TW201604282A - 可用於防治昆蟲害蟲的營養期殺昆蟲蛋白 - Google Patents
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Abstract
揭露DIG-657營養期殺昆蟲毒素、編碼該等毒素的聚核苷酸、該等毒素在防治害蟲上的用途及產生該等毒素的基因轉殖型植物。本發明包括DIG-657變異體、片段及類似物。
Description
本申請案係主張於2014年6月20日提出申請之美國暫准申請案62/014,916的優先權。該申請案的完整內容在此併入本申請案以為參考資料。
本發明整體上係有關於分子生物學領域。更具體而言，本發明係有關於新的殺昆蟲蛋白毒素，其係從蘇力菌(Bacillus thuringiensis)中所發現之新的營養期殺昆蟲蛋白毒素研發而得，及有關於其等在防治昆蟲上的用途。
每年，農民因昆蟲與其他害蟲造成的作物損失及用於防治該等害蟲的費用高達數十億元。除了造成田間作物損失之外，昆蟲害蟲也成為蔬菜水果種植者、觀賞花卉生產者及居家園藝家的負擔。昆蟲害蟲在農業生產環境中所造成的損害包括減少作物產量、降低作物品質及增加採收成本。
昆蟲害蟲主要藉由密集施用化學殺蟲劑來防
治，這些化學殺蟲劑係經由抑制昆蟲生長、阻止昆蟲取食或繁殖或引發死亡而具有殺蟲活性。可藉由這種方式達到良好的昆蟲防治作用，但該等化學藥品有時也影響其他益蟲。廣泛使用化學殺蟲劑所導致的另一項問題是抗藥性昆蟲種群之出現。這問題已經由各種抗藥性管理做法而得到部分緩解，但是對於替代的害蟲防治劑之需求仍日益增加。亦已在作物植株上施用生物性害蟲防治劑，諸如表現殺蟲性毒素如δ-內毒素之蘇力菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)菌株，且有令人滿意的結果，而提供替代或補充化學殺蟲劑之一方案。已分離出用於編碼該等δ-內毒素中的一些之基因，及其等在異種宿主中的表現作用表明，可提供用於防治有經濟重要性的昆蟲害蟲之另一工具。尤其，殺昆蟲毒素諸如蘇力菌(Bacillus thuringiensis)δ-內毒素在基因轉殖型植物中的表現作用，已提供對抗所選定的昆蟲害蟲之充分保護作用，並且表現該等毒素的基因轉殖型植物已有商品上市，使農民得以減少施用化學性昆蟲防治劑。
土壤微生物蘇力菌(Bacillus thuringiensis)是一種革蘭氏陽性、形成孢子的細菌，其特徵在於伴孢晶體蛋白包涵體。蘇力菌(Bacillus thuringiensis)仍然是供研發植物嵌入型殺蟲劑之新穎殺昆蟲蛋白的主要來源。吾等使用細菌分離株的各種菌株而發明了新的蘇力菌毒素，該毒素具有對抗具商業重要性的昆蟲害蟲之活性。在北美的玉米昆蟲抗藥性市場，秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)(秋行軍蟲“FAW”)、霍伯納氏歐洲玉米螟蛾(Ostrinia nubialis Hübner)(歐洲玉米螟“ECB”)及巴迪氏玉米穗蟲(Helicoverpa zea Boddie)(玉米穗蟲“CEW”)係具關鍵驅動力的害蟲，雖然在其他地理區域存在其他的主要昆蟲害蟲(如棉鈴實夜蛾(Helicoverpa armigera)(棉花暝蛉“CBW”或玉米穗蟲“CEW”))及其他次要但也具重要性的昆蟲害蟲物種。蘇力菌毒素在生物殺昆蟲劑市場的市占率超過90%，及實質上代表供已研發出具有抗昆蟲取食性的基因轉殖型作物所用之全部基因來源。依其等的基因與蛋白結構而定，蘇力菌所產生的殺昆蟲性δ-內毒素包括晶體(Cry)、細胞毒素(Cyt)及營養期殺昆蟲蛋白(VIP)毒素。Cry毒素係在抱子形成期間所產生的不溶性晶體蛋白。而另一方面，VIP毒素係在蘇力菌生長的營養期階段所產生之可溶性蛋白。VIP蛋白的結構與Cry蛋白截然不同，但與Cry毒素同時具有造孔劑之性質及作用在昆蟲中腸的細胞上(Yu,C.-G.於1997年期刊“Appl.Environ.Microbiol.”第63期第532-536頁乙文；Lee,M.K.於2003年期刊“Appl.Environ.Microbiol.”第69期第4648-4657頁乙文；Shotkoski,F.於2003年美國棉花帶年會(Beltwide Cotton Conferences)研究彙刊第89-93頁乙文)。吾等在此說明之本發明係有關於具有廣泛殺昆蟲活性的新型VIP毒素，其包括對抗歐洲玉米螟的殺昆蟲活性，這相較於目前所知的VIP蛋白而言是獨特的(Yu,C.-G.於1997年期刊“Appl.Environ.Microbiol.”第63期第532-536頁乙文)。
專利文件WO2013/134523、WO 94/21795、WO
96/10083、5,877,012、6,107,279、6,137,033及6,291,156，以及Estruch等人(於1996年期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.”第93期第5389-5394頁乙文)與Yu等人(於1997年期刊“Appl.Environ.Microbiol.”第63期第532-536頁乙文)，述及稱作VIP3類型的殺昆蟲蛋白。VIP3基因係編碼約88kDa的蛋白，而該蛋白係在芽孢桿菌屬(Bacillus)物種生長的營養期階段產生與分泌出來。據報導，該等毒素係與形成晶體的δ-內毒素截然不同。該等文件特別提及稱作VIP1A(a)、VIP1A(b)、VIP2A(a)、VIP2A(b)、VIP3A(a)及VIP3A(b)之毒素。關於VIP蛋白的作用機制與截斷作用之論述，亦請參見Lee等人於2003年8月期刊“AEM”第69期第8號第4648-4657頁乙文。
VIP3A蛋白具有對抗廣泛的鱗翅目昆蟲害蟲之殺昆蟲活性，包括FAW、CEW、赫氏球菜夜蛾(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑色切根蟲“BCW”)及費氏菸芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(菸草芽蟲“TBW”)。最近發現，VIP蛋白具有對抗特定半翅目物種的昆蟲害蟲之毒性(Nanasaheb,P等人於2012年6月年期刊“Toxins”(巴塞爾)第4期第6號第405-429頁乙文；Sattar S.與Maiti M.K.於2011年期刊“J.Microbiol.Biotechnol.”第21期第937-946頁乙文)。因而，VIP類型的蛋白展現一獨特範圍的殺昆蟲活性。現在，如WO 98/18932、WO 98/33991、WO 98/00546及WO 99/57282的其他揭露內容，亦已辨識出VIP3類型的蛋白之同系物。
持續使用化學性與生物性製劑來防治昆蟲害
蟲，這提高了昆蟲對該等防治措施產生抗性之機率。同時，生物性防治劑的高選擇性常常導致各製劑僅防治少數特定的昆蟲害蟲。儘管抗歐洲玉米螟的基因轉殖型玉米之成功，產生抗藥性昆蟲種群之可能性仍危及Cry蛋白在歐洲玉米螟防治方面的長期耐用性，及創造出對於發現與研發用於防治歐洲玉米螟與其他害蟲的新型Cry或生物性防治劑之需求。昆蟲可經由數種機制產生對於蘇力菌Cry蛋白的抗藥性(Heckel等人於2007年乙文，Pigott與Ellar於2007年乙文)。在昆蟲中已辨識出用於Cry蛋白的多種受體蛋白類型，並且在各受體類型中都有數個實例存在。例如，可能藉由在一受體蛋白之一鈣黏蛋白域的毒素結合部分內之突變作用，而產生對於一特定Cry蛋白的抗性。另一種抗性方式可能經由一種原毒素加工蛋白酶所媒介。因而，在鱗翅目物種中，對於Cry毒素的抗性係具有複雜的遺傳基礎，且具有至少四個不同的主要抗性基因。在田野間，已在菜蛾(DBM)(Tabashnik於1994年乙文)、霍伯納氏粉紋夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)(擬尺蠖“CL”；Janmaat與Myers於2003年及2005年乙文)及玉米穗蟲(Tabashnik於2008年乙文)等物種中出現鱗翅目昆蟲對於Cry蛋白的抗性。因此，研發與運用諸如本申請案所揭露之該等新穎且高效力的植物嵌入型殺蟲性蛋白，不僅有用也是必要的。
因此，仍需要開發新穎且有效的害蟲防治劑，這些防治劑不僅使農民在經濟上受益，也是環境上可接受的。特別需要的防治劑係靶向廣泛之具經濟重要性的昆蟲
害蟲，該等防治劑可有效防治已對現有的昆蟲防治劑產生抗性或可能產生抗性之昆蟲種群，及該等防治劑所具有的效力係與目前的防治劑相當或較高。
本發明提供殺昆蟲性VIP毒素，包括在本申請案中稱作DIG-657的蛋白毒素以及DIG-657的變異體；編碼該等毒素的核酸；使用該等毒素防治害蟲之方法；在基因轉殖型宿主細胞中產生該等毒素之方法；及表現該等毒素的基因轉殖型植物。本發明進一步提供核酸構築質體，其所包含的一核酸序列係編碼選自由DIG-657、DIG-657變異體及DIG-657片段所組成之群組的一殺昆蟲蛋白。揭露選自由DIG-657、DIG-657變異體及DIG-657片段所組成之群組之殺昆蟲性分離蛋白，及一種包含序列辨識編號：2的第206至第803個殘基之殺昆蟲蛋白。亦揭露植物、植物部位及種子，而其所包含的一核酸序列係編碼選自由DIG-657、DIG-657變異體及DIG-657片段所組成之群組之一蛋白。亦揭露一種用於防治一昆蟲害蟲種群之方法，其包括用一殺蟲有效量之包含序列辨識編號：2的第206至第803個殘基之一多肽，接觸該害蟲種群中的個體。
本發明在一實施例中提供一種分離的DIG-657昆蟲毒素多肽，其包含選自由下列所組成之群組之一核心毒素節段：(a)一多肽，其包含序列辨識編號：2的第206至第803個殘基之胺基酸序列；(b)一多肽，其所包含的一胺基酸
序列與序列辨識編號：2的第206至第803個殘基之胺基酸序列的序列一致性係至少90%；(c)一多肽，其所包含之序列辨識編號：2的第206至第803個殘基之一胺基酸序列係具有至多20個胺基酸的取代作用、刪除作用或修飾作用，且未對於序列辨識編號：2所編碼之毒素的表現作用或活性產生不利影響；或其具殺昆蟲活性的一片段。
本發明在另一實施例中提供一種分離的DIG-657昆蟲毒素多肽，其包含選自由下列所組成之群組之一DIG-657核心毒素節段：(a)一多肽，其包含序列辨識編號：2的第1至第803個殘基之胺基酸序列；(b)一多肽，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：2的第1至第803個殘基之胺基酸序列的序列一致性係至少95%或96%或97%或98%或99%；(c)一多肽，其所包含之序列辨識編號：2的第1至第803個殘基之一胺基酸序列係具有至多20個胺基酸的取代作用、刪除作用或修飾作用，且未對於序列辨識編號：1所編碼之毒素的表現作用或活性產生不利影響；或其具殺昆蟲活性的一片段；(d)一多肽，其所包含的一胺基酸序列與序列辨識編號：2的第206至第803個殘基之胺基酸序列的序列一致性係至少93%或94%或95%或96%或97%或98%或99%，且未對於表現作用或毒素活性產生不利影響。
本發明在另一實施例中提供包含DIG-657昆蟲毒素的可育性植株。本發明進一步提供產生一抗昆蟲性或耐昆蟲性基因轉殖型植物之一種方法，其包括將本發明的一核酸分子導入該基因轉殖型植物中，其中該核酸分子可在
該基因轉殖型植物中按防治昆蟲的一有效量表現。
本發明在另一實施例中提供用於防治一害蟲種群之一種方法，其包括用一殺蟲有效量的DIG-657昆蟲毒素接觸該種群。
本發明在另一實施例中提供編碼本發明的DIG-657毒素之分離核酸分子。就DIG-657毒素的一胺基酸序列而言，可藉由使用預定的宿主植物所偏好的密碼子，逆轉譯該胺基酸序列，而設計編碼序列；然後使用任擇的密碼子以除去可能引發問題的序列，及提供週期性終止密碼子以消除在非編碼讀框中之長的開放編碼序列，而改進該等序列。
本發明在另一實施例中提供包含編碼DIG-657昆蟲毒素的一核苷酸序列之DNA構築質體，該核苷酸序列係與可在一植物中驅動表現作用但非衍生自蘇力菌之一啟動子操作連鎖。本發明亦提供一基因轉殖型植物，其包含已穩定嵌入其基因體中之該DNA構築質體，及提供用於保護一植物免於害蟲傷害之一種方法，其包括將該構築質體導入該植物中。
在又一實施例中，本發明提供用於產生一抗昆蟲性或耐昆蟲性植物之一種方法，其包括將一種非基因轉殖型植物與一基因轉殖型植物育種，該基因轉殖型植物係包含可表現一DIG-657毒素之穩定嵌入植物基因體中的一外來DNA構築質體；及藉由分析從該基因轉殖型植物所發出的外來DNA構築質體的至少一部分，而篩選子代。
圖1係純化的DIG-657之SDS-PAGE圖像。第1道係分子量標記；第2道係3微克之純化的全長式DIG-657；第3道係用胰蛋白酶(DIG-657重量/胰蛋白酶重量為1：10)處理純化的全長蛋白達1小時後之DIG-657的反應產物。
序列辨識編號：1係編碼全長式DIG-657昆蟲毒素之DNA序列。
序列辨識編號：2係導譯的DIG-657蛋白序列。
序列辨識編號：3係編碼DIG-657變異體1之玉米最佳化DNA序列。
序列辨識編號：4係DIG-657變異體2及具有就螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的表現作用進行最佳化之密碼子。
序列辨識編號：5係DIG-657v4，玉米最佳化的高GC含量序列。
序列辨識編號：6係DIG-657v5，從N端截斷205個胺基酸之DIG-657的玉米最佳化的高GC含量序列。
序列辨識編號：7係序列辨識編號：6的導譯蛋白序列。
序列辨識編號：8係全長式DIG-657的大豆最佳密碼子最佳化版本。
序列辨識編號：9係截短型DIG-657的大豆最佳
密碼子最佳化版本。
序列辨識編號：10係與全長式DIG-657的大豆最佳密碼子最佳化版本融合之編碼葉綠體轉運肽4的DNA(Trap4)。
序列辨識編號：11係TraP4 DIG-657全長式大豆最佳密碼子的導譯蛋白序列。
序列辨識編號：12係與截短型DIG-657的大豆最佳密碼子最佳化版本融合之Trap4。
序列辨識編號：13係Trap4 DIG-657截短型版本的導譯蛋白序列。
本發明提供殺昆蟲蛋白毒素及用於輸送該毒素之方法，該毒素具功能活性及可有效對抗數個昆蟲目的昆蟲，較佳為鱗翅目的昆蟲。“功能活性”(或“具有對抗...的活性”)係指該等蛋白作用為具口服活性的毒素或昆蟲防治劑，係指該等蛋白具有一毒性效應，或可干擾或阻止昆蟲生長或取食。當一昆蟲與一有效量之本發明的一毒素接觸時，該毒素係經由基因轉殖型植物的表現作用、調配式蛋白組成物、可噴灑式蛋白組成物、一餌料基質或其他輸送系統輸送，結果通常是造成昆蟲死亡、抑制昆蟲生長或繁殖或阻止昆蟲取食該來源，該來源較佳為製造毒素供應予昆蟲之一基因轉殖型植物。本發明的功能性蛋白可單獨或一起同工，以提高或改善一或多種其他毒素蛋白的活性。“有毒的”、“毒性”或“毒素”等詞係為了表達該標的毒素具
有如本申請案所界定的功能活性。
較佳對於取食昆蟲產生完全致死性，但這並非達到功能活性所需的。若昆蟲避開該毒素或停止取食，這迴避行為在一些應用中是有用的，即使該效應是亞致死性或致死性是延遲或間接的。例如，若所期望的是抗昆蟲性基因轉殖型植物，則造成昆蟲不願取食該植物與對於昆蟲產生致死毒性是同等有用，因為最終目標是避免昆蟲損害植物。
從蘇力菌菌株PS46L發現及分離出編碼DIG-657之一核酸。就“分離”一詞而言，本案申請者係指藉著人手將核酸分子從其等的原生環境移出及置入一不同環境中。因為遺傳密碼的冗餘性，多種不同的DNA序列可編碼本申請案中所揭露的胺基酸序列。一旦得知胺基酸序列，在受過訓練的人員之技術範圍內，即可造出編碼相同或實質上相同的毒素之該等任擇的DNA序列。確定DIG-657的全長編碼區之核酸序列(序列辨識編號：1)，及從該核酸序列導譯出DIG-657的全長式蛋白序列(序列辨識編號：2)。針對GenomeQuest資料庫“GQ-Pat Platinum蛋白”與“GQ-Pat GoldPlus蛋白”以及基因資料庫(GenBank)的非冗餘性蛋白資料庫，查詢DIG-657蛋白序列。最相近的已知同系物為XMI335(一致性為94%，WO2013134523-002)與Vip3Ba(一致性為74%，Rang等人之登錄號為AAV70653)。
在本申請案中亦述及對昆蟲具有活性之DIG-657毒素的變異體，及統稱為DIG-657昆蟲毒素或變異體，及
包括片段與截短形式。可藉由DIG命名法來識別個別的DIG-657變異體。DIG-657毒素係用於防治鱗翅目昆蟲害蟲的理想候選藥劑。
發現到DIG-657與其變異體毒素之一項意想不到的性質，亦即其等對於已產生Cry1F與Cry1A毒素的抗性之歐洲玉米螟與菜蛾種群具有活性。因此，DIG-657毒素係用於防治與阻止具抗性的鱗翅目昆蟲害蟲種群之理想候選藥劑。
本發明的DIG-657毒素具有對抗鱗翅目昆蟲的活性，較佳對抗菜蛾、歐洲玉米螟、秋行軍蟲、玉米穗蟲、棉花暝蛉及菸草芽蟲。亦預期對於黑色切根蟲、擬尺蠖、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)(甜菜行軍蟲“BAW”)、棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)(紅鈴蟲)、沃氏向日葵螟(Cochylis hospes Walsingham)(向日葵斑螟)及向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)(向日葵頭蛾)具有殺昆蟲活性。
螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)所產生的DIG-657之殺昆蟲活性，經證實在鱗翅目昆蟲物種上亦具有活性，該等鱗翅目昆蟲物種包括歐洲玉米螟；具cry1F抗性的歐洲玉米螟(rECB)、菜蛾、具cry1A抗性的菜蛾(rDBM)、玉米穗蟲、黑色切根蟲及菸草芽蟲。亦在棉花暝蛉、秋行軍蟲及具cry1F抗性的秋行軍蟲(rFAW)上試驗DIG-657蛋白的活性。
可同時對抗玉米與大豆的昆蟲害蟲之生物活性範圍係非常有利的。在生物分析法中進行胰蛋白酶截短型
毒素(序列辨識編號：7)對抗歐洲玉米螟之試驗，及顯示其活性約略與全長式DIG-657相當，這表明在該蛋白N端的前205個胺基酸並非生物活性所必需。
全長式DIG-657具有一個完整的N端，當用胰蛋白酶(胰蛋白酶/DIG-657為1：10)處理時，該蛋白被剪切成為二個條帶，其中一者係位於約65kDa，而另一者係位於約18kDa(圖1)。此外，亦存在一種剩餘的小型全長式DIG-657。由DIG-657的65kDa剪切產物之N端胺基酸分析顯示，胰蛋白酶的剪切位點為(205K/S206)。
可藉由習用方式合成編碼DIG-657、其變異體、截斷體及片段之核苷酸序列，及選殖至標準質體載體中，或可藉由對於其他含有該等核苷酸序列的構築質體之標準分子生物學操作而獲得。可辨識出位於DIG-657編碼區內部之獨特的限制酶酶切位點，及可合成包含位於DIG-657編碼區的限制酶酶切位點之間的序列之DNA片段，該等片段中之各者係編碼一特定的刪除、插入或其他DIG-657變異。在適當的限制酶酶切位點，編碼改質的DIG-657片段之DNA片段可與其他DIG-657編碼區片段或其他Cry或VIP編碼區片段連接，而得編碼所需的全長式DIG-657蛋白、刪除型或變異體DIG-657蛋白之一編碼區。例如，可在第一DIG-657編碼區的開端辨識出一適當的限制酶識別位點，及在DIG-657編碼區內部辨識出第二個限制酶酶切位點。該第一DIG-657編碼區在該等限制酶酶切位點的剪切作用將產生一DNA片段，其包含部分的第一DIG-657編碼
區。第二DNA片段的兩側係所處位置類似之可相容的限制酶酶切位點，及該等位點對於另一DIG-657編碼區具特異性；或可組合使用其他VIP3編碼區與第一DNA限制酶酶切片段，以建構一變異體。
抗毒素抗體。使用技藝中所熟知的標準程序，製備本申請案中所揭露的毒素或該等毒素的片段之抗體。該等抗體係適用於檢測植物組織與其他多種物質中是否存在DIG-657毒素。該抗體與抗血清係適用於檢測本發明所申請專利的DIG-657毒素及其變異體或片段之各種方法中。眾所周知地，經一報導基團標記的抗體可在多種環境中用於辨識是否存在抗原。已在放射性免疫分析法中使用經放射性同位素標記的抗體，及以非常高的精確度與靈敏度在多種生物液體中辨識是否存在抗原。最近，已在ELISA分析法中使用經酵素標記的抗體來取代放射性標記的抗體。此外，對於本發明的蘇力菌殺昆蟲毒素具有免疫反應性之抗體，可與諸如聚苯乙烯孔或顆粒之一固定化物質結合，及在免疫分析法中用於測定一試驗試樣中是否存在蘇力菌毒素。亦可使用抗DIG-657抗體，而從重組型生產系統或天然來源分離出DIG-657毒素。
DIG-657的基因轉殖型表現作用。可用多種方式“施用”或提供標的蛋白毒素，使其與標的昆蟲接觸。例如，可使用DIG-657毒素作為基因轉殖型植物中之植物嵌入型保護劑(由植物所產生及存在於植物中)，這是技藝中所眾所周知的。亦可選擇在植物的特定組織表現該毒素基
因，諸如根部、葉部等。這可經由使用技藝中眾所周知的組織特異性啟動子而達成。
本發明的一個較佳實施例係用編碼標的殺昆蟲蛋白或其變異體之基因進行植物轉形作用。藉著在轉形植物的細胞中存在防治量的標的殺昆蟲蛋白或其變異體，該轉形植物可以抗標的昆蟲害蟲之攻擊。在被一特定昆蟲害蟲吃食的植物中，藉由在其基因體中嵌入與表現編碼DIG-657毒素的遺傳物質，使得成蟲或幼蟲在吃食該植物後死亡。單子葉與雙子葉分類中的眾多成員皆已進行轉形。基因轉殖型農藝作物以及水果與蔬菜係具有商業價值。該等作物包括但不限於玉米、稻米、大豆、芥菜、向日葵、苜蓿、高粱、小麥、棉花、花生、番茄、馬鈴薯等。存在許多眾所周知的技術可用於將外來遺傳物質導入單子葉植物或雙子葉植物細胞中，及可用於獲得穩定維持及表現所導入基因之可育性植株。
在一個較佳實施例中，DIG-657或一變異體係經由一基因轉殖型植物而以口服方式傳送，該基因轉殖型植物係包含表現本發明的一毒素之一核酸序列。本發明提供產生一抗昆蟲性基因轉殖型植物之一種方法，其包括將本發明的一核酸分子導入該植物中，其中在該基因轉殖型植物中，該毒素係以防治一昆蟲的一有效量表現。在一非限制性實例中，一種基本的選殖策略可在NcoI與SacI限制酶酶切位點，將全長或改質的DIG-657編碼序列次選殖至一植物表現質體中。例如使用Gateway®技術或標準限制酶片
段選殖程序，在植物表現元件(如植物可表現型啟動子、3’端轉錄終止與聚腺苷酸添加決定因子等)的控制下，將所產生之含有適當的DIG-657編碼區之植物表現組合體次選殖至一種二元載體質體中。若採用Gateway®技術，則可使用例如LR ClonaseTM(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)，將全長與改質的基因植物表現組合體重組至二元植物轉形質體中。當質體存在於大腸桿菌(E.coli)與農桿菌屬(Agrobacterium)細胞中時，則可便利地使用具有賦予對於抗生素大觀黴素的抗性之一細菌基因之二元植物轉形載體。可便利地使用含有一植物可表現的可篩選標記基因之二元載體質體，該基因在所期望的宿主植物中係具有功能性。植物可表現的可篩選標記基因之實例包括但不限於該等編碼轉位子Tn5的胺基糖苷磷轉移酶基因(aphII)者，其賦予對於抗生素康黴素(kanamycin)、新黴素(neomycin)及G418之抗性，以及編碼對於下列各者的抗性或耐受性之該等基因：嘉磷塞(glyphosate)；潮黴素(hygromycin)；胺甲喋呤；草胺膦(phosphinothricin)(畢拉草(bialaphos))、咪唑啉酮類、磺醯尿素；及三唑并嘧啶除草劑，諸如氯磺隆(chlorosulfuron)、溴苯腈(bromoxynil)、得拉本(dalapon)等。
任擇地，含有DIG-657基因插入之二元植物轉形載體的質體結構，係藉由嫻熟農桿菌屬操作的技術人員眾所周知的標準分子生物學方法，按照從候選農桿菌屬分離株所製備的質體DNA之限制酶酶切指紋圖譜進行。
嫻熟經由農桿菌媒介型轉形方法獲得轉形植物的技術人員將明瞭，可使用Z707S以外的農桿菌屬菌株，及菌株之選擇可能取決於待轉形的宿主植物物種之一致性。
基因轉殖型阿拉伯芥屬(Arabidopsis)植物之昆蟲生物分析法。在人工飼料覆蓋分析法中，可使用表現改質的DIG-657蛋白之基因轉殖型阿拉伯芥屬品系，來顯明對抗敏感型昆蟲物種的活性。從基因轉殖型與非基因轉殖型阿拉伯芥屬品系萃取的蛋白，可藉由適當方法進行量化，及調整試樣體積以標準化蛋白濃度。然後如下文所述，在人工飼料上進行生物分析法。在分析法中應包括非基因轉殖型阿拉伯芥屬(Arabidopsis)及/或緩衝液與水，作為背景核查處理。
基因轉殖型玉米之生物分析法。亦可藉由習用的生物分析方法，顯明在植物細胞中所產生的DIG-657毒素與變異體之生物活性(如見Huang等人於2006年乙文)。可在一受控的進食環境下，藉由用來自產生DIG-657毒素的一植物之各種植物組織或組織碎片餵食標的昆蟲，而試驗其功效。任擇地，可從來自產生DIG-657毒素的一植物之各種植物組織製備蛋白萃取物，及將所萃取的蛋白納入一種人工飼料生物分析法中。應理解該餵食分析法的結果將與按類似方式進行的生物分析法相比較，而該生物分析法係採用來自不產生DIG-657蛋白或變異體的宿主植物之適當的對照組織；或與其他對照試樣相比較。
DIG-657毒素及具殺昆蟲活性的變異體。除了具序列辨識編號：2的全長式DIG-657毒素之外，本發明亦涵蓋具序列辨識編號：2、序列辨識編號：11或序列辨識編號：13之具有殺昆蟲活性的變異體。就變異體一詞而言，本案申請者意欲包括特定的刪除型、取代型及插入型突變體。DIG-657片段係存在於序列辨識編號：2中的任一蛋白序列，其比全長式DIG-657胺基酸序列短及具有殺昆蟲性質。亦涵蓋DIG-657變異體片段作為本發明的一部分，及界定為含有本申請案中所述之特定的刪除型、取代型及插入型突變體及具有殺昆蟲活性之DIG-657片段。在說明本發明所包括的DIG-657毒素之變異體之前，簡要回顧DIG-657蛋白毒素的結構是有益的。
藉由進行有限數量的胺基酸刪除作用、取代作用或添加作用所產生之DIG-657變異體。即可按循序方式，在序列辨識編號：2的胺基酸序列中進行胺基酸刪除作用、取代作用及添加作用，及可藉由生物分析法試驗該等變異對於殺昆蟲活性之影響。前提在於變化的數目在數量上是有限的，該試驗不涉及不合理的實驗。本發明亦包括核心毒素節段(序列辨識編號：2之第206至803個胺基酸，或在其中已進行至多10個、至多15個或至多20個獨立的胺基酸添加作用、刪除作用或取代作用者)之具殺昆蟲活性的變異體。
可藉由隨機突變作用製造變異體，或可設計變異體。在設計型變異體的情況下，當保有毒素關鍵區中的
胺基酸一致性時，所產生的變異體活性與原有毒素類似之機率很大；該關鍵區係導致生物活性，或涉及決定最終負責生物性活性之三維構形。若取代作用是保留性取代作用，則保有活性之機率很大。胺基酸可分為下列類別：非極性、未荷電極性、鹼性及酸性。在保留性取代作用中，一類別的一胺基酸被相同類型的另一胺基酸取代，係最不可能實質上改變該變異體的生物活性。表1提供各類別所屬胺基酸實例之清單。
本發明的殺害蟲蛋白係由與序列辨識編號：1的核苷酸序列充分一致之一核苷酸序列所編碼，或該殺蟲性蛋白係與序列辨識編號：2的胺基酸序列充分一致。“充分
一致”係指當使用本申請案所述排比程式中之一者及使用標準參數而與一參考序列比較時，一胺基酸或核苷酸序列係具有至少約60%或65%的序列一致性，約70%或75%的序列一致性，約80%或85%的序列一致性，約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性。本技術領域的嫻熟技術人員將明白，藉由將密碼子簡併性、胺基酸相似性、讀框定位等納入考量，可適當地調整該等數值，以測定由二種核苷酸序列編碼的蛋白之對應的一致性。
為測定二種胺基酸序列或二種核酸的一致性百分比，就最佳比對之目的進行序列排比。二種序列之間的一致性百分比係受到該等序列所共享的相同位置之數目之影響(亦即一致性百分比=相同位置之數目/位置總數(如重疊位置)x100)。在一實施例中，該二序列的長度相同。在另一實施例中，一致性百分比之計算係橫跨整個參考序列。可使用與下文所述者類似的技術，測定二序列之間的一致性百分比，不論容許或不容許缺口。在計算一致性百分比時，通常計數完全相符者。一缺口(排比中之一位置及其中一序列在該處存在一殘基而另一序列則無)係視為具有非一致殘基之位置。
可使用一數學演算法，來測定二序列之間的一致性百分比。用於比較二序列之數學演算法的非限制性實例，係Karlin與Altschul於1990年期刊“Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA”第87期第2264頁乙文之演算法，及由Karlin與
Altschul於1993年期刊“Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA”第90期第5873-5877頁乙文提出修改。該演算法被納入Altschul等人於1990年期刊“J.Mol.Bioi.”第215期第403頁乙文提出之BLASTN與BLASTX程式。可用分數=100及字長=12的BLASTN程式進行BLAST核苷酸之搜尋，而得與本發明之殺蟲性類型的核酸分子同源之核苷酸序列。可用分數=50及字長=3的BLASTX程式進行BLAST蛋白之搜尋，而得與本發明之殺蟲性蛋白分子同源的胺基酸序列。為了比較之目的，可使用Altschul等人於1997年期刊“Nucleic Acids Res.”第25期第3389頁乙文中所述之缺口式BLAST(在BLAST 2.0版中)，而獲得缺口排比。任擇地，可使用PSI-Blast進行疊代搜尋，以檢測分子之間的遙遠關係。見同上之Altschul等人於1997年乙文。當使用BLAST、缺口式BLAST及PSI-Blast程式時，可使用個別程式(如BLASTX與BLASTN)的系統內定參數。亦可藉由人工檢視方式進行排比。
用於序列比較之數學演算法之另一非限制性實例係ClustalW演算法(Higgins等人於1994年期刊“Nucleic Acids Res.”第22期第4673-4680頁乙文)。ClustalW比較序列及排比整個胺基酸或DNA序列，及因而可提供關於整個胺基酸序列的序列保留性之數據。有數種市售的DNA/胺基酸分析套裝軟體採用ClustalW演算法，諸如Vector NTI套裝程式(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)的ALIGNX模組。用ClustalW進行胺基酸序列排比之
後，可評估胺基酸一致性百分比。適用於分析ClustalW排比之軟體程式的一個非限制性實例為GENEDOCTM。GENEDOCTM(Karl Nicholas)使得以評估多種蛋白之間的胺基酸(或DNA)相似性與一致性。用於序列比較之數學演算法的另一非限制性實例，係Myers與Miller於1988年期刊“CABIOS”第4(1)期第11-17頁乙文中之演算法。在ALIGN程式(第2.0版)中納入該演算法，ALIGN程式係GCG威斯康辛遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package)第10版的一部分(可自美國加州聖地牙哥的阿賽樂德(Accelrys)有限公司取得)。當使用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可採用PAM120權重殘基表，缺口長度罰分為12，及缺口罰分為4。除非另有說明，否則將使用GAP第10版及下列參數，來測定序列一致性或相似性，GAP第10版係採用Needleman與Wunsch於1970年期刊“J.Mol.Biol.”第48(3)期第443-453頁乙文之演算法，其中所用參數如下：就一核苷酸序列的一致性%與相似性%，所用缺口權重為50及長度權重為3，及使用nwsgapdna.cmp評分矩陣；就一胺基酸序列的一致性%或相似性%，使用缺口權重為8及長度權重為2，及使用BLOSUM62評分程式。亦可使用等效程式。“等效程式”係指就所論及的任二序列而言，當相較於藉由GAP第10版所產生之對應的排比時，其所產生的排比係具有相同的核苷酸殘基配對及相同的序列一致性百分比之任何序列比較程式。
蛋白酶敏感性變異體。可依蛋白分解方式，將
包括DIG-657在內的VIP3蛋白從大小約88kDa截短成為大小約66kDa的一產物。該66kDa蛋白係包含第206至803個胺基酸殘基。昆蟲腸道蛋白酶的功用通常是幫助昆蟲從膳食蛋白質中獲取所需的胺基酸。最為人所瞭解的昆蟲消化性蛋白酶為絲胺酸蛋白酶，其似乎是最常見的類型(Englemann與Geraerts於1980年乙文)，尤其就鱗翅目昆蟲物種而言。相較於鱗翅目昆蟲的腸道，鞘翅目昆蟲的腸道較偏中性至酸性。大部分的鞘翅目幼蟲與成蟲，例如科羅拉多馬鈴薯甲蟲(CPB)，具有微酸性中腸，及主要的蛋白分解活性係由半胱胺酸蛋白酶提供(Wolfson與Murdock於1990年乙文)。更確切地，Thie與Houseman(1990年乙文)在科羅拉多馬鈴薯甲蟲中辨識出半胱胺酸蛋白酶、組織蛋白酶B樣與組織蛋白酶H樣及天門冬胺醯基蛋白酶、組織蛋白酶D樣，及進行其等的特徵分析。Gillikin等人(1992年乙文)對於WCR幼蟲腸道的蛋白分解活性進行特徵分析，而發現主要為半胱胺酸蛋白酶。第7,230,167號美國專利揭露在WCR中存在歸因於組織蛋白酶之蛋白酶活性。昆蟲腸道蛋白酶的多樣性與不同的活性水平可能影響一昆蟲對於一蘇力菌毒素的敏感性。
在本發明的另一實施例中，可將蛋白酶剪切位點工程設計在所欲位置，以影響特定昆蟲害蟲之易受影響的幼蟲之中腸內的蛋白加工處理作用。可藉由諸如化學基因合成作用或剪接重疊式PCR(Horton等人於1989年乙文)之方法，導入該等蛋白酶剪切位點。例如，可選擇性地將
絲胺酸蛋白酶辨識序列插入Cry蛋白結構中的特定位點，以在易受影響的幼蟲之中腸內的所欲刪除點影響蛋白加工處理作用。可按該方式使用之絲胺酸蛋白酶係包括鱗翅目昆蟲中腸絲胺酸蛋白酶，諸如胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酵素、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶等(Christeller等人於1992年乙文)。此外，藉由用未分級的幼蟲中腸蛋白酶製備物所產生的Cry蛋白分解產物之定序作用，或藉由與刷狀緣膜囊的結合作用，而依實驗方式辨識出的刪除位點，可經基因工程設計而達成蛋白活化作用。藉由基因刪除作用或藉由導入蛋白酶剪切位點，可使得所產生之改質型Cry或VIP3蛋白對於鱗翅目昆蟲害蟲的活性提高，該等昆蟲害蟲包括歐洲玉米螟、玉米穗蟲、棉花暝蛉、黑色切根蟲、秋行軍蟲、甜菜行軍蟲、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、條螟(Diatraea saccharalis)、西方豆夜盜蟲(Loxagrotis albicosta)及其他標的害蟲。
可藉由基因工程設計位於所欲加工處理位點的適當辨識序列，以影響特定昆蟲害蟲之易受影響的幼蟲之中腸內Cry蛋白加工處理作用，或許也提供對抗非易受影響的昆蟲害蟲之活性，而進一步利用鱗翅目昆蟲與鞘翅目昆蟲的絲胺酸蛋白酶，諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及組織蛋白酶G樣蛋白酶；鱗翅目昆蟲與鞘翅目昆蟲的半胱胺酸蛋白酶，諸如組織蛋白酶(B樣、L樣、O樣及K樣蛋白酶)(Koiwa等人於2000年乙文及Bown等人於2004年乙文)；鱗翅目昆蟲與鞘翅目的金屬蛋白酶，諸如
ADAM10(Ochoa-Campuzano等人於2007年乙文)；及鱗翅目與鞘翅目昆蟲的天門冬胺酸蛋白酶，諸如組織蛋白酶D樣與E樣、胃蛋白酶、瘧原蟲天門冬胺酸蛋白酶及凝乳酶。
藉由導入或除去位於編碼序列的適當位置之蛋白酶加工處理位點，而促成或除去昆蟲、植物或微生物蛋白酶對於一較大型變異體蛋白的蛋白分解性剪切作用，藉此方式所產生之DIG-657變異體係位於本發明的範圍內。據理解，該操作的最終結果係產生其活性與完整(全長式)毒素蛋白相同或更佳好之毒素片段分子。
噴塗應用係另一實例，及亦為技藝中眾所周知。可適當地配製標的蛋白供所欲的最終用途之用，然後在發現蟲害之前、在發現標的昆蟲之後、在之前也在之後等，噴塗(或按其他方式施用)至待保護的植物及/或植物周圍及/或植物附近。例如，亦可使用技藝中所知的餌粒。
當一昆蟲與一有效量的毒素接觸時，該毒素係經由基因轉殖型植物的表現作用、調配式蛋白組成物、可噴灑式蛋白組成物、一餌料基質或其他輸送系統輸送，結果通常是造成昆蟲死亡，或者昆蟲不再取食製造毒素供應予昆蟲之該來源。
藉著適宜的微生物宿主，如假單胞菌屬(Pseudomonas)，可將該等微生物施用至害蟲的環境中，及讓微生物在該處增殖與被取食。結果是防治了害蟲。任擇地，可在延長毒素活性及使得細胞穩定之條件下，處理承
載該毒素基因之微生物宿主。然後可將仍保有毒性活性之經處理的細胞，施用至標的害蟲的環境中。
寡核苷酸探針之研發。用於辨識本發明的毒素與基因之另一方法係經由使用寡核苷酸探針。該等探針係可檢測的核苷酸序列。可藉由一適當的放射性標記而使得該等序列成為可檢測的，或可使其本身發螢光，如第6,268,132號美國專利所述。如技藝中所眾所周知，若探針分子與核酸試樣藉由形成該二分子之間的強鹼基配對鍵結而雜交，則可合理地假定，該探針與試樣具有實質的序列同源性。較佳藉由技藝中眾所周知的技術，在嚴格條件下進行雜交作用，如Keller與Manak於1993年乙文中所述。探針檢測作用提供了按一已知方式測定雜交作用是否發生之一種方法。該探針分析提供一種用於辨識本發明的毒素編碼基因之快速方法。可使用DNA合成器與標準程序，合成作為本發明的探針之核苷酸節段。該等核苷酸序列亦可作為用於擴增本發明的基因之PCR引子。
核酸雜交作用。如嫻熟分子生物學的人士所眾所周知，二核酸的相似性之特徵可在於其等雜交之傾向。如本申請案中所用之“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”等詞，係指在該等條件下，可檢測出一探針與其標的序列之雜交(黏合)程度係高於與其他序列的雜交作用(如至少為背景的2倍以上)。嚴格條件係具有序列依賴性，並且在不同的情況不盡相同。藉由控制雜交作用及/或清洗條件的嚴格性，可辨識出與探針100%互補之標的序列(同源探測)。任
擇地，可調整嚴格條件，以容許在序列中有一些錯誤配對，而得以檢測出較低程度的相似性(異源探測)。一般而言，一探針的長度係少於約1000個核苷酸，其長度較佳少於500個核苷酸。
典型地，嚴格條件係在pH 7.0至pH 8.3之鹽濃度低於約1.5M的鈉離子，通常約0.01至1.0M的鈉離子濃度(或其他鹽類)之該等條件，及用於短探針(如10至50個核苷酸)之溫度係至少約30℃，而用於長探針(如超過50個核苷酸)之溫度係至少約60℃。亦可藉由添加去穩定劑諸如甲醯胺而達到嚴格條件。例示性低度嚴格條件係包括在37℃用30%至35%甲醯胺、1M氯化鈉、1% SDS(正十二烷硫酸鈉)所組成的緩衝溶液進行雜交作用，及在50℃至55℃用1X至2X SSC(20X SSC為3.0M氯化鈉/0.3M檸檬酸三鈉)清洗。例示性中度嚴格條件係包括在37℃用40%至45%甲醯胺、1M氯化鈉、1% SDS中進行雜交作用，及在55℃至60℃在0.5X至1X SSC中清洗。例示性高度嚴格條件係包括在37℃用50%甲醯胺、1M氯化鈉、1% SDS進行雜交作用，及在60℃至65℃在0.1X SSC中清洗。選擇性地，清洗緩衝液可包含約0.1%至約1%的SDS。雜交期間一般少於約24小時，通常約4至12小時。
特異性通常受到雜交後清洗作用之影響，關鍵因素為最終清洗溶液的離子強度與溫度。就DNA/DNA雜交體而言，熱熔點(Tm)係一互補標的序列中的50%與一完全配對的探針雜交之溫度(在所界定的離子強度與pH值之
下)。Tm係因著每1%的錯誤配對而降低約1℃；因而，可調整Tm、雜交條件及/或清洗條件，以促進具所需一致性之序列的黏合作用。例如，若尋求一致性高於90%之序列，Tm可降低10℃。一般而言，在所界定的離子強度與pH值，所選擇的嚴格條件係低於特定序列及其補體的Tm約5℃。然而，可使用高度嚴格條件，其進行雜交及/或清洗作用的溫度係比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃；可使用中度嚴格條件，其進行雜交及/或清洗作用的溫度係比Tm低6℃、7℃，8℃、9℃或10℃；及可使用低度嚴格條件，其進行雜交及/或清洗作用的溫度係比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃。
可藉由實驗測定Tm(以℃為單位)，或藉由計算推估Tm的近似值。就DNA-DNA雜交體而言，可從Meinkoth與Wahl(1984年乙文)的公式來推估Tm的近似值：Tm(℃)=81.5℃+16.6(log M)+0.41(GC%)-0.61(甲醯胺%)-500/L；其中M為單價陽離子的莫耳濃度，GC%為DNA中的鳥嘌呤核苷與胞嘧啶核苷酸百分比，甲醯胺%係雜交溶液中的甲醯胺百分比，及L係以鹼基對為單位的雜交體長度。任擇地，藉由下列公式(Beltz於1983年乙文)說明Tm：Tm(℃)=81.5℃+16.6(log[鈉+])+0.41(GC%)-0.61(甲醯胺%)-600/L，其中[鈉+]係鈉離子莫耳濃度，GC%為DNA中的鳥嘌呤核苷與胞嘧啶核苷酸百分比，甲醯胺%係雜交溶液中的甲醯胺百分比，及L係以鹼基對為單位的雜交體長度。
藉由該等公式、雜交與清洗組成物及所欲的Tm，一般技術人員將明白在本質上已說明了雜交及/或清洗溶液的嚴格性之變異。若所欲的錯誤配對程度造成Tm低於45℃(水溶液)或32℃(甲醯胺溶液)，較佳增加SSC的濃度，以使得可採用較高的溫度。關於核酸雜交作用的詳盡指南可見P.Tijssen所著“用核酸探針進行雜交作用(Hybridization with Nucleic Acid Probes)”乙書第1冊(1993年出版，ISBN-10：0444898840，精裝本ISBN-13：9780444898845)及Ausubel等人於1995年乙文。亦見Sambrook等人於1989年乙文。
建構編碼DIG-657殺昆蟲毒素的表現質體及在細菌宿主中表現。使用標準選殖方法來建構螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)(Pf)表現質體，該表現質體係經基因工程設計而產生由植物最佳化編碼區所編碼的全長式DIG-657蛋白。從新英格蘭生物實驗室(New England BioLabs)公司(NEB；美國麻州伊普斯維奇(Ipswich))取得限制性內切酶與T4 DNA接合酶，以分別用於限制性酶切作用與DNA接合作用。按照供應商針對低套數質體純化作用之說明書，使用NucleoSpin®質體套組(美國賓州伯利恒(Bethlehem)的馬歇雷-納格爾(Macherey-Nagel)有限公司)，進行質體製備作用。在瓊脂糖Tris-醋酸鹽凝膠電泳之後，使用QIAquick®凝膠萃取套組(荷蘭林堡省(Limburg)芬洛
(Venlo)的凱傑(Qiagen)公司)，純化DNA片段。
使用含有供選殖用的特異性限制酶酶切位點之基因特異性引子，從親代蘇力菌菌株PS46L/DBt11889擴增編碼DIG-657的基因。然後使用傳統的接合選殖方法，將所產生的DIG-657聚合酶鏈反應(PCR)產物選殖至螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)表現載體pDOW1169中。
基本選殖策略係涉及將DIG-657毒素編碼序列(CDS)(序列辨識編號：1)次選殖至pDOW1169中的SpeI與SalI限制酶酶切位點，從而將其置於來自質體pKK223-3(美國威斯康辛州密爾瓦基的PL法瑪西亞(PL Pharmacia)公司)的Ptac啟動子與rrnBT1T2終止子的表現作用控制之下。pDOW1169係一中等套數質體，其具有RSF1010複製起點、一個pyrF基因及位於限制酶辨識位點之前的一個核糖體結合位點，而該等限制酶辨識位點係將含有蛋白編碼區的DNA片段係導入之處(美國申請案20080193974)。藉由電穿孔作用，將稱作pDOW1169的表現質體轉形至DC454(一種近野生型螢光假單胞菌(P.fluorescens)菌株及其具有δpyrF與lsc：：lacIQI突變作用)或其衍生物中，從SOC-大豆水解物培養基中回收，及接種在篩選培養基(缺少尿嘧啶的M9葡萄糖瓊脂，同上Sambrook乙文)上。微生物操作之細節可參見Squires等人於2004年乙文、美國專利申請案20060008877、美國專利申請案20080193974及美國專利申請案20080058262，其等在此併入本案以為參考資料。首先藉由小量製備的質體DNA之限制性酶切作用，進行菌
落之篩選。針對所挑選之含有DIG-657毒素的殖株，用四種限制酶進行其質體DNA的酶切作用，及進一步確認序列，以證實插入片段之存在。
在搖瓶中的生長與表現分析。藉由在搖瓶中生長之承載表現構築質體的螢光假單胞菌(P.fluorescens)菌株(pDOW1169)，產生供特徵分析與昆蟲生物分析之DIG-657毒素。將DIG-657培養物的甘油菌種(0.5毫升)接種至具有9.5%甘油之50毫升之所界定的生產培養基(加州霍利斯特(Hollister)的Teknova公司型錄編號3D7426)。最初在振盪下及在30℃培養24小時之後，藉由添加異丙基-β-D-1-硫代半乳哌喃糖苷(IPTG)，而誘發經由Ptac啟動子的DIG-657毒素基因表現作用。在誘發當時及在誘發後的不同時間點進行培養物的採樣。藉由在600nm的光密度(OD600)測量細胞密度。亦可使用適合螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)生長的其他培養基，如Huang等人於2007年乙文及美國專利申請案20060008877中所述。
農桿菌屬(Agrobacterium)轉形作用。在二元植物轉形與表現質體的建構作用中，係使用標準選殖方法。從NEB取得限制性內切酶與T4 DNA接合酶。使用NucleoSpin®質體製備套組或NucleoBond® AX Xtra Midi套組(皆來自德國迪倫(Duren)的馬歇雷-納格爾(Macherey-Nagel)有限公司)，按照廠商的說明書進行質體製備作用。
在凝膠分離作用後，使用QIAquick® PCR純化套組或QIAEX II®凝膠萃取套組(二者均來自荷蘭林堡省(Limburg)芬洛(Venlo)的凱傑(Qiagen)公司)，純化DNA片段。
製備根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株Z707S(Z707之一種具鏈黴素抗性的衍生菌株；Hepburn等人於1985年乙文)的電穿孔勝任細胞細胞，及使用電穿孔作用進行轉形(Weigel與Glazebrook於2002年乙文)。在電穿孔作用後，在光析槽中添加1毫升的酵母萃取蛋白腖(YEP)培養液(10克/公升的酵母萃取物、10克/公升的蛋白腖及5克/公升的氯化鈉)，及將細胞-YEP懸浮液轉移至15毫升的培養管中，在持續攪拌的28℃水浴中培養4小時。將細胞接種至加有瓊脂(25克/公升)的YEP上，其中具有大觀黴素(200微克/毫升)與鏈黴素(250微克/毫升)，及該等平皿在28℃培養2至4天。挑選分離良好的單菌落，及劃線接種至如上述具有大觀黴素與鏈黴素之新的YEP+瓊脂平皿上，及在28℃培養1至3天。
藉由使用載體特異性引子之PCR分析，該載體特異性引子中具有從所挑選的農桿菌屬(Agrobacterium)菌落製備的模板質體DNA，而檢視二元植物轉形載體中是否存在DIG-657基因插入物。按照廠商的說明書，使用凱傑(Qiagen)公司(荷蘭林堡省(Limburg)芬洛(Venio))的Spin®小量製劑，在如上具有大觀黴素與鏈黴素的YEP中生長之15毫升過夜培養物的4毫升等分試樣之細胞沉澱物，進行萃取。將農桿菌屬(Agrobacterium)電穿孔轉形作用中所用的
二元載體之質體DNA，納入作為對照組。按照廠商的說明書，使用來自英杰(Invitrogen)公司(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad))的Taq DNA聚合酶，以0.5X濃度完成PCR反應。在MJ研究(MJ Research)公司的帕耳帖(Peltier)熱循環器上進行PCR反應，該熱循環器的條件設定如下：步驟1)於94℃達3分鐘；步驟2)於94℃達45秒；步驟3)於55℃達30秒；步驟4)就預期產物長度的每個鹼基對，於72℃進行1分鐘；步驟5)回到步驟2共29次；步驟6)於72℃達10分鐘。在循環之後，讓反應維持在4℃。藉由瓊脂糖凝膠電泳(如重量/體積為0.7%至1%的瓊脂糖)分析擴增產物，及藉由溴化乙啶染色作用而可目視觀察。挑選其PCR產物與對照組質體一致之菌落。
DIG-657之生產。藉由離心作用，分離在搖瓶生長之具有表現作用構築質體(pDOW1169)的螢光假單胞菌(P.fluorescens)菌株的細胞，將所得的細胞沉澱物冷凍於-80℃。使用EasyLyseTM細菌性蛋白萃取液(美國威斯康辛州麥迪遜(Madison)的生物科技(Biotechnologies)公司之EPICENTRE®)，從冷凍搖瓶細胞沉澱物試樣產生可溶性與不溶性部分。將各細胞沉澱物懸浮於1毫升的EasyLyseTM溶液中，在溶胞緩衝液中進一步進行1：4之稀釋，及在室溫中振盪培養30分鐘。溶胞產物係在4℃及14,000rpm離心20分鐘，及回收上清液作為可溶性部分。然後將沉澱物(不溶性部分)懸浮於等體積的磷酸鹽緩衝鹽
水(PBS；11.9mM磷酸氫二鈉、137mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀，pH值為7.4)中。
試樣係按1：1的比例與含有β-巰基乙醇的2X拉姆力(Laemmli)試樣緩衝液混合(同上Sambrook等人乙文)，煮沸5分鐘，然後添加至Criterion XT® Bis-Tris 12%凝膠(美國加州赫丘里斯(Hercules)的伯瑞(Bio-Rad)有限公司)。在所建議的XT MOPS緩衝液中進行電泳。按照廠商的操作程序，用Bio-Safe考馬斯(Coomassie)染色劑(美國加州理奇蒙(Richmond)的伯瑞(Bio-Rad)公司)進行凝膠染色作用，及使用阿爾發創新技術(Alpha Innotech)公司(美國加州聖萊昂納多(San Leandro))的成像系統進行成像。
包涵體之製備。DIG-657一般位於含有編碼DIG-657的基因之螢光假單胞菌(P.fluorescens)細胞的可溶性部分。在一些情況下，如SDS-PAGE與MALDI-MS(基質輔助式雷射脫附/離子化質譜法)所示，發現有不等百分比的DIG-657蛋白位於蛋白包涵體(IB)製備物中。為分離來自該部分的該蛋白，將螢光假單胞菌(P.fluorescens)發酵沉澱物置於37℃水浴中解凍。將細胞按25%重量/體積之比例懸浮於溶胞緩衝液(50mM Tris、pH 7.5、200mM氯化鈉、20mM乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉鹽、1% Triton X-100及5mM二硫蘇糖醇(DTT))中；在使用前添加5毫升/公升的細菌性蛋白酶抑制劑雞尾酒(P8465，美國密蘇里州聖路易市的西克瑪艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司)。使用設定於最低的手持式均質機(美國奧
克拉荷馬州巴特爾斯維爾(Bartlesville)的BioSpec Products有限公司之組織撕裂器(Tissue Tearor))，使細胞懸浮。藉由用刮勺混合，將溶菌酶(25毫克之美國密蘇里州聖路易市的西克瑪(Sigma)公司之來自雞蛋蛋清的L7651)添加至細胞懸浮液，讓懸浮液在室溫培養1小時。將該懸浮液置於冰上冷卻15分鐘，然後使用必能信(Branson)超音波細胞破碎儀250型(美國康乃狄克州丹伯里(Danbury))進行音波振動處理(進行為時1分鐘的處理二次，處理週期50%，輸出30%)。藉由顯微鏡檢視細胞溶胞作用。若需要，則再添加25毫克的溶菌酶，及重複培養及音波振動處理步驟。當經由顯微鏡檢視確認細胞溶胞作用時，溶胞產物於11,500 x g離心25分鐘(4℃)，以形成IB沉澱物，及將上清液棄置。然後將IB沉澱物再度懸浮於100毫升的溶胞緩衝液中，用手持式攪拌器進行均質化，及如上述進行離心。藉由再懸浮(於50毫升的溶胞緩衝液中)、均質化、音波振動處理及離心，而重複清洗IB沉澱物，直至上清液成為無色及IB沉澱物變成堅實及灰白色為止。在最後一次清洗中，將IB沉澱物再懸浮於含有2mM EDTA之經無菌過濾(0.22微米)的蒸餾水中，及進行離心。將最終沉澱物再懸浮於含有2mM EDTA之經無菌過濾的蒸餾水中，及分成1毫升的等分試樣儲存於-80℃。
藉由將IB沉澱物之1毫升的等分試樣解凍及用經無菌過濾的蒸餾水進行1：20的稀釋作用，而進行IB製備物的蛋白SDS-PAGE分析與定量分析。稀釋過的試樣然後與4X還原試樣緩衝液一起煮沸[250mM Tris、pH6.8、40%甘油(體積/體積)、0.4%溴酚藍(重量/體積)、8% SDS(重量/體積)及8% β-巰基乙
醇(體積/體積)]，添加至Novex® 4-20% Tris-甘胺酸之12+2孔式凝膠(美國加州卡爾斯巴德的英杰(Invitrogen)公司)上，及用1X Tris/甘胺酸/SDS緩衝液運行(美國加州理奇蒙(Richmond)的伯瑞(BioRad)公司)。凝膠在200伏特運行60分鐘，然後用考馬斯藍進行染色(在45%甲醇、10%乙酸之50% G-250/50% R-250)，及用蒸餾水中的7%乙酸、5%甲醇進行脫色。藉由比較該等條帶相對於牛血清白蛋白(BSA)試樣之密度測量數值，而完成標的條帶之定量分析，該牛血清白蛋白試樣係在相同凝膠上運行以產生一標準曲線。
包涵體的溶解化作用。在微量試管式的5415C型微量離心機之最高設定(約14,000 x g)上，進行6毫升的包涵體懸浮液(含有32毫克/毫升的DIG-657蛋白)之離心作用，以將包涵體沉澱。在一個50毫升的錐形管中，移除儲存緩衝液的上清液，及置換為25毫升之pH值為11的100mM碳酸鈉緩衝液。使用一吸量管使包涵體再懸浮，及渦旋使之完全混合。在4℃，將試管置於一個輕緩搖動平臺上過夜，以萃取標的蛋白。萃取物係於4℃及30,000 x g離心30分鐘，及使用艾美康恩(Amicon)Ultra-15再生型纖維素離心過濾裝置(分子量截止點為30,000；美國麻薩諸塞州比勒麗卡(Billerica)之密里博(Millipore)公司)，將所產生的上清液濃縮5倍。然後，使用拋棄式PD-10管柱(美國紐澤西州皮斯卡特維(Piscataway)的GE醫療保健(GE Healthcare)公司)，將試樣緩衝液換為pH值為10的10mM CAPS[3-(環
己胺基)1-丙磺酸]。
凝膠電泳。藉由在含有5mM的二硫蘇糖醇作為還原劑之NuPAGE® LDS試樣緩衝液(美國加州卡爾斯巴德的英杰公司)中按1：50的比例稀釋，及在95℃加熱4分鐘，而製備供電泳所用之濃縮萃取物。在自0.2至2微克/泳道的五個BSA標準品(用於繪製標準曲線)旁邊，將試樣加載至4-12% NuPAGE®凝膠的二重複泳道中。使用MOPS SDS電泳緩衝液(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)，施用200伏特的電壓，直到追蹤染料到達凝膠底部為止。凝膠係使用位於45%甲醇、10%乙酸中的0.2%考馬斯藍G-250進行染色；及首先用45%甲醇、10%乙酸短暫脫色，然後用7%乙酸、5%甲醇進行長時間脫色，直至背景被清除為止。在脫色作用之後，用伯瑞(Bio-Rad)公司的Fluor-S多重成像器(MultiImager)掃描凝膠。使用該儀器的第4.5.2版Quantity One軟體，而得扣除背景值之經染色的蛋白條帶之體積，及產生BSA標準曲線，以用於計算儲備溶液中的DIG-657蛋白濃度。
DIG-657純化作用。按照Lee,M.K.等人(2003年乙文)所述之VIP3的類似方式，進行DIG-657的純化作用，其中將經DIG-657基因轉形之螢光假單胞菌的細胞化霜解凍；在0.5毫升的蛋白酶抑制劑雞尾酒(美國密蘇里州聖路易市的西克瑪(Sigma)公司)存在下，將細胞懸浮在萃取緩
衝液(10mM Tris-HCl、2mM EDTA、2mM DTT)中；及以音波振動處理五次，每次1分鐘，在各次的音波振動處理循環之間，靜置於冰上達1分鐘。該溶液於20,000 x g離心10分鐘，收集上清液及施用至MonoQ離子交換管柱(1公分直徑X10公分長度)。藉由在離子交換管柱(MonoQ 1010，紐澤西州皮斯卡特維市的GE醫療(GE Healthcare)公司)上循序色層分析，藉由疏水性色層分析，及藉由尺寸排阻色層分析，而達成蛋白純化作用。最終的製備物顯示單一的蛋白條帶，其按約90kDa的表觀分子量運行。
試樣製備作用與生物分析法。在pH值為10的10mM CAPS中適當稀釋DIG-657的純化製備物，及在所有生物分析法中包括由該緩衝液所組成的一對照處理，其係作為對於死亡率及/或生長抑制作用之背景檢查。藉由使用牛血清白蛋白(BSA)的凝膠電泳，建立供凝膠密度測定所用的標準曲線，該凝膠密度係使用伯瑞(Bio-Rad)公司(美國加州理奇蒙(Richmond))的成像系統(具有第4.5.2版Quantity One軟體的Fluor-S多重成像器(MultiImager))測量，而估算生物分析緩衝液中的蛋白濃度。在讀取之前，凝膠基質中的蛋白係用考馬斯藍式染劑進行染色，及進行脫色。
在餵食人工昆蟲食料之蟲齡1至2天的鱗翅目昆蟲的新生幼蟲中，進行生物分析，以試驗純化蛋白的殺昆蟲活性。玉米穗蟲、SBL、菜蛾、VBC、歐洲玉米螟、秋
行軍蟲及菸草芽蟲的幼蟲係從一商業昆蟲飼養所(美國賓州卡萊爾(Carlisle)的Benzon Research有限公司)所養育之昆蟲群體所得的蟲卵孵化出來。rECB與rFAW的幼蟲係從專屬群體(美國印第安那州印第安那波里之道氏益農(Dow AgroSciences LLC)公司)採集的蟲卵孵化出來。
在專為昆蟲生物分析所設計的128孔式塑膠盤(美國紐澤西州皮特曼(Pitman)的C-D國際(C-D International)公司)中，進行生物分析。各孔含有2.0毫升的多物種式鱗翅目昆蟲食料(美國阿肯色州湖村(Lake Village)的南地產品(Southland Products)公司)。藉由吸量管將40微升等分試樣的蛋白試樣輸送至各孔之2.0平方公分的食料表面(20微升/平方公分)。食料濃度係按孔中每平方公分(cm2)的表面積之DIG-657蛋白量(奈克)計算。使用自9,000至3奈克/平方公分之9種劑量濃度範圍，每種劑量使用16隻幼蟲進行試驗。將經處理的塑膠盤放置在通風櫥中，直到食料表面上的液體蒸發或被吸收進入食料中為止。
在孵化後24至48小時內，用濕駝毛刷拾起個別幼蟲及放置在經處理過的食料上，每孔放置1隻幼蟲。然後用透明塑料黏合片將受侵染的孔密封，並通風以容許氣體交換(美國紐澤西州皮特曼(Pitman)的C-D國際(C-D International)公司)。將生物分析盤放置在受控的環境條件(28℃，相對濕度約60%，16小時：8小時的[光：暗])五天，之後記錄暴露於各蛋白試樣的昆蟲總數，死亡昆蟲的數目及存活昆蟲的重量。計算各項處理之死亡百分比及生
長抑制百分比。使用下列公式計算生長抑制作用(GI)：GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]其中TWIT為該項處理中的昆蟲總重，TNIT為該項處理中的昆蟲總數，TWIBC為背景檢查(緩衝液對照組)中的昆蟲總重，及TNIBC為背景檢查(緩衝液對照組)中的昆蟲總數。
所測定的GI50係使得GI數值為50%之食料中的DIG-657蛋白濃度。50%致死濃度(LC50)係記錄為殺滅50%的試驗昆蟲之食料中的DIG-657蛋白濃度。經由第9.0.3版JMP Pro軟體(美國北卡羅來納州卡瑞(Cary)的賽仕電腦軟體(SAS Institute)股份有限公司)，使用非線性邏輯三種參數，測定生長抑制濃度-回應曲線。藉由并合死亡率數據的Probit分析(Finney於1971年乙文)，及使用POLO-PC(LeOra軟體)，進行致死濃度-回應曲線之分析。
表2顯示在歐洲玉米螟、具cry1F抗性的歐洲玉米螟(rECB)、菸草芽蟲、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)(沃克氏(Walker))(大豆尺蠖(SBL))、藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(胡伯納氏(Hübner))(藜豆毛蟲(VBC))、玉米穗蟲、秋行軍蟲、具cry1F抗性的秋行軍蟲(rFAW)及菜蛾上之DIG-657蛋白的生物分析結果。一項意想不到且令人驚訝的發現係在於rECB試驗昆蟲對於DIG-657蛋白的作用之易受影響程度，該程度即使不高於歐洲玉米螟昆蟲的易受影響型菌株，也是與其相當。
表2
使用新生幼蟲，藉由表面污染進行棉鈴實夜蛾(Helicoverpa armigera)之生物分析。在具有128個單元格的盤上進行毒性試驗，每個單元格細胞為2平方公分。使用25與2500奈克/平方公分之濃度來測定死亡百分比，對照組則僅使用緩衝液(表3)。使用七種不同的純化型原毒素濃度，進行試驗而測定LC50數值，對照組則僅使用緩衝液(表4)。在25℃及16小時：8小時的光：暗條件七天之後，評估死亡率及靜止不動的狀態。針對死亡與L1靜止不動的幼蟲評分，而得“功能性死亡率”。結果顯明DIG-657對抗棉鈴實夜蛾(Helicoverpa armigera)之活性。
表3在人工飼料生物分析上試驗之DIG-657引發的棉鈴實夜蛾(Helicoverpa armigera)死亡百分比
阿拉伯芥屬(Arabidopsis)轉形作用。使用花序浸染方法(Weigel與Glazebrook於2002年乙文)，將阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)Col-01轉形。使用所挑選的農桿菌屬(Agrobacterium)菌落及接種在YEP培養液中之1毫升至15毫升的培養物，YEP培養液中含有供篩選用的適當抗生素。該培養物在220rpm持續攪拌下，在28℃培養過夜。各培養物係用於接種在YEP培養液中之二個500毫升的培養物，YEP培養液中含有供篩選用的適當抗生素，及新培養物在28℃與持續攪拌下培養過夜。在室溫中，藉由在約
8700 x g離心10分鐘而將細胞沉澱，將所產生的上清液棄置。將細胞沉澱物輕緩地再懸浮於500毫升的感染液中，該感染液含有：1/2x馬氏(Murashige)與史氏(Skoog)鹽(西克瑪艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司)/甘柏格(Gamborg)維生素B5(美國密蘇里州聖路易市的戈德生物技術(Gold BioTechnology)公司)、10%(重量/體積)蔗糖、0.044μM苄基胺基嘌呤(10微升/公升之位於DMSO中的1毫克/毫升之儲備溶液)及300微升/公升的Silwet L-77。將植齡約1個月的植物在感染液中浸染15秒，需小心謹慎，以確保最新的花序浸沒其中。將植物側放及覆蓋(透明或不透明)達24小時，用水清洗，及直立放置。該等植物係在22℃及16小時：8小時之光：暗的光照期生長。在浸染後約4個星期，採收種子。
阿拉伯芥屬(Arabidopsis)之生長與篩選。讓剛採收下來的T1種子在室溫及乾燥劑存在下乾燥至少7天。讓種子懸浮於0.1%瓊脂/水溶液(西克瑪艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司)中，然後在4℃層積2天。為預備栽種，將Sunshine Mix LP5(美國華盛頓州貝爾維尤(Bellevue)的尚果園藝(Sun Gro Horticulture)有限公司)置入10.5英吋x21英吋的萌芽盤(美國明尼蘇達州清水城(Clearwater)的堤奧塑膠(T.O.Plastics)有限公司)中，用細蛭石覆蓋，用荷阿格蘭氏(Hoagland)培養液(Hoagland與Arnon於1950年乙文)地下灌溉直至潮濕為止，然後讓其排水24小時。將層積種子播種至蛭石上，及蓋上濕度罩(加拿大安大略省布蘭里
亞(Bramalea)的闊德製品(KORD Products)公司)達7天。種子發芽，及在恆定溫度(22℃)與濕度(40至50%)下，在120至150微莫耳/平方公尺秒的光強度之長日照條件(16小時：8小時之光：暗的光照期)下，讓植株生長在一個Conviron(型號CMP4030或CMP3244；加拿大馬尼托巴省(Manitoba)布蘭里亞(Winnipeg)的受控環境(Controlled Environments Limited)有限公司)中。起初用荷阿格蘭氏(Hoagland)培養液澆灌植株，隨後用去離子水澆灌，保持土壤濕潤但不潮濕。
在播種5至6天後，將濕度罩移開，及在植株上噴灑一化學篩選劑，以除滅從非轉形種子萌發的植株。例如，若二元植物轉形載體所提供的植物可表現型可篩選標記基因係一pat或bar基因(Wehrmann等人於1996年乙文)，可藉由噴灑1000X的Finale溶液(5.78%固殺草(glufosinate)銨鹽，美國亞利桑那州鳳凰城(Phoenix)的法納姆(Farnam)有限公司)，而篩選轉形植株。間隔5至7天再進行後續的二次噴灑。在最後一次噴灑之7至10天後，確認存活植株(生長旺盛的植株)，及移植至用Sunshine Mix LP5所預備的盆中。用濕度罩覆蓋移植後的植物達3至4天，及在上述生長條件下，置於Conviron中。
嫻熟雙子葉植物轉形作用的技術人員將明白，當使用其他的植物可表現型可篩選標記基因(如除草劑抗性基因)時，有其他方法可供篩選轉形植株之用。
包含DIG-657的基因轉殖型大豆(Glycine max)。按技藝中所知之方式，例如包括藉由農桿菌屬(Agrobacterium)媒介型轉形作用，產生10至20株基因轉殖型T0大豆(Glycine max)植株及其中承載了供含有DIG-657的核酸所用之表現載體。用氯氣過夜進行成熟的大豆(Glycine max)種子的滅菌作用達16小時。在氯氣滅菌作用後，將種子置於LAMINARTM層流通風櫥中的一個開口容器中，以驅散氯氣。接著，使用黑箱，讓經滅菌的種子在24℃及在黑暗中吸入無菌的水達16小時。
製備對半剖開的大豆種子。包含一部分的胚軸之對半剖開的大豆種子之操作，需要使用固定在解剖刀上的10號刀片縱向切割而製備大豆種子材料，其係沿種子的種臍分離與除去種皮，及將種子分成兩個子葉部分。仔細留意除去部分的胚胎軸，其中約1/2至1/3的胚軸仍附著在子葉的節端。
接種。然後將包含一部分的胚軸之對半剖開的大豆種子浸沒在含有包含DIG-657的二元質體之根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(如菌株EHA 101或EHA 105)之一溶液中約30分鐘。在將包含胚軸的子葉浸入之前，將根癌農桿菌溶液稀釋至λ=0.6 OD650的最終濃度。
共同培養。在接種之後，在覆蓋一張濾紙的培養皿中，讓對半剖開的大豆種子與根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株在共同培養基(美國紐澤西州胡馬納(Humana)出版社於2006年付梓之王侃所著“農桿
菌操作程序(Agrobacterium Protocols)”乙書2.1)中共同培養5天。
誘導芽體形成。在共同培養5天之後，對半剖開的大豆種子係在由B5鹽類、B5維生素，28毫克/公升的二價鐵、38毫克/公升的Na2EDTA、30克/公升的蔗糖、0.6克/公升的MES、1.11毫克/公升的BAP、100毫克/公升的TIMENTINTM、200毫克/公升的頭孢塔新(cefotaxime)及50毫克/公升的萬古黴素(pH 5.7)所組成之液態誘導芽體形成(SI)培養基中清洗。對半剖開的大豆種子然後在由B5鹽類、B5維生素、7克/公升的諾布爾(Noble)瓊脂、28毫克/公升的二價鐵、38毫克/公升的Na2EDTA、30克/公升的蔗糖、0.6克/公升的MES、1.11毫克/公升的BAP、50毫克/公升的TIMENTINTM、200毫克/公升的頭抱塔新(cefotaxime)、50毫克/公升的萬古黴素(pH值為5.7)所組成之誘導芽體形成I(SI I)培養基上培養，讓子葉的平坦側朝上及子葉的節端嵌入至培養基中。在培養2個星期之後，將來自轉形的對半剖開式大豆種子之外植體轉移至含有SI I培養基的誘導芽體形成II(SI II)培養基，其中補充了6毫克/公升的固殺草(glufosinate)(LIBERTY®)。
芽體伸長作用。在SI II培養基上培養2個星期之後，從外植體移除子葉，及藉由在子葉的基部作個切口而切除含有胚軸的萌芽枕。將從子葉所分離的芽體枕轉移至芽體伸長(SE)培養基中。SE培養基係由MS鹽類、28毫克/公升的二價鐵、38毫克/公升的Na2EDTA、30克/公升的蔗
糖與0.6克/公升的MES、50毫克/公升的天冬醯胺酸、100毫克/公升的L-焦麩胺酸、0.1毫克/公升的IAA、0.5毫克/公升的GA3、1毫克/公升的玉米素核糖苷、50毫克/公升的TIMENTINTM、200毫克/公升的頭孢塔新(cefotaxime)、50毫克/公升的萬古黴素、6毫克/公升的固殺草(glufosinate)、7克/公升的諾布爾(Noble)瓊脂(pH 5.7)所組成。每二個星期將培養物轉移至新的SE培養基。培養物係在24℃的CONVIRONTM生長箱中生長，及每日用80至90微莫耳/平方公尺秒的光強度光照18小時。
生根。藉由在子葉芽體枕的基部切除伸長的芽體，而將從子葉芽體枕發出的伸長芽體分離出來，及將伸長的芽體浸沒在1毫克/公升的IBA(吲哚3-丁酸)達1至3分鐘，以促進生根。接著，將伸長的芽體轉移至植物培養皿中的生根培養基(MS鹽類、B5維生素、28毫克/公升的二價鐵、38毫克/公升的Na2EDTA、20克/公升的蔗糖與0.59克/公升的MES、50毫克/公升的天冬醯胺酸、100毫克/公升的L-焦麩胺酸、7克/公升的諾布爾(Noble)瓊脂，pH值為5.6)。
栽培。在24℃及每日光照18小時的CONVIRONTM生長箱培養1至2個星期之後，將已長出根部的芽體轉移至一個有蓋的聖代冰淇淋杯中之土壤混合物，及放入在光強度為120至150微莫耳/平方公尺秒的長日照條件(16小時光/8小時暗)及恆定溫度(22℃)與濕度(40至50%)下之CONVIRONTM生長箱(型號CMP4030與
CMP3244，加拿大馬尼托巴省(Manitoba)布蘭里亞(Winnipeg)的受控環境(Controlled Environments Limited)有限公司)，以讓小植株適應。讓已生根的小植株在聖代冰淇淋杯中適應數個星期，然後轉移至溫室，以進一步適應及長成健壯的基因轉殖型大豆植物。
將基因轉殖型品系的發育及形態特徵與非轉形植物相比較。比較植物根部、芽體、葉部及繁殖特徵。並未在基因轉殖型植物與非轉形植物觀察到根長度與生長模式之差異。植物芽體特徵諸如高度、葉片數目與大小、花期、花卉大小與外觀皆相近。一般而言，當在試管內及在溫室的土壤中培養時，並未在基因轉殖型品系與該等未表現DIG蛋白者之間觀察到形態上的差異。
玉米的農桿菌屬(Agrobacterium)媒介型轉形作用。將來自High II或B-104 F1雜交植株的種子(Armstrong等人於1991年乙文)種植在裝有95% Metro-Mix 360無土生長培養基(美國華盛頓州貝爾維尤(Bellevue)的尚果園藝(Sun Gro Horticulture)有限公司)與5%黏土/壤土的混合物之5加侖盆中。植物在溫室中生長，溫室中係採用高壓鈉燈與金屬鹵化物燈之組合及16：8小時的光：暗光照期。進行受控型近緣授粉作用，以獲得供轉形用的未成熟F2胚芽。在授粉後8至10天，當胚芽尺寸約為1.0至2.0毫米時，
將未成熟的胚芽分離出來。
感染作用與共同培養。藉由用液體肥皂擦洗，在70%乙醇中浸泡2分鐘，然後浸沒於20%市售漂白劑(0.1%次氯酸鈉)中30分鐘，隨後用無菌水沖洗，而進行玉米穗表面的消毒工作。農桿菌係在含有100毫克/公升的大觀黴素、10毫克/公升的四環黴素及250毫克/公升的鏈黴素之YEP固態培養基及28℃生長2至3天，及藉由將1至2個接種環的細菌轉移至5毫升之含有100μM乙醯丁香酮的液態感染培養基(LS基礎培養基(Linsmaier與Skoog於1965年乙文)、N6維生素(Chu等人於1975年乙文)、1.5毫克/公升的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、68.5克/公升的蔗糖、36.0克/公升的葡萄糖、6mM L-脯胺酸，pH值為5.2)，而製備含有一超級二元載體之農桿菌屬(Agrobacterium)細胞懸浮液。將該溶液渦旋直至懸浮液均勻為止，使用具有紫色濾波器的克萊特-薩默森((Klett-Summerson)比色計，將濃度調整為最終密度約為200克萊特(Klett)單位，或在550nm的光密度約為0.4。將未成熟的胚芽分離及直接置入一個含有2毫升的感染培養基之微量離心管中。將培養基移除，及更換為1毫升之密度為200克萊特(Klett)單位的農桿菌屬(Agrobacterium)溶液，農桿菌屬(Agrobacterium)與胚芽溶液係在室溫培養5分鐘，然後轉移至共同培養基(LS基礎培養基(含有N6維生素、1.5毫克/公升的2,4-D、30.0克/公升的蔗糖、6mM L-脯胺酸、0.85毫克/公升的硝酸銀、100μM乙醯丁香酮及3.0克/公升的結蘭膠(Gellan)(美國堪薩斯
州列涅薩(Lenexa)的植物技術實驗室(PhytoTechnology Laboratories)公司)，pH值為5.8)，在25℃與黑暗條件下培養5天。
在共同培養之後，將胚芽轉移至篩選培養基，在此之後，在約8個星期之期間獲得轉形分離株。使用LS基礎培養基(具有1X N6維生素、1.5毫克/公升的2,4-D、0.5克/公升的MES(2-(N-啉基)乙磺酸單水合物；美國堪薩斯州列涅薩(Lenexa)的植物技術實驗室(PhytoTechnology Laboratories)公司)、30.0克/公升的蔗糖、6mM L-脯胺酸、1.0毫克/公升的硝酸銀、250毫克/公升的頭孢塔新(cefotaxime)、2.5克/公升的結蘭膠(Gellan)之LS基礎培養基，pH值為5.7)及畢拉草(bialaphos)(美國密蘇里州聖路易市的戈德生物技術(Gold BioTechnology)公司)，篩選經含有一植物可表現型pat或bar可篩選標記基因之超級二元質體轉形的玉米組織。將胚芽轉移至含有3毫克/公升的畢拉草(bialaphos)的篩選培養基中，直至獲得胚性分離株為止。藉由每隔2個星期轉移至新的篩選培養基，而讓所得的分離株茁壯起來，以供再生與進一步分析之用。嫻熟玉米轉形作用的技術人員將明白，當使用其他的植物可表現型可篩選標記基因(如除草劑抗性基因)時，有其他方法可供篩選轉形植株之用。
將包含於質體pDAB114534與pDAB114535中之DIG-657的二種不同構築質體(序列辨識編號：5與序列辨識編號：6)(表5)轉形至玉米中。再生T0植物及試驗其等防
治標的昆蟲害蟲之能力。構築質體pDAB115782係含有YFP(黃色螢光蛋白)的基因之一質體，其係作為經一非殺昆蟲性基因轉形的植物之負對照組。
以二重複方式，從V5 T0基因轉殖型植物的V3或V4葉片切下1.0X0.5平方英吋的葉片。就各項試驗而言，先進行野生型植物葉片組織的取樣，再進行轉形植物的取樣，以避免在葉片邊緣上之蘇力菌毒素的交叉污染。在生物分析盤的各孔(加蓋的32孔式盤，美國紐澤西州皮特曼(Pitman)的CD國際(CD International)公司)中，將所切下的一葉片置於2%水-瓊脂(美國紐澤西州費爾勞恩(Fair Lawn)的飛世爾科技(Fisher Scientific)公司)上，及就各昆蟲物種、各事件及各構築質體重複該項操作二次。用10隻新生
(蟲齡24至48小時)的歐洲玉米螟或條螟(Diatraea saccharalis)(費氏(Fabricius))(甘蔗螟蟲“SCB”)感染各孔，及用穿孔的塑膠蓋密封，以讓空氣流通。將該等盤置於28℃(16：8小時的光：暗，40%相對濕度)，及三天後就葉片損傷百分比評定等級。藉由使用JMP® Pro 9.0.1(美國北卡羅來納州卡瑞(Cary)的賽仕電腦軟體(SAS Institute)股份有限公司於2010年上市)，用ANOVA分析葉片損傷百分比數據；當變異數同質時，則用圖基-克拉馬(Tukey-Kramer)檢定分析平均分隔。所觀察到之各昆蟲物種在基因轉殖型植物材料上所造成的葉片損傷水平係示於表6。
相較於YFP負對照組構築質體(115782)，114534與114535構築質體所造成的平均損傷皆較少。表現全長式DIG-657蛋白之構築質體114534所展現的昆蟲活性係大於
表現截短型DIG-657蛋白的構築質體114535。
再生作用與產生種子。就再生作用而言，將培養物轉移至“28”誘導培養基(MS鹽類與維生素、30克/公升的蔗糖、5毫克/公升的苄基胺基嘌呤、0.25毫克/公升的2,4-D、3毫克/公升的畢拉草(bialaphos)、250毫克/公升的頭孢塔新(cefotaxime)、2.5克/公升的結蘭膠(Gellan)，pH值為5.7)，先在低光密度條件(14μEm-2s-1)下一個星期，然後在高光密度條件(約89μEm-2s-1)下一個星期。之後將組織轉移至“36”再生培養基(除了缺少植物生長調節劑之外，其餘與誘導培養基相同)。將長度為3至5公分的小植株轉移至玻璃培養試管中，其中含有SHGA培養基(申克氏(Schenk)與希爾德布蘭特氏(Hildebrandt)鹽類與維生素(1972年乙文)；美國堪薩斯州列涅薩(Lenexa)的植物技術實驗室(PhytoTechnology Laboratories)公司)、1.0克/公升的肌醇、10克/公升的蔗糖與2.0克/公升的結蘭膠(Gellan)，pH值為5.8)，以讓其繼續生長及發育出芽體與根部。將植物移植至本申請案先前所述的相同土壤混合物中，及讓其在溫室中生長至開花。進行受控式授粉作用，以產生種子。
設計DIG-657蘇力菌殺昆蟲蛋白的編碼序列之植物最佳化版本。設計及合成具有植物密碼子偏移之一DNA序列，以在基因轉殖型單子葉植物與雙子葉植物中產生
DIG-657蛋白。從寄存在基因資料庫(GenBank)的序列所得之706個蛋白編碼序列(CD)，計算玉米(Zea mays L.)的密碼子使用表。從網站http：//www.kazusa.or.jp/codon/的資料下載菸草(菸草(Nicotiana tabacum)，1268個編碼序列)；油菜(西洋油菜(Brassica napus)，530個編碼序列)；棉花(陸地棉(Gossypium hirsutum)，197個編碼序列)；及大豆(大豆(Glycine max)；約1000個編碼序列)之密碼子使用表。將使用率佔該胺基酸在任一植物類型中的總密碼子使用之約10%以下的任何冗餘密碼子略去之後，按經適當權重的平均相對量，計算包含玉米與雙子葉植物資料集所共有的高度使用密碼子之一偏移密碼子組。為了導出編碼DIG-657蛋白的一植物最佳化序列，進行密碼子取代作用及以實驗方式測定DIG-657DNA序列，以使得所產生的DNA序列具有植物最佳化密碼子偏移表的整體密碼子組成。進一步改進該序列，以除去不良的限制酶辨識位置、潛在的植物內含子剪接位置、長串的A/T或C/G殘基及可能干擾植物細胞中的編碼區之mRNA安定性、轉錄作用或轉譯作用之其他基序。所進行的其他改變係導入所欲的限制酶辨識位置及除去長的內部開放讀框(+1以外的框)。該等改變皆在保有植物偏移型密碼子組成的限制之內進行。所設計序列的合成作用係由商業供應商(美國加州門洛帕克(Menlo Park)的DNA2.0公司)進行。關於合成基因的生產之其他指南，例如可見於WO 97/13402與第5,380,831號美國專利。編碼DIG-657變異體1之一玉米最佳化DNA序列係示於序列辨識
編號：3。編碼DIG-657變異體2之一螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)最佳化DNA序列係示於序列辨識編號：4。編碼DIG-657之一玉米最佳化的高GCDNA序列係示於序列辨識編號：5。編碼從N端截斷204個胺基酸的DIG-657基因之一玉米最佳化的高GCDNA序列係示於序列辨識編號：6。編碼全長式DIG-657之一雙子葉植物最佳化DNA序列係揭露為序列辨識編號：8。編碼截短型DIG-657之一雙子葉植物最佳化DNA序列係揭露為序列辨識編號：9。
藉由標準方法(同上Sambrook等人乙文)，在具有放射性標記的基因特異性探針之南方印漬上，進行固定化DNA之雜交作用。用於標記聚核苷酸探針的放射性同位素包括32磷、33磷、14碳或3氫。可藉由嫻熟分子生物學領域的技術人員眾所周知的數種方法中之任一者，將放射性同位素納入聚核苷酸探針分子中(如見同上Sambrook等人乙文)。一般而言，雜交作用與後續的清洗作用係在嚴格條件下進行，而得以檢測與所申請專利之毒素編碼基因同源的標的序列。就雙股DNA基因探針而言，雜交作用係在6X SSPE、5X丹哈特氏(Denhardt)溶液、0.1% SDS、0.1毫克/毫升的變性DNA[20X SSPE為3M氯化鈉、0.2M NaHPO4及0.02M EDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)；100X丹哈特氏(Denhardt)溶液(20克/公升的聚乙烯吡咯啶酮、20克/公升的菲可(Ficoll)400型及20克/公升的BSA組分V)中，在比DNA雜交體的Tm低20℃至25℃之溫度進行過夜。
通常按下列方式進行清洗作用：
a.在1X SSPE、0.1% SDS(低度嚴格性清洗)及室溫中清洗15分鐘二次(低度嚴格性清洗)。
b.在0.2X SSPE、0.1% SDS及比Tm低20℃之溫度清洗15分鐘一次(中度嚴格性清洗)。
就寡核苷酸探針而言，雜交作用可在6X SSPE、5X丹哈特氏(Denhardt)溶液、0.1% SDS、0.1毫克/毫升的變性DNA中，在比雜交體的Tm低10℃至20℃之溫度進行過夜。可藉由下列公式測定寡核苷酸探針的Tm(Suggs等人於1981年乙文)。
Tm(℃)=2(T/A鹼基對的數目)+4(G/C鹼基對的數目)
通常按下列方式進行清洗作用：
a.在1X SSPE、0.1% SDS(低度嚴格性清洗)及室溫中清洗15分鐘二次(低度嚴格性清洗)。
b.在1X SSPE、0.1% SDS及雜交溫度清洗15分鐘一次(中度嚴格性清洗)。
可藉由放射性標記以外的方式，使得用於雜交作用的探針分子及探針與標的分子所形成的雜交體分子成為可檢測的。該等任擇方法係涵蓋於本發明的範圍內。
儘管本揭露內容可容許各種改質與任擇形式，在本申請案中已依例示方式詳細描述具體實施例。然而，應瞭解本揭露內容並非意欲侷限於所揭露的特定形式。反之，本揭露內容係涵蓋落在本揭露內容的範圍內之所有改質作用、等效物及任擇方案，而本揭露內容的範圍係由所
附申請專利範圍及其等的法律等效物所界定。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 可用於防治昆蟲害蟲的營養期殺昆蟲蛋白
<130> 74948
<160> 13
<170> 專利申請軟體3.5版
<210> 1
<211> 2412
<212> DNA
<213> 蘇力菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 1
<210> 2
<211> 803
<212> PRT
<213> 蘇力菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 2
<210> 3
<211> 2412
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 3
<210> 4
<211> 2412
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 4
<210> 5
<211> 2412
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 5
<210> 6
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 6
<210> 7
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉譯自合成的全長式編碼區
<400> 7
<210> 8
<211> 2412
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 8
<210> 9
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 9
<210> 10
<211> 2625
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 10
<210> 11
<211> 874
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉譯自合成的全長式編碼區
<400> 11
<210> 12
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的全長式編碼區
<400> 12
<210> 13
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉譯自合成的全長式編碼區
<400> 13
Claims (16)
- 一種核酸構築質體，其所包含之一或多種異種的調控序列係驅動編碼選自由DIG-657、一DIG-657變異體、一DIG-657片段及一DIG-657變異體片段所組成之群組的一殺昆蟲蛋白之一核酸序列的表現作用。
- 如請求項1之核酸構築質體，其係包含選自由序列辨識編號：1、序列辨識編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6、序列辨識編號：8、序列辨識編號：9、序列辨識編號：10、序列辨識編號：12以及具有與序列辨識編號：1至少百分之90一致性之一核酸序列所組成之群組的一核酸。
- 一種經分離的殺昆蟲蛋白，其係選自由DIG-657、一DIG-657變異體、一DIG-657片段及一包含序列辨識編號：2的第206至第803個殘基之殺昆蟲蛋白所組成之群組。
- 如請求項3之一種經分離的殺昆蟲蛋白，其係選自由序列辨識編號：2、序列辨識編號：7、序列辨識編號：11及序列辨識編號：13所組成之群組。
- 一種植物、種子或植物部位，其係包含如請求項1之一核酸序列。
- 一種植物、種子或植物部位，其係包含如請求項2之一核酸序列。
- 一種植物、種子或植物部位，其係包含如請求項3之一 殺昆蟲蛋白。
- 一種植物、種子或植物部位，其係包含如請求項4之一殺昆蟲蛋白。
- 如請求項5之植物或植物部位，其中該多肽具有對抗選自由歐洲玉米螟、具Cry1F抗性的歐洲玉米螟、大豆尺蠖、藜豆毛蟲、菸草芽蟲、棉花螟蛉、玉米穗蟲及菜蛾所組成之群組的一昆蟲之殺昆蟲活性。
- 如請求項7之植物或植物部位，其中該多肽具有對抗選自由歐洲玉米螟、具Cry1F抗性的歐洲玉米螟、大豆尺蠖、藜豆毛蟲、菸草芽蟲、棉花螟蛉、玉米穗蟲及菜蛾所組成之群組的一昆蟲之殺昆蟲活性。
- 一種用於防治易受影響的昆蟲之方法，其包括用如請求項3之蛋白的一有效量接觸該昆蟲。
- 如請求項11之方法，其中該蛋白係選自由序列辨識編號：2、序列辨識編號：7、序列辨識編號：11及序列辨識編號：13所組成之群組。
- 如請求項11之方法，其中該易受影響的昆蟲係具Cry1F抗性的歐洲玉米螟。
- 如請求項11之方法，其中該蛋白係包含序列辨識編號：2的第206至第803個殘基。
- 如請求項14之方法，其中該昆蟲種群係選自由歐洲玉米螟、具Cry1F抗性的歐洲玉米螟、大豆尺蠖、藜豆毛蟲、菸草芽蟲、棉花螟蛉、玉米穗蟲及菜蛾所組成之群組。
- 一種用於生產抗昆蟲的植物品種之方法，其包括將一非 基因轉殖型植物與一基因轉殖型植物育種，該基因轉殖型植物所包含之一外來DNA構築質體係穩定地併入該抗昆蟲性植物品種的基因體中及驅動一DIG-657毒素的表現作用，及藉由分析來自該抗昆蟲性植物之外來DNA構築質體的至少一部分而篩選子代。
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