RU2810598C2 - Способ получения фермента протеин-глутаминазы для пищевой промышленности в Escherichia coli - Google Patents
Способ получения фермента протеин-глутаминазы для пищевой промышленности в Escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810598C2 RU2810598C2 RU2022110740A RU2022110740A RU2810598C2 RU 2810598 C2 RU2810598 C2 RU 2810598C2 RU 2022110740 A RU2022110740 A RU 2022110740A RU 2022110740 A RU2022110740 A RU 2022110740A RU 2810598 C2 RU2810598 C2 RU 2810598C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- enzyme
- protein glutaminase
- coli
- glutaminase
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 16
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims abstract description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims abstract description 7
- 101100398248 Arabidopsis thaliana KIN10 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 38
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 7
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000249126 Chryseobacterium proteolyticum Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000000659 Autoimmune lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical class N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения фермента протеин-глутаминазы, предусматривающий культивирование рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli AK21, представляющего собой штамм E. coli BL21(DE3)-pET15b-PG, полученный путём трансформации E. coli BL21 (DE3), плазмидой pET15b-PG, конструкция которой приведена на фиг.1, на среде, содержащей триптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу, индукцию биосинтеза фермента лактозой и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и очистку фермента методами хроматографии. Изобретение обеспечивает получение фермента протеин-глутаминазы с концентрацией не менее 3 мг/мл и содержанием целевого белка не менее 95%. 2 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к пищевой и кормовой промышленности и может быть использовано при производстве пищевых и кормовых белков.
Разработан способ получения ферментного препарата на основе фермента протеин-глутаминазы.
Извлечение и использование овсяных белков в пищевых и кормовых продуктах затруднено из-за их низкой растворимости в воде и плохой способности к образованию тонких эмульсий.
Возможным решением этой проблемы является создание на поверхности белковых глобул дополнительных одноименных зарядов от ионогенных боковых радикалов аминокислотных остатков. Одним из таких способов является превращение поверхностных глутаминов в глутаминовые кислоты путем гидролиза амидных связей в их боковых радикалах под действием ферментов протеин-глутаминаз. Ферментативный гидролиз по сравнению с химическим позволяет проводить процесс при более низких температурах и без использования агрессивных сред (кислот и щелочей) [1]. Для ферментативного превращения глутаминов в глутаматы на поверхности белка используют фермент протеин-глутаминазу из штамма Chryseobacterium proteolyticum [2]. В настоящий момент известны попытки получения продуцентов протеин глутаминазы на базе Corinebacterium glutamicum [3].
Ближайшим аналогом заявляемого способа получения фермента протеин-глутаминазы является способ по патенту EP 1 748 077 A1, в котором заявлен способ получения рекомбинантной протеин-глутаминазы в штаммах C. glutamicum c использованием tat-зависимого сигнального пути коринебактерий.
Задача заявляемой группы изобретений:
разработать способ получения ферментного препарата протеин-глутаминазы в штаммах E.coli.
Задача решена путем:
разработки плазмидной конструкции pET-PG, определяющей биосинтез фермента протеин-глутаминазы, путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli на среде, содержащей триптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу в фосфатном буфере, индукции биосинтеза фермента лактозой и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом, очистки фермента методами хроматографии, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм E. coli AK21, в среду для культивирования добавляют сульфат аммония до 50 г/л, аммиак до 1% с поддержкой pH=6,9 добавлением смеси H2SO4 и HCl в соотношении 7/1,5, а в стадию контроля активности входит обработка надосадочной фракцией ростовой среды штамма Bacillus subtilis KK1112.
Способ получения фермента протеин-глутаминазы в общем виде
В качестве штамма-продуцента протеин-глутаминазы используют клетки штамма E. coli BL21 (DE3), способные синтезировать РНК-полимеразу фага Т7. Для осуществления синтеза протеин-глутаминазы в E. coli сконструирована рекомбинантная плазмида pET-PG. содержащая природную последовательность гена prgA из Chryseobacterium proteolyticum под контролем Т7 промотора и терминатора транскрипции.
Для биосинтеза используют среду, не содержащую NaCl. Индукцию биосинтеза фермента осуществляют добавлением лактозы и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в среду, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, глицерин, глюкозу в фосфатном буфере, сульфат аммония в количестве 15-60 г/л.
На первом этапе проводят биосинтез протеин-глутаминазы в биореакторе, что позволяет получить культуру высокой оптической плотности OD600 порядка 50-70 и получить выход целевого продукта порядка 25 г сырой биомассы с литра с содержанием протеин-глутаминазы до 30% от общего содержания клеточного белка. Общее время ферментации составляет от 10 до 14 часов.
Полученную в результате биосинтеза биомассу используют для очистки протеин-глутаминазы. Очистку целевого белка проводят путём дезинтеграции клеток с помощью микрофлюидайзера (M110P Microfluidizer®), осаждением клеточных компонентов с помощью ультрацентрифугирования и дальнейшей очистки растворимой фракции на хроматографической колонке Ni-NTA Agarose (Quiagen).
Полученный в результате очистки белок представляет из себя про-протеин-глутаминазу, активная форма фермента получается при обработке про-протеин-глутаминазы субтилизином. В качестве ферментного препарата субтилизина для обработки про-протеин-глутаминазы используют надосадочную фракцию ростовой среды штамма Bacillus subtilis KK1112. В результате получается активный ферментный препарат протеин-глутаминазы.
Активность протеин-глутаминазы определяют двумя способами:
1. По увеличению растворимости овсяного белка
В реакционную смесь на основе фосфатного буфера добавляют нерастворимый овсяной белок и 2 мг/мл и активный фермент протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С. Спектрофотометрически определяют увеличение доли растворенного овсяного белка в смеси.
2. По высвобождению аммиака при обработке протеин-глутаминазой овсяного белка.
В реакционную смесь на основе фосфатного буфера добавляют нерастворимый овсяной белок 2 мг/мл и активный фермент протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С, после инкубации добавляют реактив Несслера и спектрофотометрически измеряют количество высвобожденного аммиака.
Полученный в результате раствор активного целевого белка протеин-глутаминаз, имеющий чистоту не менее 95% по протеин-глутаминазе, является ферментным препаратом и может храниться как минимум 7 дней в тёмном месте при температуре 4°С.
Заявляемая группа изобретений проиллюстрирована следующими фигурами:
Фиг. 1. Генетическая конструкция pET15b-PG, определяющая синтез протеин-глутаминазы в E.coli.
Фиг. 2. Электрофоретический анализ ферментного препарата протеин-глутаминазы, полученного на основе штамма E. coli AK21. Дорожка 1 – очищенный препарат фермента протеин-глутаминазы, дорожка 2 – белковый маркер PageRuler™ Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific).
Пример 1. Получение генетической конструкции, определяющей синтез протеин-глутаминазы в
E.coli
Ген prgA из Chryseobacterium proteolyticum амплифицируют с использованием олигонуклеотидов, определяющих присоединение к белку PrgA 6-Гис-метки с N-конца, а также определяющих наличие сайтов рестрикции с двух концов амплифицированного фрагмента.
Концы амплифицированного фрагмента гена prgA обрабатывают ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Коммерческую плазмиду pET15b обрабатывают теми же ферментами рестрикции. Амплифицированный фрагмент гена prgA с использованием фермента ДНК-лигазы сшивают с коммерческим вектором pET15b по липким концам.
Полученная конструкция pET15b-PG (фиг. 1) определяет синтез белка протеин-глутаминазы с 6-Гис-меткой на N-конце под контролем промотора фага Т7 с лактозным оператором.
Полученной генетической конструкцией pET15b-PG трансформируют клетки E.coli. В результате получается штамм-продуцент E. coli AK21.
Пример 2. Получение фермента протеин-глутаминазы
Биосинтез протеин-глутаминазы осуществляют в биореакторе объёмом 1.5 л с использованием штамма E. coli BL21(DE3)-pET15b-PG (E. coli AK21), полученного путём трансформации E. coli BL21 (DE3), плазмидой pET15b-PG. Данный штамм обеспечивает транскрипцию гена prgA находящегося под контролем промотора фага Т7 с лактозным оператором.
Стерилизацию среды проводят в ферментёре в объёме 2.5 л. Среда имеет следующий состав: триптон, дрожжевой экстракт, глицерин (17.5, 8.75 и 7.75 г соответственно). Соли: KH2PO4, (NH4)2SO4 и Na2HPO4*12H2O (7.4, 15.3 и 40.3 г. соответственно) стерилизуют отдельно от среды в объёме 115 мл и затем добавляются в ферментёр. Добавки готовят отдельно согласно таблице 1.
Таблица 1. Добавки к ферментационной среде
| Вещество | Навеска, г | Обьем, л | Режим стерилизации | |
| (NH4)2SO4 | 57.5 | 0.125 | Автоклавируется | |
| Ампициллин, Ap | 1.0 | 0.005 | Разводится стерильной водой | |
| Глюкоза моногидрат №1 и №2 | 53.4 | 0.125 | 2 колбы №1 - 170 мл и №2 - 330 мл, фильтр 0,45μм и автоклав | |
| Альфа-D Лактоза (водная), №1 и №2 | 43.2 | 0.24 | 2 колбы №1 - 320 мл и №2 - 640 мл, фильтр 0,45 μм и автоклав | |
| Питательная среда (ПС) | триптон | 30 | 1,1 | 1 колба на 2,5 л, Автоклав |
| др.экстракт | 15 | |||
| MgSO4 | 0.225 | 0.00225 | Автоклав | |
| NaOH | 3.85 | 0.05 | фильтр 0,22μм | |
| ИПТГ | 0.06 | 0,00025 | фильтр 0,22μм | |
После автоклавирования раствор сульфата аммония и лактозу № 2 добавляют к питательной среде (АЛПС).
Сульфат магния, Ap и глюкозу №1 добавляют в ферментёр непосредственно перед засевом. Посевную культуру выращивают в среде триптон, дрожжевой экстракт и глицерин (11,3, 5,6 и 5,3 г/л соответственно) в объёме 300 мл (две колбы по 150 мл) при температуре 37°С, с аэрацией 200 об/мин до оптической плотности (OD=0,5). Ферментацию проводят при 37°С, с аэрацией, обеспечивающей содержание кислорода в среде кислорода не ниже 20% (после начала индукции DO не должно превышать 60%). Добавление глюкозы № 2 начинают при достижении культурой OD = 5±1, со скоростью подачи, обеспечивающей содержание глюкозы в среде от 5 до 10 г/л. По окончании добавления глюкозы и достижении культурой OD = 25 осуществляют индукцию биосинтеза протеин-глутаминазы добавлением в ферментационную среду лактозы № 1 и ИПТГ. Через час после начала индукции начинают добавлять АЛПС с равномерной скоростью 10 мл/мин. Добавляют аммиак до 1% с поддержкой pH=6,9±0,1 добавлением смеси H2SO4 и HCl в соотношении 7/1,5. Далее аммиаком и серной кислотой поддерживают pH=6,9±0,1. Пеногаситель добавляют по мере появления пены. Контроль биосинтеза осуществляют после раунда ферментации по SDS-PAGE белковому электрофорезу. Общее время ферментации 12,5 часов.
В результате ферментации получают от 40 г сырой биомассы с содержанием протеин-глутаминазы от 30% общего содержания клеточного белка.
Пример 3. Очистка
фермента протеин-глутаминазы
Полученную в ходе ферментации биомассу используют для выделения целевого белка. Для этого 20 г клеток суспендируют в соотношении 1:10 в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,2. Разрушение клеточной биомассы проводят с помощью микрофлюидайзера (M110P Microfluidizer®). Клеточный лизат центрифугируют, супернатант наносят на колонку с сорбентом Ni-NTA Agarose (Quiagen), уравновешенным буфером A.
Колонку промывают повышающейся концентрацией имидазола (буфер Б). Выход белка протеин-глутаминазы происходит при концентрации имидазола в буфере Б 100 ммоль.
В результате получают гомогенный препарат протеин-глутаминазы (фиг. 2) с концентрацией не менее 3 мг/мл (содержание целевого белка не менее 95%).
Пример 4. Получение активной формы фермента протеин-глутаминазы
К полученному в результате очистки ферментному препарату протеин-глутаминазы добавляют надосадочную фракцию ростовой среды штамма Bacillus subtilis KK1112 из расчета 50 мкл надосадочной на 3 мг протеин-глутаминазы. В результате получается препарат активной формы протеин-глутаминазы с концентрацией не менее 3 мг/мл.
Пример 5. Определение активности полученного препарата протеин-глутаминазы
Активность протеин-глутаминазы определяют двумя способами:
1. По увеличению растворимости овсяного белка
В реакционную смесь на основе фосфатного буфера добавляют нерастворимый овсяной белок и 2 мг/мл и 20 мкг активного фермента протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С. Повышение растворимости овсяного белка оценивают используя спектрофотометр (Shimadzu UV-1800), оценивают рассеивание проходящего света на длине волны λ=600нм (OD600). Для нерастворимого овсяного белка OD600=0.8, после обработки активной формой фермента протеин-глутаминазы OD600=0.2.
2. По высвобождению аммиака при обработке протеин-глутаминазой овсяного белка
В реакционную смесь на основе фосфатного буфера объемом 300 мкл добавляют нерастворимый овсяной белок 2 мг/мл и 20 мкг активного фермента протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С, после инкубации реакцию останавливают добавлением добавляют 100 мкл 1.5М трихлоруксусной кислоты. После дезактивации образец центрифугируют при 10000 g и к 50 мкл супернатанта добавляют 50мкл реактива Несслера и 1150 мкл воды. Далее, используя спектрофотометр (Shimadzu UV-1800) в образце измеряют поглощение при длине волны λ=450 нм. Количество аммиака считают, используя стандартную кривую: была получена активность порядка 10 ед./мг для овсяного белка.
Заключение
Таким образом, разработан способ получения активной формы фермента протеин-глутаминазы, который позволяет синтезировать до 30% протеин-глутаминазы, в расчете на суммарный клеточный белок. Активная форма фермента протеин-глутаминазы позволяет увеличить растворимость овсяного белка и обладает удельной активностью порядка 10 ед./мг.
Источники информации
Jiang Z., Strohm T. S., Salovaara H., Sibakov J., Kanerva P., Loponen J. (2015) Oat protein solubility and emulsion properties improved by enzymatic deamidation // Journal of Cereal Science (64). 126–132.
Yamaguchi, S., Jeenes, D.J., Archer, D.B., (2001) Protein-glutaminase from Chryseobacterium proteolyticum, an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins - purification, characterization and gene cloning. Eur. J. Biochem. 268, 1410-1421.
Yoshimi Kikuchi & Hiroshi Itaya & Masayo Date & Kazuhiko Matsui & Long-Fei Wu. (2008) Production of Chryseobacterium proteolyticum protein-glutaminase using the twin-arginine translocation pathway in Corynebacterium glutamicum // Appl Microbiol Biotechnol 78:67–74.
Claims (1)
- Способ получения фермента протеин-глутаминазы путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli AK21, представляющего собой штамм E. coli BL21(DE3)-pET15b-PG, полученный путём трансформации E. coli BL21 (DE3), плазмидой pET15b-PG, конструкция которой приведена на фиг.1, на среде, содержащей триптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу, индукции биосинтеза фермента лактозой и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом, очистки фермента методами хроматографии.
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2022110740A RU2022110740A (ru) | 2023-10-20 |
| RU2810598C2 true RU2810598C2 (ru) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1748077A1 (en) * | 2004-04-20 | 2007-01-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing protein |
| RU2733440C2 (ru) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения фермента метионин-гамма-лиазы, противоопухолевое лекарственное средство ГЛФ МГЛ на основе этого фермента и применение этого средства для торможения роста опухоли (варианты) |
| CN107325977B (zh) * | 2016-04-28 | 2020-10-13 | 华东师范大学 | 一种产蛋白质谷氨酰胺酶的方法、纯化及应用 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1748077A1 (en) * | 2004-04-20 | 2007-01-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing protein |
| CN107325977B (zh) * | 2016-04-28 | 2020-10-13 | 华东师范大学 | 一种产蛋白质谷氨酰胺酶的方法、纯化及应用 |
| RU2733440C2 (ru) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения фермента метионин-гамма-лиазы, противоопухолевое лекарственное средство ГЛФ МГЛ на основе этого фермента и применение этого средства для торможения роста опухоли (варианты) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LU X. ET AL. Mass production of active recombinant Chryseobacterium proteolyticum protein glutaminase in Escherichia coli using a sequential dual expression system and one-step purification. IUBMB Life. 2020 Nov;72(11):2391-2399. doi: 10.1002/iub.2358. Найдено онлайн: https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/iub.2358 Дата обращения 31.05.2023. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5290694A (en) | Recombinant DNA, bacterium of the genus Pseudomonas containing it, and process for preparing lipase by using it | |
| AU716692B2 (en) | Esterases | |
| JP3656277B2 (ja) | 組換えｄｎａ法によるトランスグルタミナーゼの効率的製造法 | |
| CN110564708B (zh) | 一种重组磷脂酶d及其在合成磷脂酰丝氨酸或其它磷脂中的应用 | |
| RU2669996C2 (ru) | Новый мутантный белок орнитиндекарбоксилаза и его применение | |
| KR20050074313A (ko) | 세팔로스포린 ｃ 아실라제 | |
| WO2021027390A1 (zh) | 一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法 | |
| RU2810598C2 (ru) | Способ получения фермента протеин-глутаминазы для пищевой промышленности в Escherichia coli | |
| JP4529338B2 (ja) | ヒダントイナーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞、タンパク質の製造方法および光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| JP5283154B2 (ja) | トリプシン様酵素 | |
| Lee et al. | Mass production of thermostable D‐hydantoinase by batch culture of recombinant Escherichia coli with a constitutive expression system | |
| JP4437170B2 (ja) | 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用 | |
| KR20030072208A (ko) | 신규 프로모터 및 이 프로모터를 사용한 유전자 발현방법 | |
| KR101383546B1 (ko) | 심해 해저에서 분리된 에스터라제 ktl 4 | |
| KR100463966B1 (ko) | 시아노카르복실산 에스테르로부터 디카르복실산모노에스테르의 제조 | |
| KR100270508B1 (ko) | 신규세파로스포린디아세틸라아제유전자및이를이용한단백질제조방법 | |
| CN116355875B (zh) | 甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体及其在生产s-腺苷甲硫氨酸中的应用 | |
| JP4684993B2 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼおよびその産生 | |
| EP4151742B1 (en) | Transgenic cell line and genetically engineered bacterium expressing fructosamine deglycase, and use of fructosamine deglycase | |
| KR20180043219A (ko) | Gaba 생산성이 향상된 코리네박테리움속 균주의 제조 방법 및 이를 이용한 gaba의 생산 방법 | |
| JP5619400B2 (ja) | 酸性ホスファターゼ及びそれをコードする核酸、並びにこれらを利用したリボフラビン−５’−リン酸の製造方法 | |
| US20240132925A1 (en) | Method for preparing pyrrolidone | |
| JP4406298B2 (ja) | アミノペプチダーゼ | |
| KR100251524B1 (ko) | 고온성미생물바실러스속균주유래의내열성d-아미노산아미노트랜스퍼라아제를암호하는유전자및이를이용한d-아미노산아미노트랜스퍼라아제의제조방법 | |
| KR100251523B1 (ko) | 고온성 절대 공생 미생물 심비오박테리움의 공생균주인 고온성 미생물 바실러스속 균주 유래의 내열성 글루타메이트라세마아제를 암호하는 유전자 및 이를 이용한 내열성 글루타메이트라세마아제의 제조방법 |