准确的判断待测样品是否为转基因玉米HiII-NGc-1。

本发明的第三目的在于提供根据前述右边界侧翼序列设计的PCR引物对，所述引物对能够快速、准确地检测待测样品是否为转基因玉米HiII-NGc-1。

本发明的第四目的在于提供一种PCR检测试剂盒，所述试剂盒将前述引物和其他辅助检测试剂盒集成在一起，具有便于运输、可直接使用等优点。

本发明的第五目的在于提供前述引物对或前述适合的使用方法，通过所述方法可以快速、准确地检测待测样品是否为转基因玉米HiII-NGc-1。

为实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

转基因玉米HiII-NGc-1的外源插入片段的右边界侧翼序列，其核苷酸序列如SEQID NO：9所示。

本发明建立在吉林省农业科学院提供的抗虫抗除草剂转基因玉米HiII-NGc-1基础之上。所述转基因玉米具有稳定的世代遗传性、高抗虫性和优良的耐除草剂草铵膦强等性状，具有良好的应用前景和育种价值。但在本发明之前，尚无人知晓所述转基因玉米的外源插入片段的侧翼序列，因此，无法建立能够有效鉴定该转基因玉米的方法。

本发明精心设计巢式PCR引物GSP1和GSP2、用于检测的引物GSP3，并结合TdT末端加尾酶以及OligodC，通过锚定PCR、测序获得转基因玉米HiII-NGc-1的外源插入片段的右边界侧翼序列。

本发明所述右边界侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，其包括部分外源基因的序列以及所述外源插入片段右侧的玉米基因组序列，表明在玉米基因组的该处位置插入外源基因cryNGc和bar。只有转基因玉米HiII-NGc-1具有所述右边界侧翼序列，而外源基因cryNGc和bar的质粒载体、非转基因玉米、插入其他外源基因的转基因玉米或者在基因组的其他位置处插入外源基因cryNGc和bar的转基因玉米都不具备上述右边界侧翼序列。因此，基于该侧翼序列，可以特异性地检测待测样品是否源自转基因玉米HiII-NGc-1，在转基因玉米的检测以及种质资源的鉴定方面具有重要意义和广泛的应用前景。

本发明还提供所述右边界侧翼序列在检测转基因玉米HiII-NGc-1中的应用。

本发明所述应用基于上述右边界侧翼序列，可以通过分子生物学方法，例如PCR、分子杂交，对转基因玉米HiII-NGc-1进行特异性检测，具有操作简单、准确率高等优点。

在一些具体实施方式中，根据所述右边界侧翼序列设计用于检测所述转基因玉米的PCR引物或杂交探针。

本发明还提供根据所述右边界侧翼序列设计的PCR引物对，所述PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10所示。

本发明所述引物对分别设计在外源基因cryNGc和bar上，以及该外源基因插入位点右侧的玉米基因组上，只有以目标转基因玉米为模板才能通过所述引物对扩增获得855bp的目的产物，其他样本均无法扩增获得目标产物。因此，本发明所述PCR引物对能够用于特异性地检测转基因玉米HiII-NGc-1。另外，本发明所述引物对还具有特异性好、扩增效率高等优点。因此，本发明所述引物对对提高转基因材料的鉴定效率、转基因产品的管理与检测，以及种质资源的鉴定具有重要的意义。

本发明还提供一种PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物对，以及其他辅助检测试剂。

本发明上述试剂盒将上述引物对与PCR用到的其他辅助试剂集成在一起，具有便于运输、可直接使用的优点。

在一些具体的实施方式中，所述其他辅助检测试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

在一些具体的实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的一种或多种；优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；更优选地，所述TaqDNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。

在一些具体的实施方式中，所述其他辅助检测试剂包括PCR反应预混液，所述预混液为DNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液的混合物。

本发明还提供前述引物对或前述试剂盒的使用方法，所述方法包括：

(1)以待测玉米样品的DNA为模板，使用前述引物对或前述试剂盒中的引物对进行PCR扩增；

(2)根据PCR扩增产物判定所述待测玉米样品是否为转基因玉米HiII-NGc-1。

本发明上述使用方法通过简单的PCR方法即可检测样品是否为转基因玉米HiII-NGc-1，具有检测方便、特异性好、以及准确性好的优点。

在一些具体的实施方式中，所述PCR反应的退火温度为59～61℃，循环数为32～37次；优选地，所述退火温度为60℃，所述循环数为35次。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明涉及转基因玉米HiII-NGc-1，所述转基因玉米的世代遗传稳定高、抗虫和抗除草剂的性能好，表现出良好的农艺性状，具有广阔的应用前景。本发明首次获得基因玉米HiII-NGc-1的外源基因插入位点的右边界侧翼序列，并设计相应的PCR引物和建立特异性PCR检测方法，能够准确地检测待测样品是否来自基因玉米HiII-NGc-1，具有高灵敏度，高准确性，以及操作简单，市场前景广泛等优点，对提高转基因材料的鉴定效率、转基因产品的管理与检测以及种质资源的鉴定具有重要的意义。

(2)本发明上述引物对经精心设计和反复筛选方最终确定，分别设计在外源基因和其插入位点右侧的玉米基因组上，只有以转基因玉米HiII-NGc-1为模板才能扩增得到目的片段，其他模板均不能扩增获得目的片段，可容易地判断检测对象是否为基因玉米HiII-NGc-1。另外，本发明上述引物对还具有特异性和准确性好、检测效率高的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为转基因玉米HiII-NGc-1和非转基因玉米HiII的cryNGc基因扩增结果，其中，M：DL2000 DNA marker；1：阳性对照；2：非转基因玉米HiII；3：空白对照；4-18：转基因玉米HiII-NGc-1；

图2为转基因玉米HiII-NGc-1和非转基因玉米HiII的bar基因扩增结果，其中，M：DL2000 DNA marker；1：阳性对照；2：非转基因玉米HiII；3：空白对照；4-18：转基因玉米HiII-NGc-1；

图3为转基因玉米HiII-NGc-1的全长插入序列及右边界侧翼序列示意图；

图4为转基因玉米HiII-NGc-1的右边界侧翼序列特异性PCR检测，其中，M：DL2000DNA marker；1：质粒；2：非转基因玉米HiII；3：空白对照；4：HiII-NGc-1玉米T₂代材料；5：HiII-NGc-1玉米T₃代材料；6：HiII-NGc-1玉米T₄代材料；7：HiII-NGc-2玉米T₂代材料；8：HiII-NGc-3玉米T₂代材料；

图5为转基因玉米HiII-NGc-1的右边界侧翼序列灵敏度PCR检测结果。M：DL2000DNA marker；1：阴性对照；2：空白对照；3-7分别为含有100％，10％，1％，0.5％，0.1％，0.05％的HiII-NGc-1；

图6为外源片段在玉米基因组上具体插入位置，其插入在玉米第10号染色体上；

图7为玉米第10号染色体插入位点附近区域基因组功能分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

cryNGc基因：由吉林省农业科学院自主研发，授权专利号：ZL201510131077.7；

转基因玉米HiII-NGc-1：即参考文献1中记载的“抗虫抗除草剂玉米HiII-NGc-1，公众可从吉林省农业科学院获得。

玉米HiII-NGc-2：记载于参考文献2中的转化事件HG-2，公众可从吉林省农业科学院获得；

转基因玉米HiII-NGc-3：记载于参考文献2中的转化事件HG-3，公众可从吉林省农业科学院获得。

实施例1克隆转基因玉米HiII-NGc-1的侧翼序列

1、采用普通CTAB法提取玉米样品的基因组DNA，具体操作过程按农业部1485号公告-4-2010，转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化实施。其中，所述玉米样品包括待转基因玉米HiII-NGc-1和非转基因玉米HiII。

2、PCR扩增

检测转基因玉米HiII-NGc-1阳性材料和非转基因玉米HiII是否能够扩增得到cryNGc基因和bar基因：以玉米的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，分别扩增cryNGc基因(981bp大小)，bar基因(352bp大小)。其中，PCR扩增中使用的引物对如表1所示，PCR反应体系如表2所示，PCR反应程序如表3所示。

具体检测结果如图1～2所示。根据图1～2所示结果可知，转基因玉米HiII-NGc-1的基因组DNA均能够扩增得到cryNGc基因和bar基因，而非转基因玉米HiII不能扩增得到cryNGc基因和bar基因。

表1 PCR反应的引物对

引物名称	核苷酸序列	序列号
			cryNGc F	CGCCTTATTGGCAACTAC	SEQ ID NO：1
cryNGc R	CCTGCTACTACTGGACGAAA	SEQ ID NO：2
			bar F	CCGTGCCACCGAGGCGGACAT	SEQ ID No.3
bar R	CAGCCCGATGACAGCGACCAC	SEQ ID No.4

表2 PCR反应体系

2×EasyTaqPCR SuperMix	10μL
		引物对(10mmol/L)	各0.2μL
模板	1μL
		ddH2O	8.6μL
总体系	20μL

表3 PCR反应程序

3、采用锚定PCR方法克隆转基因玉米HiII-NGc-1的右侧翼序列

根据cryNGc基因已知序列设计两条巢式引物GSP1(外侧引物)和GSP2(内侧引物)，一条用于检测的引物GSP3(与GSP2搭配使用)，所述引物的具体核苷酸序列如表4所述。

表4扩增转基因玉米HiII-NGc-1右侧翼序列的引物

引物名称	核苷酸序列	序列号
			GSP1	CCTAAGACCATAGACCGTGGAGAGA	SEQ ID NO：5
GSP2	TCACCACTCCGTTCTCCTTCGTCTC	SEQ ID NO：6
			GSP3	TCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGT	SEQ ID No：7
OligodC	CCCCCCCCCCCCCCCC	SEQ ID No：8

以转基因玉米基因组DNA为模板，先用引物GSP1进行单引物扩增，扩增产物用TdT末端加尾酶在3’端加上一串鸟嘌呤(G)；以加尾产物为模板，GSP2和OligodC为引物进行巢式PCR扩增。PCR反应体系程序如表5～8所示。

表5 GSP单引物扩增PCR反应体系

表6 GSP单引物PCR反应程序

表7巢式PCR反应体系

10×LA PCR BufferII	5μL
		GSP2	2μL
Oligo dC	2μL
		dNTP Mixture	5μL
加尾产物	1μL
		LA Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH2O	34.5μL
		总体系	50μL

表8 PCR反应程序

4、胶回收、连接和转化

将巢式扩增产物切胶回收后与克隆载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，选取阳性克隆测序，分析测序结果，按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书，对酶切后获得的目的片段进行胶回收纯化。纯化后的DNA溶液在-20℃冰箱保存，用于下面的连接实验。

其中，DNA片段的连接体系如表9所示。将所述DNA连接体系充分混匀后，置于16℃金属浴中过夜连接，获得重组质粒。按照大肠杆菌感受态细胞DH5α的说明书对重组质粒进行大肠杆菌的热激转化。最后将转化的感受态细胞，均匀涂布于具有相应抗生素的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养。

表9 DNA片段的的连接体系

5、阳性克隆的筛选并测序

采用菌落PCR的方法筛选出阳性克隆。菌落PCR反应体系和反应程序分别如表10～11所示，其中，引物对分别为GSP2和GSP3。根据电泳检测结果，将阳性克隆菌株置于LB液体培养基中，摇菌后-20℃保存菌种，送去公司测序，测序结果为SEQ ID NO：9。

将测序结果与玉米基因组序列进行比对，结果表明，SEQ ID NO：9所示DNA片段的第1～6721位核苷酸序列为外源片段，包括bar基因和cryNGc基因，第6722～6906位核苷酸序列为玉米基因组序列。

生物信息学分析结果表明，HiII-NGc-1外源片段插入到玉米第10条染色体上的非编码重复序列区域，对基因编码区无影响，其中外源片段在染色体上的插入位置如图6所示，插入位点附近区域基因组功能分析如图7所示。

表10菌落PCR的反应体系

表11 PCR反应程序

实施例2设计检测转基因玉米HiII-NGc-1的右边界旁侧序列的引物对，并进行特异性检测

根据转基因玉米HiII-NGc-1的右边界侧翼序列中的玉米基因组DNA部分设计引物AP2，与GSP2搭配，以转基因玉米基因组DNA为模板进行PCR检测，PCR反应体系和反应程序同实施例1，目的条带大小为855bp。其中，AP2：GACGAAGGTGATGTTTGCCGAAGGT(SEQ ID No.10)。

选择转基因玉米HiII-NGc-1的、HiII-NGc-2、HiII-NGc-3，非转基因玉米HiII为模板。提取各材料基因组DNA，进行特异性PCR检测，PCR反应体系和反应程序同实施案例1。具体检测结果如图4所示，其中，抗虫抗除草剂玉米HiII-NGc-1的基因组DNA可以扩增获得目的片段，而其他的转基因玉米或非转基因玉米则无法扩增得到目的片段，表明引物对AP2和GSP2的特异性好。

实施例3特异性引物的灵敏度检测

提取转基因玉米HiII-NGc-1的基因组DNA，将HiII-NGc-1的DNA按照100％，10％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0％进行稀释(各百分数对应的DNA样品的具体浓度依次为100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.5ng/μl，0.1ng/μl，0.05ng/μl，0ng/μl)，作为灵敏度检测的模板使用。分别以如上系列拷贝数的基因组DNA样品作为模板，采用引物GSP2和AP2进行PCR扩增。反应体系和反应程序参照实施例1。实验同时设置以水代替模板DNA的阴性对照，具体检测结果如图5所示。

结果显示：采用引物GSP2和AP3进行PCR扩增，0.5％的基因组DNA样品(0.5ng/μl)即可扩增出大小为855bp的条带(如图5示)。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为855bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明855bp的目的条带确实如序列表中序列1的第6046-6900位所示。以上结果表明得到的引物GSP2和AP3具有较强的灵敏度。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献1：抗虫抗除草剂转基因玉米HiII-NGc-1的遗传稳定性分析，刘洋等，《生物技术进展》，2016年06期，第428～434页。

参考文献2：转cry1Ab/Gc基因玉米的不同转化事件Bt蛋白表达和抗虫性分析，《哈尔滨师范大学自然科学学报》，2016年03期，第87～92页。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林省农业科学院

<120> 转基因玉米HiII-NGc-1的外源插入片段的右边界侧翼序列

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgccttattg gcaactac 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgctacta ctggacgaaa 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgtgccacc gaggcggaca t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagcccgatg acagcgacca c 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctaagacca tagaccgtgg agaga 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcaccactcc gttctccttc gtctc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcctagtttg cgcgctatat tttgt 25

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccccccccc cccccc 16

<210> 9

<211> 6906

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg 60

cggacgtttt taatgtactg aattaacgcc gaattgctct agcattcgcc attcaggctg 120

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 180

gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 240

tgtaaaacga cggccagtgc caagctaatt cgcttcaaga cgtgctcaaa tcactatttc 300

cacaccccta tatttctatt gcactccctt ttaactgttt tttattacaa aaatgccctg 360

gaaaatgcac tccctttttg tgtttgtttt tttgtgaaac gatgttgtca ggtaatttat 420

ttgtcagtct actatggtgg cccattatat taatagcaac tgtcggtcca atagacgacg 480

tcgattttct gcatttgttt aaccacgtgg attttatgac attttatatt agttaatttg 540

taaaacctac ccaattaaag acctcatatg ttctaaagac taatacttaa tgataacaat 600

tttcttttag tgaagaaagg gataattagt aaatatggaa caagggcaga agatttatta 660

aagccgcgta agagacaaca agtaggtacg tggagtgtct taggtgactt acccacataa 720

cataaagtga cattaacaaa catagctaat gctcctattt gaatagtgca tatcagcata 780

ccttattaca tatagatagg agcaaactct agctagattg ttgagcagat ctcggtgacg 840

ggcaggaccg gacggggcgg taccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa acccacgtca 900

tgccagttcc cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cgcggggggc atatccgagc 960

gcctcgtgca tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac cacgctcttg 1020

aagccctgtg cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc cagtcccgtc 1080

cgctggtggc ggggggagac gtacacggtc gactcggccg tccagtcgta ggcgttgcgt 1140

gccttccagg ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc ggcgacgagc 1200

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tcggtacgga agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt tgacgatggt gcagaccgcc 1320

ggcatgtccg cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg gctcatggta 1380

gatcccccgt tcgtaaatgg tgaaaatttt cagaaaattg cttttgcttt aaaagaaatg 1440

atttaaattg ctgcaataga agtagaatgc ttgattgctt gagattcgtt tgttttgtat 1500

atgttgtgtt gagaattaat tctcgaggtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 1560

gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata 1620

tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc 1680

ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatagcc 1740

tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca 1800

ataaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt 1860

tgaaaagtct caattgccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt tttggagtag 1920

acaagtgtgt cgtgctccac catgttatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt 1980

ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg 2040

tcggcagagg catcttcaac gatggccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggag 2100

ccaccttcct tttccactat cttcacaata aagtgacaga tagctgggca atggaatccg 2160

aggaggtttc cggatattac cctttgttga aaagtctcaa ttgccctttg gtcttctgag 2220

actgtatctt tgatattttt ggagtagaca agtgtgtcgt gctccaccat gttgacctgc 2280

aggcatgcaa gcttgcatgc ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga 2340

taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg 2400

tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat 2460

aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac 2520

atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt 2580

gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt 2640

tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat tttttttagt 2700

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 2760

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 2820

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 2880

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cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 3000

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 3060

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 3120

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gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 3240

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cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg 3360

tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta 3420

gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg 3480

tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg 3540

attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc 3600

cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt 3660

ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattaa ttctgtttca aactacctgg 3720

tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga 3780

agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga 3840

tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt 3900

cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa 3960

ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa 4020

atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg 4080

gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa 4140

gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat 4200

atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt 4260

gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga ggatccaaca 4320

gccccgggat ggacaacaat ccgaacataa acgagtgcat tccgtacaac tgcctttcta 4380

accccgaggt tgaggttctt ggtggtgagc gtattgagac cggctacacc cccatcgaca 4440

tcagcctctc actcactcaa ttcttgctct ccgaatttgt gccaggtgca ggcttcgtgc 4500

tcggcctggt ggatattatc tgggggattt tcgggccctc gcaatgggac gcgttcctcg 4560

tgcagatcga gcaactcatc aatcagcgca tcgaggagtt cgcgagaaac caagcgatct 4620

ctaggttgga aggcttgtca aatttgtacc agatctacgc cgagtctttc cgggagtggg 4680

aagccgaccc caccaatcca gcgctcaggg aagaaatgcg gattcagttc aacgatatga 4740

atagcgccct gactacggcc attcctctct tcgcggtcca aaattatcag gttccacttt 4800

tgtccgttta cgtccaggca gctaacttgc acttgtctgt tctcagggac gtgtctgtgt 4860

ttgggcagag atggggattc gatgccgcga ccatcaactc acgctacaac gaccttactc 4920

gccttattgg caactacact gatcacgccg tcaggtggta caatacaggt cttgagcggg 4980

tctggggccc agatagtcgg gattggattc gctacaatca attcaggcgc gagctgaccc 5040

tgacggtcct cgacattgtg agtctctttc cgaactatga ttcccgcacc tacccgattc 5100

gcactgtgtc acaactgact agggagatct atactaatcc cgtgctggag aatttcgacg 5160

gatcttttag aggttccgcc caggggattg agggctcgat taggtcgcca cacctgatgg 5220

atatactcaa cagcatcaca atctacacag acgctcaccg cggagagtac tattggtcgg 5280

gtcaccagat catggcatcg ccagtggggt tctctggacc ggaatttact tttccattgt 5340

atgggacaat gggcaacgcc gctccacagc agagaatcgt ggcgcagctc ggacagggtg 5400

tctatcggac ccttagctcc actctttata gacggccgtt taacatcggc atcaataatc 5460

aacagctcag cgttctcgac ggaaccgagt ttgcttacgg aacgtcgtcc aatctgcctt 5520

ccgctgtcta ccggaagtcc gggaccgtgg actccttgga cgagatacct cctcagaata 5580

ataacgtgcc tcctcgccag ggattcagtc atcggctttc gcacgtgtct atgttccgca 5640

gcgggttctc aaattcctca gtgtccatta tccgcgctcc tatgttctcc tggattcacc 5700

gttcagccga gttcaataat atcatcgctt ccgattcagg atccattacg caactcccaa 5760

tggttaaagc acacactttg catgctggtg ccacggtggt taggggtccg ggtttcacag 5820

ggggagacat cctgcggcgc accacctcgg ggagcttcgg cgacatgagg atcacaaatt 5880

tttcgtccag tagtagcagg taccgggtcc gcattagata cgcttcaaca acggatcttc 5940

agttcttcct gaacgtcggc gggactccgg tcaacgtggc ggattttcct aagaccatag 6000

accgtggaga gaatcttgaa tatggcagct tccgcaccgc cggcttcacc actccgttct 6060

ccttcgtctc ctctactaac aattttacgc tcggcgtgca gtcagtgtct tccggcaacg 6120

agatcttcgt tgatagaatc gagtttgtgc ccgcggactg agagctcgaa tttccccgat 6180

cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 6240

attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 6300

acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 6360

atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 6420

ttactagatc gggaattcgt aatcatgtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 6480

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 6540

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 6600

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 6660

ggagcttgag cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttaaacta tcagtgtttg 6720

aagatcatta tgtcctaagg gaaataatgc ttcgaaggac gaagggtatt aacatttaac 6780

atcttgtgtt gtcttgttct taattcatag tatttaagaa caagtcccca acattggcgc 6840

ccacctctgg tgaactcact tccatttctt gagctttgaa caccttcggc aaacatcacc 6900

ttcgtc 6906

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacgaaggtg atgtttgccg aaggt 25

Claims (10)

1.转基因玉米HiII-NGc-1的外源插入片段的右边界侧翼序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

2.权利要求1所述右边界侧翼序列在检测转基因玉米HiII-NGc-1中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，根据权利要求1所述右边界侧翼序列设计用于检测所述转基因玉米的PCR引物或杂交探针。

4.根据权利要求1所述右边界侧翼序列设计的PCR引物对，其特征在于，所述PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10所示。

5.一种PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述引物对，以及其他辅助检测试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述其他辅助检测试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的一种或多种；优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；更优选地，所述Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述其他辅助检测试剂包括PCR反应预混液，所述预混液为DNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液的混合物。

9.权利要求4所述引物对或权利要求5～8任一项所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以待测玉米样品的DNA为模板，使用权利要求4所述引物对或权利要求5～8任一项所述试剂盒中的引物对进行PCR扩增；

(2)根据PCR扩增产物判定所述待测玉米样品是否为转基因玉米HiII-NGc-1。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的退火温度为59～61℃，循环数为32～37次；优选地，所述退火温度为60℃，所述循环数为35次。