BR102015014770B1 - Construto de ácido nucleico, proteína inseticida isolada, e métodos para o controle de insetos susceptíveis, e para a produção de uma variedade de plantas resistentes a insetos - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS INSETICIDAS VEGETATIVAS ÚTEIS PARA O CONTROLE DE INSETOSPRAGA. A presente invenção refere-se a toxinas inseticidas vegetativas DIG-657, polinucleotídeos que codificam tais toxinas, uso de tais toxinas para o controle de pragas, e plantas transgênicas que produzem este tipo de toxinas. A invenção inclui variantes, fragmentos e análogos de DIG-657.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade e benefício do Pedido Provisório U.S. 62/014916, depositado em 20 de junho de 2014. Todo o conteúdo deste pedido de patente é incorporado aqui por referência neste pedido.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se genericamente ao campo da biologia molecular. Mais especificamente, a invenção diz respeito a novas toxinas de proteína inseticida desenvolvidas a partir de uma nova toxina da proteína inseticida vegetativa encontrada em Bacillus thuringiensis e a sua utilização para o controle de insetos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Os insetos e outras pragas custam aos agricultores bilhões de dólares por ano em perdas e despesas de culturas para manter estas pragas sob controle. Além das perdas em culturas de campo, os insetos- praga também são um fardo para os produtores de frutas e vegetais, para os produtores de flores ornamentais, e para os jardineiros. As perdas causadas por insetos-praga em ambientes de produção agrícola incluem diminuição da produtividade da cultura, redução da qualidade da cultura e aumento dos custos de colheita.

[004] Os insetos-praga são controlados principalmente por aplicações de uso intensivo de pesticidas químicos, que são ativos através da inibição do crescimento de insetos, prevenção de alimentação ou reprodução de insetos, ou causando a morte. Um bom controle de insetos pode assim ser alcançado, mas estes produtos químicos podem às vezes também afetar outros insetos benéficos. Outro problema resultante da vasta utilização de pesticidas químicos é o aparecimento de populações de insetos resistentes. Isto tem sido parcialmente aliviado por várias práticas de gestão da resistência, mas há uma necessidade crescente de agentes de controle de pragas alternativos. Agentes de controle de pragas biológicos, tais como cepas de Bacillus thuringiensis (Bt), que expressam as toxinas pesticidas como delta-endotoxinas, também foram aplicados a plantas de cultura com resultados satisfatórios, oferecendo uma alternativa ou um complemento para os pesticidas químicos. Os genes que codificam algumas destas delta-endotoxinas foram isolados e a sua expressão em hospedeiros heterólogos tem mostrado fornecer outra ferramenta para o controle de insetos-praga importantes economicamente. Em particular, a expressão de toxinas inseticidas, tais como Bacillus thuringiensis delta-endotoxinas, em plantas transgênicas têm proporcionado uma proteção eficaz contra insetos-praga selecionados, e as plantas transgênicas que expressam tais toxinas têm sido comercializadas, permitindo que os agricultores reduzam as aplicações de agentes químicos de controle de insetos.

[005] O micróbio do solo Bacillus thuringiensisé uma bactéria formadora de esporos gram-positiva caracterizada por inclusões de proteína cristalina parasporal. A Bacillus thuringiensis continua a ser a principal fonte de proteínas inseticidas novas para o desenvolvimento de pesticidas incorporados na planta. Usando várias cepas de bactérias isoladas, foram inventadas novas toxinas Bt que são ativas contra insetos-praga comercialmente importantes. No mercado norte- americano de resistência a insetos de milho, Spodoptera frugiperda (lagarta-do-cartucho "FAW"), Ostrinia nubialis Hübner (broca-européia- do-milho "ECB"), e Helicoverpa zea Boddie (lagarta da espiga de milho "CEW") são as principais pragas, embora existam outros insetos-praga principais em outras geografias (por exemplo, Helicoverpa armigera (lagarta do algodão "CBW" ou lagarta da espiga "CEW")) e espécies adicionais secundárias, mas importante de insetos-praga. As toxinas Bt representam mais de 90% do mercado de bioinseticida e essencialmente toda a fonte de genes para culturas transgênicas que foram desenvolvidas para proporcionar resistência a alimentação de insetos. As bactérias Bt produzem delta-endotoxinas inseticidas incluindo toxinas cristal (Cry), citotoxina (Cyt) e proteína inseticida vegetativa (VIP), dependendo da sua estrutura do gene e da proteína. As toxinas Cry são produzidas durante a formação de esporos como proteínas formadoras de cristais insolúveis. As toxinas VIP, por outro lado, são produzidas como proteínas solúveis, durante a fase vegetativa de crescimento de bactérias Bt. As proteínas VIP são distintas das proteínas Cry na sua estrutura, mas compartilham a propriedade com toxinas Cry de ser formadores de poros que atuam em células localizadas no intestino médio de insetos (Yu, C.-G., et al., 1997 Appl. Environ. Microbiol. 63: 532-536, Lee, M.K., et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:4648-4657, Shotkoski, F., et al, 2003, Proc. Beltwide Cotton Conf, 89-93). Descrevemos aqui a invenção de novas toxinas VIP que têm amplo espectro de atividade inseticida, incluindo atividade inseticida contra EBC, que é único em comparação com proteínas VIP atualmente conhecidas (Yu, C.-G., et al., 1997 Appl. Environ. Microbiol. 63: 532-536).

[006] Os documentos de Patente WO2013/134523, WO 94/21795, WO 96/10083, 5877012, 6107279, 6137033, e 6291156, bem como Estruch et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5389-5394) e Yu et al. (1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536), descrevem uma classe de proteínas inseticidas chamada VIP3. Os genes de VIP3 codificam cerca de 88 kDa proteínas que são produzidas e secretadas por Bacillus durante as suas fases vegetativas de crescimento. Estas toxinas foram descritas para serem diferentes de delta-endotoxinas de formação de cristal. Estes documentos fazem referência específica às toxinas designadas VIP1A(a), VIP1A(b), VIP2A(a), VIP2A(b), VIP3A(a) e VIP3A(b). Ver também Lee et al., AEM vol. 69, no. 8 (Agosto de 2003), páginas 4648-4657, para uma discussão sobre o mecanismo de ação e de truncamento de proteínas VIP.

[007] A proteína VIP3A possui atividade inseticida contra um amplo espectro de pragas de lepidópteros, incluindo FAW, CEW, Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca "BCW"), e Heliothis virescens Fabricius (lagarta do tabaco "TBW"). Mais recentemente, as proteínas VIP foram consideradas tóxicas para certas espécies de insetos-praga de hemípteros (Nanasaheb, P. et al., Toxins(Basel) vol. 4, no. 6 (Jun 2012), páginas 405-429, Sattar S. e Maiti M.K., J. Microbiol. Biotechnol. 2011, 21:937-946). Assim, a classe de proteínas VIP apresenta um espectro único de atividade inseticida. Outras divulgações, WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546 e WO 99/57282, também já identificaram homólogos da classe VIP3 de proteínas.

[008] O uso continuado de agentes químicos e biológicos para controlar pragas de insetos aumenta a chance de insetos desenvolverem resistência a essas medidas de controle. Além disso, a elevada seletividade dos agentes de controle biológico resulta muitas vezes em apenas alguns insetos-praga específicos a ser controlados por cada agente. Apesar do sucesso do milho transgênico resistente ao EBC, a possibilidade do desenvolvimento de populações de insetos resistentes ameaça a durabilidade a longo prazo das proteínas Cry no controle do EBC e cria a necessidade de descobrir e desenvolver novos Cry ou outros tipos de agentes de controle biológico para controlar ECB e outras pragas. A resistência de insetos às proteínas Cry Bt pode desenvolver através de vários mecanismos (Heckel et al., 2007, Pigott e Ellar, 2007). Várias classes de proteínas do receptor para proteínas Cry foram identificadas dentro de insetos, e existem vários exemplos dentro de cada classe de receptor. A resistência a uma proteína Cry particular pode se desenvolver, por exemplo, por meio de uma mutação dentro da parte de ligação da toxina de um domínio da caderina de uma proteína do receptor. Um outro meio de resistência pode ser mediado por uma protease de processamento de protoxina. Assim, a resistência a toxinas Cry em espécies de lepidópteros tem uma base genética complexa, com pelo menos quatro genes grandes de resistência distintos. Os insetos lepidópteros resistentes às proteínas Cry têm desenvolvido no domínio dentro das espécies DBM (mariposa diamondback) (Tabashnik, 1994), Trichoplusia ni Hübner(repolho looper "CL"; Janmaat e Myers 2003, 2005), e CEW (Tabashnik et al., 2008). Portanto o desenvolvimento e a implantação de novas proteínas pesticidas incorporadas a plantas de alta potência, tais como as apresentadas aqui, são úteis e necessárias.

[009] Por conseguinte, continua a haver uma necessidade de descobrir agentes de controle de pragas novos e eficazes que proporcionem um benefício econômico para os agricultores e que são aceitáveis em termos ambientais. Particularmente são necessários agentes de controle específicos para uma ampla gama de insetos-praga importantes economicamente que controlam eficazmente as populações de insetos que são, ou podem tornar-se, resistentes a agentes existentes para controle de insetos e os que têm potência igual ou aumentada em comparação com os agentes de controle atuais.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção proporciona toxinas inseticidas VIP, incluindo a toxina da proteína designada aqui por DIG-657, bem como variantes de DIG-657, ácidos nucleicos que codificam estas toxinas, métodos de controle de pragas usando as toxinas, métodos para produzir as toxinas em células hospedeiras transgênicas e plantas transgênicas que expressam as toxinas. A invenção proporciona ainda construtos de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína inseticida selecionada entre o grupo consistindo em DIG-657, uma variante de DIG-657 e um fragmento de DIG-657. As proteínas inseticidas isoladas selecionadas a partir do grupo consistindo em DIG-657, uma variante de DIG-657, um fragmento de DIG-657 e uma proteína inseticida compreendendo os resíduos 206803 da SEQ ID NO: 2 são reveladas. Também são reveladas plantas, partes de plantas e sementes compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína selecionada entre o grupo consistindo em DIG-657, uma variante de DIG-657 e um fragmento de DIG-657. É também revelado um método para controlar uma população de insetos-praga, compreendendo o contato de indivíduos na referida população de pragas com uma quantidade inseticida eficaz de um polipeptídeo compreendendo os resíduos 206 a 803 da SEQ ID NO: 2.

[0011] Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado de toxina de insetos DIG-657 que compreende um segmento de núcleo de toxina selecionado do grupo consistindo em (a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 206 a 803 da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos resíduos 206 a 803 da SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos dos resíduos 206 a 803 da SEQ ID NO: 2 com substituições, supressões ou modificações de até 20 aminoácidos, que não afetem negativamente a expressão ou a atividade da toxina codificada pela SEQ ID NO: 2; ou um fragmento inseticida ativo do mesmo.

[0012] Em outra modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado de toxina de insetos DIG-657 que compreende um segmento de núcleo de toxina DIG-657 selecionado entre o grupo consistindo em (a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 1 a 803 da SEQ ID NO : 2; (b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos resíduos 1 a 803 da SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos dos resíduos 1 a 803 da SEQ ID NO: 2 com substituições, supressões ou modificações de até 20 aminoácidos, que não afetem negativamente a expressão ou a atividade da toxina codificada pela SEQ ID NO: 1; ou um fragmento inseticida ativo do mesmo; (d) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 93% ou 94% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos dos resíduos 206 a 803 da SEQ ID NO: 2 que não afetem negativamente a expressão ou a atividade da toxina.

[0013] Em outra modalidade, a invenção proporciona plantas férteis que compreendem uma toxina de insetos DIG-657. A presente invenção proporciona ainda um método para produção de uma planta transgênica resistente a insetos ou tolerante a insetos, compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico da invenção na planta transgênica, em que a molécula de ácido nucleico é expressável na planta transgênica em uma quantidade eficaz para o controle de insetos.

[0014] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para controlar uma população de pragas, compreendendo o contato da referida população com uma quantidade pesticidamente eficaz de uma toxina de insetos DIG-657.

[0015] Em outra modalidade, a invenção proporciona moléculas de ácidos nucleicos isolados que codificam uma toxina DIG-657 da invenção. Dada uma sequências de aminoácidos para toxinas DIG-657, sequências de codificação podem ser desenhadas por tradução reversa da sequência de aminoácidos utilizando códons preferidos pela planta hospedeira pretendida, e, em seguida, refinando sequências utilizando códons alternativos para remover as sequências que possam causar problemas e proporcionar códons de parada periódica para eliminar sequências codificadoras longo abertas nos quadros de leitura não codificantes.

[0016] Em outra modalidade, a invenção fornece construtos de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma toxina de insetos DIG-657 funcionalmente ligada a um promotor que não é derivado de Bt e é capaz de dirigir a expressão em uma planta. A invenção também proporciona uma planta transgênica que compreende o construto de DNA estavelmente incorporado no seu genoma e um método para proteger uma planta a partir de uma praga que compreende a introdução do construto na referida planta.

[0017] Em ainda outra modalidade, a invenção proporciona um método para a produção de uma planta resistente a insetos ou tolerante a insetos compreendendo a reprodução de uma planta não transgênica com uma planta transgênica compreendendo um construto de DNA exógeno, capaz de expressar uma toxina de DIG-657, estavelmente incorporado no genoma da planta e selecionando a descendência através da análise para, pelo menos, uma porção do construto de DNA estranho que emana a partir da planta transgênica.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] A Figura 1 é uma imagem de um gel de SDS-PAGE de DIG- 657purificado. Linha 1, marcador de peso molecular; linha 2, 3 μg de DIG-657 purificado de comprimento total; linha 3, produtos da reação de DIG-657 após a proteína purificada de comprimento total ser tratada com tripsina (1:10 DIG-657 p/ tripsina p) durante 1 h.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0019] SEQ ID NO: 1 sequência de DNA codificando a toxina de inseto DIG-657 de comprimento total.

[0020] SEQ ID NO: 2 sequência de proteína DIG-657 deduzida.

[0021] SEQ ID NO: 3 sequência de DNA otimizada do milho codificando a variante 1 de DIG-657.

[0022] SEQ ID NO: 4 variante de 2DIG-657 com códons optimizados para a expressão em Pseudomonas fluorescens.

[0023] SEQ ID NO: 5 v4 de DIG-657, conteúdo otimizado alto de GC de milho.

[0024] SEQ ID NO: 6 v5 de DIG-657 conteúdo otimizado alto de GC de milho de DIG-657 truncado 205 AA a partir do N-terminal.

[0025] SEQ ID NO: 7 A sequência da proteína deduzida de SEQ ID NO: 6.

[0026] SEQ ID NO: 8 A versão otimizada do códon mais preferida da soja DIG-657 de comprimento total.

[0027] SEQ ID NO: 9 A versão otimizada do códon mais preferido da soja de DIG-657 truncado.

[0028] SEQ ID NO: 10 Peptídeo 4 de trânsito do cloroplasto de codificação de DNA (Trap4) fundido com a versão otimizada do códon mais preferido da soja de DIG-657 de comprimento total.

[0029] SEQ ID NO: 11 Sequência de proteína deduzida do códon mais preferido da soja de comprimento total TraP4 DIG-657.

[0030] SEQ ID NO: 12 TraP 4 fundido com a versão otimizada de codões mais preferida de soja de DIG-657truncado.

[0031] SEQ ID NO: 13 Sequência de proteína deduzida de versão truncada de Trap4 DIG-657.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] A presente invenção proporciona toxinas de proteínas inseticidas e métodos para a entrega de toxinas que são funcionalmente ativas e eficazes contra várias ordens de insetos, de preferência insetos Lepidópteros. Por "atividade funcional" (ou "ativo contra") entende-se que as proteínas funcionam como toxina ativo por via oral ou agentes de controle de insetos, que as proteínas têm um efeito tóxico, ou são capazes de perturbar ou impedir o crescimento ou alimentação de insetos. Quando um inseto entra em contato com uma quantidade eficaz de uma toxina da presente invenção entregue através da expressão da planta transgênica, composição(ões) formulada(s) de proteína, composição(ões) pulverizável(is) de proteína, uma matriz de isca ou outro sistema de entrega, os resultados são geralmente a morte do inseto, a inibição do crescimento ou proliferação do inseto, ou prevenção dos insetos que se alimentam da fonte, de um modo preferido uma planta transgênica, que disponibilizam as toxinas para os insetos. Proteínas funcionais da presente invenção também podem funcionar em conjunto ou isoladamente para aumentar ou melhorar a atividade de uma ou mais outras proteínas toxinas. Os termos "tóxico", "toxicidade" ou "toxina" pretendem significar que as toxinas sujeitas têm atividade funcional, tal como definido aqui.

[0033] A letalidade completa para os insetos alimentadores é preferível, mas não é necessário para alcançar a atividade funcional. Se um inseto evita a toxina ou cessa a alimentação, essa evasão será útil em algumas aplicações, mesmo se os efeitos forem subletais ou se a letalidade for atrasada ou indireta. Por exemplo, se as plantas transgênicas resistentes a insetos são desejadas, a relutância dos insetos para se alimentar de plantas é tão útil quanto a toxicidade letal para os insetos porque o objetivo final é evitar danos às plantas induzidas por insetos.

[0034] Um ácido nucleico codificando DIG-657 foi descoberto e isolado da cepa de Bt PS46L. Por "isolado" significa que as moléculas de ácidos nucleicos foram removidas do seu ambiente nativo e foram colocadas em um ambiente diferente pela mão do homem. Por causa da redundância do código genético, uma variedade de diferentes sequências de DNA pode codificar as sequências de aminoácidos apresentadas aqui. Está bem dentro da habilidade de uma pessoa treinada na técnica para criar estas sequências de DNA alternativas que codificam a mesma, ou essencialmente a mesma toxina, uma vez que as sequências de aminoácidos são conhecidas. A sequência de ácido nucleico para a região de codificação de comprimento total de DIG-657 (SEQ ID NO: 1) foi determinada, e a sequência da proteína de comprimento total de DIG-657 (SEQ ID NO: 2) foi deduzida a partir da sequência de ácido nucleico. A sequência da proteína de DIG-657 foi interrogada contra as bases de dados GenomeQuest "proteína GQ-Pat platina" e "proteína GQ-Pat GoldPlus", bem como a base de dados de proteínas não redundante de GenBank. Os homólogos mais próximo conhecidos são XMI335 (94% de identidade, WO2013134523-002) e Vip3Ba (74% de identidade, No. de Acesso AAV70653, Rang et al).

[0035] As variantes ativas de inseto da toxina DIG-657 são também descritas aqui, e são referidas coletivamente como toxinas de insetos DIG-657, ou variantes e incluem fragmentos e formas truncadas. Variantes individuais de DIG-657 podem ser identificadas por nomenclatura específica DIG. As toxinas DIG-657 são candidatas ideais para o uso para controlar pragas de lepidópteros.

[0036] Uma propriedade surpreendente de DIG-657 e suas toxinas variantes é que elas foram descobertas como sendo ativas contra populações de BCE e DBM que são resistentes a toxinas Cry1F e Cry1A. Assim, as toxinas DIG-657 são candidatas ideais para o controle e a prevenção de populações de pragas lepidópteros resistentes.

[0037] As toxinas DIG-657 da invenção são ativas contra insetos lepidópteros, de preferência contra DBM, ECB, FAW, CEW, CBW, e TBW. A atividade inseticida também é esperada para BCW, CL, Spodoptera exigua (lagarta militar da beterraba "BAW"), Pectinophora gossypiella (lagarta-rosada), Cochylis hospes Walsingham e Homoeosoma electellum.

[0038] A atividade inseticida de DIG-657 produzida em Pseudomonas fluorescens foi demonstrada como sendo ativa em espécie dos Lepidópteros, incluindo ECB; ECB resistente a cry1F (rECB), DBM, DBM resistente a cry1A (rDBM), CEW, BCW e TBW. A proteína DIG-657 também foi testada para a atividade em CBW, FAW e FAWresistente a Cry1F (rFAW).

[0039] Este espectro de atividade biológica contra pragas de insetos de milho e de soja é altamente vantajoso. A toxina tripsina truncada (SEQ ID NO: 7) foi testada contra ECB no bioensaio e mostrou ser aproximadamente igual em atividade, a DIG-657 de comprimento total, indicando que os primeiros 205 aminoácidos no N-terminal da proteína não são necessários para a atividade biológica.

[0040] O DIG-657 de comprimento total tem um terminal N intacto e quando tratado com tripsina (1:10 de tripsina / DIG-657), a proteína é clivada a duas bandas, uma a aproximadamente 65 kDa e outra a cerca de 18 kDa (Figura 1). Além disso, um DIG-657 pequeno de comprimento total residual também estava presente. A análise de aminoácidos N- terminal do produto clivado de 65 kDa de DIG-657 indicam que o local de clivagem da tripsina é (205K / S206).

[0041] As sequências de nucleotídeos que codificam DIG-657, suas variantes, fragmentos e truncagens, podem ser sintetizadas e clonadas em vetores de plasmídeo padrão por meios convencionais, ou podem ser obtidas por manipulação padrão de biologia molecular de outros construtos contendo as sequências de nucleotídeos. Locais únicos de restrição internos para uma região de codificação de DIG-657 podem ser identificados e fragmentos de DNA que compreendem as sequências entre os locais de restrição da região codificadora de DIG- 657 podem ser sintetizados, cada tal fragmento codifica uma deleção específica, inserção ou outra variação de DIG-657. Os fragmentos de DNA que codificam os fragmentos de DIG-657 modificados podem ser ligados a outros fragmentos de região de codificação de DIG-657 ou fragmentos de região de codificação Cry ou VIP em locais de restrição adequados para a obtenção de uma região codificante que codifica a proteína DIG-657 desejada de comprimento total, proteína DIG-657 suprimida ou variante. Por exemplo, pode-se identificar um local de reconhecimento de restrição apropriada, no início de uma primeira região de codificação de DIG-657, e um segundo local de restrição interno para a região codificadora de DIG-657. A clivagem da primeira região de codificação de DIG-657 nestes locais de restrição iria gerar um fragmento de DNA compreendendo parte da primeira região codificadora de DIG-657. Um segundo fragmento de DNA flanqueado por locais de restrição compatíveis situados analogamente específicos para uma outra região de codificação DIG-657 ou a outra região de codificação VIP3 pode ser utilizado em combinação com o primeiro fragmento de restrição de DNA para construir uma variante.

[0042] Anticorpos antitoxina. Os anticorpos para as toxinas apresentadas aqui, ou fragmentos destas toxinas, podem ser preparados usando procedimentos padrão bem conhecidos na técnica. Tais anticorpos são úteis para detectar a presença de toxinas DIG-657 em tecidos de plantas e uma variedade de outras substâncias. Tais anticorpos e antissoros são úteis em vários métodos de detecção das toxinas DIG-657 reivindicadas da invenção, e variantes ou fragmentos das mesmas. Sabe-se que os anticorpos marcados com um grupo de informação podem ser usados para identificar a presença de antígenos em uma variedade de meios. Os anticorpos marcados com radioisótopos têm sido utilizados em radioimunoensaios para identificar, com grande precisão e sensibilidade, a presença de antigênicos em uma variedade de fluidos biológicos. Mais recentemente, os anticorpos marcados com enzimas têm sido usados como um substituto para anticorpos radiomarcados no ensaio de ELISA. Além disso, os anticorpos imunorreativos para a toxina Bt inseticida da presente invenção podem ser ligados a uma substância de imobilização tal como um poço de poliestireno ou partículas e utilizados em imunoensaios para determinar se a toxina Btestá presente em uma amostra de teste. Os anticorpos anti-DIG-657 são também utilizados para o isolamento de quantidades de toxinas DIG-657 a partir de sistemas de produção recombinantes ou fontes naturais.

[0043] Expressão transgênica de DIG-657. As toxinas da proteína em particular podem ser "aplicadas" ou fornecidas para contatar os insetos alvo em uma variedade de maneiras. Por exemplo, as toxinas DIG-657 podem ser utilizadas como protetoras incorporadas às plantas em plantas transgênicas (produzida por e presente na planta) e são bem conhecidas na técnica. A expressão dos genes das toxinas também pode conseguir seletividade em tecidos específicos da planta, tais como as raízes, folhas, etc. Isto pode ser conseguido através da utilização de promotores específicos de tecidos bem conhecidos na técnica.

[0044] Uma modalidade preferida da presente invenção é a transformação de plantas com genes que codificam a proteína inseticida em particular ou suas variantes. As plantas transformadas são resistentes ao ataque por insetos-praga alvo, em virtude da presença de quantidades controladas de proteína inseticida em particular ou suas variantes nas células da planta transformada. Ao incorporar e expressar o material genético que codifica uma toxina DIG-657 no genoma de uma planta comida por um determinado inseto-praga, os adultos ou larvas morrem após consumir a planta como alimento. Numerosos membros das classificações monocotiledôneas e dicotiledôneas foram transformados. Culturas agronômicas transgênicas, bem como frutas e legumes são de interesse comercial. Essas culturas incluem, mas não estão limitadas a, milho, arroz, soja, canola, girassol, alfalfa, sorgo, trigo, algodão, amendoins, tomates, batatas, e semelhantes. Existem numerosas técnicas bem conhecidas para introdução de material genético exógeno nas células de plantas monocotiledóneas ou dicotiledóneas, e para a obtenção de plantas férteis que expressam e mantém estavelmente o gene introduzido.

[0045] Em uma modalidade preferida, DIG-657 ou sua variante é entregue por via oral através de uma planta transgênica que compreende uma sequência de ácido nucleico que expressa uma toxina da presente invenção. A presente invenção proporciona um método de produção de uma planta transgênica resistente a insetos, compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico da invenção na planta, em que a toxina é expressável na planta transgênica em uma quantidade eficaz para controlar um inseto. Em um exemplo não limitativo, uma estratégia de clonagem básica pode ser para subclonar sequências codificadoras de DIG-657 modificadas ou de comprimento total em um plasmídeo de expressão em plantas em locais de restrição NcoI e SacI. Os cassetes de expressão da planta resultante contendo a região de codificação DIG-657 apropriado sob o controle de elementos de expressão de plantas, (por exemplo, promotores de plantas expressáveis, de terminação da transcrição terminal 3' e determinantes de adição poliadenilados, e semelhantes) são subclonadas em um vetor plasmídico binário, utilizando, por exemplo, tecnologia Gateway® ou procedimentos convencionais de clonagem de fragmento de enzimas de restrição. LR Clonase™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), por exemplo, pode ser utilizado para recombinar os cassetes de expressão de plantas de genes modificados e de comprimento total em um plasmídeo binário de transformação de plantas, se a tecnologia Gateway® for utilizada. É conveniente empregar um vetor binário de transformação de plantas que abriga um gene bacteriano que confere resistência ao antibiótico espectinomicina quando o plasmídeo está presente em células de E. coli e de Agrobacterium. É também conveniente empregar um vetor plasmídico binário, que contém um gene marcador selecionável expresso em plantas que é funcional nas plantas hospedeiras desejadas. Exemplos de genes marcadores selecionáveis expressados em plantas incluem, mas não estão limitados a aqueles que codificam o gene da fosfotransferase de aminoglicósido (aphII) de transposão Tn5, que confere resistência ao antibiótico canamicina, neomicina e G418, assim como os genes que codificam para a resistência ou tolerância ao glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bialafos), imidazolinonas, sulfonilureias e herbicidas de triazolopirimidina, tais como clorsulfurão, bromoxinil, dalapon e semelhantes.

[0046] Alternativamente, a estrutura do plasmídeo do vetor binário de transformação de plantas contendo a inserção do gene DIG-657 é realizada por mapeamento genético da digestão de restrição do DNA de plasmídeo preparado a partir de Agrobacterium candidata isolada por métodos convencionais de biologia molecular bem conhecidos dos peritos na técnica de manipulação de Agrobacterium.

[0047] Os versados na técnica de obtenção de plantas transformadas através de métodos de transformação mediados por Agrobacteriumcompreenderão que outras cepas de Agrobacterium além de Z707S podem ser utilizadas, e a escolha de uma cepa pode depender da identidade das espécies de planta hospedeira a ser transformada.

[0048] Bioensaios de insetos de Arabidopsistransgênica. Linhagens transgênicas de Arabidopsis que expressam proteínas DIG- 657 modificadas podem ser utilizadas para demonstrar atividade contra espécies de insetos sensíveis em ensaios de sobreposição de dieta artificial. A proteína extraída a partir de linhagens de Arabidopsis transgênicas e não transgênicas pode ser quantificada por métodos adequados e os volumes de amostra são ajustados para normalizar a concentração de proteína. Os bioensaios são então conduzidos em dieta artificial tal como descrito abaixo. Arabidopsisnão transgênica e/ou tampão e água devem ser incluídos nos ensaios como tratamentos de verificação de antecedentes.

[0049] Bioensaio de milho transgênico. A bioatividade das toxinas DIG-657 e variantes produzidas em células de plantas também pode ser demonstrada por meio de métodos convencionais de bioensaio (ver, por exemplo, Huang et al., 2006). A eficácia pode ser testada por alimentação de vários tecidos vegetais ou pedaços de tecido derivados de uma planta que produz uma toxina DIG-657 para insetos alvo em um ambiente de alimentação controlado. Alternativamente, extratos de proteínas podem ser preparados a partir de vários tecidos vegetais derivados de uma planta produtora da toxina DIG-657 e incorporando as proteínas extraídas em um bioensaio de dieta artificial. É para ser entendido que os resultados de tais ensaios de alimentação estão sendo comparados a bioensaios realizados da mesma forma que empregam tecidos de controle adequados a partir de plantas hospedeiras que não produzem a proteína DIG-657 ou variantes, ou de outras amostras de controle.

[0050] Toxinas DIG-657 e variantes com atividade inseticida. Além da toxina DIG-657 de comprimento total da SEQ ID NO: 2, a invenção abrange variantes com atividade inseticida de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 13. Pelo termo variante, os requerentes pretendem incluir certos mutantes de eliminação, substituição e inserção. Um fragmento de DIG-657 é qualquer sequência de proteína que se encontra na SEQ ID NO: 2, que é menos do que a sequência de aminoácidos de comprimento total DIG-657 e que tem propriedades inseticidas. Os fragmentos variantes de DIG-657 também estão contemplados como parte da presente invenção e são definidos como os fragmentos de DIG-657 contendo determinados mutantes de eliminação, substituição e inserção descritos aqui e que têm atividade inseticida. Como um prefácio para descrever as variantes das toxinas DIG-657 que estão incluídas na invenção, será útil rever brevemente a arquitetura das toxinas proteicas de DIG-657.

[0051] Variantes de DIG-657 criadas fazendo um número limitado de deleções, substituições ou adições de aminoácidos. Deleções, substituições e adições de aminoácidos à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 podem ser prontamente feitas de uma maneira sequencial e os efeitos de tais variações sobre a atividade inseticida pode ser testada por bioensaio. Uma vez que o número de mudanças é limitada em número, tais testes não envolvem experimentação razoável. A invenção também inclui variantes com atividade inseticida do segmento da toxina central (aminoácidos 206-803 da SEQ ID NO: 2, ou em que até 10, até 15, ou até 20 adições, deleções ou substituições independentes de aminoácidos foram feitas).

[0052] As variantes podem ser feitas fazendo mutações aleatórias ou as variantes podem ser desenhadas. No caso de mutantes desenhados, existe uma elevada probabilidade de geração de variantes com atividade semelhante à toxina nativa, quando a identidade de aminoácidos é mantida em regiões críticas da toxina que representam atividade biológica ou são envolvidas na determinação da configuração tridimensional que em última análise é responsável pela atividade biológica. Uma alta probabilidade de reter atividade também ocorrerá se as substituições forem conservadoras. Os aminoácidos podem ser colocados nas seguintes classes: não polares, polares sem carga, básicos e ácidos. As substituições conservativas em que um aminoácido de uma classe é substituído por um outro aminoácido do mesmo tipo são menos susceptíveis de alterar significativamente a atividade biológica da variante. A Tabela 1 proporciona uma listagem de exemplos de aminoácidos que pertencem a cada classe. TABELA 1

[0053] Proteínas pesticidas da presente invenção são codificadas por uma sequência de nucleotídeos suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou as proteínas pesticidas são suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Por "suficientemente idêntica"entende-se uma sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, de cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, de cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, de cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência comparativamente a uma sequência de referência, utilizando um dos programas de alinhamento descritos aqui utilizando parâmetros convencionais. Um especialista na técnica vai reconhecer que estes valores podem ser adequadamente ajustados para determinar a identidade correspondente das proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos, levando em consideração a degenerescência do códon, semelhança do aminoácido, posicionamento do quadro de leitura e semelhantes.

[0054] Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação óptima. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas combinadas pelas sequências (isto é, a percentagem de identidade = número de posições idênticas / número total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a percentagem de identidade é calculada através da totalidade da sequência de referência. A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando técnicas semelhantes às descritas abaixo, permitindo ou não gaps. No cálculo da percentagem de identidade, as combinações tipicamente exatas são contadas. Um gap (uma posição em um alinhamento em que um resíduo está presente em uma sequência, mas não na outra) é considerado como uma posição com resíduos não idênticos.

[0055] A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 87: 2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5877. Tal algoritmo está incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácido nucleico do tipo pesticida da presente invenção. As buscas por proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a moléculas de proteínas pesticidas da invenção. Para obter alinhamentos com gap para fins de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Alternativamente, PSI BLAST pode ser utilizado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrões dos programas respectivos (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

[0056] Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins et al (1994) Nucleic Acids Res. 22:. 4673-4680). O ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de aminoácidos ou de DNA, e portanto, pode proporcionar dados sobre a conservação da sequência da sequência de aminoácidos completa. O algoritmo ClustalW utilizado em vários pacotes de software de análise de DNA/ aminoácido disponíveis comercialmente, tais como o módulo ALIGNX de Vector NTI Program suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, a percentagem de identidade de aminoácidos pode ser avaliada. Um exemplo não limitante de um programa de software útil para a análise de alinhamentos ClustalW é GENEDOC™. O GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a avaliação da similaridade e identidade de aminoácido (ou DNA) entre várias proteínas. Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4 (1): 11-17. Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que faz parte do GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível de Accelrys, Inc., San Diego, CA, EUA). Quando se utiliza o programa ALIGN para a comparação de sequências de aminoácidos, uma tabela PAM120 de peso de resíduo, uma penalidade de comprimento de gap de 12 e uma penalidade de gap de 4 pode ser utilizada. A menos que indicado de outra forma, o GAP versão 10, que utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 (3): 443-453, vai ser utilizado para determinar a identidade ou semelhança de sequência utilizando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de semelhança para uma sequência de nucleotídeos utilizando Peso GAP de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando o peso GAP de 8 e o peso do comprimento de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62. Podem também ser utilizados programas equivalentes. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento com combinações de resíduos de nucleotídeos idênticos e uma percentagem de identidade de sequência idêntica quando comparado com o correspondente alinhamento gerado por GAP versão 10.

[0057] Variantes sensíveis à protease. As proteínas VIP3, incluindo DIG-657, podem ser proteoliticamente truncadas de cerca de 88 kDa em tamanho a um produto de cerca de 66 kDa em tamanho. A proteína de 66 kDa compreende os resíduos de aminoácidos 206-803. As proteases do intestino de inseto tipicamente funcionam em ajudar o inseto a obter aminoácidos necessários de proteína dietética. As proteases digestivas de insetos melhores entendidas são proteases de serina, que parecem ser o tipo mais comum (Englemann e Geraerts (1980), particularmente em espécies de lepidópteros. Os insetos coleópteros têm o intestino mais neutro para ácido do que o intestino dos lepdóperos. A maioria das larvas e adultos dos coleópteros, por exemplo, o besouro-da-batata (CPB), têm intestino médio ligeiramente ácido, e as proteases de cisteína fornecem a maior atividade proteolítica (Wolfson e Murdock, 1990). Mais precisamente, Thie e Houseman (1990) identificaram e caracterizaram as proteases de cisteína, do tipo catepsina B e do tipo catepsina H, e a protease aspartil, catepsina tipo D, em CEC. Gillikin et al. (1992) caracterizaram a atividade proteolítica nos intestinos de larvas WCR e encontraram principalmente proteases de cisteína. A Patente US No. 7.230.167 revelou que uma atividade de protease atribuída a catepsina G existe em WCR. A diversidade e os diferentes níveis de atividade da proteases no intestino de insetos pode influenciar a sensibilidade de um inseto para uma toxina Bt em particular.

[0058] Em outra modalidade da invenção, os sítios de clivagem de protease podem ser modificados em locais desejados para afetar o processamento da proteína dentro do intestino médio de larvas susceptíveis de certos insetos-praga. Estes locais de clivagem da protease podem ser introduzidos por métodos tais como a síntese química do gene ou PCR de extensão de sobreposição (Horton et al., 1989). As sequências de reconhecimento da serina protease, por exemplo, podem, opcionalmente, ser inseridas em sítios específicos da estrutura da proteína Cry para afetar o processamento da proteína em pontos de eliminação desejados dentro do intestino médio de larvas susceptíveis. As serina proteases que podem ser exploradas, de tal forma, incluem serina proteases do intestino médio de Lepidópteros, tais como tripsina ou enzimas semelhantes a tripsina, quimotripsina, elastase, etc (Christeller et al., 1992). Além disso, os sítios de deleção empiricamente identificados por sequenciação de produtos de digestão de proteínas Cry gerados com preparações de protease do intestino médio de larvas não fraccionado ou por ligação a vesículas de membrana de borda em escova podem ser manipulado para efetuar a ativação da proteína. Proteínas Cry ou VIP3 modificadas geradas quer por deleção do gene ou por introdução de locais de clivagem de protease tendo atividade melhorada em pragas de lepidópteros, incluindo ECB, CEW, CBW, BCW, FAW, BAW, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Loxagrotis albicosta, e outras pragas alvo.

[0059] As serina proteases de Lepidópteros e Coleópteros, tais como a tripsina, a quimotripsina e a protease semelhante à catepsina G, as proteases de cisteína de lepidópteros e coleópteros, como catepsinas (proteases semelhantes a B, a L, a O, e a K) (Koiwa et al., (2000) e Bown et al., (2004)), metaloproteases de lepidópteros e coleópteros, tais como ADAM10 (Ochoa-Campuzano et al., (2007)), e proteases de ácido aspártico de lepidópteros e coleópteros, tais como catepsinas semelhantes a D e a E, pepsina, plasmepsina e quimosina podem ainda ser exploradas por modificação de sequências de reconhecimento adequadas nos locais de processamento pretendidos para afetar o processamento de proteínas Cry dentro do intestino médio de larvas susceptíveis de determinados insetos-praga e, talvez, também funcionem para proporcionar atividade contra insetos-praga não suscetíveis.

[0060] As variantes DIG-657 produzidas por introdução ou eliminação dos locais de processamento da protease nas posições adequadas na sequência de codificação para permitir ou eliminar a clivagem proteolítica de uma proteína variante maior por proteases de insetos, plantas ou micro-organismos estão dentro do âmbito da invenção. O resultado final de tal manipulação é entendido como sendo a geração de moléculas de fragmentos de toxina que têm a mesma ou melhor atividade que a toxina proteína intacta (comprimento total).

[0061] As aplicações em spray são outro exemplo e também são conhecidas na técnica. As proteínas em particular podem ser adequadamente formuladas para a utilização final pretendida, e, em seguida, pulverizadas (ou de outra forma aplicadas) sobre a planta e/ou em torno da planta e/ou na vizinhança da planta a ser protegida - antes de uma infestação ser descoberta, depois que os insetos alvo são descobertos, tanto antes como depois, e semelhantes. Grânulos de isca, por exemplo, podem também ser utilizados e são conhecidos na técnica.

[0062] Quando um inseto entra em contato com uma quantidade eficaz de toxina entregue através de expressão da planta transgênica, composição(ões) de proteína formulada(s), composição(ões) de proteína pulverizável (eis), uma matriz de isca ou outro sistema de fornecimento, os resultados são geralmente a morte do inseto, ou os insetos não se alimentam da fonte que faz com que as toxinas sejam disponíveis para os insetos.

[0063] Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseudomonas, os micróbios podem ser aplicados ao ambiente da praga, onde irão se proliferar e serem ingeridos. O resultado é um controle da praga. Como alternativa, o micróbio que hospeda o gene da toxina pode ser tratado em condições que prolonguem a atividade da toxina e estabilizam a célula. A célula tratada, que retém a atividade tóxica, pode, então, ser aplicada no ambiente da praga alvo.

[0064] Desenvolvimento de sondas de oligonucleotídeo. Outro método para a identificação de toxinas e genes da presente invenção é através da utilização de sondas de oligonucleotídeos. Estas sondas são sequências de nucleotídeos detectáveis. Estas sequências podem ser tornadas detectáveis por virtude de um marcador radioativo apropriado ou podem ser produzidas inerentemente fluorescente, tal como descrito em, por exemplo, Patente US N° 6.268.132. Como é bem conhecido na técnica, se a molécula de sonda e a amostra de ácido nucleico se hibridizam através da formação de ligações fortes de emparelhamento de bases entre as duas moléculas, pode ser razoavelmente assumido que a sonda e a amostra tem substancial homologia de sequência. De preferência, a hibridização é efetuada sob condições rigorosas, por técnicas bem conhecidas na arte, tal como descrito, por exemplo, em Keller e Manak (1993). A detecção da sonda proporciona um meio para determinar, de uma forma conhecida, se ocorreu hibridização. Essa análise de sonda proporciona um método rápido para a identificação de genes que codificam toxinas da presente invenção. Os segmentos de nucleotídeos que são utilizados como sondas de acordo com a invenção podem ser sintetizados utilizando um sintetizador de DNA e os procedimentos padrão. Estas sequências de nucleotídeos podem também ser utilizadas como iniciadores de PCR para amplificar os genes da presente invenção.

[0065] Hibridização de ácidos nucleicos. Como é bem conhecido pelos versados em biologia molecular, a semelhança de dois ácidos nucleicos pode ser caracterizada pela sua tendência de hibridizar. Tal como utilizados aqui, os termos "condições rigorosas" ou "condições de hibridização rigorosas" pretendem referir-se a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar (anelamento) à sua sequência alvo para um grau maior detectável do que a outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). As condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando o rigor da hibridização e/ou condições de lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares da sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Em alternativa, as condições rigorosas podem ser ajustadas para permitir algum desemparelhamento nas sequências de modo que graus inferiores de semelhança são detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de preferência menos de 500 nucleotídeos de comprimento.

[0066] Tipicamente, as condições rigorosas serão aquelas em que a concentração salina é inferior a cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a pH 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30° C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60° C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). As condições rigorosas podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. Exemplos de condições de baixo rigor incluem hibridização com uma solução tampão de 30% a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 37° C e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl / 0,3 M citrato de trissódio) de 50° C a 55° C. Condições de rigor moderado exemplificativas incluem hibridação em 40% a 45% de formamida, 1,0 M NaCl, 1% SDS a 37° C e uma lavagem em 0,5X a 1X de SSC, de 55° C a 60° C. Condições de rigor elevadas exemplificativas incluem hibridação em formamida a 50%, 1 M NaCl, 1% SDS a 37° C e uma lavagem em 0,1X SSC a 60° C a 65° C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração de hibridação é geralmente inferior a cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a 12 horas.

[0067] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós- hibridação, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução final de lavagem. Para híbridos de DNA / DNA, o ponto de fusão térmico (Tm) é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente combinada. Tm é reduzido em cerca de 1° C por cada 1% de desemparelhamento; assim, Tm, condições de hibridação e/ou condições de lavagem podem ser ajustados para facilitar o emparelhamento de sequências da identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com > 90% de identidade são procuradas, a Tm pode diminuir 10° C. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5° C mais baixa do que a Tm para a sequência específica e seu complemento, a uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições altamente rigorosas podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 1° C, 2° C, 3° C ou 4° C mais baixa do que o Tm; condições rigorosas moderadas podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 6° C, 7° C, 8° C, 9° C ou 10° C mais baixa do que o Tm, e condições rigorosas baixas podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 11° C, 12° C, 13° C, 14° C, 15° C, ou 20° C mais baixa do que o Tm.

[0068] Tm (em °C) pode ser determinado experimentalmente ou pode ser aproximado por cálculo. Para híbridos de DNA-DNA, o Tm pode ser aproximado a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984): Tm (° C) = 81,5° C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% de formamida) - 500 / L; onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, % GC é a percentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % de formamida é a percentagem de formamida na solução de hibridação, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. Alternativamente, o Tm é descrito pela seguinte fórmula: Tm (° C) = 81,5° C + 16,6 (log [Na+]) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% de formamida) - 600/L (Beltz, 1983 et al.) onde [Na+] é a molaridade dos íons de sódio,% GC é a percentagem de guanosina e nucleotídeos de citosina no DNA, % de formamida é a percentagem de formamida na solução de hibridação, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases.

[0069] Utilizando as equações, as composições de hibridação e lavagem, e Tm desejada, os versados compreenderão que variações no rigor de hibridação e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de descombinação resultar em um Tm inferior a 45° C (solução aquosa) ou a 32° C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta pode ser usada. Um guia extenso para a hibridação de ácidos nucleicos encontra-se em Hybridization with Nucleic Acid Probes Vol.1 por P. Tijssen (1993, ISBN-10: 0444898840, ISBN-13: 9780444898845 Capa dura) e Ausubel et al. (1995). Também ver Sambrook et al. (1989).

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0070] Construção de plasmídeos de expressão que codificam a toxina inseticida DIG-657 e expressão em hospedeiros bacterianos. Os métodos de clonagem padrão foram utilizados na construção de plasmídeos de expressão modificados de Pseudomonas fluorescens (Pf) para produzir proteínas DIG-657 de comprimento total codificadas pelas regiões de codificação optimizadas de plantas. As endonucleases de restrição e T4 DNA ligase de foram obtidas de New England Biolabs (NEB; Ipswich, MA) para a digestão de restrição e ligação de DNA, respectivamente. As preparações de plasmídeo foram realizadas utilizando o Kit de plasmídeo NucleoSpin® (Macherey-Nagel Inc, Bethlehem, PA), seguindo as instruções dos fornecedores para a purificação do plasmídeo de baixa cópia. Os fragmentos de DNA foram purificados utilizando um kit QIAquick® Gel Extraction (Qiagen, Venio, Limburg) após eletroforese em gel de agarose Tris-acetato.

[0071] O gene que codifica a DIG-657 foi amplificado fora da cepa parental Bt PS46L/DBt11889 utilizando iniciadores específicos do gene contendo os locais de restrição específicos para clonagem. O produto resultante DIG-657 da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi então clonado no vetor de expressão do Pseudomonas fluorescens pDOW1169 utilizando o método de ligação de clonagem tradicional.

[0072] A estratégia básica de clonagem envolveu a subclonagem da sequência de codificação da toxina DIG-657 (CDS) (SEQ ID NO: 1) em pDOW1169 nos locais de restrição Spel e Sall, através dos quais é colocada sob o controle de expressão do promotor Ptac e do terminador rrnBT1T2 do plasmídeo pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). pDOW1169 é um plasmídeo de cópia médio com a origem de replicação RSF1010, um gene pyrF, e um local de ligação do ribossoma precedendo os locais de reconhecimento de enzimas de restrição nos quais os fragmentos de DNA contendo as regiões de codificação de proteínas podem ser introduzidos (Pedido US 20080193974). O plasmídeo de expressão, designado pDOW1169, foi transformado por eletroporação em DC454 (uma cepa quase do tipo selvagem de P. fluorescens possuindo as mutações deltapyrF e lsc::lacIQI), ou em seus derivados, recuperado em meio hidrolisado de soja SOC, e plaqueado em meio seletivo (ágar de glicose M9 sem uracil, Sambrook et al., supra). Detalhes das manipulações microbiológicas estão disponíveis em Squires et al., (2004), Pedido de Patente US 20060008877, Pedido de Patente US 20080193974 e Pedido de Patente US 20080058262, incorporados aqui por referência. As colônias foram primeiramente rastreadas por digestão de restrição de miniprep de plasmídeo DNA. O plasmídeo DNA de clones selecionados contendo a toxina DIG-657 foi digerido com quatro enzimas de restrição e sequência verificada para validar ainda mais a presença da inserção.

EXEMPLO 2

[0073] Cultivo e análise de expressão em frascos de agitação. A produção da toxina DIG-657 para a caracterização e ensaio biológico do inseto foi realizada por cultura em frasco agitado de cepas de P. fluorescens que abrigam construtos de expressão (pDOW1169). Um estoque de glicerol de cultura DIG-657 (0,5 mL) foi inoculado em 50 ml de meio de produção definido com glicerol a 9,5% (Teknova Catalog No. 3D7426, Hollister, CA). A expressão do gene da toxina DIG-657 por meio do promotor Ptac foi induzida por adição de isopropil-β-D-1- tiogalactopiranósido (IPTG), após um período de incubação inicial de 24 horas a 30° C com agitação. As culturas foram amostradas na hora da indução e a vários tempos pós-indução. A densidade celular foi medida por densidade óptica a 600 nm (OD600). Outros meios de cultura adequados para o cultivo de Pseudomonas fluorescens podem também ser utilizados, por exemplo, como descrito em Huang et al. (2007) e Pedido de Patente US 20060008877.

EXEMPLO 3

[0074] Transformação de Agrobacterium. Métodos de clonagem padrão foram utilizados na construção de plasmídeos binários de expressão e transformação de plantas. As endonucleases de restrição e T4 DNA ligase foram obtidas a partir de NEB. As preparações de plasmídeo foram realizadas utilizando o kit NucleoSpin® Plasmid Preparation ou o kit NucleoBond® AX Xtra Midi (ambos da Macherey- Nagel, Duren, Alemanha), seguindo as instruções dos fabricantes. Os fragmentos de DNA foram purificados utilizando o Kit de Purificação de PCR QIAquick® ou o Kit de extração QIAEXII® Gel (ambos de Qiagen, Venio, Limburg) após o isolamento do gel.

[0075] As células eletrocompetentes da cepa de Agrobacterium tumefaciens Z707S (um derivado resistente à estreptomicina de Z707;. Hepburn et al, 1985) foram preparadas e transformadas utilizando eletroporação (Weigel e Glazebrook, 2002). Após a eletroporação, 1 mL de caldo de extrato de levedura peptona (YEP) (10 g/ L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona e 5 g/L de NaCl) foi adicionado à cuvete e a suspensão de células YEP foi transferida para um tubo de cultura de 15 mL para a incubação a 28° C em um banho de água com agitação constante durante 4 horas. As células foram semeadas em placas de YEP mais ágar (25 g/L) com espectinomicina (200 μg/ml) e estreptomicina (250 μg/ml) e as placas foram incubadas durante 2-4 dias a 28° C. Colônias individuais bem separadas foram selecionadas e riscadas sobre novas placas de YEP + agar com espectinomicina e estreptomicina como descrito acima, e incubadas a 28° C durante 1-3 dias.

[0076] A presença da inserção do gene DIG-657 no vetor binário para transformação de plantas foi realizada por análise de PCR utilizando iniciadores específicos do vetor com o plasmídeo DNA molde preparado a partir de colônias selecionadas de Agrobacterium. O agregado de células a partir de uma alíquota de 4 mL de uma cultura de 15 mL cultivada durante a noite em YEP com espectinomicina e estreptomicina como anteriormente foi extraído utilizando Qiagen (Venlo, Limburg, Holanda) Spin® Mini Preps, realizado segundo as instruções do fabricante. O plasmídeo DNA a partir do vetor binário usado na transformação de eletroporação do Agrobacterium foi incluído como um controle. A reação de PCR foi completada utilizando Taq DNA polimerase a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante em concentrações de 0,5X. As reações de PCR foram realizadas em um termociclador MJ Research Peltier Thermal Cycler programado com as seguintes condições: Etapa 1) 94° C durante 3 minutos; Etapa 2) 94° C durante 45 segundos; Etapa 3) 55° C durante 30 segundos; Etapa 4) 72° C durante 1 minuto por kb de comprimento do produto esperado; Etapa 5) 29 vezes para a Etapa 2; Etapa 6) 72° C durante 10 minutos. A reação foi mantida a 4° C após o ciclo. Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose (por exemplo, agarose a 0,7% a 1%, w/v) e visualizados por coloração com brometo de etídio. Uma colônia foi escolhida cujo produto de PCR era idêntico ao do plasmídeo de controle.

EXEMPLO 4

[0077] Produção de DIG-657. As células de cultura em frasco agitado de cepas de P. fluorescens que abrigam construtos de expressão (pDOW1169) foram isoladas por centrifugação e os agregados de células resultantes congelados a -80° C. As frações solúveis e insolúveis a partir de amostras de agregados de células congeladas de frascos de agitação foram geradas utilizando solução de extração de proteína bacteriana EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Cada sedimento celular foi suspenso em 1 mL de solução de EasyLyse™ e ainda diluído 1: 4 em tampão de lise e incubado com agitação em temperatura ambiente durante 30 minutos. O lisado foi centrifugado a 14.000 rpm durante 20 minutos a 4° C e o sobrenadante foi recuperado como a fração solúvel. O agregado (fração insolúvel) foi então suspenso em um volume igual de tampão fosfato salino (PBS; 11,9 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, pH 7,4).

[0078] As amostras foram misturadas 1:1 com tampão de amostra Laemmli 2X contendo β-mercaptoetanol (Sambrook et al., Supra.) e fervidas durante 5 minutos antes de carregar em géis Criterion XT® BisTris a 12% (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). A eletroforese foi realizada no tampão de XT MOPS recomendado. Os géis foram corados com BioSafe Coomassie Stain (Bio-Rad, Richmond, CA) de acordo com o protocolo do fabricante e visualizados utilizando o sistema de tratamento de imagens Alpha Innotech (San Leandro, CA).

EXEMPLO 5

[0079] Preparação dos corpos de inclusão. A DIG-657 foi geralmente localizada na fração solúvel de células de P. fluorescens contendo o gene para DIG-657. Em alguns casos, uma percentagem variável da proteína DIG-657 foi encontrada localizada em preparações da proteína em corpos de inclusão (IB), como demonstrado por SDS- PAGE e MALDI-MS (Espectometria de massa por Ionização e dessorção a laser assistida por matriz). Para isolar esta proteína desta fração, os agregados de fermentação de P. fluorescens foram descongelados em banho de água a 37° C. As células foram ressuspensas a 25% w/v em tampão de lise (50 mM Tris, pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM EDTA sal de dissódio (ácido etilenodiaminotetracético), 1% Triton X-100, e 5 mM ditiotreitol (DTT)) ; 5 ml/L de coquetel inibidor de protease bacteriana (P8465 Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionados imediatamente antes da utilização. As células foram suspensas usando um homogeneizador de mão na configuração mais baixa (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). A lisozima (25 mg de Sigma, St. Louis, MO, L7651 a partir de clara de ovo de galinha) foi adicionada à suspensão celular, misturando com uma espátula de metal, e a suspensão foi incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A suspensão foi arrefecida em gelo durante 15 minutos, em seguida sonicada utilizando um Branson (Danbury, CT) Sonifier 250 (duas sessões de 1- minuto, a 50% de ciclo de trabalho, saída 30%). A lise celular foi verificada por microscopia. Um adicional de 25 mg de lisozima foram adicionados, se necessário, e os passos de incubação e sonicação foram repetidos. Quando a lise das células foi confirmada por meio de microscopia, o lisado foi centrifugado a 11.500 xg durante 25 minutos (4° C) para formar o agregado IB, e o sobrenadante foi descartado. O agregado IB foi ressuspenso com 100 mL de tampão de lise, homogeneizado com o misturador de mão e centrifugado como acima. O agregado IB foi lavado repetidamente por ressuspensão (em 50 mL de tampão de lise), homogeneização, sonicação e centrifugação até que o sobrenadante ficasse incolor e o agregado IB se tornasse firme e esbranquiçado na cor. Para a lavagem final, o agregado IB foi ressuspenso em água destilada esterilizada por filtração (0,22 μm) contendo 2 mM EDTA, e centrifugado. O agregado final foi ressuspenso em água destilada esterilizada por filtração contendo 2 m EDTA M, e armazenado em alíquotas de 1 ml a -80° C.

[0080] A análise de SDS-PAGE e quantificação de proteínas nas preparações IB foi realizada por descongelamento de uma alíquota de 1 ml do agregado IB e diluindo 1:20 com água destilada esterilizada por filtração. A amostra diluída foi em seguida fervida com 4X tampão de amostra redutora [250 mM Tris, pH 6,8, glicerol a 40% (v/v), azul de bromofenol a 0,4% (w/v), SDS a 8% (w/v) e β-mercapto-etanol a 8% (v/v)] e carregada em uma Tris-glicina Novex® 4-20%, 12 + 2 corrida de gel no poço (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 1X tampão Tris / glicina / SDS (BioRad, Richmond , CA). O gel foi corrido durante 60 minutos a 200 volts, então corado com azul de Coomassie (50% G-250/50% R- 250 em metanol a 45%, ácido acético a 10%), e descorado com ácido acético a 7%, metanol a 5% em água destilada. A quantificação de bandas alvo foi feita comparando valores densitométricos para as bandas contra corridas de amostras de Albumina de Soro Bovino (BSA) no mesmo gel para gerar uma curva padrão.

EXEMPLO 6

[0081] Solubilização de corpos de inclusão. Seis ml de suspensão de corpos de inclusão (contendo 32 mg/ml de proteína DIG-657) foram centrifugadas na potência máxima de uma microcentrífuga Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 xg) para agregar as inclusões. O sobrenadante tampão de armazenamento foi removido e substituído com 25 ml de 100 mM tampão de carbonato de sódio, pH 11, em um tubo cônico de 50 ml. As inclusões foram ressuspensas utilizando uma pipeta e agitadas em vórtice para misturar bem. O tubo foi colocado em uma plataforma de agitação suave a 4° C durante a noite para extrair a proteína alvo. O extrato foi centrifugado a 30.000 xg durante 30 min a 4° C, e o sobrenadante resultante foi concentrado 5 vezes utilizando um dispositivo de filtro centrífugo de celulose regenerada Amicon Ultra-15 (corte de peso molecular de 30.000; Millipore, Billerica, MA). O tampão de amostra foi em seguida alterado para 10 mM CAPS [ácido 3-(ciclo-hexamino)1-propanossulfônico] pH 10, utilizando colunas descartáveis PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

EXEMPLO 7

[0082] Eletroforese em gel. O extrato concentrado foi preparado para eletroforese por diluição a 1:50 em tampão de amostra NuPAGE® LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 5 mM de ditiotreitol como agente redutor e aquecido a 95° C durante 4 minutos. A amostra foi carregada em linhas duplicadas de um gel NuPAGE® a 4-12% ao lado de cinco padrões de BSA variando de 0,2 a 2 μg/linha (para a geração da curva padrão). Tensão foi aplicada a 200 V usando tampão de corrida MOPS SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) até que o corante de rastreio atingisse o fundo do gel. O gel foi corado com azul de Coomassie G- 250 a 0,2% em metanol a 45%, ácido acético a 10% e descorados, primeiro brevemente com metanol a 45%, ácido acético a 10%, e, em seguida, em pormenor com ácido acético a 7%, metanol a 5% até que o fundo ficasse limpo. Na sequência de descoloração, o gel foi digitalizado com um Biorad Fluor-S MultiImager. O Software Quantity One v.4.5.2 do instrumento foi utilizado para obter os volumes subtraídos do fundo das bandas de proteínas coradas e para gerar a curva padrão de BSA que foi usada para calcular a concentração de proteína DIG-657 na solução estoque.

EXEMPLO 8

[0083] Purificação de DIG-657. A purificação de DIG-657 foi realizada semelhante a VIP3 como descrito por Lee, MK, et al (2003), onde as células de Pf transformadas com o gene de DIG-657 foram descongeladas, suspensas em tampão de extração (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT) na presença de 0,5 ml de coquetel inibidor de protease (Sigma, St. Louis, MO) e sonicadas cinco vezes durante um minuto cada, com descanso em gelo durante 1 minuto entre cada ciclo de sonicação. A solução foi centrifugada a 20.000 xg durante 10 min, e o sobrenadante foi recolhido e aplicado a uma coluna de troca iônica MonoQ (1 cm de diâmetro X 10 cm de comprimento). A purificação da proteína foi conseguida por cromatografia sequencial de troca iônica (MonoQ 1010, GE Healthcare, Piscataway, NJ), cromatografia hidrofóbica e cromatografia de exclusão de tamanho. A preparação final revelou uma única banda de proteína migrando com um peso molecular aparente de cerca de 90 kDa.

EXEMPLO 9

[0084] Preparação das amostras e bioensaios. As preparações purificadas de DIG-657 foram diluídas apropriadamente em 10 mM CAPS, pH 10, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle consistindo nesse tampão, que serviu como um controle de antecedentes para a mortalidade e/ou a inibição do crescimento. As concentrações de proteína em tampão de bioensaio foram estimadas por eletroforese em gel, utilizando albumina de soro bovino (BSA) para criar uma curva padrão para a densitometria em gel, que foi medida usando um sistema de imagem BioRad (Richmond, CA) (Fluor-S MultiImager com Quantity One Software versão 4.5.2). As proteínas da matriz de gel foram coradas com o corante a base de Coomassie azul e descoradas antes da leitura.

[0085] As proteínas purificadas foram testadas quanto à atividade inseticida nos bioensaios realizados com larvas de lepidópteros recém- nascidas de 1-2 dias de idade em dieta artificial de inseto. As larvas de CEW, SBL, DBM, VBC, ECB, FAW e TBW foram eclodidas de ovos provenientes de uma colônia mantida por um insectário comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). As larvas de rECB e rFAW foram eclodidas de ovos recolhidos de colônias particulares (Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, IN).

[0086] Os bioensaios foram realizados em bandejas plásticas de 128 poços projetados especificamente para bioensaios de insetos (C-D internacional, Pitman, NJ). Cada poço continha 2,0 mL de dieta para multi-espécies de lepidoptera (Southland Products, Lake Village, AR). Uma alíquota de 40 μl de amostra de proteína foi distribuída com uma pipeta sobre a superfície de dieta de 2,0 cm2 de cada poço (20 μL/ cm2). Concentrações da dieta foram calculadas como a quantidade (ng) de proteína DIG-657 por centímetro quadrado (cm2) de área da superfície do poço. Uma variação de concentração de 9 dose foi utilizada a partir de 9,000 a 3 ng/cm2 com 16 larvas testadas por dose. As bandejas tratadas foram organizadas em uma coifa até que o líquido na superfície da dieta tenha sido evaporado ou sido absorvido na dieta.

[0087] Dentro de 24-48 horas de eclosão, as larvas individuais foram apanhadas com um pincel pelo de camelo umedecido e depositadas sobre a dieta tratada, uma larva por poço. Os poços infestados foram então selados com folhas adesivas de plástico transparente e ventilados para permitir a troca de gás (C-D International, Pitman, NJ). As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28° C, ~ 60% de umidade relativa, 16: 8 [luz: escuro]) durante 5 dias, depois disso foram registrados o número total de insetos expostos a cada amostra de proteína, o número de insetos mortos, e o peso de insetos sobreviventes. A percentagem de mortalidade e a porcentagem da inibição de crescimento foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (GI) foi calculada usando a fórmula que se segue:

[0088] onde TWIT é o peso total de insetos no tratamento, TNIT é o número total de insetos no tratamento, TWIBC é o peso total de insetos na verificação de antecedentes (Tampão de controle), e TNIBC é o número total de insetos na verificação de antecedentes (Tampão de controle).

[0089] A GI50 foi determinada como sendo a concentração da proteína DIG-657 na dieta em que o valor de GI foi de 50%. A concentração letal a 50% (LC50) foi registada como a concentração da proteína DIG-657 na dieta em que 50% dos insetos de teste foram mortos. As curvas de concentração-resposta de inibição de crescimento foram determinadas utilizando uma logística de parâmetro 3 não linear através de software JMP Pro, versão 9.0.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). A curva de concentração-resposta letal foi analisada por análise de Probit (Finney, 1971) dos dados de mortalidade reunidos e foi conduzida utilizando POLO-PC (LeOra Software).

[0090] A Tabela 2 apresenta os resultados dos testes de bioensaios da proteína DIG-657 em BCE, rECB, TBW, Pseudoplusia includens (Walker) (looper de soja, "SBL"), Anticarsia gemmatalis(Hübner) (lagarta, "VBC"), CEW, FAW, rFAW, e DBM. Uma constatação inesperada e surpreendente é que os insetos de teste rECB foram mais susceptível à ação da proteína DIG-657 assim como a cepa susceptível de insetos ECB. TABELA 2

[0091] Eficácia de DIG-657 purificada contra múltiplas espécies de insetos testadas no bioensaio de dieta sobreposta artificial (ng/cm2)

[0092] Os bioensaios de Helicoverpa armigera foram conduzidos por contaminação da superfície, usando as larvas recém-nascidas. Os ensaios de toxicidade foram realizados em placas de 128 células, cada célula de 2 cm2. As concentrações de 25 e 2500 ng/cm2 foram utilizadas para determinar a percentagem de mortalidade, com um controle de tampão único (Tabela 3). Os testes para determinar os valores de LC50 foram realizados utilizando 7 concentrações diferentes de protoxinas purificadas, com um controle de apenas tampão (Tabela 4). Mortalidade e interrupção foram avaliados após 7 dias a 25° C com condições de 16: 8 de luz:escuro. "Mortalidade Funcional" foi obtida pontuando mortos e L1 interrupção de larvas. Os resultados mostraram atividade DIG-657 contra Helicoverpa armigera. TABELA 3

[0093] A percentagem de mortalidade de DIG-657 contra Helicoverpa armigera testada em bioensaio de dieta artificial. TABELA 4

[0094] LC50 (ng/cm2) de DIG-657 contra Helicoverpa armigera testada em bioensaio de dieta artificial. *Valores em () são 0,95 de limites de confidência

EXEMPLO 10

[0095] Produção de proteínas inseticidas Bt DIG-657 e variantes em plantas dicotiledôneas.

[0096] Transformação da Arabidopsis. Arabidopsis thaliana Col-01 é transformada utilizando o método de mergulho floral (Weigel e Glazebrook, 2002). A colônia selecionada de Agrobacterium é utilizada para inocular 1 ml a 15 ml de culturas de caldo de YEP contendo os antibióticos apropriados para a seleção. A cultura é incubada durante a noite a 28° C com agitação constante a 220 rpm. Cada cultura é usada para inocular duas culturas de 500 mL de caldo de YEP contendo os antibióticos apropriados para a seleção e as novas culturas foram incubadas durante a noite a 28° C com agitação constante. As células são sedimentadas a aproximadamente 8700 xg durante 10 minutos em temperatura ambiente, e o sobrenadante resultante é descartado. O sedimento de células é suavemente ressuspenso em 500 ml de meios de infiltração contendo: 1/2x sais de Murashige e Skoog (Sigma-Aldrich) / vitaminas B5 de Gamborg (Gold Biotechnology, St. Louis, MO), 10% (w/v) sacarose, 0,044 μM benzilaminopurina (10 μL/L de 1 mg/ml de estoque em DMSO) e 300 μL/L de Silwet L-77. As plantas de aproximadamente 1 mês de idade são mergulhadas no meio durante 15 segundos, com o cuidado de assegurar a submersão da mais nova inflorescência. As plantas são então colocada sobre os seus lados e cobertas (transparente ou opaco), durante 24 horas, lavadas com água, e colocadas na posição vertical. As plantas são cultivadas a 22° C, com um fotoperíodo de 16:8 luz:escuro. Aproximadamente 4 semanas após a imersão, as sementes são colhidas.

[0097] Cultivo e Seleção de Arabidopsis. Sementes T1 recentemente colhidas são deixadas secar durante pelo menos 7 dias em temperatura ambiente na presença de dessecante. A semente é suspensa em uma solução de agar/ água a 0,1% (Sigma-Aldrich) e, em seguida, estratificada a 4° C durante 2 dias. Para se preparar para o plantio, Sunshine Mix LP5 é coberta (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) em bandejas de germinação de 26,67 cm (10,5 polegadas) x 53,34 cm (21 polegadas) (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) com vermiculita fina, sub-irrigada com solução de Hoagland ( Hoagland e Arnon, 1950) até molhar, em seguida, deixada escorrer durante 24 horas. Semente estratificada é semeada na vermiculita e coberta com coifas de umidade (KORD Products, Bramalea, Ontário, Canadá) durante 7 dias. As sementes são germinadas e as plantas são cultivadas em um Conviron (Modelos CMP4030 ou CMP3244; Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dias longos (fotoperíodo de 16:8 luz:escuro) com uma intensidade de luz de 120150 μmol/m2seg sob condições de temperatura constante (22° C) e umidade (40-50%). As plantas são regadas inicialmente com solução de Hoagland e, posteriormente, com água deionizada para manter o solo úmido, mas não molhado.

[0098] As coifas são removidas 5-6 dias após semeadura e as plantas são pulverizadas com um agente de seleção químico para matar as plantas germinadas a partir de sementes não transformadas. Por exemplo, se o gene marcador selecionável expressável da planta fornecido pelo vetor binário para transformação de plantas for um gene pat ou bar (Wehrmann et al., 1996), as plantas transformadas podem ser selecionadas por pulverização com uma solução 1000X de Finale (5,78% glufosinato de amônio, Farnam Companies Inc., Phoenix, AZ.). Duas pulverizações subsequentes são realizados a intervalos de 5-7 dias. Sobreviventes (plantas em crescimento ativo) são identificados 710 dias após a pulverização final e são transplantados para vasos preparados com Sunshine Mix LP5. As plantas transplantadas são cobertas com uma coifa de umidade durante 3-4 dias e colocadas em um Conviron sob as condições de crescimento acima mencionadas.

[0099] Os versados na técnica de transformação de plantas dicotiledóneas entenderão que outros métodos de seleção de plantas transformadas estão disponíveis quando outros genes marcadores selecionáveis expressáveis de planta (por exemplo, genes de tolerância a herbicidas) são utilizados.

EXEMPLO 11

[00100] Glycine max transgênico compreendendo DIG-657. Dez a 20 plantas Glycine max T0 transgênicas abrigando vetores de expressão para ácidos nucleicos que compreendem DIG-657 são geradas tal como é conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium. Sementes de soja maduras (Glycine max) são esterilizadas durante a noite com o gás de cloro durante dezesseis horas. Após esterilização com gás de cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma câmara de fluxo LAMINAR™ para dissipar o gás de cloro. Em seguida, as sementes esterilizadas são embebidas com H2O estéril por 16 horas no escuro, utilizando uma caixa negra a 24° C.

[00101] Preparação de semente de soja dividida. A semente de soja dividida que compreende uma parte de um protocolo de eixo embrionário exige a preparação do material de semente de soja, que é cortado longitudinalmente, utilizando uma lâmina de # 10 afixada a um bisturi, ao longo do hilo da semente para separar e remover o revestimento da semente, e para dividir a semente em duas seções de cotilédones. Atenção especial é feita para remover parcialmente o eixo embrionário, em que cerca de 1/2 - 1/3 do eixo do embrião permanece ligada à extremidade nodal do cotilédone.

[00102] Inoculação. As sementes de soja divididas que compreende uma porção parcial dos eixos embrionários são então imersas durante cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo o plasmídeo binário compreendendo DIG-657. A solução de Agrobacterium tumefaciensé diluída para uma concentração final de À=0,6 OD650 antes de imergir os cotilédones que compreendem o eixo do embrião.

[00103] Cocultivo. Após a inoculação, a semente de soja dividida é permitida a cocultivar com o Agrobacterium tumefaciens durante 5 dias em meio de cocultura (Wang, Kan Agrobacterium Protocols 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Impressão) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro.

[00104] Indução do broto. Após 5 dias de cocultivo, as sementes de soja divididas são lavadas em meio líquido de indução de broto (SI) que consiste em sais B5, vitaminas B5, 28 mg/L ferroso, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L sacarose, 0,6 g/L MES, 1,11 mg/L BAP, 100 mg/L TIMENTIN™, 200 mg/l cefotaxima e 50 mg/L vancomicina (pH 5,7). As sementes de soja divididas são então cultivadas em meio de indução de broto I (SI I) que consiste em sais B5, vitaminas B5, 7 g/L agar Noble, 28 mg/L ferroso, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L sacarose, 0,6 g/L MES, 1,11 mg/L BAP, 50 mg/L TIMENTIN™, 200 mg/l cefotaxima, 50 mg/l vancomicina (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone voltado para cima e a extremidade nodal do cotilédone embebida no meio. Após 2 semanas de cultura, os explantes de semente de soja dividida transformada são transferidos para o meio de indução de broto II (SI II) contendo meio SI I suplementado com 6 mg/L de glufosinato (LIBERTY®).

[00105] Alongamento do broto. Após 2 semanas de cultura em meio de SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e uma folha do broto lavada contendo os eixos embrionários é excisada, fazendo um corte na base do cotilédone. A folha do broto isolada do cotilédone é transferida para o meio de alongamento do broto (SE). O meio SE consiste em sais de MS, 28 mg/L ferroso, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/l sacarose e 0,6 g/L MES, 50 mg/l asparagina, 100 mg/L ácido L- piroglutâmico, 0,1 mg/L IAA, 0,5 mg/L GA3, 1 mg/L zeatina ribósido, 50 mg/L TIMENTIN™, 200 mg/l cefotaxima, 50 mg/L vancomicina, 6 mg/L glufosinato, 7 g/L agar Noble, (pH 5.7). As culturas foram transferidas para meio fresco SE a cada 2 semanas. As culturas são cultivadas em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24° C com um fotoperíodo de 18 h a uma intensidade luminosa de 80-90 μmol/ m2seg.

[00106] Enraizamento. Brotos alongados que se desenvolveram a partir da folha do broto de cotilédone são isolados pelo corte do broto alongado na base da folha de broto de cotilédones, e mergulhando o broto alongado em 1 mg/L IBA (ácido indol 3- butírico) durante 1-3 minutos para promover o enraizamento. Em seguida, os brotos alongados são transferidos para meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, 28 mg/L ferroso, 38 mg/L Na2EDTA, 20 g/l sacarose e 0,59 g/L MES, 50 mg/l asparagina, 100 mg/L ácido L-piroglutâmico, 7 g/L agar Noble, pH 5,6) em bandejas Phytá.

[00107] Cultivo. Após a cultura em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24° C, fotoperíodo de 18 h, durante 1-2 semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo em um copo de sundae coberto e colocado em uma câmara de crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dias longos (16 horas de luz / 8 horas de escuro) com uma intensidade de luz de 120-150 μmol/m2seg sob temperatura constante (22° C) e umidade (40 -50%) para aclimatação de plântulas. As plântulas enraizadas são aclimatadas em copos de sundae por várias semanas antes de serem transferidas para a estufa para posterior aclimatização e estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.

[00108] O desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas. As características da raiz da planta, do broto, da folhagem e da reprodução são comparadas. Não há nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento radicular e de crescimento das plantas transgênicas e não transformadas. As características do broto da planta tais como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são semelhantes. De um modo geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de proteínas DIG quando cultivadas in vitro e em solo na estufa.

EXEMPLO 12

[00109] Produção de proteínas inseticidas Bt DIG-657 e variantes em plantas monocotiledôneas.

[00110] Transformação mediada por Agrobacteriumdo milho. Sementes de um cruzamento F1 alto II ou B-104 (Armstrong et al., 1991) foram plantadas em vasos de 5 galões contendo uma mistura de 95% meio de cultura sem solo Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) e 5% de argila/ terra argilosa. As plantas foram cultivadas em estufa, utilizando uma combinação de sódio de alta pressão e lâmpadas de iodetos metálicos com um fotoperíodo de 16: 8 horas de luz: escuro. Para obter embriões imaturos F2 para transformação, sib-polinizações controladas foram realizadas. Os embriões imaturos foram isolados em 8-10 dias após a polinização quando os embriões foram de aproximadamente 1,0 a 2,0 mm de tamanho.

[00111] Infecção e de cocultivo. Espigas de milho foram esterilizadas na superfície esfregando com sabão líquido, imersão em etanol a 70% durante 2 minutos, e, em seguida, imersão em alvejante comercial a 20% (hipoclorito de sódio a 0,1%) durante 30 minutos antes de serem enxaguadas com estéril água. Uma suspensão de células de Agrobacterium contendo um vetor superbinário foi preparada por transferência de 1-2 ciclos de bactérias cultivadas em meio sólido YEP contendo 100 mg/L espectinomicina, 10 mg/L tetraciclina, e 250 mg/L estreptomicina a 28° C durante 2- 3 dias em 5 ml de meio de infecção líquido (Meio Basal LS (Linsmaier e Skoog, 1965), vitaminas N6 (Chu et al., 1975), 1,5 mg/L ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 68,5 g/L sacarose, 36,0 g/L glucose, 6 mM L-prolina, pH 5,2) contendo 100 μM de acetosiringona. A solução foi agitada em vórtice até se obter uma suspensão uniforme, e a concentração foi ajustada a uma densidade final de cerca de 200 unidades Klett utilizando um colorímetro Klett- Summerson com um filtro roxo, ou uma densidade óptica de cerca de 0,4 a 550 nm. Os embriões imaturos foram isolados diretamente para um tubo de microcentrífuga contendo 2 ml do meio de infecção. O meio foi removido e substituído com 1 ml de solução de Agrobacterium com uma densidade de 200 unidades Klett, e a solução de Agrobacterium e do embrião foi incubada durante 5 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, transferida para meio de cocultura (Meio Basal LS, (contendo vitaminas N6, 1,5 mg/ L de 2,4-D, 30,0 g/L de sacarose, 6 mM de L-prolina, 0,85 mg/L de AgNO3, 100 μM de acetosiringona e 3,0 g/L de goma de gelano (PhytoTechnology Laboratories., Lenexa, KS), pH 5,8) durante 5 dias a 25° C sob condições de escuridão.

[00112] Após o cocultivo, os embriões foram transferidos para meio seletivo depois do qual os isolados transformados foram obtidos ao longo de aproximadamente 8 semanas. Para a seleção de tecidos de milho transformados com um plasmídeo superbinário contendo um gene marcador selecionável pat ou bar expressável na planta, um meio de base LS (meio basal LS, com 1X vitaminas N6, 1,5 mg/L de 2,4-D, 0,5 g/L de MES (mono-hidrato de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico;. PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), 30,0 g/L de sacarose, 6 mM de L-prolina, 1,0 mg/L de AgNO3, 250 mg/l de cefotaxima, 2,5 g/L de goma gelano, pH 5,7) foi utilizado com Bialafos (Gold BioTechnology, St. Louis, MO). Os embriões foram transferidos para meio de seleção contendo 3 mg/L de bialafos até que isolados embriogênicos fossem obtidos. Isolados recuperados foram reunidos por transferência para meio de seleção fresco, em intervalos de 2 semanas para a regeneração e análise adicional. Os versados na técnica da transformação de milho compreenderão que outros métodos de seleção de plantas transformadas estão disponíveis quando outros genes marcadores selecionáveis expressáveis na planta (por exemplo, genes de tolerância a herbicidas) são utilizados.

[00113] Dois construtos diferentes de DIG-657 contidas em plasmídeos pDAB114534 e pDAB114535 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) (Tabela 5) foram transformadas em milho. Plantas T0 foram regeneradas e testadas quanto à sua capacidade para controlar os insetos-praga alvo. Construto pDAB115782 é um plasmídeo contendo o gene para uma YFP (proteína fluorescente amarela), utilizada como um controle negativo para uma planta transformada com um gene não inseticida. TABELA 5

[00114] Descrição dos plasmídeos contendo diferentes construtos DIG-657 transformados em plantas de milho.

[00115] Um corte da folha de 6,45 cm2 x 3,23 cm2 (1,0 X 0,5 polegadas quadrado) foi feito em duplicado a partir da folha V3 ou V4 de plantas transgênicas T0 V5. Para cada ensaio, os tecidos da folha da planta de tipo selvagem foram amostrados em primeiro lugar para evitar a contaminação cruzada das toxinas Bt nas bordas da folha, seguido pelas plantas transformadas. Em cada poço da bandeja de bioensaio (bandejas de 32 poços e tampas, CD International, Pitman, NJ), uma folha de corte foi colocada em água-agar a 2% (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) e isto foi repetido duas vezes por espécies de insetos, por evento e por construto. Cada poço foi infestado com dez EBC ou Diatraea saccharalis (Fabricius) (Sugarcane Borer "SCB") neonatos (24-48 horas de idade) e selado com uma tampa de plástico perfurada para permitir a troca de ar. As bandejas foram colocadas a 28° C (16: 8 h de luz: escuro, UR a 40%) e após 3 dias, elas foram classificadas quanto a porcentagem de danos na folha. A porcentagem dos dados de dano da folha foi analisada com ANOVA e separações médias com o teste de Tukey-Kramer quando as variações foram homogêneas usando JMP® Pro 9.0.1 (2010 SAS Institute Inc., Cary, NC). O nível de dano da folha observado por cada espécie de inseto em material de planta transgênico é mostrado na Tabela 6. TABELA 6

[00116] Porcentagem média de danos da folha causados por alimentação de larvas ECB ou SCB nos tecidos foliares de milho T0 de construtos 114534, 114535 ou 115782 * Desvio padrão (n=10)

[00117] Ambos os construtos 114534 e 114535 resultaram em menos danos médios em comparação com o construto de controle negativo YFP (115782). O construto 114534 expressando a proteína DIG-657 de comprimento total apresentou maior atividade inseticida sobre o construto 114535 expressando a proteína DIG-657 truncada.

EXEMPLO 13

[00118] Regeneração e produção de sementes. Para a regeneração, as culturas foram transferidas para meio de indução "28" (sais MS e vitaminas, 30 g/L de sacarose, 5 mg/L de benzilaminopurina, 0,25 mg/L de 2,4-D, 3 mg/L de bialafos, 250 mg/L de cefotaxima, 2,5 g/L de goma Gellan, pH 5,7) durante 1 semana sob condições de pouca luz (14 μEm- 2s-1), depois, uma semana em condições de alta-luz (aproximadamente 89 μEm-2s-1). Os tecidos foram posteriormente transferidos para meio de regeneração "36" (o mesmo que meio de indução, exceto faltando reguladores de crescimento). As plântulas de 3-5 cm de comprimento foram transferidas para tubos de cultura de vidro contendo meio de SHGA (Schenk e Hildebrandt salts and vitamins (1972); PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), 1,0 g/L de mio-inositol, 10 g/L de sacarose e 2,0 g/L de goma Gellan, pH 5,8) para permitir o crescimento e desenvolvimento do broto e das raízes. As plantas foram transplantadas para a mesma mistura de solo conforme descrito anteriormente neste documento e cultivadas até à floração na estufa. Foram realizadas polinizações controladas para produção de sementes. EXEMPLO 14

[00119] Desenho de uma versão optimizada da planta da sequência de codificação para a proteína inseticida Bt DIG-657. Uma sequência de DNA que tem um viés de códons da planta foi desenhada e sintetizada para produzir a proteína DIG-657 em plantas transgênicas monocotiledóneas e dicotiledóneas. Uma tabela de utilização de códons para o milho (Zea mays L.) foi calculada a partir de sequências de codificação de proteínas 706 (CDs) obtidas de sequências depositadas no GenBank. Tabelas de uso de códon do tabaco (Nicotiana tabacum, 1.268 CDs), canola (Brassica napus, 530 CDs), algodão (Gossypium hirsutum, 197 CDs) e soja (Glycine max; ca. 1000 CDs) foram baixadas a partir de dados no site http://www.kazusa.or.jp/codon/. Um conjunto de códons pré-concebido que compreende os códons altamente usados comuns a ambos os conjuntos de dados de milho e dicotiledóneas, em quantidades relativas médias ponderadas apropriadas, foi calculado após omitir qualquer códon redundante utilizado menos do que cerca de 10% do total de códon usado para esse aminoácido em qualquer tipo de planta. Para obter uma sequência de plantas optimizadas que codifica a proteína DIG-657, substituições de códons para a sequência de DNA de DIG-657 experimentalmente determinada foram feitas de tal forma que a sequência de DNA resultante tinha a composição do códon total de polarização da tabela pré-concebida de códons optimizados da planta. Refinamentos posteriores da sequência foram feitos para eliminar locais de reconhecimento indesejáveis de enzimas de restrição, locais de splicing de íntron da planta potenciais, corridas longas de resíduos de A/T ou C/G, e outros motivos que possam interferir com a estabilidade de RNA, transcrição, ou tradução da região de codificação em células vegetais. Outras mudanças foram feitas para introduzir locais de reconhecimento de enzimas de restrição desejadas, e para eliminar quadros de leituras abertos longos (quadros outros que não +1). Essas mudanças foram todas feitas dentro dos limites de retenção da composição do códon pré-concebido da planta. Síntese da sequência concebida foi realizada por um fornecedor comercial (DNA2.0, Menlo Park, CA). Orientação adicional em relação à produção de genes sintéticos pode ser encontrada em, por exemplo, WO 97/13402 e Patente US N° 5.380.831. Uma sequência de DNA optimizada de milho que codifica a variante1 de DIG-657 é apresentada na SEQ ID NO: 3. Uma sequência de DNA optimizada de Pseudomonas fluorescens que codifica a variante2 de DIG-657 é apresentada na SEQ ID NO: 4. Uma sequência de DNA de GC alta optimizada de milho que codifica DIG- 657 é apresentada na SEQ ID NO: 5. Uma sequência de DNA de GC alta optimizada de milho que codifica o gene truncado 204 aa de DIG- 657 do terminal N é apresentada na SEQ ID NO: 6. Uma sequência de DNA optimizada de dicotiledóneas que codifica a DIG-657 de comprimento total é apresentada na SEQ ID NO: 8. Uma sequência de DNA optimizada de dicotiledóneas que codifica a DIG-657 truncada é apresentada na SEQ ID NO: 9.

[00120] A hibridação de DNA imobilizado em Southern blots com sondas específicas para o gene radioativamente marcado é realizada por métodos padrão (Sambrook et al., Supra.). Isótopos radioativos utilizados para marcação de sondas polinucleotídicas incluem 32P, 33P, 14C, ou 3H. A incorporação de isótopos radioativos em moléculas de sonda de polinucleotídeo é feita por qualquer um dos vários métodos bem conhecidos dos versados no campo da biologia molecular. (Ver, por exemplo, Sambrook et al., Supra). Em geral, a hibridação e lavagens subsequentes são realizadas sob condições rigorosas que permitem a detecção de sequências alvo com homologia com os genes que codificam as toxinas reivindicadas. Para sondas do gene de DNA de cadeia dupla, a hibridação é realizada durante a noite a 20° C até 25° C abaixo do Tm do híbrido do DNA em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg/mL de DNA desnaturado [20X SSPE é 3M de NaCl, 0,2 M de NaHPO4, e 0,02 M de EDTA (sal de sódio de ácido etilenodiamino tetra-acético); 100X solução de Denhardt (20 g/L de polivinilpirrolidona, 20 g/L de Ficoll tipo 400 e 20 g/L de BSA fração V).

[00121] As lavagens são tipicamente realizadas como se segue: a. Duas vezes em temperatura ambiente durante 15 minutos em 1x SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de baixo rigor). b. Uma vez a 20° C abaixo da temperatura Tm durante 15 minutos em 0,2 X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de rigor moderado).

[00122] Para as sondas oligonucleotídicas, a hibridação pode ser realizada durante a noite a 10° C até 20° C abaixo do Tm do híbrido em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. O Tm para as sondas de oligonucleotídeos pode ser determinado pela seguinte fórmula (Suggs et al., 1981).

[00123] Tm (° C) = 2 (número de pares de bases T/A) + 4 (número de pares de base G/C)

[00124] As lavagens são tipicamente realizadas como se segue: a. Duas vezes em temperatura ambiente durante 15 minutos em 1X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de baixo rigor). b. Uma vez em temperatura de hibridação durante 15 minutos em 1x SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de rigor moderado).

[00125] As moléculas da sonda para hibridização e moléculas híbridas formadas entre sonda e moléculas alvo podem ser tornadas detectáveis por outros meios sem ser marcação radioativa. Tais métodos alternativos destinam-se a estar dentro do âmbito da presente invenção.

[00126] Enquanto a presente invenção pode ser susceptível a várias modificações e formas alternativas, modalidades específicas têm sido descritas por meio de exemplo em detalhes aqui. No entanto, deve ser entendido que a presente descrição não se destina a ser limitada às formas particulares divulgadas. Em vez disso, a presente divulgação é para cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas, que se enquadrem no âmbito da presente divulgação, como definido pelas seguintes reivindicações anexas e seus equivalentes legais.

Claims (6)

1. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais elementos reguladores heterólogos e uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida em que a referida sequência de ácido nucleico é escolhida dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 12.

2. Método para o controle de insetos susceptíveis, caracterizado pelo fato de que compreende o contato do referido inseto com uma quantidade eficaz de uma proteína selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o inseto susceptível é uma broca do milho europeu resistente a Cry1F.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende os resíduos 206 a 803 da SEQ ID NO: 2.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a população de insetos é selecionada dentre o grupo que consiste em broca do milho europeu, broca do milho europeu resistente a Cry1F, lagarta-falsa-medideira, lagarta da soja, lagarta do tabaco, lagarta do algodão, larva de traça do milho e traça das crucífe- ras.

6. Método para a produção de uma planta resistente a insetos, caracterizado pelo fato de que compreende transformar uma planta com um construto de ácido nucleico compreendendo um ou mais elementos reguladores heterólogos e uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida em que a referida sequência de ácido nucleico é escolhida dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 12 e selecionar a progênie através da análise de pelo menos uma porção do construto do DNA exógeno da referida planta transformada.