JP4684993B2

JP4684993B2 - グルコースデヒドロゲナーゼおよびその産生

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Publication number: JP4684993B2
Application number: JP2006505277A
Authority: JP
Inventors: ルート・マイスナー; ヴァルター・ヴァイヒェル; ラインハルト・コッホ; イリーナ・バチマトワ; リューシャ・マルシンケヴィシエネ; リタ・メスキエネ; ラサ・セメナイテ; ヴィダ・カサイテ; ローランダス・メスキス
Original assignee: Bayer Technology Services GmbH
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2003-05-07
Filing date: 2004-04-27
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2024-04-27
Also published as: DE502004007143D1; DK1623025T3; US7432096B2; CA2525387C; DE10320259A1; US20090087874A1; CA2525387A1; ES2305767T3; JP2006525005A; EP1623025B1; ATE395414T1; EP1623025A1; WO2004099399A1; US20060263838A1

Description

発明の詳細な説明

本発明は、アシネトバクター由来の新規PQQ-依存可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ(sPQQGDH)に関し、適当な微生物発現系における過剰生産によるその調製方法に関する。

糖尿病を患う患者は、彼らの血液グルコースを定期的に測定しなければならない。グルコースの測定はまた、発酵過程(fermentation processes)の重要部分である。多くの場合、グルコースは、酵素学的に測定される。この目的のため、グルコースオキシダーゼ、または珍しい場合では、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼの何れかが用いられる。グルコースオキシダーゼによるその方法は、酵素が、加えられたメディエーターばかりでなく、存在する酵素にも電子を転移するという不都合がある。それ故、測定結果は、酸素分圧に依存する。かねてから、この酵素をsPQQ-依存グルコースデヒドロゲナーゼで置換する試みが為されている。PQQはピロロキノリンキノンを表す。PQQはグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)の補欠分子族である。それは、酸化還元等価物を転移する。これらの酵素の利点は、その測定は酸素分圧に依存せず、より正確な測定が可能となることである。加えて、より小さなサンプル体積での測定が、これらの酵素の使用により可能となる。

文献によると、２つの異なるPQQGDHが発見されている。一方は膜結合型(mPQQGDH)であり、グルコースセンサーでの使用に適さない。他方は可溶性であり(sPQQGDH)、アシネトバクター属株で種々発見されている(Biosci. Biotech. Biochem. 59 (8), pp. 1548-1555, 1995)。該酵素はホモダイマーであり、分子量50 kDaである。可溶性および膜結合PQQGDHは配列に相同性はなく、免疫学的におよびそれらの動力学に関して相違する(Cleton-Jansen et al., 172 (11), pp. 6308 - 6315, J. Bacteriol. 1990) (Matsushita et al., Biochemistry 28 (15), pp. 6276 - 6280, 1989)。

アシネトバクター由来のsPQQGDHはこれまでに知られている。著者らは全員、LMD 79.41株、NCIMB 11517株またはJCM 6841株(何れもUS 2001021523)を使用している(Kojima et al., Biotechnology Letters, 22, pp. 1343 - 1347, 2000)。

これら株のsPQQGDHのDNA 配列は、受託番号X15871(LMD 79.41)、E28183(JCM 6841)およびE28182(NCIMB 11517)でGenbankに寄託されている。

遺伝子配列を修飾することにより、これらsPQQGDHの性質を変える多くの試みが為されている(EP 1 167 519 A1, EP 1 176 202 A1, Sode und Kojima, Biotechn. Letters, Vol. 19, (11) pp. 1073-1077, 1997)。これらのケースの目的は、の酵素の基質特異性およびそ熱安定性を改善することであった。EP 1 167 519 A1は、熱安定性を増大させるための、アシネトバクター LMD 79.41のsPQQGDHの各アミノ酸の置換を記載する。その変更は、アミノ酸 209、210、231、420および421で行われた。WO 02/072839 A1は、熱安定性を増大させ、水溶性を改善するための、アミノ酸配列における変更を更に記載する。置換は、167位、231位、340位、415および418位において行われた。そのナンバリングは、何れの場合も、EP 1 167 519で使用されるナンバリングに基づいている。アシネトバクター LMD 79.41由来の酵素と、本発明の新規sPQQGDHおよびアシネトバクター JCM 6841由来のものとを比較するとき、後者の２つの酵素はLMD 79.41由来のものよりも２アミノ酸長いという事実を考慮することも必要である。これに関して、成熟酵素およびシグナルペプチドが考慮される。

WO 02/34919 A1は、マルトースに対する酵素の親和性を減少させるための、各アミノ酸の置換を記載する。酵素の熱安定性は影響を受けない。

酵素は、通常、大腸菌におけるその異種発現により調製する。sPQQGDHの発現で生ずる問題は、大腸菌は酵素を合成し得るけれども、補因子 PQQを合成できないという点である。Sode et al. (J. Biotechnology, 49, 239-243, 1996)によると、アポ酵素 mPQQGDHの発現は、膜結合グルコースデヒドロゲナーゼの場合には可能であるけれども、不安定となり、細胞の培養の間に更に破壊される。Matsushita et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1548-1555, 1995)は、補因子の結合によって生じ、トリプシン消化からのホロ酵素の保護によって生ずる酵素における構造変化を推論する。

この理由のため、研究グループおよび製造者らは全員、PQQを細胞培養の間に加えるかまたは株内自体で発現が生じPQQを形成させるか、何れかの方法で活性があり、かつ安定な酵素を調製する試みをしている。Sode et al. (J. Biotechnology, 49, 239-243, 1996)は、大腸菌においてPQQ合成用の遺伝子とmPQQGDHとの共発現に成功し、OD 4で約 1500 U/lに達した。細胞培養の間でのPQQの付加により1100 U/lに達する。しかし、その系には、細胞が高光学密度には到達せず、酵素産生の間に死滅するという問題がある(Kojima et al., Biotechnology Letters, 22, 1343-1347, 2000)。上記引用文献の著者らは、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)での活性sPQQGDHの合成について述べている。この生物は遺伝学的に利用可能であり、PQQを合成する能力を有する。それ故、この場合、約 14 000 U/lの活性が達成されるが、更なるPQQ供給(feeding)が必要となる。Yoshida et al. (Enzym. Microb. Technol. 30, pp. 312-318, 2002)は、Pichia pastorisにおいて可溶性sPQQGDHを異種発現させ、それ故、使用可能な酵素が、200 000 U/lまで生じた。しかし、この目的のためには、非常に高い細胞密度に到達することが必要となる。加えて、酵素はグリコシル化され、更に、沈殿および２回のイオン交換により精製されなければならない。費用効率の高い調製は、特に、入念な精製およびグリコシル化により妨げられる。

Toyobo Co. Ltd., Japanは、JP 09140378において、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)を用いたsPQQGDHの調製について述べている。３回の精製工程の後に60 U/lが得られている。その系の生産性を向上するために、後に、その酵素はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)において異種発現された。この株はPQQを合成できるためである。

OlsthoornおよびDuine(Arch. Biochem. Biophys. 336 (1), 42-48, 1996)は、100 l 培養槽中でsPQQGDHを発現する大腸菌クローンのバッチ培養について述べている。培養後、酵素は、３回のカラム工程で精製される。そのクローンはPQQを形成しない; 補因子は酵素アッセイにおいてのみ加えられる。その収量は、培養物１lあたり精製タンパク質10 mgである。しかし、培養物の低い細胞密度、念入りな精製方法および収量により、その方法は明らかに不経済である。

本発明の詳細
スクリーニングの間に、sPQQGDHを形成するアシネトバクター・カルコアセティカス属が12株発見された。Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)による新規株の分類により、部分的16S rDNA 配列において、アシネトバクター・カルコアセティカス標準株と99.8% 相同性が見られた。しかし、観察されたＤ-マレートの利用およびL-フェニルアセテートの破壊無能力はその標準株とは異なっている。この特性は、発見された12株すべてで見られる。

これらの株で形成されるsPQQGDHは、実質的な特性において、上記既知酵素とは異なる。一方では、それらは、標準株由来の酵素と比べて改善されている熱安定性を有する(実施例3参照)。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸の配列も異なる。

新規sPQQGDHをコードする12 遺伝子の配列分析では以下の結果が見られた(図 1参照):
新しく発見されたすべてのsPQQGDHのヌクレオチド配列は、アシネトバクター LMD 79.41およびアシネトバクター JCM 6841 および NCIMB 11517由来の酵素の配列とは明らかに異なっている。

各々のヌクレオチド配列から得られ得るアミノ酸配列もまた、上記既知の配列とは異なる。アシネトバクター LMD 79.41由来のsPQQGDHはシグナルペプチドを含む478 アミノ酸を有するが、２つの他の既知の株アシネトバクター JCM 6841およびアシネトバクター NCIMB 11517由来のもの、および本発明で見出した配列由来のものは、それぞれ、シグナルペプチドを含む480 アミノ酸を有する。

新しく発見されたsPQQGDHのアミノ酸配列は、上記既知のものとは多くの位置で相違している。驚くべきことに、上記すべての酵素におけるアミノ酸とは異なるアミノ酸が、12の位置で見出され、それらすべての遺伝子は本明細書に新しく記載した。加えて、本明細書に新たに記載する少なくとも75%の遺伝子が、４つの位置において上記遺伝子におけるアミノ酸とは異なるアミノ酸を有する。更に、本明細書に新しく記載する酵素において、更なる置換があり、それは、個々の酵素でまたは幾つかの酵素で生ずる。

本発明による、新たに見出されたsPQQGDHにおける特定の置換は、以下のアミノ酸よりなる。アミノ酸のナンバリングは、シグナルペプチドを含む480 アミノ酸を含む、アシネトバクター JCM 6841株由来の酵素でのナンバリングに基づく(図 1参照):
アミノ酸として、21位にNを、41にSを、47にLを、121にVまたはAを、149にAを、213にSを、244にIを、320にGを、391にSを、452にSを、474にRを、480にQをを有するすべてのsPQQGDHは本発明によるものである。

更に、本発明によるものは、上記の置換に加えて以下の置換が生じ得るすべてのsPQQGDHである:
16位にH、18にL、20にF、40にG、48にI、61にA、111にT、154にD、190にE、293にA、311にS、314にA、324にL、333にM、339にS、355にG、366にD、417にN、そして418にAがあり得る。

新規に見出した酵素はすべて、野生型酵素よりも熱的に安定であることを驚くべきことに見出した。その熱安定性は、グルコースセンサーとしてのsPQQGDHの使用の成功に必須の基準である。このため、60℃ および 70℃、１時間のインキュベーションで見られる残存活性は、すべて、アシネトバクター LMD 79.41由来の酵素よりも高かった。本発明によるsPQQGDHにおいて60℃で見られる残存活性は51.5%と12.5%の間であった。その野生型は、同一アプローチでは、その元の活性のたった1.8%であった。最初の活性に対し26.7%と8.8%との間の活性が70℃で観察されたが、野生型酵素は、元の活性のたった6.4%であった。

アミノ酸の標的化置換およびランダム置換によりsPQQGDHの熱安定性を増大する種々の試みが過去に行われている。

しかし、EP 1 167 519 A1は、本発明によるsPQQGDHにおける位置とはかなり相違する位置でのアミノ酸の置換をクレームする。同一のことがWO 02/072839に記載の置換にいえる。これはまた、WO 02/34919 A1に記載の置換にもいえる。このため、本発明によるsPQQGDHの熱安定性の増大は、この特性への影響が事前に知られていないアミノ酸群すべての置換と相関する。

本発明による酵素は、適当な培地中で関連株を培養することにより調製され得る。この目的のために、文献に記載の培地、例えば、栄養ブロス(nutrient broth)(Difco 0003)を使用することが可能である。細胞が増殖した後、それらを回収し、破砕する。酵素は以下のように精製する。

野生型由来のsPQQGDHは、好ましくは、適当な宿主中にクローニングされる。そのため、通常の遺伝学的に容易に利用可能である原核生物、例えば、バチラス、クレブシエラ、シュードモナス、および大腸菌属のメンバーが可能である。その酵素は、更にまた、真核生物において、例えば、ピチア、サッカロマイセス、ハンゼヌラ、アスペルギウスまたはクリヴェロミセス(Kluyveromyces)属のメンバーにおいて発現し得る。その酵素はまた、植物または動物細胞株において発現し得る。

クローニングに、標準的な方法、例えば、ディジェネレートプライマーを用いるPCRまたは適当なプローブを用いるゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションを用いることが可能である。発現は、好ましくは、大腸菌で行う。その発現は、通常、BL21、DH5、HB101、JM101、RV308、TOPP、TOP10、XL-1株およびその誘導体で行う。W3110およびDH5株を、好ましくは、使用する。通常の発現ベクターは、この目的に用い得る。そのベクターは、典型的に、複製起点、抗生物質耐性およびプロモーター配列を含む。用い得るベクターの例は以下のものである: pUC18/19、pBluescript、pTZ、pGEX、pPROEx、pcDNA3.1、YEp24、pBAC、pPICZ。pMAL、pET、pTrx、pCAL、pQE および pPROTet シリーズのベクターが好ましい。pASK-IBA 2 から pASK-IBA 7のシリーズの発現ベクターが、特に好ましくは、用いられる。耐性選択用の通常の抗生物質は、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールである。

培地中に分泌するタンパク質を生ずる発現系の使用もまた可能である。

ベクターは、通常の方法により宿主細胞に移し得る。この目的に用いる例は、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、化学的形質転換である。

クローン化sPQQGDHの生成は、インデューサーの添加により誘導される。この目的に用いるそのインデューサーは、選択した発現系に適当なもの、例えば、IPTG、トリプトファン、グルコースおよびラクトースなどである。そのインデューサーであるアンヒドロテトラサイクリンが特に好ましくは使用される。

組み換え細胞系株は、それに適当な培地中で培養される。原核生物および真核生物の培養に使用する通常の方法は、この目的に適当である。培養は、適当な培養槽中で行われ得る。生物は、好ましくは、非常に高い細胞密度に到達するような方法で培養される。これを行うためには、毒性代謝産物が生じないようなストラテジーにより適当に管理される、C源およびN源の供給を必要とする(概要として、Schugerl et al. (editors) in: Bioreaction Engineering, pp. 374-390, Springer-Verlag, Berlin, 2000; Yee and Blanch, Bio/Technology, 10 (2), pp. 1550-1556, 1992)。

この発明の目的に適当な方法は、例えば、Riesenberg et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 34, pp. 77-82, 1990のものである。

細胞の培養は、理想的には、28-37℃で行うが、その温度は、タンパク質の発現では10-28℃に低下させる。好ましくは、15-25℃であり、特に好ましくは、20-22℃である。

本発明の方法の使用によって、文献において先に記載されているよりも活性酵素の明らかにより高い収量が達成されることを驚くべきことに見出した。大腸菌クローンが、バッチ培養において培養されるとき、この方法で48 mgもの精製タンパク質が１リットルの培養上清から得られる(実施例5および6参照)。Yoshida et al.(Enzym. Microbiol. Technol., 30, pp. 312-318, 2002)は43 mg/lを達成した。しかし、酵素の念入りな精製が必要であり、それがグリコシル化される。OlsthoorneおよびDuine(Arch. Biochem. Biophys. 336 (1), pp. 42-48, 1996は10 mg/lの収率を報告している。

本発明による酵素を有する細胞が高い細胞密度の培養(fermentation)で培養されるならば、実際に、培養液１lあたりの精製酵素は220mgを超えることが可能となる(実施例8)。

細胞の培養後、それを回収し、適当な方法、例えば、フレンチプレス、界面活性剤の添加または超音波などにより破砕する。そのタンパク質溶液は緩衝化し、僅かにアルカリpHとする。その緩衝液はpHを7と9との間に調節し、好ましくは、7.8と8.2の間とする。

用い得る緩衝性物質は、生化学では通常の緩衝液であり、例えば、Tris、MOPSまたはPIPES 緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などであり; その濃度は5-100 mMでなければならず、好ましくは、20-70 mMの範囲、特に好ましくは、50 mMである。

今や、sPQQGDHは、タンパク質溶液から非常に簡単に精製され得る。これを行うため、そのタンパク質溶液を通常のイオン交換クロマトグラフィーにより精製するか、イオン交換物質を直接該タンパク質溶液に添加し、次いで、吸引漏斗で残りの液体を分離するか何れかによって精製される。適当なイオン交換体は陽イオン交換体であり、例えば、Lewatit樹脂CM-、S-、SM-Sepharose、CM-、SP-Sephadex、Amberlyst 15、Amberlite CG 50、Amberlite IR-120、カルボキシメチル-、スルホキシエチル-、オキシセルロース、リン酸セルロースおよびCM-Toyopearlなどである。CM-Toyopearlを好ましくは用いる。

次いで、タンパク質を、通常の方法により、イオン交換物質から溶出させる。このために、徐々に増加するNaCl勾配を用い、緩衝液は、イオン交換物質へのタンパク質の結合のために事前に用いた緩衝液を用いる。酵素は、通常、約 200 mM NaClの濃度で溶出する。

次いで、酵素を更に精製してもよく、通常の方法、例えば透析および限外濾過により、塩含有量を減少させることも可能である。

本発明のsPQQGDHの調製物および精製物は、好ましくは、アポ酵素として生じ、補因子 PQQは、酵素が完全に精製されたあとに加える。PQQの添加は、理想的には、イオン交換体での精製後に酵素の緩衝液の交換と共に行う。

PQQは、緩衝液を交換前か交換後に加えてもよい。好ましくは、事前に添加する。その量は、タンパク質溶液の含有量による。0.1から5 molのPQQを、活性酵素１moleあたり加えるのがよい。活性タンパク質の１moleあたり0.5から2 mol、特に好ましくは、2 molのPQQを加えるのが理想である。しかし、該酵素をホロ酵素として調製し、精製することも可能である。この目的のため、PQQは、細胞培養の間、細胞破砕の間、または精製前に加え得る。更に、本発明のsPQQGDHは、PQQを合成できる生物における異種発現によりホロ酵素として調製することも可能である。これらは、例えば、クレブシエラまたはシュードモナス属由来の生物であり得る。

本発明により新規sPQQGDHをグルコース測定に用いる。それらは、特に好ましくは、血液グルコースの測定に用いられ得る機器に用いる。更には、例えば、発酵過程(fermentation processes)におけるグルコース測定に酵素を用いることも可能である。

本発明のsPQQGDHを診断方法に用いる場合、その試験キットは、典型的には、緩衝液、メディエーターおよび数ユニットの酵素活性を含む。典型的には、0.5-10 Uを用い、好ましくは、1-5 Uを用いる。この目的には、種々の酵素製剤が可能である。それは、例えば、凍結-または噴霧-乾燥させ、溶液として製剤し得る。適当な電極は、炭素、金または白金電極であり得る。酵素は、通常、電極に固定化される。通常、この目的のために、架橋剤を用いるが、その酵素はまたカプセル化してもよい。更に、透析膜により、光架橋、電気伝導または酸化還元ポリマーにより、固定化できる可能性がある。上記方法の組合せも可能である。

酵素は、好ましくは、ホロ酵素として適用するが、それらはまた、必要なPQQが第二の層に供される場合には、アポ酵素として用い得る。新規sPQQGDHは、好ましくは、グルタルアルデヒドにより炭素電極に固定化され、次いで、過剰のグルタルアルデヒドを完全に反応させるためアミンを含む試薬で処理される。

実施例
実施例 1: sPQQGDHを産生する新規株の探索
土壌サンプルを、生理食塩水 (0.9% NaCl)に懸濁し、アリコートを、唯一の炭素源であるグルコネートと共に栄養培地を含む寒天プレートにストリーキングした。該培地は、以下の組成を有していた:

そのプレートは30℃で24-48 時間インキュベートした。

他に代わるものとして、OxoidのPseudomonas-Agarをも用いた。インキュベーション条件は同一であった。

選択された増殖コロニーは、グルコース-エオシン-メチレンブルー寒天で単離した。これは、以下の組成を有していた:

そのプレートは30℃で24 時間インキュベートした。暗赤色および／または緑色の光沢により陽性クローンを同定し得る。これらのコロニーを、その純度をチェックするために、栄養寒天(Oxoid)に再びストリーキングする。その組成は以下の通りであった:

そのプレートは30℃で48 時間インキュベートし、再び単離した。その後、精製株を、100 mlの液体栄養ブロス(Oxoid)中、30℃で20時間培養した; その培地は、以下の組成を有していた:

培養後、該培養物を回収(4500 × g, 40 分, 4℃)し、生理食塩水(0.9% NaCl)で洗浄した。そのペレットを、5 mlの50 mM KP 緩衝液、pH 7.2に再懸濁し、超音波で破砕した。その抽出物を再び10 000 × g、4℃、30分間遠心分離し、細胞-フリー上清中のGDH活性を測定した。唯一の炭素源としてグルコネートを有するスクリーニング培地におけるGDH活性により26株を単離できた。シュードモナス培地での培養後に4株が単離できた。

実施例 2: 酵素の精製
sPQQGDHを調査するための株を、8 lのNB培地(Oxoid)中に培養した。その培地には、0.1% グルコースが含まれており、30℃で20時間培養した。その細胞を回収し(4500 × g, 40 分, 4℃)し、0.9% 生理食塩水で洗浄し、150-200 mlの10 mM MOPS、pH 8.0で処理した。その細胞は超音波で破砕した。細胞-フリーの抽出物を300 mlのTSKゲルCM-Toyopearl 650M (Tosoh Corp.)にロードし、3-4 カラム体積の10 mM MOPS、pH 8.0で洗浄した。溶出は、3-4-倍のカラム体積で0-0.3 M NaCl勾配により行った。活性フラクションをプールし、透析チューブ中へ移し、水吸収剤として高い粘性のカルボキシルメチルセルロースを加えることにより濃縮した。その濃縮サンプルは、3.5 体積の10 mM K-MOPS、pH 6.8に再懸濁し、再びCM Toyopearl カラムで精製した。カラムの平衡化および洗浄は、10 mM K-MOPS、pH 6.8で行い、溶出は、0-0.3 M NaCl勾配で行った。活性フラクションをプールし、上記のように濃縮した。それらを、熱安定性測定の出発物質とした。

実施例 3: 熱安定性の試験
熱安定性は、精製酵素を50、60および70℃で60 分間インキュベーションすることにより測定した。そのインキュベーションは、1 mM CaCl₂、0.1% Triton X-100、0.1% BSAおよび5μM PQQの存在する50 mM Pipes、pH 6.5で行った。そのインキュベーション後、サンプルを氷上で冷却し、残存活性を測定した。それは、元の活性のパーセンテージで表した。

表 1: 種々の新規単離体由来の新規sPQQGDHの熱安定性

実施例 4: 新規sPQQGDH遺伝子のクローニングおよび分析
本明細書記載の新規の株由来のsPQQGDH 遺伝子をクローニングするために、合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRでゲノムDNAの完全コード配列の増幅を最初に試みた。しかしながら、これに使用したプライマーであって、公表されたsPQQGDH 配列(X15871; LMD 79.41)由来の該プライマーでは、PCR産物を得られなかった。というのは、本発明のsPQQGDH配列は、特に、シグナルペプチドの領域および終止コドンの近傍において野生型とは非常に異なっているからである。この理由のため、PCRでの使用によりコード配列の断片を増幅することを目的とし、野生型配列の両鎖由来の種々のプライマーを使用した。幾つかのこれらのプライマーの組合せにより、実施例3に記載の株から、その断片の単離が可能であった。市販のキットを、PCR 反応すべてに用い、それは、通常、RocheのPCR master kitであり、製造者指示書に従い行った。プライマー、
GDH-fwd P1 (5'-CCA GAT AAT CAA ATT TGG TTA AC-3')および
GDH-rev P7 (5'-CAT CAC GAT AAC GGT TYT TGC-3')を用い、約 1200 bpの大きさの断片を単離できた。次いで、得られたDNA片を配列決定した。各遺伝子の完全配列を得るためにインバースPCRを行った(Sambrook and Russell: Molecluar Cloning - A Laboratory Manual. CSHL Press (2001), p. 8.81)。本発明のケースでの、この目的のために用いたプライマーは、GDH 遺伝子の未知の部分を更なるPCRで合成できるように、断片の端にそれぞれ位置していた。そのPCR 反応は、制限エンドヌクレアーゼ EcoRIおよびBglIIで切断した各株のゲノムDNAに対して行い、次いで、T4 リガーゼで再環化した。用いたプライマーは、
GDH-3Mid (5'-GGGATATGACCTACATTTGCTGGC-3') および
GDH-5Mid (5'-TGTCCATCAGCRTCATTTACAAYCTCAG-3')であり、GDH 遺伝子の3'末端(GDH-3Mid)および5'末端(GDH-5Mid)の方向にそれぞれ定方向DNA合成(directed DNA synthesis)を開始した。この方法で得られたアンプリコンでは、今まで、ベクター pCR2.1中にクローニングし、その後、配列決定することにより明らかとなるコード配列部分は見つかっていなかった。この度、完全に利用可能となったDNA 配列を新たに用い、プライマーを開発した。そのプライマーにより、開始コドンから終止コドンまでのコード配列を定方向にクローニングすることができた。IBAの指示に従いベクター pASK-IBA3中へのクローニングが可能な場合に、該プライマーを選択した。この目的のため、BsaI 切断部位は、コード配列の直前(5'-結合プライマー中)および直後(3' 結合プライマー中)に位置し、それによって、BsaI 開裂ベクター pASK-IBA3中へのBsaI-切断PCR産物の直接のライゲーションが可能となる。使用した5' プライマーは、
GDH-U3(5'-TGGTAGGTCTCAAATGAATAAACATTTATTGGCTAAAATTAC-3')であり、使用した3' プライマーは、
GDH-L3(5'-ATGGTAGGTCTCAGCGCTCTGAGCTTTATATGTAAACCTAATCAAAG-3'; クローン PT15由来のGDH用)および
GDH-L4(5'-ATGGTAGGTCTCAGCGCTCTGAGCTTTATATGTAAATCTAATCAGAG-3'; その他すべてのクローン用)であった。得られたプラスミドはpA13 Xと称する。“X”に、ゲノムDNAが単離されたクローンの株番号を代入する。比較目的で、野生型株 LMD79.41由来のsPQQGDH 遺伝子を同じ方法でクローニングした。しかし、これに使用したプライマーは、公表された配列から得た。このプラスミドをpAI3-wtと名付けた。

記載したプラスミドを、化学的形質転換により、大腸菌株DH5α(Invitrogenから入手)に導入した。この方法で得られた細菌株はDH5α::pAI3-Xと名付けた。そのプラスミドを、同様の方法で、更に大腸菌株、W3110 (ATCC 27325)に導入した。そして、これらの株をW3110::pAI3-Xと名付けた。

実施例 5: 大腸菌によるsPQQGDHの組み換え体調製
前培養物を以下の通り調製した。0.1 mlのグリセロールストックのDH5α::pAI3-KOZ65 細胞を、2 mlのLB培地(50 μg/ml アンピシリン)に加え、37℃、225 rpmで一夜で撹拌した。本培養として、1 lのTB培地(50 μg/ml アンピシリン)に、十分に増殖した前培養物を接種した。該培養物は、ODが約 1に到達するまで37℃、225 rpmで撹拌した。次いで、その本培養物に、アンヒドロテトラサイクリン(AHT)ストック溶液で誘導をかけた。そのインデューサーは、この目的のためにDMFに溶かしておいた。該培養物におけるAHTの最終濃度は0.2 μg/mlであり、誘導は27℃、225 rpmで24 時間行った。その後、本培養物のODは4.2となった。

本培養物の遠心分離（3220 × g、4℃、15分間）により細胞を回収した。その細胞ペレットを40 ml(= 全体積の1/25)の75 mM トリス-HCl、pH 8.0に再懸濁し、フレンチプレスを用い破砕した。これは、全細胞懸濁液をフレンチプレスで二度処理することにより行った。インクルージョンボディおよび細胞破砕物のために濁り得るライゼートを遠心分離(48 745 × g、4℃、10分間)した。タンパク質含有量および上清の活性をアッセイした。タンパク質含有量は9.25 mg/mlであり、活性は1.4 kU/mlであった。元の培養物に基づくと、培養物１lあたり56 kUが得られた。

実施例 6: 組み換えsPQQGDHの精製
実施例 5の11.2 mlの上清を、陽イオン交換体 (Toyopearl CM-650M、TOSOH BIOSEP GmbH)のクロマトグラフィーにより4℃で分離した。カラムベッドが約 130 mlであるXK 50/20 カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を、この目的に用いる; 流速は8 ml/分であった。カラムは10 カラム体積の10 mM K MOPS、pH 8.0 + 1 mM CaCl₂で平衡化し、その後、サンプルをロードした。そのカラムを4 カラム体積の10mM K-MOPS、pH 8.0 + 1mM CaCl₂で洗浄し、次いで、それを、10 mM K-MOPS、pH 8.0(各場合1 mM CaCl₂を含む)における0から0.4 N NaClまでの直線状の塩勾配で溶出させ、フラクション中の溶出液を回収した。カラムの再生は、3 カラム体積の1 N NaCl + 1mM CaCl₂で行う。

溶出液フラクションについて、平底96-ウェルマイクロタイタープレートにおいて活性をアッセイした。活性フラクションを見つけるためである。呈色溶液は以下の組成を有していた:
20 mM トリス/HCl、pH 7.5(2% グルコース含有)中、
0.2 mM PMS (H₂O中のフェナジンメトサルフェート)
+ 0.22 mM NTB (H₂O中のニトロテトラゾリウムブルー)
+ 3 μM PQQ Na 塩(DMSO中)。
アッセイは以下の通り行った: 各場合において、90 μlのサンプルをマイクロタイタープレートに導入し、110 μlの呈色溶液をそれぞれに加えた; その呈色反応は通常１分後に観察され得る。その結果に基づき、オンラインUVクロマトグラムおよび活性アッセイにおいて、活性フラクションを合わせ、そのプールを濃縮した。濃縮は好適には限外濾過 (30 000 MWCO)により行う。タンパク質決定および定量的活性アッセイを続けて行う(実施例9参照)。

表 2: 大腸菌 DH5α::pAI3-KOZ65からのsPQQGDHの精製

活性のあるバンドがSDSゲルおよびネイティブゲルにおいて１つだけ検出された。したがって、タンパク質は純粋であった。元の培養物に基づくと、培養物１lあたり48.2 mgの純粋タンパク質が得られた。

実施例 7: W3110 株由来の組み換えsPQQGDHの調製および熱安定性の試験
LMD79.41 (プラスミド pAI3-wt)由来の組み換えsPQQGDHとKOZ65 (プラスミド pAI3-KOZ65)由来のsPQQGDHとの熱安定性の比較のため、株W3110::pAI3-wt および W3110::pAI3-KOZ65を、200 mlのTB培地(100 μg/ml アンピシリン含有)中で培養した。その培養物のOD₆₀₀ が3に到達した後、細菌を遠心分離(4600 rpm、10秒)し、そのペレットを、いずれの場合も25 mlの新しいTB培地(100 μg/ml アンピシリン含有) に入れた。誘導のために濃度2 μg/ml のAHTを加え、細胞を22℃、6時間撹拌した。次いで、改めて細胞をペレットとし、そのペレットを、更に処理するまで-80℃で保存した。凍結した細胞を、いずれの場合も25 mlのMOPS 緩衝液(10 mM MOPS pH 8、2.5 mM CaCl₂、0.05% Triton X-100)で再懸濁し、懸濁液が明らかに透明となるまで超音波処理で破砕した。細胞残渣は20 000 rpm、4℃、30分間で除き、上清はToyopearl CM-650 M カラム (20 ml ベッド体積)で精製した。この目的のため、サンプルをロードした後、カラムを50 mlのMOPS 緩衝液(上記参照)で洗浄し、次いで、結合タンパク質を、MOPS 緩衝液中における0から0.6 mM のNaCl勾配で溶出させた。GDH活性を有するフラクションをプールし、該プールの活性を測定した(実施例 9参照)。

両酵素調製物の熱安定性を、50 mM Pipes（1 mM CaCl₂、0.1% Triton X-100、0.1% BSAおよび5 μM PQQを含有）、pH 6.5に溶液が20 U/mlとなるように調節し希釈することにより測定した。この溶液のアリコートを、並行して、4℃、50℃、57℃および64℃で60分間インキュベートした。次いで、その残存活性を、4℃での値を100%として以下のように調査した(三重に行う; 実施例9参照):

実施例 8: 高細胞-密度培養(fermentation)による調製
その培養(fermentation)は、Braunの10リットルのスチール製の培養槽(BIOSTAT C)で行った。

この目的のために、5リットルの(修飾した)Riesenberg培地を用いた。

微量元素溶液

pHは、すべての培地成分を加えた後に、5 N NaOHで6.80の調節した。

栄養溶液に、37℃で一夜培養した100 mlの前培養物(100 mg/l アンピシリンを含有するLB培地)を接種した。

その接種後のODは0.066であった。通気速度は2 l/分に、スターラースピードは500 rpmにそして温度は37℃に調節した。pHは5 N NH₃でpH 7.25に調節し、培養(fermentation)の間、一定とした。

12 時間の培養の後、pO₂は10%未満に落ち込み、殆どのグルコースが消費された。15 時間の増殖後、OD₆₀₀は14.2であり、乾物(dry matter)は6.2 g/lであった。この時点で供給(feeding)を開始した。その供給(feed)溶液は以下からなる:

溶液は濾過により滅菌した。それをチュービング・ポンプにより培養槽に供給した。そのポンプ送達は標的 pO₂により制御し、20%にセットした。制御は、ポンプがpO₂ >20%でスイッチを入れ、新たなグルコースが供給されるように行った。次いで、酸素消費の開始は、再度のpO₂の落ち込みの要因となる。ポンプは、pO₂が20%未満となった場合にスイッチが切れる。スターラースピードおよび通気速度は変化させなかった。64 時間の培養後のOD₆₀₀は50.2であった。次いで、5リットルの二倍濃縮TB培地を培養槽に供給し、温度を22℃に低下させ、通気速度は4 l/分に設定した。

スターラースピードを700 rpmに上げた。次いで、培養物を10 mlのアンヒドロテトラサイクリン溶液(DMF中2 mg/ml)で6 時間誘導した。次いで、サンプルを採取し、活性を測定した。その活性アッセイは、培養液で223 U/mlの値を示した。培養物１mlあたり220 mgを超える精製酵素が得られた。

実施例 9: 活性アッセイの手順:
測定は、“Ultraspec 2000”光度計で行った。この目的のため以下の溶液を用いた:

EDB = 酵素希釈緩衝液
作業用試薬は以下の成分からなる:
25.5 ml PIPES、2.2% Triton X-100を含む
0.9 ml グルコース
2.0 ml PMS
1.0 ml NTB
EDBおよび作業用試薬は可能ならば新しいものを作成した。

活性測定の手順:
20 μlの選択サンプル希釈液をマイクロキュベット中に入れる(サンプル溶液の代わりに20 μlのEDBを加え、零値とする)、
600 μlの作業用試薬を加え、そして直ぐに、570 nmで3 分間、測定を開始する。

活性の算出:
吸収の変化を吸光/分の変化として測定する; １ユニットのGDHは、１分あたり0.5 μmolのホルマザンを生ずる。以下の式を適用する:
U/ml = 吸光/分の変化 × 1.54 × 希釈係数ε = 40 200 M^-1cm^-1

（原文に記載なし）

Claims

野生型アシネトバクターＬＭＤ７９．４１のアミノ酸配列に変異を有する組み換え可溶性ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｓＰＱＱＧＤＨ）であって、野生型アシネトバクターＬＭＤ７９．４１およびアシネトバクターＪＣＭ６８４１のアミノ酸配列と比較して、該野生型アシネトバクターＬＭＤ７９．４１のアミノ酸配列のうち下記のアミノ酸：
ｉ）２１位がＮ；
ｉｉ）４１位がＳ；
ｉｉｉ）４７位がＬ；
ｉｖ）１２１位がＶまたはＡ；
ｖ）１４９位がＡ；
ｖｉ）２１３位がＳ；
ｖｉｉ）２４４位がＩ；
ｖｉｉｉ）３２０位がＧ；
ｉｘ）３９１位がＳ；
ｘ）４５２位がＳ；
ｘｉ）４７４位がＲ；および
ｘｉｉ）４８０位がＱ；
に置換されている、ここに、アミノ酸位置のナンバリングがアシネトバクターＪＣＭ６８４１株由来のｓＰＱＱＧＤＨにおけるナンバリングに基づいている、組み換えｓＰＱＱＧＤＨ。
野生型アシネトバクターＬＭＤ７９．４１のアミノ酸配列のうち少なくとも１つの下記のアミノ酸：
ｉ）１６位がＨ；
ｉｉ）１８位がＬ；
ｉｉｉ）２０位がＦ；
ｉｖ）４０位がＧ；
ｖ）４８位がＩ；
ｖｉ）６１位がＡ；
ｖｉｉ）１１１位がＴ；
ｖｉｉｉ）１５４位がＤ；
ｉｘ）１９０位がＥ；
ｘ）２９３位がＡ；
ｘｉ）３１１位がＳ；
ｘｉｉ）３１４位がＡ；
ｘｉｉｉ）３２４位がＬ；
ｘｉｖ）３３３位がＭ；
ｘｖ）３３９位がＳ；
ｘｖｉ）３５５位がＧ；
ｘｖｉｉ）３６６位がＤ；
ｘｖｉｉｉ）４１７位がＮ；または
ｘｉｘ）４１８位がＡ；
に置換されている、請求項１記載の組み換えｓＰＱＱＧＤＨ。
配列番号１２に示される組み換えｓＰＱＱＧＤＨ。
組み換えｓＰＱＱＧＤＨを発現する微生物を培養し、次いで、組み換えｓＰＱＱＧＤＨを単離することを特徴とする、請求項１または２記載の組み換えｓＰＱＱＧＤＨを調製する方法。
組み換えｓＰＱＱＧＤＨを発現する微生物を培養し、次いで、組み換えｓＰＱＱＧＤＨを単離することを特徴とする、請求項３記載の組み換えｓＰＱＱＧＤＨを調製する方法。
請求項１または２記載の組み換えｓＰＱＱＧＤＨを１つまたはそれ以上含む、グルコースの検出用試薬。
請求項３記載の組み換えｓＰＱＱＧＤＨを１つまたはそれ以上含む、グルコースの検出用試薬。