KR19990039947A - 고온성 절대공생 미생물 심비오박테리움의 공생균주인 고온성미생물 바실러스 속 균주 유래의 내열성 글루타메이트 라세마아제를 암호하는 유전자 및 이를 이용한 내열성 글루타메이트 라세마아제의 제조방법 - Google Patents

고온성 절대공생 미생물 심비오박테리움의 공생균주인 고온성미생물 바실러스 속 균주 유래의 내열성 글루타메이트 라세마아제를 암호하는 유전자 및 이를 이용한 내열성 글루타메이트 라세마아제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고온성 미생물바실러스속 (Bacillussp.) 균주 유래의 내열성 글루타메이트 라세마아제를 암호하는 유전자 및 그를 이용하여 내열성 글루타메이트 라세마아제를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고온성 절대공생 미생물심비오박테리움의 공생균주인바실러스속 균주 유래의 글루타메이트 라세마아제를 암호하는 유전자 및 그의 염기서열, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터와 대장균 형질전환체 그리고 이들을 이용한 글루타메이트 라세마아제의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하여 제조된 내열성 글루타메이트 라세마아제는 높은 온도에서도 그 활성이 탁월하고 효소안정성이 높아 D-글루탐산의 제조를 위한 생물전환공정에 생물촉매로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

고온성 절대공생 미생물 심비오박테리움의 공생균주인 고온성 미생물 바실러스 속 균주 유래의 내열성 글루타메이트 라세마아제를 암호하는 유전자 및 이를 이용한 내열성 글루타메이트 라세마아제의 제조방법
본 발명은 고온성 미생물 바실러스 속 (Bacillus sp.) 균주 유래의 내열성 글루타메이트 라세마아제를 암호하는 유전자 및 그를 이용하여 내열성 글루타메이트 라세마아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 고온성 절대공생 미생물 심비오박테리움의 공생균주인 바실러스 속 균주 유래의 글루타메이트 라세마아제 (Glutamate racemase: EC 5.1.1.3; 이하 'GluRA'로 약칭함)를 암호하는 유전자 및 그의 염기서열, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터와 대장균 형질전환체 그리고 이들을 이용한 GluRA 의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하여 제조된 내열성 GluRA 는 높은 온도에서도 그 활성이 탁월하고 효소안정성이 높아 D-글루탐산의 제조를 위한 생물전환공정에 생물촉매로 유용하게 사용될 수 있다.
D-글루탐산은 의약품, 생리활성물질, 항생제 및 합성감미료의 원료물질로 이용되고 다른 D-아미노산을 함유한 고부가가치의 의약품 합성공정에 기질물질로 이용되는 등 그 용도가 광범위하다. D-글루탐산은 합성공정이 복잡하고 고가이기 때문에 이에 대한 경제성 있는 제조방법이 개발되어 저렴한 가격으로 공급될 수 있다면 그 수요는 급증할 것으로 전망된다.
고가의 D-글루탐산 제조법은 크게 화학적 제조 방법과 효소적 제조 방법으로 나눌 수 있다. 화학적 제조법에 의한 아미노산의 생산은 D,L-아미노산이 혼합된 상태(racemic mixture)로 생성물이 얻어지기 때문에, 복잡한 광학적 분할 과정 등을 거쳐야 하는 어려움이 있다. 반면, 생물 촉매를 이용한 D-글루탐산 합성은 광학적으로 순수한 D-글루탐산을 직접 제조할 수 있으며 부반응이 없어 환경오염 원인이 되는 부산물 생성을 줄일 수 있기 때문에 저공해 청정기술로서 주목되고 있다.
효소적 제조법은 GluRA 를 생물촉매로 이용하여 L-글루탐산으로부터 D-글루탐산을 직접 제조하는 방법과 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제(D-amino acid aminotransferase, EC 2.6.1.21)를 생물촉매로 사용하여 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)로부터 D-글루탐산을 제조하는 방법 등이 있다.
효소적 제조법에 사용되는 GluRA 는 유산균(N.Nakajima et al., Agric. Biol. Chem., 52, 3099-3104 (1988)), 에스테리카 속(G. Balico and P. Venetianer, J. Bacteriol., 175, 6571-6577 (1993)), 바실러스 속(L. Liu et al., Biochem., 121, 1155-1161 (1997)) 및 스타필로코크스 속(M. J. Pucci et al., J. Bacteriol., 177, 336-342 (1995)) 균주 등에서 발견된다.
GluRA 는 박테리아의 세포벽 주요 구성성분 중의 하나인 D-글루탐산을 L-글루탐산으로부터 직접 제조하는 효소로서, L-글루탐산에 대한 높은 기질 특이성을 가진다. GluRA 을 이용한 D-글루탐산의 효소적 합성은 기질인 L-글루탐산을 가한 반응액에 적정량의 GluRA 를 가하면 L-글루탐산이 D-글루탐산으로 전환되어 평형조건에 도달한다. 이러한 효소 전환반응 완료 후 글루타메이트 디카복시라아제(glutamate decarboxylase, EC 5.1.1.3)를 반응액에 첨가하여 반응액내에 남아있는 잔존 L-글루탐산을 분해함으로서 광학적으로 순수한 D-글루탐산을 제조할 수 있다.
효소를 생물촉매로 이용하는 생물 전환 공정에 있어서 생물촉매의 안정성은 효소전환합성반응의 생산성을 결정하는 가장 중요한 요인이다. 내열성 GluRA 의 생물촉매 전환반응을 이용하여 고부가가치 의약용 아미노산인 D-글루탐산 및 여러 종류의 D-아미노산을 제조하기 위한 효소공정에 있어서 생물촉매의 안정성은 생산성 증대에 매우 중요한 요소로 작용한다. 일반적으로 고온의 생육 환경에 서식하는 고온성 미생물들은 서식지의 고온 극한 환경의 영향에 의해 열에 안정한 내열성 효소를 가지고 있다. 그리고 이러한 내열성 효소는 열에 안정한 특징 이외에도 유기 용매에 대한 안정성, pH에 대한 안정성 및 화학 변성제 등에 대한 안정성도 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 고온성 미생물에서 유래되는 내열성 GluRA 는 상기에서 언급한 생물촉매의 안정성을 가지고 있으므로 D-글루탐산 및 여러종류의 D-아미노산의 제조기술 개발에 있어서 생물촉매로 유용하게 사용될 수 있다.
이에 본 발명자들은 국내 각지의 토양, 폐수, 두엄, 간헐천 등의 고온균 서식지로부터 분리한 1,300 여종의 고온성 미생물로부터 내열성 GluRA 를 생산하는 신규 고온성 미생물을 탐색한 결과, 65℃에서도 생육이 가능하고 열안정성이 매우 높은 내열성 GluRA 를 생산하는 신규 고온성 미생물 바실러스 속 SK-1 균주(KCTC 0306BP)를 분리하여 출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제 97-15427 호).
본 발명자들은 고온성 미생물 유래의 내열성 GluRA 를 대량 생산하는 유전공학적 방법을 개발하기 위하여 연구를 계속한 결과, 상기 고온성 미생물 바실러스 속 SK-1 균주로부터 내열성 GluRA 유전자를 클로닝하고 이를 포함한 발현벡터를 제조한 다음 발현벡터를 대장균에 형질전환시키고 그로부터 내열성 GluRA 를 제조하여 그 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 고온성 미생물 바실러스 속 (Bacillus sp.) 균주 유래의 내열성 GluRA 를 암호하는 유전자 및 그의 염기서열, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터와 대장균 형질전환체 그리고 이들을 이용한 GluRA 의 제조방법을 제공하는 데 목적이 있다.
도 1 은 내열성 글루타메이트 라세마아제를 암호하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터 pGSK 23 의 작제과정을 도시한 것이고,
도 2 는 본 발명에 의하여 제조한 내열성 글루타메이트 라세마아제를 이용하여 D-글루탐산을 제조하는 데 있어서 온도의 영향을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고온성 미생물 균주인 바실러스 속 균주로부터 생산되는 내열성 GluRA 를 암호하는 유전자 및 그의 염기서열을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 및 그의 대장균 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 내열성 GluRA 유전자를 포함하는 발현벡터로 미생물을 형질전환시킨 후 그 형질전환체를 배양하여 조세포 용출액을 얻고 이를 열처리한 다음 크로마토그래피를 수행하여 내열성 GluRA 를 얻는 GluRA 의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 고온성 미생물 균주인 바실러스 속 균주 유래의 내열성 GluRA 의 아미노산 서열을 제공한다.
또한 본 발명은 고온성 미생물인 바실러스 속 SK-1 균주 유래의 내열성 GluRA 를 L-글루탐산을 기질로 D-글루탐산을 얻는 D-글루탐산 전환반응의 생물촉매로 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 고온성 미생물 균주인 바실러스 속 균주로부터 생산되는 내열성 GluRA 를 암호하는 유전자를 얻기 위하여, 고온성 바실러스 속 균주를 배양하여 얻은 균체로부터 분리한 총염색체를 제한효소로 부분절단하여 적당한 크기의 DNA 단편을 분리한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 고온성 바실러스 속 균주로 한국 토양으로부터 분리된 고온성 바실러스 속 SK-1 균주를(KCTC 0306BP) 이용한다.
상기에서 제조한 바실러스 속 균주의 DNA 단편으로 D-글루탐산 요구성 돌연변이 대장균 균주를 형질전환시켜 D-글루탐산을 함유하지 않은 배지에서도 죽지 않는 균주를 선별함으로써, 내열성 GluRA 를 암호하는 유전자를 가진 클론을 분리한다.
구체적으로, 상기 D-글루탐산 요구성 돌연변이 대장균 균주로 대장균 WM335를 이용한다. 대장균 WM335 는 세포벽을 구성하는 D-글루탐산을 합성하는 기능을 상실하여 D-글루탐산이 첨가되지 않은 배지에서는 생육할 수 없는 D-글루탐산 요구성 돌연변이 균주이다 (Lugtenberg, E. J. J. et al., J. Bacteriol. 114, 499-506, (1973)).
상기의 내열성 GluRA 를 암호하는 유전자를 포함한 클론 DNA 를 제한효소를 이용하여 분석하여 GluRA 유전자를 분리한다.
구체적으로 상기 클론은 내열성 GluRA 를 암호하는 유전자를 포함하는 6.2 kb 크기의 재조합 플라스미드를 가지고 있으며 이 플라스미드의 삽입 DNA 중 불필요한 부분을 제한효소로 절단하여 최종적으로 792 bp 의 GluRA 유전자 DNA 단편을 분리하였다.
상기 내열성 GluRA 유전자를 포함하는 플라스미드를 pGSK 23 으로 명명하고 이 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 그 형질전환체(E. coli XL1-Blue/pGSK23)를 1997년 10월 10일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0393BP).
또한 내열성 GluRA 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pGSK 23 등을 사용하여 생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Science 214, 1205-1210 (1981))으로 내열성 GluRA 유전자의 염기서열을 결정한다. 구체적으로 고온성 바실러스 속 SK-1 균주(KCTC 0306BP)로부터 분리한 내열성 GluRA 유전자는 서열 1의 염기서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 내열성 GluRA 의 아미노산 서열을 상기 염기서열을 이용하여 결정한다. 구체적으로 고온성 바실러스 속 SK-1 균주 유래의 내열성 GluRA 는 264개의 아미노산으로 이루어진 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 내열성 GluRA 유전자를 포함하는 발현벡터로 미생물을 형질전환시키고 그 형질전환체를 배양하여 조세포 용출액을 얻어 열처리한 다음 크로마토그래피를 수행하여 내열성 GluRA 를 얻는 GluRA 의 제조방법을 제공한다.
구체적으로 고온성 바실러스 속 균주로부터 생산되는 내열성 GluRA 는 발현벡터 pGSK23 에 의하여 형질전환된 상기 대장균 형질전환체(KCTC 0393BP)를 LB 배지에 접종하고 24 시간 배양 후, 균체를 수확하고 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하여 조효소액을 얻는다.
상기 조효소액을 열처리함으로써 대장균 유래의 단백질 및 효소들을 효과적으로 제거하는데, 열처리하는데 바람직한 온도는 55℃ 이다.
상기 열처리로 부분정제한 효소액을 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)와 비친수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography) 등을 통해 순수하게 정제된 내열성 GluRA 을 얻는다.
상기의 과정으로 제조된 고온성 바실러스 속 균주 유래의 내열성 GluRA 의 활성을 조사하기 위하여, L-글루탐산을 함유한 반응액에 상기 내열성 GluRA 를 가하고 고속액상분석기로 D-글루탐산의 생산량을 측정하였다.
또한 내열성 GluRA 의 활성에 온도가 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상기 D-글루탐산의 생산반응을 온도를 달리하면서 측정하였다.
그 결과 본 발명의 내열성 GluRA 은 높은 D-글루탐산 생산성을 보이며 고온에서도 그 활성이 탁월함을 알수 있었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 바실러스 속 SK-1 (KCTC 0306BP) 유래의 내열성 GluRA를 암호하는 유전자 클로닝
토양으로부터 분리된 고온성 미생물 바실러스 속 SK-1 균주(KCTC 0306BP)를 100 ㎖의 1.5% 폴리펩톤(polypeptone), 0.2 % 효모 추출물(yeast extract), 0.2 % 고기 추출물(meat extract), 0.2 % 글리세롤(glycerol), 0.2 % K2HPO4, 0.2 % KH2PO4, 0.026 % NH4Cl의 조성을 갖는 MY 액체 배지에 접종하고 55℃에서 8 시간 배양한 후 5000rpm 에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 총염색체를 분리하였으며, 총염색체 분리는 사이또 등의 방법(Saito, H. and Miura, K. Biochem. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963))에 의하였다. 구체적으로, 회수한 균체를 SE (0.15M NaCl, 0.1M EDTA (pH0.8))로 세척하고 ST (0.1M NaCl, 0.01M EDTA, 0.1M 트리스-HCl(pH9.0)) 10 ㎖에 현탁시킨 후 그 현탁액에 리소짐 5- 10 mg , TS (0.14M NaCl, 0.001M EDTA, 0.02M 트리스-HCl(pH7.5) 및 5% SDS) 2.5ml 및 프로티아제 12mg 을 첨가하여 37℃에서 3시간 방치한 후 12.5ml 의 페놀을 가하여 실온에서 15분간 방치하고 원심분리하였다. 이로부터 상등액을 취한 후 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 유리막대로 염색체 DNA 를 분리하였다. 이 염색체 DNA 를 TE (0.01M 트리스-HCl, 0.1mM EDTA (pH7.5)) : 에탄올(v/v)을 3:7, 2:8, 1:9 로 혼합한 용액으로 각각 세척하고 SSC (0.1M NaCl, 0.15M 구연산 나트륨) 에 녹였다. 이 용액에 RNase A 를 가하여 37℃에서 방치한 후 페놀을 동량 첨가하여 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 회수하여 2배량의 에탄올을 가한 후 유리막대로 총염색체 DNA 를 분리하였다. 이를 TE 에 녹인 후 100배량의 TE 에 하룻밤 동안 투석하여 조염색체 DNA 2ml를 얻었다.
이 조염색체 DNA 를 제한효소 Sau3AI 로 부분 가수분해한 후 원심분리에 의한 수크로즈 밀도구배로 약 3 내지 10 kb 크기의 DNA 단편들을 분리하였다. 분리된 DNA 단편은 제한효소 BamHI 으로 가수분해하고 5'-말단의 인산을 제거한 후 벡터 pBR 322(파마시아사, 스웨덴)와 혼합하여 16℃에서 16시간동안 T4 DNA 리가아제와 반응시켜서 재조합 플라스미드가 생성되도록 하였다. 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션(electrophoration) 법에 따라 대장균 WM335 의 형질전환에 이용하였다.
대장균 WM335 는 미생물 세포벽을 구성하는 D-글루탐산을 합성하는 기능을 상실하여 D-글루탐산이 첨가되지 않은 배지에서는 생육할 수 없는 D-글루탐산 요구성 돌연변이 균주이다(Lugtenberg, E. J. J. et al., J. Bacteriol. 14 , 499-506 (1973)).
따라서 상기 형질전환된 재조합 대장균들을 앰피실린을 함유한 LB 평판배지에서 배양하면 고온성 바실러스 속 SK-1으로부터 유래하는 GluRA 유전자를 보유하여 D-글루탐산을 합성하는 기능을 갖게된 재조합 대장균만이 D-글루탐산을 함유하지 않은 배지에서도 생육 가능하게 된다. 이와같은 선별 과정을 통하여 내열성 GluRA 활성을 보유하여 D-글루탐산을 첨가하지 않은 배지에서도 생육할 수 있는 재조합 균주 1종을 분리하였다.
<실시예 2> 내열성 GluRA 를 암호하는 DNA 염기서열 결정
선별된 내열성 GluRA 활성을 보유한 재조합 대장균으로부터 6.2 kb 크기인 재조합 플라스미드 pGSK23 을 추출 및 정제한 후 제한효소지도를 작성하여 재조합 내열성 GluRA 가 함유되어 있는 부분을 결정하였다.
pGSK23 의 삽입 DNA 중 GluRA 와 무관하여 불필요한 부분을 제한효소 Hind Ⅲ로 절단하여 Hind Ⅲ DNA 단편 약 1.1kb 를 제거하고 자가라이게이션(self-ligation)하여 서브클론 pGSK 231 을 수득하였다. 이 플라스미드를 주형 DNA로 사용하여 생거의 방법(Sanger, F. et al., Science 214, 1205-1210 (1981))에 따라 염기서열을 결정하고 이로부터 내열성 GluRA 의 아미노산 서열을 결정하였다(서열목록 참조). 결정된 염기배열로부터 내열성 GluRA 를 암호하는 792 bp 크기의 유전자를 확인하였다.
<실시예 3> 재조합 대장균으로부터 내열성 GluRA의 생산
재조합 내열성 GluRA 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pGSK23 을 대장균 XL1-Blue 균주에 형질전환 시킨 후 1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨 및 0.01% 앰피실린을 함유하는 LB-앰피실린 배지에서 24시간 동안 배양하여 재조합 내열성 GluRA 의 생산을 수행한 후 배양액으로부터 균체를 회수하고 파쇄하여 재조합 내열성 GluRA 를 함유한 조효소액을 제조하였다. 상기 방법으로 제조한 조효소액을 60℃에서 30분간 방치하여 재조합 대장균 유래의 단백질 및 효소들을 선별적으로 변성시킨 후 12000rpm 으로 30분간 원심분리하여 조효소액으로부터 제거하였다. 열처리로 부분정제한 조효소액을 이온교환 크로마토그래피와 비친수성 크로마토그래피를 통해 재조합 내열성 GluRA 를 완전 정제하였다. 제조된 조효소액의 재조합 GluRA 활성은 0.1 트리스완충액(pH 8.5) 0.2 ml에 각각 10mM 의 D-글루탐산 그리고 배양액 0.01ml에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제된 반응액을 55℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 GluRA 반응에 의하여 생성된 D-글루탐산의 양을 형광검출기가 장착된 고속 액상 분석기(HPLC)로 분석하였다.
<실시예 4> 내열성 GluRA 를 이용한 D-글루탐산의 생산
상기 실시예 3의 방법으로 수득한 재조합 내열성 GluRA 를 D-글루탐산 제조의 생물촉매원으로 사용하였다. D-글루탐산을 생물촉매 전환법으로 제조하기 위한 반응액은 10mM 의 L-글루탐산, 50mM 의 트리스 완충액(pH 8.5)에 효소원으로 정제된 GluRA 를 10mg/ml 의 농도가 되도록 첨가하여 조제하였다. 이 반응액을 55℃의 수조에서 반응을 수행한 결과, 3.5g/l/h 의 생산성으로 D-글루탐산을 제조할 수 있었다.
<실시예 5> 내열성 GluRA 를 사용한 D-글루탐산 제조에 대한 온도의 영향 조사
상기 실시예 4에서의 L-글루탐산을 포함한 반응액에 내열성 GluRA 를 생물촉매로 첨가하고 반응온도를 달리하면서 D-글루탐산 제조를 수행한 결과 도 2에 나타낸 바와 같이 70 ℃에서 최대치를 나타내었으며, 70 ℃이상의 고온에서도 높은 D-글루탐산 제조활성을 나타내었다.
따라서 본 발명의 재조합 대장균으로부터 생산된 바실러스 속 SK-1 균주 유래의 내열성 GluRA 는 높은 열안정성을 가지고 있으므로, 고온에서도 D-글루탐산 제조용 생물촉매로 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 고온성 바실러스 속 균주가 포함하고 있는 GluRA 를 암호하는 유전자는 유전공학적 방법으로 L-글루탐산을 D-글루탐산으로 전환시켜 이성질체 형성을 촉매하는 활성을 가진 내열성 GluRA 를 대량 생산하는 데 사용되어 궁극적으로는 산업적으로 유용한 D-글루탐산을 제조하는데 이용될 수 있으며, 제조방법은 그 일예를 제시하고 있고 본 발명의 방법에 의하여 제조된 내열성 GluRA 는 높은 열안정성을 가지고 있으므로 간단한 열처리를 통하여 쉽게 정제가능하고, 고온에서도 그 활성이 탁월하여 D-글루탐산의 효소적 합성에 생물촉매로 유용하게 사용될 수 있다.
〔서열목록〕
서열번호 : 1
서열의 길이 : 792
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 유전자
〔서열목록〕
서열번호 : 2
서열의 길이 : 264
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질

Claims (11)

  1. 고온성바실러스속 (Bacillussp.) 균주 유래의 내열성 GluRA 를 암호하는 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서,바실러스속 균주는바실러스속 SK-1 균주 (KCTC 0306BP) 인 것을 특징으로 하는 유전자.
  3. 제 2 항에 있어서, 서열 1의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 고온성바실러스속 균주 유래의 내열성 GluRA 유전자를 포함하는 발현벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 발현벡터는 pGSK 23.
  6. 제 5 항의 발현벡터 pGSK 23 에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 XL1-Blue/pGSK23 (수탁번호:KCTC 0393BP).
  7. 내열성 GluRA 유전자를 포함하는 발현벡터로 미생물을 형질전환시키고 그 형질전환제를 배양하여 GluRA 를 발현시킨 다음, 이로부터 조세포 용출액을 얻어 열처리하고 이온 교환 크로마토그래피 및 비친수성 크로마토그래피를 수행하여 내열성 GluRA 를 얻는 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 열처리는 55℃의 온도가 바람직한 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 발현벡터는 pGSK 23 이고, 형질전환체는 제 5 항의 대장균 형질전환체 XL1-Blue/pGSK23 인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 서열 2로 나타나는바실러스속 SK-1 균주 유래의 내열성 GluRA 의 아미노산 서열.
  11. 고온성바실러스속 SK-1 균주 유래의 내역성 GluRA 를 생물 촉매로 사용하여 L-글루탐산을 기질로 D-글루탐산을 얻는 제조
    방법.
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