KR20180043219A

KR20180043219A - Gaba 생산성이 향상된 코리네박테리움속 균주의 제조 방법 및 이를 이용한 gaba의 생산 방법

Info

Publication number: KR20180043219A
Application number: KR1020180044014A
Authority: KR
Inventors: 이현환; 현형환; 권혁진; 김희영
Original assignee: 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2018-04-27

Abstract

본 발명은 GABA 생산과 관련된 경로(pathway)의 조절을 위해 연관 있는 유전자를 강화하거나 분지 경로(branch pathway) 해당 유전자를 제거하는 방식 등을 활용하여 다양한 재조합 벡터를 만들고 이를 코리네박테리움 균주에 도입하는 것에 관한 것으로서, 관련 유전자들의 상호 작용에 의한 결과로써 GABA의 생산성이 향상된 코리네박테리움속 균주를 제조하는 방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, GABA의 생산성이 향상된 코리네박테리움속 균주의 제조 방법을 제공함으로써, GABA의 생산에 관련된 유전자 동정을 통해 경로를 확인하고 생산성을 더욱 강화할 수 있을 뿐만 아니라, 고농도의 GABA를 획득하여 건강기능식품개발 및 각종 폴리머(polymer) 합성에도 유용하게 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 균주의 제조 방법 및 이를 이용한 GABA의 생산 방법{METHOD OF MANUFACTURING A CORYNEBACTERIUM HAVING ENHANCED GABA PRODUCTIVITY AND METHOD OF MANUFACTURING GABA USING THEREOF}

본 발명은 GABA(γ-aminobutyric acid) 생산성이 향상된 코리네박테리움속(Corynebacterium) 균주의 제조 방법 및 이를 이용한 GABA의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 GABA 생산과 관련된 경로(pathway)를 조절하기 위해 재조합 벡터(vector)를 구축하고 이를 균주 내에 도입함으로써 관련 유전자들의 상호 작용을 통해 GABA를 고수율로 획득할 수 있는 코리네박테리움속 균주를 제조하고 이를 이용해 GABA를 생산하는 방법에 관한 것이다.

GABA(γ-aminobutyric acid)는 자연계에 널리 분포되어 있는 비단백질 아미노산(nonprotein amino acid)이다. GABA는 1980년대 중반부터 사용되기 시작했으며, 2001년경부터 본격적으로 시장을 형성하기 시작하였다. 4개의 탄소로 구성되어있으며, glutamate decarboxylase(GAD)에서 L-glutamate의 탈탄산 반응에 의해 생성되며 이때 CO₂ 또한 함께 생성된다.

혈압강하, 이뇨작용, 진정작용, 뇌 혈류개선, 스트레스 해소작용, 시력회복 등의 여러 생리학적 기능을 갖고 있는 것으로 알려진 GABA는 이러한 기능을 목적으로 하여 기능식품으로의 개발이 이루어지고 있는 실정이다. 한 예로 일본 바이오벤처인 파마후드 연구소는 GABA가 성장호르몬의 분비를 촉진시킨다는 연구결과를 발표했다. 동물실험과 인체시험에서 탁월한 효능을 나타낸 GABA를 활용하여 음료제품을 타깃으로 새로운 스포츠 식품 소재로서 개발해 나갈 계획을 제시했다.

현재 GABA는 Escherichia coli과 같은 bacteria, fungi, 그리고 Neurospora crassa와 같은 yeast내에서 생산가능한 것으로 보고되어 있다. 2005년에 보고된 바에 의하면 낮은 GABA 생산성을 갖는 Bifidobacterium longum의 경우 rice glutamate decarboxylase(OsGADC-) 유전자를 형질전환시킨 결과 형질전환 시키지 않은 wild type 균주에 비하여 GABA의 생산량이 눈에 띄게 증가됨을 확인한 바 있다. 이는 genetic engineering을 통한 GABA의 생산성 향상을 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.

이외에 GABA의 생산성 향상을 위하여 GAD를 여러 sources로부터 분리 정제하여 그 생화학적 특성을 분석한 보고가 있다. GAD는 pH에 따라 활성도가 다르게 나타나는 것으로 확인되었고 GAD의 활성도에 따라 GABA의 생산성 또한 영향을 받는 것으로 나타났다. 2008년 현재 GAD는 mammalian brain, plants, E. coli, Aspergillus, 그리고 Lactic acid bacteria에서 연구 결과가 보고되어 있으며 대부분 GABA의 생산성 개선을 위하여 GAD를 이용하는 것으로 보고되어 있다. 관련 종래기술로는 한국등록특허 제10-1290657호(2013.07.23), 미국공보특허 US20110252509(2011.10.13) 등이 있다. E. coli,

본 발명의 목적은 글루타메이트 생산균주(glutamate producer)인 Corynebacterium glutamicum에서 GABA를 고농도로 생산하는 것이다. 이렇게 얻어진 GABA는 건강기능식품 개발 및 피롤리돈(pyrrolidone)과 gamma-butylolactone(GBL)의 합성에 사용할 수 있을 것으로 보이며 또한 폴리아마이드(polyamide), 폴리에스테르(polyester)와 같은 폴리머(polymer)의 합성에도 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 본 발명자는 GABA의 생산에 관련된 유전자를 동정 및 정성분석(characterization)하고 이를 이용하여 목적(target) 물질을 고수율로 생산하고자 하였다. 또한 target 생산 관련된 경로(pathway)의 강화와 별도로 다른 분지 경로(branch pathway) 관련 유전자를 제거함에 의하여 target 물질의 생산성을 더욱 높임으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, GABA 생산과 관련된 경로(pathway)의 조절을 위해 연관 있는 유전자를 강화하거나 분지 경로(branch pathway) 해당 유전자를 제거하는 방식 등을 활용하여 다양한 재조합 벡터를 만들고 이를 코리네박테리움 균주에 도입함으로써, 관련 유전자들의 상호 작용에 의한 결과로써 GABA의 생산성이 향상된 코리네박테리움속 균주를 제조하는 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GABA 특이적 운반체를 코딩하는 NCgl0464 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 GABA 특이적 운반체의 활성이 감소 또는 불활성화된, GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GABA 특이적 운반체를 코딩하는 NCgl0464 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는, 상기 GABA 특이적 운반체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 코리네박테리움속 미생물에 도입하여 재조합체를 수득하는 단계; 및 상기 재조합체 중에서 GABA 특이적 운반체의 활성이 감소 또는 불활성화된균주를 선발하는 단계를 포함하는, GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 미생물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명은 제 1 항의 미생물 혹은 제2항의 제조방법에 의해 제조한 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물 또는 미생물로부터 GABA를 회수하는 단계;를 포함하는 GABA의 생산 방법을 제공한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, GABA의 생산성이 향상된 코리네박테리움속 균주의 제조 방법을 제공함으로써, GABA의 생산에 관련된 유전자 동정을 통해 경로를 확인하고 생산성을 더욱 강화할 수 있을 뿐만 아니라, 고농도의 GABA를 획득하여 건강기능식품개발 및 각종 폴리머(polymer) 합성에도 유용하게 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1A는 GDH를 pGEM-T Easy vector로 sub-cloning하는 것을 나타낸 그림.
도 1B는 도 1A에서 sub-cloning시킨 pGEM-T Easy vector로부터의 gdh 포함 fragment를 pClik5aMCS Psod SL_GAD에 cloning하는 것을 나타낸 그림.
도 2A는 NCgl0464(1248 bps)에서 N-말단으로부터의 450 bps 및 C-말단으로부터의 450 bps에 해당하는 부위를 표시한 그림.
도 2B는 NCgl0464의 N-말단과 C-말단으로부터의 각각 450 bps에 해당하는 부위의 증폭 결과를 나타낸 사진.
도 2C는 NCgl0464의 knock-out fragments 생성을 확인한 사진.
도 3A는 NCgl0464(F)(B) fragments의 sub-cloning을 확인한 사진.
도 3B는 제작된 knock-out vector인 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B)의 그림.
도 4A는 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B) vector를 도입한 그림.
도 4B는 homologous recombination을 통한 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B) vector를 삽입한 그림.
도 4C는 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B) vector 삽입을 확인한 사진(SM : size marker, lane 1, 4, 7 : primer[GABA-T(F), GABA-T(B)], lane 2, 5, 8 : primer[Km(F), Km(B)], lane 3, 6, 9 : primer[NCgl0464(F), NCgl0464(B)]).
도 5A는 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B)의 2차 homologous recombination의 결과로 확인한 복귀돌연변이(revertant) 그림.
도 5B는 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B)의 2차 homologous recombination의 결과로 확인한 knock-out 유전자의 그림.
도 6은 2차 homologous recombination을 확인한 사진(SM: DNA size marker, Lane 1 : primer[GABA-T(F), GABA-T(B)], lane 2 : primer[Km(F), Km(B)], lane 3 : primer[NCgl0464(F), NCgl0464(B)]).
도 7은 C. glutamicum HH104 균주로 도입한 GAD, GDH 동시 발현 plasmid를 확인한 사진.
도 8은 plasmid가 도입된 균주에서 glutamate dehydrogenase(GDH)의 발현을 확인하기 위한 SDS-PAGE(좌)와 western-blotting(우) 사진.
도 9는 C. glutamicum HH110에 GAD발현 벡터인 pClikgad와 GAD,GDH 동시 발현 벡터인 pClikgadgdh 도입을 확인한 사진.
도 10은 본 발명에 따라 제조된 재조합 균주를 포함하는 모식도.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 글루타메이트 디하이드로게나제(glutamate dehydrogenase, GDH)를 코딩하는 gdh 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 GDH의 활성이 증가 또는 활성화된, GABA(γ-aminobutyric acid) 생산성이 향상된 코리네박테리움속(Corynebacterium) 미생물을 제공한다.

상기 재조합 벡터는 도 1B에 도시된 개열지도를 갖는 pClik5aMCS-Psod.C.gad-CJ4(S1).gdh(pClikgadgdh)인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 GDH를 코딩하는 gdh 유전자 및 상기 gdh 유전자의 상류에 연결되어 GDH를 발현시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 코리네박테리움속 미생물에 도입하여 재조합체를 수득하는 단계; 및 상기 재조합체 중에서 GDH의 활성이 증가 또는 활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 미생물의 제조 방법을 제공한다.

상기 프로모터는 서열목록 1로 표시되는 CJ4(S1)인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 GABA 특이적 운반체를 코딩하는 NCgl0464 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 GABA 특이적 운반체의 활성이 감소 또는 불활성화된, GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.

상기 불활성화된 NCgl0464 유전자는 일부가 결실된 유전자인 것을 특징으로 한다.

상기 NCgl0464 유전자는 N-말단으로부터의 450 bps와 C-말단으로부터의 450 bps를 제외한 나머지 부분이 결실된 것을 특징으로 한다.

상기 재조합 벡터는 pK19mobsacB로부터 유래된 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 GABA 특이적 운반체를 코딩하는 유전자의 일부 서열이 변이되어 활성이 약화된 상기 GABA 특이적 운반체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 코리네박테리움속 미생물에 도입되어 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계; 상기 수득한 재조합 벡터를 GABA를 생산할 수 있는 코리네박테리움속 미생물에 도입하여 재조합체를 수득하는 단계; 및 상기 재조합체 중에서 GABA 특이적 운반체의 활성이 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 미생물의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 첫번째 측면 또는 그의 실시태양에서 정의된 제조방법으로 제조된 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물 또는 미생물로부터 GABA를 회수하는 단계를 포함하는 GABA의 생산 방법을 제공한다.

C. glutamicum을 이용한 기존 재조합 균주

본 발명에 앞서, glutamate 고생산 균주인 C. glutamicum HH09를 이용하여 GABA-aminotransferase(gaba-T) 유전자를 넉아웃(knock-out)시킨 재조합 균주들을 제조한 바 있다(표 1)(한국미생물생명공학회, Recent Breakthroughs in Microbial Biotechnology: from Bench to Industry, 2013.07.03.).

상기 재조합 균주들의 제조과정은 아래 모식도와 같다.

SDS-PAGE

gad 유전자를 발현시키는 플라스미드를 보유한 C. glutamicum을 20 ug/ml kanamycin이 첨가된 LB배지에 30 ℃, 48시간 배양하였다. 이로부터 수확된 cell에 1X PBS(0.136 M NaCl, 0.002 M KCl, 0.01 M Na₂PO₄, pH 7.4)와 0.1 mm zirconia/silica bead(Bio Spec Products, Inc.)를 넣어준 후 Bead beater를 이용하여 1분씩 5번 분쇄한 후 원심분리를 이용해 상층액만을 얻었다. 이 상층액에 5X sample buffer(6 M Urea, 50 mM Tris-Cl pH 6.8, 100 mM Dithiothreitol, 2 % SDS, 0.1 % Bromophenol blue, 10 % glycerol)를 처리하여 10분간 boiling한 후 3분간 원심분리 하였다. 이렇게 만들어진 sample로 SDS-PAGE를 수행 한 후 staining solution(Coomassie brilliant blue R250 2.5 g, Methanol 450 ml, H₂O 450 ml, glacial acetic acid 100 ml)으로 염색하여 단백질의 발현 여부를 관찰하였다.

Western-blot

발현된 GAD와 GDH protein을 확인하기 위하여 Western blot analysis를 수행하였다. SDS-PAGE를 수행한 후, SDS-PAGE상의 단백질을 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane에 electrophoretic transfer하였다. Primary antibody로는 1/10.000 dilution된 anti-His tag antibody(Invitrogen Inc.)를 사용하였으며, secondary antibody는 anti-mouse IgG AP conjugate(Stressgen Co.)를 사용하였다. Substrate로써 4-nitroblue tetrazolium chloride(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate와 mixture type, Thermo scientific Inc.)와 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate(NBT/BCIP; Thermo scientific Inc.)를 사용하여 확인하였다.

flask culture

형질 전환시킨 C. glutamicum의 flask scale culture를 위해서 seed medium과 production medium을 사용하였다. Seed medium(KH₂PO₄1 g, Urea 4 g, SBH 55 ml, Thiamine-HCl(1 g/L) 200 ul, Biotin(50 mg/L) 1 ml, MgSO₄·7H₂O(50 g/L) 8 ml, FeSO₄·7H₂O(50 g/L) 200 ul, MnSO₄·5H₂O(50 g/L) 200 ul 및 Glucose(40 g/L), pH 7.0의 5N NaOH)에서 Spectrophotometer(분광광도계)를 이용한 cell growth의 측정값이 610nm 파장에서 8 내지 10이 되도록 배양하였다. 그리고 production medium((NH₄)₂SO₄ 30 g, KH₂PO₄ 1 g, SBH 15 g, CaCO₃ 50 g, Thiamine-HCl(1 g/L) 200 ul, Biotin(50 mg/L) 40 ul, MgSO₄·7H₂O(50 g/L) 8 ml, FeSO₄·7H₂O(50 g/L) 200 ul, MnSO₄·5H₂O(50 g/L) 200 ul 및 Glucose 70 g per 1 liter, pH 7.5의 5N NaOH)에 4 % transfer하여 배양하였다. 각 seed medium과 production medium에는 균의 선별, 배양 그리고 plasmid의 curing을 방지하기 위해 경우에 따라 20 ug/ml의 kanamycin을 첨가하였으며 30 ℃, 250 rpm에서 seed의 경우 20시간, production의 경우 120시간 배양하였다.

HPLC

C. glutamicum 균주들의 GABA 생산량을 알아보기 위하여 flask scale culture 후 생산된 GABA의 생산량은 HPLC detection system(Agilent; HP series 1100)을 standard solution으로 하여 측정하였다. Flask culture를 통해 얻은 각 시간대별 sample은 0.45 um filter로 filtration한 후, 1/10 또는 1/100으로 dilution하여 사용되었다. HPLC 분석을 위한 mixture(180 ul)는 sample 5 ul, HPLC water 160 ul, Borate buffer(0.4 M Borate buffer, pH 10.2인 5 N KOH) 10 ul, OPA-3MP(3-mercapto propionate 0.02 g, O-Phthaldiadehyde 0.02 g, 0.4 M Borate buffer 4 ml) 5 ul로 만들어졌으며, 각 분석에는 20 ul씩 사용되었다. GABA의 분리에는 Zorbax Eclipse-AAA column(4.6 x 150 mm; Agilent)을 사용했으며, 이 때 사용된 solvent는 sodium acetate buffer(50 mM Sodium acetate; Methanol:HPLC water=1:1, pH 7.0 with HCl)이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. GDH의 발현을 위한 plasmid의 제작

GDH는 TCA 회로(cycle)의 α-ketoglutarate(2-oxoglutarate)로부터 L-glutamate로 전환하는데 작용하는 효소로써 이 효소의 과발현으로 L-glutamate의 생산량을 증가시킨다. 이에 따른 GABA의 생산량 변화를 측정하기 위하여 chimeric glutamate decarboxylase(GAD)를 발현하는 pClik5aMCS Psod SL_GAD(pClikgad, BASF.)를 이용한 재조합을 수행하였다.

GAD의 발현 프로모터로는 sod(superoxide dismutase-BASF)를, GDH의 발현 프로모터로는 서열목록 1로 표시되는 자체제작한 CJ4(S1)을 사용하였다(표 2).

Promoter	Sequence
CJ4(S1)	5'-CAAATCACCCTTAGCTGGTTTGAAAAATCCGTGGCATAAATCTAGGATCGTGTAACTGGCACGAAAAGAAAGCGTCATCGGCGCTTGGGAACATCTTTTTAAGATATTCCTCAAGTGCCGTGACATCTGTCAACCCCGTGGCTGCGAGAGTCGTAGTCACAATGAAGTCCAGGAGGACATACA-3'

pGEM-T Easy vector(Promega Corporation)로의 gdh 서브-클로닝(sub-cloning) 단계(도 1A)를 거쳐 GAD와 GDH를 pClikgad에 함께 발현시키는 플라스미드(plasmid)를 제작하였다(도 1B). 하기 서열번호 2의 GDH 유전자는 C. glutamicum ATCC13032의 genomic DNA로부터 PCR로 증폭시켜 이용하였다(표 3).

[서열번호 2]

gctagcctcg ggagctctag gagatcgtga aaaacgggtc aaatttctcc gatgtagcgc

ctataaaagt cgtaccaatt ccatttgagg gcgctcaatt gtggccaggt tatataacca

gtcagtcaac tggtctcatt cgctggtcgg atgaatttaa ttaaagaaga gacttcatgc

gagttaccgc gcgttttggc gatacaaatt gataacctaa agaaattttc aaacaaattt

taattctttg tggtcatatc tgtgcgacac tgccataatt tgaacgtgag cacttaccag

cctaaatgcc cgcagtgagt taagtctcaa agcaagaagt gctctttagg gcatccgtag

tttaaaacta ttaaccgtta ggtatgacaa gccggttgat gtgaacgcag tttttaaaag

tttcaggatc agatttttca caggcatttt gctccagcaa acgcctagga tgtacatgtg

ccctcaatgg gaaccaccaa catcactaaa tggcccaggt acacacttta aaatcgtgcg

cgcatgcagc cgagatggga acgaggaaat catgacagtt gatgagcagg tctctaacta

ttacgacatg cttctgaagc gcaatgctgg cgagcctgaa tttcaccagg cagtggcaga

ggttttggaa tctttgaagc tcgtcctgga aaaggaccct cattacgctg attacggtct

catccagcgc ctgtgcgagc ctgagcgtca gctcatcttc cgtgtgcctt gggttgatga

ccagggccag gtccacgtca accgtggttt ccgcgtgcag ttcaactctg cacttggacc

atacaagggc ggcctgcgct tccacccatc tgtaaacctg ggcattgtga agttcctggg

ctttgagcag atctttaaaa actccctaac cggcctgcca atcggtggtg gcaagggtgg

atccgacttc gaccctaagg gcaagtccga tctggaaatc atgcgtttct gccagtcctt

catgaccgag ctacaccgcc acatcggtga gtaccgcgac gttcctgcag gtgacatcgg

agttggtggc cgcgagatcg gttacctgtt tggccactac cgtcgcatgg ctaaccagca

cgagtccggc gttttgaccg gtaagggcct gacctggggt ggatccctgg tccgcaccga

ggcaactggc tacggctgcg tttacttcgt gagtgaaatg atcaaggcta agggcgagag

catcagcggc cagaagatca tcgtttccgg ttccggcaac gtagcaacct acgcgattga

aaaggctcag gaactcggcg caaccgttat tggtttctcc gattccagcg gttgggttca

tacccctaac ggcgttgacg tggctaagct ccgcgaaatc aaggaagttc gtcgcgcacg

cgtatccgtg tacgccgacg aagttgaagg cgcaacctac cacaccgacg gttccatctg

ggatctcaag tgcgatatcg ctcttccttg tgcaactcag aacgagctca acggcgagaa

cgctaagact cttgcagaca acggctgccg tttcgttgct gaaggcgcga acatgccttc

cacccctgag gctgttgagg tcttccgtga gcgcgacatc cgcttcggac caggcaaggc

agtcaacgtc ggtggcgttg caacctccgc tctggagatg cagcagaacg cttcgcgcga

gacctgtgca gagaccgcag cagagtatgg acacgagaac gattacgttg tcggcgctaa

cattgctggc ttcaagaagg tagctgacgc gatgctggca cagggcgtca tctaagaccc

cggcgcttta cttaaacccc tgatccgcgt taaggatcag ggatttttga tttgttccag

gtcaattatc cgatccacat gggttaagtg cacgctgtgc ggtcgcgcaa tgatgat

Primer	Sequence
GDH(F)	5'- ATG CAT ACA GTT GAT GAG CAG GTC -3'
GDH(B)	5'- TTA GAT GAC GCC CTG TGC C -3'

실시예 2. NCgl0464 유전자의 knock-out을 위한 vector의 제작

C. glutamicum ATCC 13032 유래의 NCgl0464는 C. glutamicum의 GABA 특이적 운반체(GABA-specific transporter)로서 GABA의 흡수(uptake)에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Appl Environ Microbiol. 2012 Apr;78(8):2596-601). 따라서, NCgl0464의 넉아웃이 GABA의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 sacB system을 이용한 NCgl0464 유전자의 넉아웃을 수행하였다.

유전자의 knock-out을 위한 벡터로는 pK19mobsacB(Gene, Volume 145, Issue 1, 22 July 1994, Pages 69-73)를 사용하였으며, NCgl0464(1248 bps)의 N-말단(N-terminal)과 C-말단(C-terminal) 부분으로부터 450 bps의 유전자(도 2A)를 각각 증폭하여(도 2B) recombinant PCR로 연결함으로써 NCgl0464(F)(B) 단편(fragment)을 제조하였다(도 2C).

Recombinant PCR에 의해 제작된 NCgl0464(F)(B) 단편은 pGEM-T Easy vector로의 sub-cloning 후 EcoRI으로 절단(cutting)하여 pK19mobsacB 벡터로 삽입하였다(도 3A). 이렇게 제작된 넉아웃 벡터를 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B)라 명명하였다(도 3B).

Homologous recombination을 통한 ncgl0464의 넉아웃을 위해 플라스미드 벡터를 제작하였다. 일차적으로 (F) fragment를 NCgl0464 유전자의 start codon으로부터 450bp를 HindⅢ-NCgl0464(F)와 NCgl0464m(R) primer를 통해, (B) fragment를 stop codon으로부터 450bp를 NCgl0464m(F)와 NCgl0464(R)-XbaⅠ primer를 통해 PCR로 증폭하여 얻어내었다. 증폭된 두 DNA fragment는 각각 gel elution을 통해 정제하였고 recombinant PCR을 통해 (F)와(B)의 두 DNA fragment를 연결하였다.

실시예 3. sacB system에 의한 NCgl0464 유전자의 knock-out

전기천공법(Electroporation)으로 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B) vector를 C. glutamicum HH106 균주로 도입시켜 염색체(chromosomal) DNA상의 NCgl0464 유전자로의 삽입(integration)을 유도하였다(도 4). GAVA-T, Km 및 NCgl0464에 대한 콜로니(colony) PCR을 이용하여 삽입(integration) 여부를 확인하였다(표 4). Primer들은 모두 Bioneer Corp.에서 주문 제작하여 사용하였다.

Primer	Sequence
NCgl0464(F)	5'- ATG ACT ACC GAA TCA ATA GTT GCG ??3'
NCgl0464(B)	5'- TCT AGA CTA TGC CCA ACC CGC -3'
Km(F)	5'- ATG ATT GAA CAA GAT GGA TTG C -3'
Km(B)	5'- TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG G -3'
GABA-T(F)	5'- ATG CAT GAA GAT CTC TCA TAC CGC -3'
GABA-T(B)	5'- CTG CAG TTA GCC CAC CTT CTG GTG C -3'

Colony PCR 결과, C. glutamicum HH106의 NCgl0464 유전자로 pK19mobsacB-NCgl0464(F)(B) vector가 성공적으로 integration 되었음을 확인하였으며 knock-out vector가 integration된 후보 균주를 대상으로 sacB system을 이용한 선별(selection)을 진행하였다. sacB system에 의해 10 % sucrose 배지에서 선별을 진행하였으며 sacB gene과 kanamycin 저항성 유전자(resistant gene)가 제거되고 NCgl0464 유전자가 knock-out된 균주를 선별하였다(도 5, 6). 일련의 과정으로 NCgl0464 유전자가 knock-out 된 C. glutamicum HH106을 C. glutamicum HH110으로 명명하였다.

측정예 1. Glutamate dehydrogenase(GDH)의 발현 확인

실시예 1에서 제작된 GAD, GDH 동시 발현 plasmid를 C. glutamicum HH104 균주로 도입하였으며 콜로니 PCR을 통하여 plasmid의 도입을 확인하였다(도 7). Plasmid가 도입된 균주에서 GDH의 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE와 western-blotting을 수행하였다. SDS-PAGE와 western-blotting으로 GDH의 발현을 확인하였으며 약 49 kDa의 GDH가 성공적으로 발현함을 확인할 수 있었다(도 8).

측정예 2. Flask culture를 통한 GDH-overexpression 균주의 GABA 생산량 확인

GDH의 과발현(overexpression)이 GABA의 생산량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 플라스크 배양(flask culture)를 수행하였다. Flask culture는 C. glutamicum HH104, HH105, 그리고 GDH, GAD 동시 발현 plasmid가 도입된 C. glutamicum HH104 균주를 사용하여 진행하였다. Flask culture 결과, GDH, GAD 동시 발현 plasmid가 C. glutamicum HH104로 도입된 균주에서의 GABA 생산량이 기존의 C. glutamicum HH105 균주에서보다 증가하였음을 확인하였으며 글루탐산(glutamic acid)의 생산량 또한 증가한 것을 확인할 수 있었다(표 5).

Strain	Cell growth (OD 610nm)	Conc. of GABA (g/ℓ)	Conc. of Glutamic acid (g/ℓ)
C. glutamicum HH104	14.5	0	23.5
C. glutamicum HH105	17.9	10.0	4.3
C. glutamicum HH104 harboring plasmid expressing GDH and GAD	18.0	19.1	16.0

측정예 3. HPLC를 통한 GABA 생산량의 확인

gaba-T 유전자가 knock-out되어 있고, L-glutamate에서 GABA로 전환시켜주는 효소인 gad가 integration 되어있는 균주인 C. glutamicum HH106에 GABA uptake와 관련된 NCgl0464 유전자를 knock-out시켜 만든 균주인 C. glutamicum HH110에서의 GABA 생산량을 확인하기 위하여 flask culture을 수행하였다(표 6). 그 결과 knock-out하지 않은 균주보다 1.6배 많은 GABA 생산량을 확인하였다.

Strain	Cell growth (OD 610nm)	Conc. of GABA (g/ℓ)	Conc. of Glutamic acid (g/ℓ)
C. glutamicum HH106	19.5	1.49	31.9
C. glutamicum HH110	18.9	2.39	29.7

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANKUK UNIVERSTIY OF FOREIGN STUDIES <120> METHOD OF MANUFACTURING A CORYNEBACTERIUM HAVING ENHANCED GABA PRODUCTIVITY AND METHOD OF MANUFACTURING GABA USING THEREOF <130> 1 <140> 10-2015-0106119 <141> 2015-07-27 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 caaatcaccc ttagctggtt tgaaaaatcc gtggcataaa tctaggatcg tgtaactggc 60 acgaaaagaa agcgtcatcg gcgcttggga acatcttttt aagatattcc tcaagtgccg 120 tgacatctgt caaccccgtg gctgcgagag tcgtagtcac aatgaagtcc aggaggacat 180 aca 183 <210> 2 <211> 2037 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 gctagcctcg ggagctctag gagatcgtga aaaacgggtc aaatttctcc gatgtagcgc 60 ctataaaagt cgtaccaatt ccatttgagg gcgctcaatt gtggccaggt tatataacca 120 gtcagtcaac tggtctcatt cgctggtcgg atgaatttaa ttaaagaaga gacttcatgc 180 gagttaccgc gcgttttggc gatacaaatt gataacctaa agaaattttc aaacaaattt 240 taattctttg tggtcatatc tgtgcgacac tgccataatt tgaacgtgag cacttaccag 300 cctaaatgcc cgcagtgagt taagtctcaa agcaagaagt gctctttagg gcatccgtag 360 tttaaaacta ttaaccgtta ggtatgacaa gccggttgat gtgaacgcag tttttaaaag 420 tttcaggatc agatttttca caggcatttt gctccagcaa acgcctagga tgtacatgtg 480 ccctcaatgg gaaccaccaa catcactaaa tggcccaggt acacacttta aaatcgtgcg 540 cgcatgcagc cgagatggga acgaggaaat catgacagtt gatgagcagg tctctaacta 600 ttacgacatg cttctgaagc gcaatgctgg cgagcctgaa tttcaccagg cagtggcaga 660 ggttttggaa tctttgaagc tcgtcctgga aaaggaccct cattacgctg attacggtct 720 catccagcgc ctgtgcgagc ctgagcgtca gctcatcttc cgtgtgcctt gggttgatga 780 ccagggccag gtccacgtca accgtggttt ccgcgtgcag ttcaactctg cacttggacc 840 atacaagggc ggcctgcgct tccacccatc tgtaaacctg ggcattgtga agttcctggg 900 ctttgagcag atctttaaaa actccctaac cggcctgcca atcggtggtg gcaagggtgg 960 atccgacttc gaccctaagg gcaagtccga tctggaaatc atgcgtttct gccagtcctt 1020 catgaccgag ctacaccgcc acatcggtga gtaccgcgac gttcctgcag gtgacatcgg 1080 agttggtggc cgcgagatcg gttacctgtt tggccactac cgtcgcatgg ctaaccagca 1140 cgagtccggc gttttgaccg gtaagggcct gacctggggt ggatccctgg tccgcaccga 1200 ggcaactggc tacggctgcg tttacttcgt gagtgaaatg atcaaggcta agggcgagag 1260 catcagcggc cagaagatca tcgtttccgg ttccggcaac gtagcaacct acgcgattga 1320 aaaggctcag gaactcggcg caaccgttat tggtttctcc gattccagcg gttgggttca 1380 tacccctaac ggcgttgacg tggctaagct ccgcgaaatc aaggaagttc gtcgcgcacg 1440 cgtatccgtg tacgccgacg aagttgaagg cgcaacctac cacaccgacg gttccatctg 1500 ggatctcaag tgcgatatcg ctcttccttg tgcaactcag aacgagctca acggcgagaa 1560 cgctaagact cttgcagaca acggctgccg tttcgttgct gaaggcgcga acatgccttc 1620 cacccctgag gctgttgagg tcttccgtga gcgcgacatc cgcttcggac caggcaaggc 1680 cacccctgag gctgttgagg tcttccgtga gcgcgacatc cgcttcggac caggcaaggc 1740 agtcaacgtc ggtggcgttg caacctccgc tctggagatg cagcagaacg cttcgcgcga 1800 gacctgtgca gagaccgcag cagagtatgg acacgagaac gattacgttg tcggcgctaa 1860 cattgctggc ttcaagaagg tagctgacgc gatgctggca cagggcgtca tctaagaccc 1920 cggcgcttta cttaaacccc tgatccgcgt taaggatcag ggatttttga tttgttccag 1980 gtcaattatc cgatccacat gggttaagtg cacgctgtgc ggtcgcgcaa tgatgat 2037

Claims

GABA 특이적 운반체를 코딩하는 NCgl0464 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 GABA 특이적 운반체의 활성이 감소 또는 불활성화된, GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 미생물.
GABA 특이적 운반체를 코딩하는 NCgl0464 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는, 상기 GABA 특이적 운반체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계;
상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 코리네박테리움속 미생물에 도입하여 재조합체를 수득하는 단계; 및
상기 재조합체 중에서 GABA 특이적 운반체의 활성이 감소 또는 불활성화된균주를 선발하는 단계를 포함하는, GABA 생산성이 향상된 코리네박테리움속 미생물의 제조 방법.
제 1 항의 미생물 혹은 제2항의 제조방법에 의해 제조한 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
상기 배양물 또는 미생물로부터 GABA를 회수하는 단계;를 포함하는 GABA의 생산 방법.