CN104861074B - 融合杀虫蛋白Cry1Am、其编码基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型的融合杀虫蛋白Cry1Am及其编码基因，该融合杀虫蛋白对野生型和Cry1Ab/Cry1Ac抗性昆虫具有高杀虫活性，可以用于杀死亚洲玉米螟等鳞翅目害虫，提高转基因作物的杀虫能力。而且该融合杀虫蛋白可以有效杀死对Cry1Ac蛋白产生抗性的玉米螟，能用于昆虫抗性防治。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种融合杀虫蛋白Cry1Am、其编码基因及应用。
背景技术
虫害是造成农作物严重减产的一个主要因素，防治农业害虫最常见的手段就是使用广谱化学杀虫剂和一些生物杀虫剂。化学杀虫剂多具有广谱、高毒的特点，在杀死目标害虫的同时往往将很多益虫一起杀死，严重破坏生态平衡，并对环境造成严重污染；另一方面，农药残留对人类、牲畜的健康也造成严重威胁。生物杀虫剂具有易降解、与环境高度相容的特点，但在生产上需要重复施用，大大增加生产成本。为了弥补化学杀虫剂和生物杀虫剂在农业生产应用中的弊端，科学家们将编码杀虫蛋白的基因导入到植物体内，培育出多种转基因植物。自1996年至今，已经有多种转Bt基因杀虫作物获得批准进行商业化生产，但这些抗虫转基因作物多使用Cry1A类杀虫蛋白基因，杀虫蛋白基因的单一化、大面积使用加速害虫抗性的产生，制约了转Cry1A类抗虫转基因作物的应用年限。因此，需要不断寻找具有高杀虫能力、而且能延缓害虫抗性产生的新型基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种对野生型和Cry1Ab/Cry1Ac抗性昆虫具有高杀虫能力的新型融合杀虫蛋白Cry1Am及其编码基因。
本发明的另一目的是提供所述新型融合杀虫蛋白Cry1Am及其编码基因的应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种融合杀虫蛋白Cry1Am，其氨基酸序列如SeqID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供上述融合杀虫蛋白的编码基因，基因Cry1Am包括编码Cry1Ab上游658个氨基酸的核苷酸序列、编码30个氨基酸融合肽段的核苷酸序列、编码Cry1Ia蛋白结构域III的核苷酸序列、编码Cry1Ie蛋白结构域I和II的核苷酸序列。
本发明还根据玉米密码子的偏好性，对编码上述融合杀虫蛋白的基因Cry1Am进行改造合成，所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
应当理解的是，由于密码子具有简并性以及不同物种密码子所具有的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。在本发明中，所述核苷酸序列采用了玉米偏爱性密码子。
本发明还提供了含有所述基因的表达载体，其中，所述表达载体包括诱导表达载体和植物表达载体。
本发明还提供了含有所述基因的宿主细胞、转基因细胞系和工程菌。
本发明还提供了所述基因在提高植物抗虫性中的应用。
进一步地，所述应用是在植物体内表达所述融合杀虫蛋白的编码基因，提高植物的抗害虫能力。
进一步地，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱等。
进一步地，所述害虫为鳞翅目害虫，包括但不限于亚洲玉米螟、棉铃虫和粘虫等。
本发明还提供了所述基因在制备转基因植物中的应用。
本发明提供的融合杀虫蛋白Cry1Am，对野生型和Cry1Ab/Cry1Ac抗性昆虫具有高杀虫活性，可以用于杀死亚洲玉米螟等鳞翅目害虫，提高转基因作物的杀虫能力。而且该融合杀虫蛋白可以有效杀死对Cry1Ac蛋白产生抗性的玉米螟，能用于昆虫抗性防治。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的含有融合杀虫蛋白Cry1Am的编码基因的诱导表达载体pET30a-Cry1Am的质粒图谱。
图2为本发明实施例4中改造的植物表达载体pCAMBIA3301的质粒图谱。
图3为本发明实施例4中含有融合杀虫蛋白基因的p3301Ubi-Cry1Am植物表达载体图。
图4为本发明实施例6中试纸条检测转基因玉米中融合杀虫蛋白Cry1Am的表达；其中，1，非转基因玉米；2-5，转基因玉米。
图5为本发明实施例7中转基因玉米温室接虫鉴定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1融合杀虫蛋白编码基因Cry1Am诱导表达载体的构建
融合杀虫蛋白Cry1Am的编码基因，包括编码Cry1Ab上游658个氨基酸的核苷酸序列、编码30个氨基酸融合肽段的核苷酸序列、编码Cry1Ia蛋白结构域III的核苷酸序列、编码Cry1Ie蛋白结构域I和II的核苷酸序列。所述融合杀虫蛋白Cry1Am的氨基酸序列如SeqID No.1所示。根据玉米密码子的偏好性，对编码融合杀虫蛋白Cry1Am的基因进行改造合成，基因Cry1Am的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，基因序列委托上海生工合成并构建到pUC57载体上，构建得到具有氨苄青霉素抗性的质粒pUC57-Cry1Am。
将质粒pUC57-Cry1Am及质粒pET30a(购自美国Novagen公司)各取20ng加入到50μL大肠杆菌感受态细胞Trans5α中，冰浴30min；42℃热激90sec，冰浴2min；加入300μL LB液体培养基，37℃低速振荡恢复培养1hr后，将菌液涂于含相应抗生素的平板上，晾干；37℃培养箱倒置培养15hr。挑取单克隆菌斑于10mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜培养，次日，按照天根生化科技(北京)有限公司质粒小提中量提取试剂盒操作步骤提取质粒，并用NanoDrop 2000C微量紫外分光光度计对提取的质粒定量。
选择在质粒上有单一酶切位点且恰好位于基因两端的限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切质粒pUC57-Cry1Am及pET30a，使基因与载体的两端具有相同的粘性末端。pUC57-Cry1Am酶切后，经琼脂糖胶电泳，对照Marker分别切取约4.2kb大小的片段，用天根生化科技(北京)有限公司胶回收试剂盒对核酸片段进行回收；质粒pET30a经双酶切后用天根生化科技(北京)有限公司纯化试剂盒进行纯化回收。然后，按照T4连接酶的使用说明将切胶回收的核酸片段与纯化回收的载体片段进行连接，即构建获得含有融合杀虫蛋白Cry1Am的编码基因的诱导表达载体pET30a-Cry1Am(图1)。连接反应结束，取5μL连接产物转化大肠杆菌Trans5α，方法同上。
挑取克隆菌斑于10mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜培养，次日，提质粒并定量。用BamHI和HindIII双酶切质粒，经琼脂糖电泳验证杀虫蛋白基因与pET30a酶切位点连接的正确性。
实施例2融合杀虫蛋白Cry1Am的诱导与纯化
将测序并酶切验证正确的质粒pET30a-Cry1Am转入购自全式金公司的菌株Transetta(DE3)中，挑取单克隆，PCR扩增验证阳性菌斑。将检测阳性的菌斑接种于10mL的LB液体培养基中(含适宜抗生素)，于37℃过夜振荡培养。将含有pET30a-Cry1Am质粒的大肠杆菌菌株Transetta(DE3)，按1:100接种到10mL LB液体培养基中(含适宜抗生素)，同样于37℃过夜振荡培养。
次日，按1:200接种到200mL LB液体培养基中(含适宜抗生素)，37℃，200rpm震荡培养至OD600为0.4-0.6，加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃摇床，160rpm，震荡培养20hr左右，诱导目的蛋白的表达。
分别收集已诱导的菌体，5000rpm，低温下离心5min，弃上清液，加入1/20体积比的重悬缓冲液(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，15mM咪唑)，加入10mg/mL的溶菌酶至终浓度为100μg/mL，振荡后，冰上放置10min，超声波破碎，每隔3s超声4s，300w，15-20min，使菌体充分破碎，破碎过程冰上操作。
12000rpm，4℃，离心15min，取上清，用0.45μm滤膜过滤。加入1mL混匀的50％的Ni-NTA树脂，室温下于摇床上轻微振荡90min，使目的蛋白充分结合到Ni-NTA树脂上。将结合有目的蛋白的Ni-NTA树脂装柱纯化。新打开包装的镍柱用70％乙醇平衡，然后用5倍镍柱体积的重悬缓冲液平衡(含咪唑15mM)。
低速向柱子中加入混匀好的蛋白上清和树脂的混合物，收集流出液，标记为L15。
用洗脱液(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，30mM咪唑)8mL洗涤，收集流出液，标记为L30。
用洗脱液(25mMTris-Cl，150mM NaCl，100mM咪唑)4mL洗涤，收集流出液，标记为L100。
用洗脱液(25mMTris-Cl，150mM NaCl，250mM咪唑)10mL洗涤，收集流出液，标记为L250。
以上纯化过程均在4℃环境中操作，并严格避免交叉污染。
纯化蛋白分别转入透析袋中，用透析液(25mM Tris-Cl，150mM NaCl)在4℃环境中，转子搅拌下透析24hr，每8hr更换一次透析液。透析处理后，采用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒对纯化的L250蛋白进行定量。同时，将杀虫蛋白L250收集的流出液进行SDS-PAGE电泳检测。
实施例3融合杀虫蛋白Cry1Am的室内玉米螟杀虫试验
供试玉米螟为敏感型玉米螟及对Cry1Ac蛋白产生抗性的玉米螟。在室内温度为28±1℃、光周期(L:D)16:8h、相对湿度70-80％的条件下，采用人工饲料混合法进行室内玉米螟虫试，将纯化的融合蛋白Cry1Am及其它蛋白分别以25μg/g的量添加到人工饲料中配成饲养饲料，将饲料均分到三个48孔细胞培养板中，每孔接玉米螟初孵幼虫一头，每个浓度共接虫144头，7天后统计虫子死亡率。结果表明融合杀虫蛋白Cry1Am对敏感型玉米螟的杀虫效果比Cry1Ab、Cry1Ie或Cry1Ia1明显提高，对抗性玉米螟的杀虫效果也明显提高(表1)。
表1原核表达纯化蛋白的杀虫率
| 蛋白种类 | 敏感型玉米螟 | Cry1Ab/Cry1Ac抗性玉米螟 |
| Cry1Ab | 80％ | 10％ |
| Cry1Ie | 50％ | 60％ |
| Cry1Ia1 | 45％ | 50％ |
| 本发明Cry1Am | 100％ | 90％ |
| 阴性对照 | 0％ | 0％ |
实施例4植物转化载体p3301Ubi-Cry1Am的构建
植物表达载体的骨架为改造的质粒pCAMBIA3301(图2)。用BamHI和SacI酶切改造的pCAMBIA3301载体和pUC57-Cry1Am，37℃水浴锅中酶切1hr，酶切体系如下：
酶切产物经琼脂糖胶电泳，对照Marker分别切取约4.2kb大小的Cry1Am片段，及约11kb大小的改造pCAMBIA3301载体序列，用天根生化科技(北京)有限公司胶回收试剂盒对核酸片段进行回收；然后，按照T4连接酶的使用说明将切胶回收的核酸片段与纯化回收的载体片段进行连接。连接反应结束，取5μL连接产物转化大肠杆菌Trans5α。挑取克隆菌斑于10mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜培养，次日，提质粒并定量。用BamHI和SacI双酶切质粒，经琼脂糖电泳验证载体p3301Ubi-Cry1Am构建的正确性(图3)。
实施例5农杆菌转化法获得转Cry1Am基因玉米植株
将载体p3301Ubi-Cry1Am通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚置于D-inf溶液中一个小时后，用D-inf清洗一次，再浸入添加100μM乙酰丁香酮的D-inf的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，置于D-AS培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。幼胚洗涤去菌后，放至含1.5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含3mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次，筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好，为抗性愈伤。将以上实验选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日3000Lux光强，光照16小时，很快就会有再生小苗出现。再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗移植到罐头瓶中，并在室内培养。待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3)的小花盆中。当玉米又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中，自交获得种子。
实施例6转基因玉米植株中融合杀虫蛋白Cry1Am表达检测
采用Cry1Ab/Cry1Ac免疫检测试纸条检测转基因玉米植株中Cry1Am蛋白的表达。取0.1g玉米叶片，放入2mL离心管中，加入500μL提取液，用研棒研磨。将试纸条放入提取液中2-3分钟，转基因玉米样品在试纸条上出现两条条带，其中一个是目的条带，另一个是质控条带，而用于检测非转基因玉米样品的试纸条仅有一条质控条带(图4)。上述结果表明Cry1Am蛋白在转基因玉米中正确表达。
实施例7转基因玉米抗虫性鉴定
将产在蜡纸上的玉米螟卵块剪成每块含约30-40粒卵的小片。在温室的玉米长到6-8片叶左右时，将刚孵化的玉米螟幼虫接在心叶中，每株接虫50-60头，接虫后20天后逐株调查玉米螟取食情况。玉米螟对心叶危害程度的分级标准依据玉米抗玉米螟鉴定技术规范(中华人民共和国农业行业标准NY/T1248.5-2006)。接虫鉴定结果表明转Cry1Am基因玉米高抗玉米螟(图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.融合杀虫蛋白Cry1Am，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
6.权利要求2或3所述基因在提高植物抗虫性中的应用；其中，所述虫为玉米螟。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱。
8.权利要求2或3所述基因在制备转基因植物中的应用。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999057128A1 (en) * | 1998-05-01 | 1999-11-11 | Maxygen, Inc. | Optimization of pest resistance genes using dna shuffling |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999057128A1 (en) * | 1998-05-01 | 1999-11-11 | Maxygen, Inc. | Optimization of pest resistance genes using dna shuffling |
| CN101679491A (zh) * | 2007-03-28 | 2010-03-24 | 先正达参股股份有限公司 | 杀虫的蛋白质 |
| CN102031266A (zh) * | 2010-03-25 | 2011-04-27 | 浙江大学 | 抗虫融合基因、融合蛋白质及其应用 |
| CN103718896A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-04-16 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
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