CN110603325A

CN110603325A - 重组微生物及使用该重组微生物的吡哆胺或其盐的制造方法

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Publication number: CN110603325A
Application number: CN201880029702.9A
Authority: CN
Inventors: 馆野俊博; 秀崎友则; 安乐城正; 进藤敦德; 松本佳子; 宫田敏男; 本城胜
Original assignee: Kidney Science Co Ltd; MITSUI CHEMICAL CO Ltd
Current assignee: Kidney Science Co Ltd; MITSUI CHEMICAL CO Ltd; Mitsui Chemicals Inc; RenaScience Co Ltd
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2019-12-20
Also published as: US20200149079A1; EP3623471A4; EP3623471A1; WO2018207930A1; JPWO2018207930A1

Abstract

重组微生物，其具有编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因，所述吡哆胺合成酶具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，所述编码吡哆醇氧化酶的基因及所述编码吡哆胺合成酶的基因各自是从菌体外导入的基因，或者是内源于菌体但其表达得到增强的基因；以及，使用所述重组微生物从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的方法。

Description

重组微生物及使用该重组微生物的吡哆胺或其盐的制造方法

技术领域

本公开文本涉及能生产吡哆胺或其盐的重组微生物、及使用该重组微生物的吡哆胺或其盐的制造方法。

背景技术

吡哆胺及其盐是维生素B₆中的一种，其具有糖基化反应抑制作用，这是已知的。吡哆胺及其盐抑制例如与各种老化反应相关的糖基化终产物(Advanced Glycation EndProducts；AGE)向体内的蓄积。AGE是通过蛋白质的糖基化而生成的物质的总称，认为AGE的蓄积可使糖尿病、动脉粥样硬化症、慢性肾功能衰竭、阿尔茨海默型认知症等疾病恶化。因此，吡哆胺及其盐是被期待能通过防止AGE的蓄积来实施上述疾病的预防、治疗的有前景的物质。

另外，吡哆胺及其盐还具有作为精神分裂症药物的活性是已知的，面向其实用化进行了各种研究。此外，对利用吡哆胺及其盐所具有的各种生理活性的健康食品、化妆品的开发也正在推进。

吡哆胺及其盐可进行化学合成。例如，国际公开第2006/066806号公开了以丙氨酸和甲酸作为起始物质来化学合成吡哆胺二盐酸盐的方法。另外，国际公开第2005/077902号公开了从吡哆醇化学合成吡哆胺的方法。

另一方面，也研究了生物合成吡哆胺。国际公开第2007/142222号公开了使用无色杆菌属等的特定微生物从吡哆醛得到吡哆胺的方法。另外，国际公开第2007/142222号还公开了通过在吡哆醇存在下培养梭链枝顶孢霉(Acremonium fusidioides)而将一定量的吡哆醇转化为吡哆醛的实验。

日本特开平9-107985号公报公开了维生素B₆的制造方法，所述方法在好氧条件下于培养基中对属于根瘤菌属的具有维生素B₆生产能力的微生物进行培养，从培养液中得到所生成的维生素B₆。

作为涉及维生素B₆合成的研究，国际公开第2004/035010号公开了对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的yaaD及yaaE中至少一方的活性较之亲本生物而言增强的生物进行培养、制造维生素B₆的方法。Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic、2010、vol.67、p.104-110公开了通过序列修饰被改造为能利用L-谷氨酸的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(PPAT)。记载了通过在饱和量的吡哆醛存在下对表达具有该修饰序列的PPAT的大肠杆菌进行孵育，能够生产吡哆胺。

发明内容

发明所要解决的课题

但是，通过基于化学合成的吡哆胺合成并未得到高的反应收率。例如，国际公开第2006/066806号中记载的方法中，由于经过多个化学反应而合成吡哆胺二盐酸盐，因此反应收率降低。另外，国际公开第2005/077902号中记载的方法中，生成吡哆胺的二聚体和三聚体，反应收率也不算高。

另一方面，在作为使用了特定种类的微生物的方法的、国际公开第2007/142222号中记载的方法中，从吡哆醛向吡哆胺转化的效率根据微生物种类而大幅度变动，并且整体而言并不算高。另外，国际公开第2007/142222号中记载的在吡哆醇存在下培养梭链枝顶孢霉的实验中，大部分产物是吡哆醛而非吡哆胺。此外，日本特开平9-107985号公报的记载中，生成的维生素B₆几乎都是吡哆醇(pyridoxine)，极少生成吡哆胺。

国际公开第2004/035010号中虽然记载了通过在培养基中培养使yaaD、yaaE的基因高水平表达的微生物来得到维生素B₆，但产物是吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆胺等的混合物，无法选择性地得到吡哆胺。

如上所述，吡哆胺或其盐的化学合成(例如国际公开第2006/066806号、国际公开第2005/077902号)经过多个反应及纯化工序，并未得到高的收率。另外，虽然在微生物中也存在具有吡哆胺合成能力的微生物(例如国际公开第2007/142222号、日本特开平9-107985号公报)，但要新发现这样的微生物耗费劳力，另外，尚未能在维生素B₆族中选择性地合成吡哆胺或其盐，也未得到高的吡哆胺生产效率。另外，通过这样从天然存在的微生物种类中筛选特定微生物种类的途径，无法得到何种酶或基因对于高效生产维生素B₆是重要的这样的分子生物学信息。

此外，还有针对维生素B₆的生产使用了利用基因重组技术制备的重组微生物的例子(国际公开第2004/035010号及Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic、2010、vol.67、p.104-110)，但在物质生产时，使用通常的培养基而非选择性地得到了维生素B₆(国际公开第2004/035010号)，或者以饱和量使用昂贵的原料吡哆醛而得到了吡哆胺(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic、2010、vol.67、p.104-110)，无法达成廉价且选择性良好地生产吡哆胺或其盐。

鉴于如上所述的情况，本公开文本提供能高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的重组微生物、及使用该重组微生物高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的方法。

用于解决课题的手段

本公开文本包括以下方案。

<1>

重组微生物，其具有编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因，所述吡哆胺合成酶具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，

所述编码吡哆醇氧化酶的基因及所述编码吡哆胺合成酶的基因各自是从菌体外导入的基因，或者是内源于菌体但其表达得到增强的基因。

<2>

如<1>所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶为吡哆胺-丙酮酸转氨酶、吡哆胺-草酰乙酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶或磷酸吡哆胺转氨酶。

<3>

如<1>或<2>所述的重组微生物，其中，所述吡哆醇氧化酶由酶编号EC1.1.3.12表示。

<4>

如<1>～<3>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇氧化酶的基因来源于微黄微杆菌。

<5>

如<1>～<4>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇氧化酶的基因

(a)具有序列号5的核苷酸序列；或者

(b)具有在严格条件下与下述DNA杂交、且编码具有吡哆醇氧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述DNA具有与序列号5的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或者

(c)具有编码具有序列号1的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者

(d)具有编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与序列号1的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有吡哆醇氧化酶活性。

<6>

如<1>～<5>中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶包含下述的部分氨基酸序列(c)、部分氨基酸序列(d)、部分氨基酸序列(e)、部分氨基酸序列(f)、部分氨基酸序列(g)及部分氨基酸序列(h)中的至少一者，且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性。

(c)X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃(序列号39)

(X₈表示L、M、I或V，

X₉表示H或Q，

X₁₀表示G、C或A，

X₁₁表示E或D，

X₁₂表示P或A，

X₁₃表示V、I、L或A)

(d)X₁₄X₁₅TPSGTX₁₆X₁₇(序列号40)

(X₁₄表示H或S，

X₁₅表示D或E，

X₁₆表示I、V或L，

X₁₇表示N或T)

(e)X₁₈DX₁₉VSX₂₀X₂₁(序列号41)

(X₁₈表示V、I或A，

X₁₉表示A、T或S，

X₂₀表示S、A或G，

X₂₁表示F、W或V)

(f)X₂₂X₂₃X₂₄KCX₂₅GX₂₆X₂₇P(序列号42)

(X₂₂表示G或S，

X₂₃表示P、S或A，

X₂₄表示N、G、S、A或Q，

X₂₅表示L或M，

X₂₆表示A、S、C或G，

X₂₇表示P、T、S或A)

(g)X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁SX₃₂GX₃₃X₃₄(序列号43)

(X₂₈表示G或D，

X₂₉表示V或I，

X₃₀表示V、T、A、S、M、I或L，

X₃₁表示F、M、L、I或V，

X₃₂表示S、G、A、T、I、L或H，

X₃₃表示R、M或Q，

X₃₄表示G、R、A、D、H或K)

(h)X₃₅X₃₆RX₃₇X₃₈HMGX₃₉X₄₀A(序列号44)

(X₃₅表示L或V，

X₃₆表示T、I、V或L，

X₃₇表示I、V或L，

X₃₈表示G或S，

X₃₉表示P、A或R，

X₄₀表示T、V或S)

<7>

如<1>～<6>中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶由酶编号EC2.6.1.30表示。

<8>

如<1>～<7>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因来源于百脉根中慢生根瘤菌。

<9>

如<1>～<8>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因

(a)具有序列号6及序列号25～序列号31中任一者的核苷酸序列，或

具有序列号10的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号32～序列号38中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域；或者

(b)具有在严格条件下与下述DNA杂交、且编码具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述DNA为具有与序列号6及序列号25～序列号31中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA、或具有与序列号10的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号32～序列号38中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的DNA；或者

(c)具有编码具有序列号2及序列号18～序列号24中任一者的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者

(d)具有编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与序列号2及序列号18～序列号24的氨基酸序列中的至少一者具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性。

<10>

如<1>～<9>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因

(a)具有序列号6的核苷酸序列；或者

(b)具有在严格条件下与下述DNA杂交、且编码具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述DNA为具有与序列号6的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA；或者

(c)具有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者

(d)具有编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性。

<11>

如<1>～<5>中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶由酶编号EC2.6.1.31或EC2.6.1.1表示。

<12>

如<1>～<5>及<11>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因来源于大肠杆菌。

<13>

如<1>～<5>及<11>～<12>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因

(a)具有序列号8的核苷酸序列；或者

(b)具有在严格条件下与下述DNA杂交、且编码具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述DNA为具有与序列号8的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA；或者

(c)具有编码具有序列号4的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者

(d)具有编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与序列号4的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性。

<14>

如<1>～<13>中任一项所述的重组微生物，其还具有编码过氧化氢分解酶的基因，所述过氧化氢分解酶具有从过氧化氢生成氧的酶活性。

<15>

如<14>所述的重组微生物，其中，所述编码过氧化氢分解酶的基因是从菌体外导入的基因，或者是内源于菌体但其表达得到增强的基因。

<16>

如<14>或<15>所述的重组微生物，其中，所述过氧化氢分解酶由酶编号EC1.11.1.6表示。

<17>

如<14>～<16>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码过氧化氢分解酶的基因

(a)具有序列号7的核苷酸序列；或者

(b)在严格条件下与下述DNA杂交、且具有从过氧化氢生成氧的酶活性，所述DNA具有与序列号7的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或者

(c)具有编码具有序列号3的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；或者

(d)具有编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与序列号3的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有从过氧化氢生成氧的酶活性。

<18>

如<1>～<17>中任一项所述的重组微生物，所述重组微生物为重组大肠杆菌。

<19>

吡哆胺或其盐的制造方法，其中，使<1>～<18>中任一项所述的重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物与吡哆醇或其盐接触，在氧存在下生成吡哆胺或其盐。

<20>

如<19>所述的制造方法，其中，所述重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物包含所述吡哆醇氧化酶及所述吡哆胺合成酶。

<21>

如<20>所述的制造方法，其中，所述重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物还包含过氧化氢分解酶。

<22>

如<19>～<21>中任一项所述的制造方法，其中，所述重组微生物或所述培养物的处理物是利用包括选自由加热处理、冷却处理、细胞的机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、细胞的自体消化、表面活性剂处理、酶处理、细胞分离处理、纯化处理及提取处理组成的组中的1种以上的处理而得到的处理物。

<23>

如<19>～<22>中任一项所述的制造方法，其包括以下的(A)及(B)中的任一者或两者：

(A)向含有所述重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物的溶液中连续添加或分多次添加吡哆醇或其盐；

(B)在含有所述重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物的溶液中，进行控制以使得所述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸的摩尔浓度相对于吡哆醇或其盐的摩尔浓度而言成为1倍以上。

<24>

如<23>所述的制造方法，其中，所述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸为L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酸或D-谷氨酸。

发明效果

根据本公开文本，可提供能高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的重组微生物、及使用该重组微生物高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的方法。

附图说明

[图1]示出了试验7中的吡哆醇盐酸盐浓度、吡哆醛盐酸盐浓度及吡哆胺二盐酸盐浓度的测定结果。

[图2]示出了试验8中的吡哆醇盐酸盐浓度、吡哆醛盐酸盐浓度及吡哆胺二盐酸盐浓度的测定结果。

[图3]示出了试验9中的吡哆醇盐酸盐浓度、吡哆醛盐酸盐浓度及吡哆胺二盐酸盐浓度的测定结果。

[图4-1]示出了序列号2及序列号18～序列号24的序列的比对。

[图4-2]示出了序列号2及序列号18～序列号24的序列的比对。

具体实施方式

本公开文本提供重组微生物(以下称为本公开文本涉及的重组微生物)，其具有编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因，所述吡哆胺合成酶具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，所述编码吡哆醇氧化酶的基因及所述编码吡哆胺合成酶的基因各自是从菌体外导入的基因，或者是内源于菌体但其表达得到增强的基因。需要说明的是，本公开文本中，所谓导入，是指以能在菌体内表达的方式导入。

迄今为止，无论通过化学方法还是生物学方法，高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的方法均是未知的。吡哆胺的结构如下所示。

[化学式1]

但是，本申请的发明人发现，令人惊奇的是，通过使用具有如上所述构成的重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物，能够高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐。其理由虽然不一定明确，但推测其原因在于，上述2种酶各自被从菌体外导入、或者内源于菌体但其表达得到增强，由此能够基于被导入或增强的基因而以高表达量表达酶，从而从吡哆醇或其盐生成吡哆胺或其盐的过程中的各反应的平衡及该过程中产生的副产物等、消耗的原料等的量由于上述2种酶的协同作用而变得有利于从吡哆醇或其盐生成吡哆胺或其盐。

此外，可以推测使用本公开文本涉及的重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物时，作为中间产物而暂时生成了吡哆醛。但是，吡哆醛由于是醛而反应性高，故而在中性附近的pH条件下，即使不存在酶等催化剂，也会与丙氨酸等氨基供体自发性地反应，生成吡哆胺及副产物。如此，认为在吡哆醛的自发性反应中生成副产物，吡哆胺生成的选择性不高，因此吡哆胺的生产效率不会增高。与此相对，使用本公开文本涉及的重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物时，作为中间体的吡哆醛利用吡哆胺合成酶而迅速地转化为吡哆胺，吡哆醛的蓄积被抑制，副产物的生产也得到抑制。由此，能够达成高的吡哆胺生产效率。

这样的上述2种酶的协同作用是迄今为止尚未被发现的，由此，能够通过使用吡哆醇或其盐来以高生产效率制造吡哆胺或其盐，而无需如化学合成方法那样逐一进行多步骤的反应。而且，通过使用本公开文本涉及的重组微生物，能够避免作为副产物而大量生成维生素B₆族所包括的其他物质。另外，吡哆醇是较之吡哆醛而言能够在工业上廉价地获得的原料，由于可以将吡哆醇作为起始物质，因而能够廉价地制造吡哆胺或其盐。

<吡哆醇氧化酶>

吡哆醇氧化酶是也被称为吡哆醇-4-氧化酶的酶。吡哆醇氧化酶可以是由酶编号EC1.1.3.12表示的酶。吡哆醇氧化酶是具有催化用氧来氧化吡哆醇从而将其转化为吡哆醛的反应的酶活性的酶。需要说明的是，吡哆醛、吡哆醇也可能根据周围的环境而以盐的形式存在，但为了简化表述，本公开文本中关于酶的活性的记载省略提及盐而进行表述。吡哆醇氧化酶在将吡哆醇氧化时消耗氧而生成过氧化氢。由于生成对于生物有害的过氧化氢，因此一直认为，即使将吡哆醇氧化酶用于从吡哆醇生产其他物质，也无法达成高收率。但是，使用本公开文本涉及的重组微生物时，得到了预料之外的效果，即，能够以高生产效率达成以吡哆醇或其盐作为原料的吡哆胺或其盐的生产。

前述EC1.1.3.12的吡哆醇氧化酶可以是例如来源于阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、微黄微杆菌(Microbacteriumluteolum)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、假单胞菌(Pseudomonas)属菌株MA-1等的吡哆醇氧化酶。需要说明的是，微黄微杆菌的吡哆醇氧化酶具有序列号1的氨基酸序列。

<吡哆胺合成酶>

本公开文本中使用的所谓吡哆胺合成酶，是指具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的任意的酶。需要说明的是，吡哆醛、吡哆胺也可能根据周围的环境而以盐的形式存在，但为了简化表述，本公开文本中关于酶的活性的记载省略提及盐而进行表述。作为吡哆胺合成酶的例子，可举出例如由酶编号EC2.6.1.30表示的吡哆胺-丙酮酸转氨酶、由EC2.6.1.31表示的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶、由EC2.6.1.1表示的天冬氨酸转氨酶、及由EC2.6.1.54表示的磷酸吡哆胺转氨酶。

需要说明的是，由EC2.6.1.1表示的天冬氨酸转氨酶是以磷酸吡哆醛作为辅酶的全酶，具有将天冬氨酸的氨基转移至2-氧代戊二酸、生成谷氨酸和草酰乙酸的酶活性。已知该天冬氨酸转氨酶在未与磷酸吡哆醛结合的脱辅基酶(apoenzyme)的状态下，将谷氨酸或天冬氨酸的氨基转移至吡哆醛而合成吡哆胺(JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1962年1月，Vol.237，No.l，p.127-132)。也即，由EC2.6.1.1表示的天冬氨酸转氨酶的脱辅基酶的形态为EC2.6.1.31的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶。因此，天冬氨酸转氨酶在作为辅酶的磷酸吡哆醛不存在或量少时以脱辅基酶的形式存在，合成吡哆胺。

吡哆胺合成酶具有在从吡哆醛或其盐合成吡哆胺或其盐时将特定的氨基酸的氨基部分氧化成(＝O)、使该氨基转移而生成吡哆胺或其盐的酶活性。例如，吡哆胺-丙酮酸转氨酶能利用L-丙氨酸及D-丙氨酸中的任何，吡哆胺-草酰乙酸转氨酶及脱辅基酶的状态的天冬氨酸转氨酶能利用D-天冬氨酸、L-天冬氨酸、D-谷氨酸、及L-谷氨酸中的任何，磷酸吡哆胺转氨酶能利用D-谷氨酸。

前述吡哆胺-丙酮酸转氨酶也可来源于例如属于变形菌门、放线菌门、螺旋体门或厚壁菌门的微生物。吡哆胺-丙酮酸转氨酶可以是来源于例如百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、假单胞菌(Pseudomonas)属(例如假单胞菌属菌株MA-1)等的吡哆胺-丙酮酸转氨酶。需要说明的是，例如，百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶具有序列号2的氨基酸序列。

此外，吡哆胺-丙酮酸转氨酶也可以是例如来源于中慢生根瘤菌属菌株YR577(Mesorhizobium sp.YR577)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号18的氨基酸序列)、来源于氧化水杨酸盐假氨基杆菌(Pseudaminobacter salicylatoxidans)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号19的氨基酸序列)、来源于岸滨芽孢杆菌(Bauldia litoralis)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号20的氨基酸序列)、来源于抗锑斯科曼氏球菌(Skermanellastibiiresistens)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号21的氨基酸序列)、来源于根瘤菌属菌株AC44/96(Rhizobium sp.AC44/96)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号22的氨基酸序列)、来源于托莱多欧文氏菌(Erwinia toletana)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号23的氨基酸序列)、来源于人参雷夫松氏菌(Herbiconiux ginsengi)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号24的氨基酸序列)。

前述吡哆胺-草酰乙酸转氨酶也可以是来源于例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)等的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶。需要说明的是，例如，大肠杆菌的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶具有序列号4的氨基酸序列。前述天冬氨酸转氨酶也可以是来源于例如大肠杆菌(Escherichia coli)、绿色木霉(Trichoderma viride)等的天冬氨酸转氨酶。另外，前述磷酸吡哆胺转氨酶也可以是来源于例如丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)的磷酸吡哆胺转氨酶。

<过氧化氢分解酶>

本公开文本涉及的重组微生物可还具有编码过氧化氢分解酶的基因，所述过氧化氢分解酶具有分解过氧化氢的酶活性。本公开文本中使用的所谓过氧化氢分解酶，是指具有对在前述吡哆醇氧化酶将吡哆醇氧化时生成的过氧化氢进行分解的酶活性的任意的酶。通过还具有编码过氧化氢分解酶的基因，能够进一步减少对于生物及酶活性而言有害的过氧化氢的蓄积，在进一步提高吡哆胺或其盐的生产效率、延长反应的可持续时间的方面是有利的。另外，过氧化氢分解酶也可具有使氧再生的酶活性。对于使氧再生的酶活性的存在而言，尤其在低氧环境下进行吡哆胺或其盐的生产时能够提高反应体系中的氧的浓度，在进一步提高吡哆胺或其盐的生产效率的方面是有利的。

作为这样的过氧化氢分解酶的例子，可举出由酶编号(EC)1.11.1.1、1.11.1.2、1.11.1.3、1.11.1.5、1.11.1.6、1.11.1.7、1.11.1.8、1.11.1.9、1.11.1.10、1.11.1.11、1.11.1.13、1.11.1.14、1.11.1.16、1.11.1.17、1.11.1.18、1.11.1.19、1.11.1.21或1.11.1.23表示的酶。其中，从氧再生能力这样的方面考虑，优选由酶编号EC1.11.1.6表示的过氧化氢酶及由EC1.11.1.21表示的过氧化氢酶-过氧化物酶，进一步优选由酶编号EC1.11.1.6表示的过氧化氢酶。

前述过氧化氢分解酶可以是来源于例如西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的过氧化氢酶。或者，前述过氧化氢分解酶可以是来源于例如大肠杆菌(Escherichia coli)等的过氧化氢酶-过氧化物酶。需要说明的是，例如，西尔李斯特菌的过氧化氢酶具有序列号3的氨基酸序列。

前述吡哆醇氧化酶、吡哆胺合成酶、及过氧化氢分解酶均可以是未经修饰而具有已知的具有该酶活性的氨基酸序列(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列，例如由上述例示的微生物等天然的微生物所具有的基因编码的氨基酸序列)的蛋白质，也可以是具有对这样的氨基酸序列在不丧失其酶活性(上述的酶活性)的范围内加以序列修饰而得到的氨基酸序列的蛋白质。作为这样的修饰，可举出氨基酸残基的插入、缺失、取代及向氨基酸序列N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基。在存在氨基酸残基的插入、缺失及取代中的一者以上的情况下，插入、缺失及取代各自在存在的情况下可以是例如1～30个氨基酸残基、或者1～20个氨基酸残基、或者1～10个氨基酸残基、或者1～5个氨基酸残基，氨基酸残基的插入、缺失及取代的总数可以是例如1～50个氨基酸残基、或者1～30个氨基酸残基、或者1～10个氨基酸残基、或者1～5个氨基酸残基。另外，作为添加至末端的氨基酸残基的数目，在存在的情况下，每一个末端可以是例如1～50个氨基酸残基、或者1～30个氨基酸残基、或者1～10个氨基酸残基、或者1～5个氨基酸残基。这样的追加的氨基酸残基可形成用于向细胞外分泌等的信号序列。作为信号序列的例子，可举出大肠杆菌的OmpA信号序列等。

或者，各酶可以是具有已知的具有该酶活性的氨基酸序列(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列)自身的蛋白质；或具有与已知的具有该酶活性的氨基酸序列(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列)具有80％以上、或者85％以上、或者90％以上、或者95％以上的序列同一性的氨基酸序列、并且具有所期望的酶活性(上述的酶活性)的蛋白质。此处，序列同一性可使用例如BLAST(注册商标，National Library ofMedicine)程序基于默认参数进行评价。

例如，吡哆醇氧化酶可以是例如具有序列号1的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号1的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆醇氧化酶也可以是具有序列号1的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号1的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号1的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有作为吡哆醇氧化酶的活性。吡哆醇氧化酶活性例如可通过下述方法测定：在氧存在下向作为底物的吡哆醇的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法对生成的吡哆醛进行定量；或者，使生成的吡哆醛与三羟基甲基氨基甲烷这样的胺之间形成席夫碱，通过测定415nm等处的吸光度等，对该席夫碱进行定量。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号2及序列号18～序列号24中任一者的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号2的氨基酸序列、序列号18的氨基酸序列、序列号19的氨基酸序列、序列号20的氨基酸序列、序列号21的氨基酸序列、序列号22的氨基酸序列、序列号23的氨基酸序列、及序列号24的氨基酸序列中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。该蛋白质也应具有作为吡哆胺合成酶的活性。这种情况下，从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及L-丙氨酸的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

或者，吡哆胺合成酶也可以是包含下述的部分氨基酸序列(c)、部分氨基酸序列(d)、部分氨基酸序列(e)、部分氨基酸序列(f)、部分氨基酸序列(g)及部分氨基酸序列(h)中的至少一者、且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的吡哆胺合成酶。这种情况下，从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及L-丙氨酸的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

(c)X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃(序列号39)

(X₈表示L、M、I或V，

X₉表示H或Q，

X₁₀表示G、C或A，

X₁₁表示E或D，

X₁₂表示P或A，

X₁₃表示V、I、L或A)

(d)X₁₄X₁₅TPSGTX₁₆X₁₇(序列号40)

(X₁₄表示H或S，

X₁₅表示D或E，

X₁₆表示I、V或L，

X₁₇表示N或T)

(e)X₁₈DX₁₉VSX₂₀X₂₁(序列号41)

(X₁₈表示V、I或A，

X₁₉表示A、T或S，

X₂₀表示S、A或G，

X₂₁表示F、W或V)

(f)X₂₂X₂₃X₂₄KCX₂₅GX₂₆X₂₇P(序列号42)

(X₂₂表示G或S，

X₂₃表示P、S或A，

X₂₄表示N、G、S、A或Q，

X₂₅表示L或M，

X₂₆表示A、S、C或G，

X₂₇表示P、T、S或A)

(g)X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁SX₃₂GX₃₃X₃₄(序列号43)

(X₂₈表示G或D，

X₂₉表示V或I，

X₃₀表示V、T、A、S、M、I或L，

X₃₁表示F、M、L、I或V，

X₃₂表示S、G、A、T、I、L或H，

X₃₃表示R、M或Q，

X₃₄表示G、R、A、D、H或K)

(h)X₃₅X₃₆RX₃₇X₃₈HMGX₃₉X₄₀A(序列号44)

(X₃₅表示L或V，

X₃₆表示T、I、V或L，

X₃₇表示I、V或L，

X₃₈表示G或S，

X₃₉表示P、A或R，

X₄₀表示T、V或S)

图4-1及图4-2中示出了序列号2及序列号18～序列号24的序列的比对。图4-1及图4-2中，MlPPAT表示百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，MsPPAT表示中慢生根瘤菌属菌株YR577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，PsPPAT表示氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，BlPPAT表示岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，SsPPAT表示抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，RsPPAT表示根瘤菌属菌株AC44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，EtPPAT表示托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，HgPPAT表示人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶。部分氨基酸序列(c)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第65位～第70位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(d)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第144位～第152位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(e)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第170位～第176位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(f)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第194位～第203位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(g)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第329位～第337位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(h)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第343位～第353位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(c)优选存在于蛋白质的自N末端起第55位～第80位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第56位～第75位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(d)优选存在于蛋白质的自N末端起第134位～第162位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第139位～第157位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(e)优选存在于蛋白质的自N末端起第160位～第186位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第165位～第181位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(f)优选存在于蛋白质的自N末端起第184位～第213位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第189位～第208位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(g)优选存在于蛋白质的自N末端起第319位～第347位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第324位～第342位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(h)优选存在于蛋白质的自N末端起第333位～第363位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第338位～第358位的氨基酸残基的区域内。本公开文本中，序列彼此的比对可使用例如BLAST(注册商标，National Libraryof Medicine)程序基于默认参数进行。

本公开文本中，所谓酶B的氨基酸序列中的“与酶A的自N末端起第X位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”，是指将前述酶A的氨基酸序列与酶B的氨基酸序列进行比对时，与酶A的氨基酸序列的自N末端起第X位的氨基酸残基对应的、酶B的氨基酸序列上的氨基酸残基。

由图4-1及图4-2可知，部分氨基酸序列(c)、部分氨基酸序列(d)、部分氨基酸序列(e)、部分氨基酸序列(f)、部分氨基酸序列(g)及部分氨基酸序列(h)是在一组吡哆胺-丙酮酸转氨酶之间高度保守的区域。因此认为，包含部分氨基酸序列(c)～部分氨基酸序列(h)中的至少一者的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的变异作为本公开文本中的吡哆胺合成酶发挥功能的可能性高。另外，认为与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第197位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基对于与吡哆醛的结合是重要的，与自N末端起第68位的谷氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基对于催化活性是重要的，与自N末端起第171位的天冬氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基及与自N末端起第146位的苏氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基辅助与吡哆醛的结合，与自N末端起第336位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基及与自N末端起第345位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基对于氨基酸识别是重要的(Journal of Biological Chemistry，2008，vol.283，No.2pp1120-1127)，是在吡哆醇合成酶的功能上重要的残基。认为只要保留了这些残基，则作为本公开文本中的吡哆醇合成酶发挥功能的可能性高。但是，与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第68位的谷氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基除了谷氨酸以外也可以是天冬氨酸。另外，与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第336位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基除了精氨酸以外也可以是甲硫氨酸或谷氨酰胺。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第68位的谷氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(c-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(c-1)代替部分氨基酸序列(c)。

(c-1)X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉(序列号45)

X₁表示V、L、I或M，

X₂表示I、L或V，

X₃表示L、M、I或V，

X₄表示H或Q，

X₅表示G、C或A，

X₆表示E或D，

X₇表示P或A，

X₈表示V、I、A或L，

X₉表示L、M、P或V，

X₁₀表示G或A，

X₁₁表示L或I，

X₁₂表示E或Q，

X₁₃表示A或G，

X₁₄表示A或V，

X₁₅表示A或L，

X₁₆表示A、L、H或Y，

X₁₇表示S、G或A，

X₁₈表示L、F、V或A，

X₁₉表示I、F、V或L。

部分氨基酸序列(c-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第63位～第81位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(c-1)优选存在于蛋白质的自N末端起第53位～第91位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第58位～第86位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第146位的苏氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(d-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(d-1)代替部分氨基酸序列(d)。

(d-1)X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈TPSGTX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆(序列号46)

X₁表示V、I、L或M，

X₂表示V或I，

X₃表示S、A、V、C或F，

X₄表示V、I、A、L或T，

X₅表示C或V，

X₆表示H、N或A，

X₇表示H或S，

X₈表示D或E，

X₉表示I、V或L，

X₁₀表示N或T，

X₁₁表示P或D，

X₁₂表示I、V、L或A，

X₁₃表示D、N、E、A、G、Q、V、R或P，

X₁₄表示A、E、Q或D，

X₁₅表示I或L，

X₁₆表示G或A。

部分氨基酸序列(d-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第138位～第158位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(d-1)优选存在于蛋白质的自N末端起第128位～第168位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第133位～第163位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第171位的天冬氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(e-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(e-1)代替部分氨基酸序列(e)。

(e-1)X₁X₂X₃X₄X₅X₆DX₇VSX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂(序列号47)

X₁表示G、D或A，

X₂表示A、G、K、T、Q、R或E，

X₃表示Y、N、L或F，

X₄表示L、F、M或V，

X₅表示I、L或Y，

X₆表示V、A或I，

X₇表示A、S或T，

X₈表示S、A或G，

X₉表示F、W或V，

X₁₀表示G、A或L，

X₁₁表示G或S，

X₁₂表示M、V或L。

部分氨基酸序列(e-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第165位～第179位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(e-1)优选存在于蛋白质的自N末端起第155位～第189位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第160位～第184位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第197位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(f-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(f-1)代替部分氨基酸序列(f)。

(f-1)X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉KCX₁₀GX₁₁X₁₂PX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉S(序列号48)

X₁表示A、S、V或I，

X₂表示D、G或A，

X₃表示I、L、F、V或M，

X₄表示Y、F、L或C，

X₅表示V或I，

X₆表示T或A，

X₇表示G或S，

X₈表示P、S或A，

X₉表示N、G、S、Q或A，

X₁₀表示L或M，

X₁₁表示A、S、C或G，

X₁₂表示P、T、S或A，

X₁₃表示G、A或S，

X₁₄表示L或V，

X₁₅表示T、S或A，

X₁₆表示M、I、L、V或F，

X₁₇表示M、L、V、A或I，

X₁₈表示G、A、H或S，

X₁₉表示V、I或A。

部分氨基酸序列(f-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第188位～第211位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(f-1)优选存在于蛋白质的自N末端起第178位～第221位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第183位～第216位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第336位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(g-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(g-1)代替部分氨基酸序列(g)。

(g-1)X₁X₂X₃X₄X₅SX₆GX₇X₈(序列号49)

X₁表示Y、F、H或S，

X₂表示G或D，

X₃表示V或I，

X₄表示V、T、A、S、M、I或L，

X₅表示F、M、L、I或V，

X₆表示S、G、A、T、I、L或H，

X₇表示R、M或Q，

X₈表示G、R、A、D、H或K。

部分氨基酸序列(g-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第328位～第337位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(g-1)优选存在于蛋白质的自N末端起第318位～第347位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第323位～第342位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第345位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(h-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(h-1)代替部分氨基酸序列(h)。

(h-1)X₁X₂X₃X₄X₅RX₆X₇HMGX₈X₉AX₁₀X₁₁(序列号50)

X₁表示L、Q、K、A、F、Y或W，

X₂表示G、N、H或D，

X₃表示K、R或N，

X₄表示L或V，

X₅表示T、I、V或L，

X₆表示I、V或L，

X₇表示G或S，

X₈表示P、A或R，

X₉表示T、V或S，

X₁₀表示Q、R、E、K、H、Y或G，

X₁₁表示P或G。

部分氨基酸序列(h-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自N末端起第340位～第355位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(h-1)优选存在于蛋白质的自N末端起第330位～第365位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自N末端起第335位～第360位的氨基酸残基的区域内。

另外，吡哆胺合成酶可以是例如具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号2的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号2的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号2的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有作为吡哆胺合成酶的活性(从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，本公开文本中也称为吡哆胺合成酶活性)。从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性(吡哆胺合成酶活性)例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及需要的氨基酸(具有与序列号2的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质的情况下为例如L-丙氨酸)的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

或者，吡哆胺合成酶可以是例如具有序列号4的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号4的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号4的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号4的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号4的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有作为吡哆胺合成酶的活性(从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，本公开文本中也称为吡哆胺合成酶活性)。从吡哆醛合成吡哆胺的酶(吡哆胺合成酶活性)例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及需要的氨基酸(具有与序列号4的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质的情况下为例如L-谷氨酸或L-天冬氨酸或者它们的盐)的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

另外，过氧化氢分解酶可以是例如具有序列号3的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号3的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，过氧化氢分解酶也可以是具有序列号3的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号3的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号3的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有作为过氧化氢分解酶的活性。过氧化氢分解酶活性例如可通过下述方法测定：向作为底物的过氧化氢的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，以240nm处的吸光度的减少等作为指标，对过氧化氢量的减少进行定量。

<编码吡哆醇氧化酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码过氧化氢分解酶的基因>

编码吡哆醇氧化酶的基因可以是编码上述的吡哆醇氧化酶的任意的基因。编码吡哆胺合成酶的基因可以是编码上述的吡哆胺合成酶的任意的基因。编码过氧化氢分解酶的基因可以是编码上述的过氧化氢分解酶的任意的基因。这些基因所编码的酶不限于已知的具有该酶活性的氨基酸序列(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列)，也可以是具有与前述已知的氨基酸序列不同的、经修饰的氨基酸序列的酶。

这样的基因可以是作为具有各酶的微生物而在上文中示例的微生物(成为来源的微生物)所天然具有的基因等已知的基因，也可以是对核苷酸序列进行了修饰而成的基因，以使其编码下述修饰氨基酸序列，所述修饰氨基酸序列是在能得到所期望的酶活性的范围内如上述那样对该酶的已知的氨基酸序列进行修饰而得到的。作为这样的修饰氨基酸序列的例子，可举出上述那样的与序列号1～4的氨基酸序列中的任一者类似的氨基酸序列。另外，可在密码子的简并的范围内使编码特定的氨基酸序列的基因的核苷酸序列变化。这种情况下，从基因的表达效率的方面考虑，优选使用在成为重组微生物的宿主的微生物中使用频率高的密码子。

需要说明的是，基因的核苷酸序列也可根据应编码的氨基酸序列、基于密码子表进行设计。设计的核苷酸序列可通过利用基因重组技术修饰已知的核苷酸序列来得到，也可通过化学合成核苷酸序列来得到。

作为修饰核苷酸序列的方法，可举出例如位点特异性突变法(Kramer，W.andfrita，H.J.，Methods in Enzymology，vol.154，P.350(1987))、重组PCR法(PCRTechnology，Stockton Press(1989)、化学合成特定部分的DNA的方法、对基因进行羟基胺处理的方法、对保有基因的菌株进行紫外线照射处理、或用亚硝基胍、亚硝酸等化学药剂进行处理的方法、使用市售的突变导入试剂盒的方法等。

例如，前述编码吡哆醇氧化酶的基因、前述编码吡哆胺合成酶的基因、及前述编码过氧化氢分解酶的基因均可以是未经修饰而具有编码具有该酶活性的多核苷酸的已知的核苷酸序列(例如，上述示例的微生物等生物中天然存在的基因所具有的核苷酸序列)的DNA，也可以是具有对这样的核苷酸序列在编码的酶不丧失其酶活性(上述的酶活性)的范围内加以序列修饰而得到的核苷酸序列的DNA。作为这样的修饰，可举出核苷酸的插入、缺失、取代及向核苷酸序列5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸。在存在核苷酸的插入、缺失及取代中的一者以上的情况下，插入、缺失及取代各自在存在的情况下可以是例如1～90个核苷酸、或者1～60个核苷酸、或者1～30个氨基酸残基、或者1～20个氨基酸残基、或者1～15个核苷酸、或者1～10个核苷酸、或者1～5个核苷酸，核苷酸的插入、缺失及取代的总数可以是例如1～100个核苷酸、或者1～50个核苷酸、或者1～30个核苷酸、或者1～10个核苷酸、或者1～5个核苷酸。核苷酸的插入、缺失可以局部地存在，但优选就核苷酸序列整体而言不发生大规模的移码。另外，作为添加至末端的核苷酸的数目，在存在的情况下，可以是每一个末端为例如1～150个核苷酸、或者1～100个核苷酸、或者1～50个核苷酸、或者1～30个核苷酸、或者1～10个核苷酸、或者1～5个核苷酸。这样的追加的核苷酸可编码用于向细胞外分泌等的信号序列。

或者，编码各酶的基因也可以是具有编码具有该酶活性的多核苷酸的已知的核苷酸序列(例如，生物中天然存在的基因的核苷酸序列)自身的DNA，或具有与前述已知的核苷酸序列具有80％以上、或者85％以上、或者90％以上、或者95％以上的序列同一性的核苷酸序列、且编码具有所期望的酶活性(上述的酶活性)的酶的DNA。此处，序列同一性可使用例如BLAST(注册商标，National Library of Medicine)程序基于默认参数进行评价。

或者，编码各酶的基因也可以是具有编码具有该酶活性的多核苷酸的已知的核苷酸序列(例如生物中天然存在的基因的核苷酸序列)自身的DNA，或具有在严格条件下与具有与前述已知的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的核苷酸序列、且编码具有所期望的酶活性(上述的酶活性)的酶的DNA。另外，严格条件下的杂交可如下所述地实施。

杂交中，以包含与作为基准的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其部分序列的DNA作为探针，与作为对象的DNA进行杂交，在严格条件下洗涤后，确认探针是否与作为对象的核酸明显地杂交。探针的长度可使用例如连续的20个核苷酸以上、优选50个核苷酸以上、进一步优选100个核苷酸以上、进一步优选200个核苷酸以上。也优选使用具有与作为基准的核苷酸序列相同的核苷酸长度、在全长范围内互补的DNA作为探针。所谓用于杂交的条件，可示例本领域技术人员为了检测特定的杂交信号而通常使用的条件。优选表示严格的杂交条件和严格的洗涤条件。可举出例如在含有6×SSC(柠檬酸钠氯化钠，saline sodiumcitrate)(1×SSC的组成：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5％SDS、5×登哈特(Denhardt)及100mg/ml鲱鱼精子DNA的溶液中与探针一同于55℃保温一夜这样的条件等。可示例随后在0.2×SSC中于42℃洗涤过滤器等。作为严格条件，为过滤器的洗涤工序中的0.1×SSC、50℃的条件，作为更严格的条件，可举出相同工序中的0.1×SSC、65℃的条件。

例如，编码吡哆醇氧化酶的基因可以是例如具有序列号5的核苷酸序列(微黄微杆菌的吡哆醇氧化酶基因的核苷酸序列)的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号5的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，且编码具有吡哆醇氧化酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆醇氧化酶的基因可以是例如具有序列号5的核苷酸序列的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列是对序列号5的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆醇氧化酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆醇氧化酶也可以是具有序列号5的核苷酸序列的DNA、或具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与序列号5的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆醇氧化酶活性的蛋白质。

编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号6的核苷酸序列(百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列)或序列号8的核苷酸序列(大肠杆菌的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶基因的核苷酸序列)的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号6或8的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号6或8的核苷酸序列的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列是对序列号6或8的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号6或8的核苷酸序列的DNA、或具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与序列号6或8的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号6及序列号25～序列号31中任一者的核苷酸序列的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号6及序列号25～序列号31中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号6及序列号25～序列号31中任一者的核苷酸序列的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列是对序列号6及序列号25～序列号31中任一者的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号6及序列号25～序列号31中任一者的核苷酸序列的DNA、或具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与序列号6的核苷酸序列、序列号25(编码中慢生根瘤菌属菌株YR577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号26(编码氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号27(编码岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号28(编码抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号29(编码根瘤菌属菌株AC44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号30(编码托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、及序列号31(编码人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

在以大肠杆菌等原核生物作为宿主的重组微生物中进行表达的情况下，也可为了容易表达而优化密码子。例如，可对核苷酸序列进行修饰而使得以高频率使用在成为宿主的原核生物中编码各氨基酸的密码子之中的使用频率最高的密码子作为该氨基酸的密码子。从这样的观点考虑，作为包含编码吡哆胺合成酶的基因的DNA，可使用例如具有序列号10的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号32～序列号38中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的DNA，也可使用具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号10的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号32～序列号38中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的DNA杂交，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。对于序列号10的核苷酸序列而言，自其5’末端起17个核苷酸成为上游区，起始密码子位于第18位核苷酸～第20位核苷酸。因此，也可使用该核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域作为编码吡哆胺合成酶的基因区。同样地，对于序列号32～序列号38的核苷酸序列而言，均是自其5’末端起17个核苷酸成为上游区，起始密码子位于第18位核苷酸～第20位核苷酸。因此，也可使用这些核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域作为编码吡哆胺合成酶的基因区。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号10的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号32～序列号38中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列是对序列号10的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号32～序列号38中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号10的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号32～序列号38中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的DNA、或具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与序列号10的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号32的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码中慢生根瘤菌属菌株YR577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号33的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号34的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号35的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号36的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码根瘤菌属菌株AC44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号37的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、及序列号38的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

编码过氧化氢分解酶的基因可以是例如具有序列号7的核苷酸序列(西尔李斯特菌的过氧化氢酶基因的核苷酸序列)的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号7的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，且编码具有过氧化氢分解酶活性的蛋白质。

或者，编码过氧化氢分解酶的基因可以是例如具有序列号7的核苷酸序列的DNA，也可以是具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列是对序列号7的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有过氧化氢分解酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的N末端或C末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，过氧化氢分解酶也可以是具有序列号7的核苷酸序列的DNA、或具有下述核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与序列号7的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有过氧化氢分解酶活性的蛋白质。

<具有编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因的重组微生物>

在本公开文本涉及的重组微生物内，编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因各自可以是内源于菌体但其表达得到增强的基因，也可以是从菌体外导入至菌体内的基因。另外，在重组微生物内可以存在内源于菌体但其表达得到增强的基因、和从菌体外导入至菌体内的基因这两者。另外，在本公开文本涉及的重组微生物内，除了内源于菌体但其表达得到增强的编码吡哆醇氧化酶的基因、及/或被从菌体外导入至菌体内的编码吡哆醇氧化酶的基因以外，还可存在内源于菌体且未进行表达增强的(例如启动子未经修饰的)编码吡哆醇氧化酶的基因。同样地，除了内源于菌体但其表达得到增强的编码吡哆胺合成酶的基因、及/或从菌体外导入至菌体内的编码吡哆胺合成酶的基因以外，还可存在内源于菌体且未进行表达增强的(例如启动子未经修饰的)编码吡哆胺合成酶的基因。本公开文本中，由于对编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因各自施以内源于菌体的基因的表达增强及从菌体外向菌体内的基因导入中的一者以上，因此，即使在菌体内原本存在未进行表达增强的基因，仍然能得到较之来自该未进行表达增强的原本的基因的表达量而言显著更高的表达量，由此能够达成高的吡哆胺生产效率。

本公开文本涉及的重组微生物还具有编码过氧化氢分解酶的基因时，该编码过氧化氢分解酶的基因可以是内源于菌体的基因，可以是内源于菌体但其表达得到增强的基因，也可以是从菌体外导入至菌体内的基因。但是，若反应速度增大，则过氧化氢的生成量也增大，因此，优选为了增加过氧化氢分解酶的表达量而实施下述中的至少一者：增强内源于菌体的编码过氧化氢分解酶的基因的表达；及从菌体外将编码过氧化氢分解酶的基因导入至菌体内。

换言之，编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因各自可以是内源于宿主微生物的基因组但通过进行启动子的置换等操作而使其表达增强的基因，也可以是使用质粒等载体从菌体外导入至菌体内的基因。除此以外，还可存在内源于重组前的宿主微生物的基因组且未进行表达增强的基因。本公开文本中，将编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因各自从宿主微生物的细胞外导入、或者通过启动子的置换等而使内源于宿主微生物的细胞的该基因的表达增强，由此使该基因的表达升高，赋予由前述2种酶的组合带来的吡哆胺生产能力。此处，对编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因各自进行导入或表达增强时，可以实施从宿主微生物的细胞外的导入、和通过启动子的置换等进行的该基因表达的增强之中的仅一方，也可实施这两方。

本公开文本涉及的重组微生物可具有编码过氧化氢分解酶的基因，也可不具有编码过氧化氢分解酶的基因。本公开文本涉及的重组微生物还具有编码过氧化氢分解酶的基因时，编码过氧化氢分解酶的基因可以是内源于重组前的宿主微生物的基因组的基因，可以是内源于宿主微生物的基因组但通过进行启动子的置换等操作而使其表达增强的基因，也可以是使用质粒等载体从菌体外导入至菌体内的基因。对编码过氧化氢分解酶的基因进行导入或表达增强时，可以实施从宿主微生物的细胞外的导入、和通过启动子的置换等进行的该基因表达的增强之中的仅一方，也可实施这两方。

若不对编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因实施上述那样的基因表达的升高，则无法得到用于高水平生产吡哆胺或其盐的充分的生产能力。因此，在本公开文本涉及的重组微生物中，对编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因这两者各自实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方。需要说明的是，从菌体外导入酶基因并非一定限于用于补充宿主微生物中不存在的酶基因，还可基于使内源于宿主微生物的酶基因的表达也增强的目的而实施。关于宿主微生物中不存在的酶基因，可使用例如KEGG、BRENDA这样的酶数据库容易地进行确认。

在通过用其他启动子置换内源于宿主微生物的基因的启动子来增强该基因的表达的情况下，作为这样的其他启动子(新导入的启动子)，只要能够在宿主微生物中增强基因的表达(与启动子置换前相比能够加以增强)即可，没有特别限定，可以是构成型启动子，也可以是诱导型启动子。启动子的置换可使用常规的基因重组技术进行。需要说明的是，内源于宿主微生物的启动子的序列只要对基于新导入的启动子的表达不造成在实用上成为问题的不良影响，则可部分或完全地残留。

宿主微生物为例如原核生物时，作为可用作新导入的启动子的启动子的例子，可举出来源于大肠杆菌的trp启动子、lac启动子、GAPDH启动子、来源于λ噬菌体的PL启动子及PR启动子、来源于枯草芽孢杆菌的葡糖酸合成酶启动子(gnt)、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)、α-淀粉酶启动子(amy)等。另外，也可利用如tac启动子这样独自进行了修饰或设计而得到的启动子序列。

宿主微生物为例如丝状菌时，作为可用作新导入的启动子的启动子的例子，可举出纤维二糖水解酶(cbh)启动子、内切葡聚糖酶(egl)启动子、木聚糖酶III(xyn3)启动子、U6启动子、α-淀粉酶(amy)启动子等。

宿主微生物为例如酵母时，作为可用作新导入的启动子的启动子的例子，可举出醇脱氢酶(ADH1)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK1)启动子、肽链延伸因子(TEF)启动子、3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)启动子、半乳糖激酶(GAL1)启动子、金属硫蛋白(CUP1)启动子、抑制性酸性磷酸酶(PHO5)启动子、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)启动子等。需要说明的是，上述启动子的序列的来源不限于成为宿主微生物的酵母。也可使用如巨细胞病毒(CMV)启动子等这样的外源的启动子。

从宿主微生物的菌体外导入基因(外源(heterogenous)基因)时，作为其方法，只要能够将基因导入至菌体内(细胞内)、使该基因所编码的酶表达即可，没有特别限定，可举出利用保有酶基因的质粒进行的转化、酶基因向基因组的导入、及它们的组合。在导入基因时，也可将组入了该基因的表达载体导入至菌体内。该表达载体只要组入了前述基因的核苷酸序列即可，没有特别限定，但基于提高转化效率、翻译效率等的观点，更优选为显示如下所示的构成的质粒载体、噬菌体载体。

表达载体只要含有前述基因的核苷酸序列、能将前述宿主微生物转化即可，没有特别限定。根据需要，除了该核苷酸序列以外，也可含有构成其他区域的核苷酸序列(以下也简称为“其他区域”)。作为其他区域，可举出例如通过转化而得到的重组微生物产生所期望的酶所需要的控制区域、自主复制所需要的区域等。

另外，基于容易筛选前述重组微生物这样的观点，可还含有编码能成为筛选标记的筛选基因的核苷酸序列。

作为产生所期望的酶所需要的控制区域，可举出启动子序列(包括控制转录的操纵基因序列)、核糖体结合序列(SD序列)、转录终止序列等。

对于以酵母作为宿主微生物时能够使用的表达载体而言，除了前述基因的核苷酸序列以外，基于前述基因的表达效率的观点，优选还含有启动子序列。作为启动子序列，只要能够在以酵母作为宿主微生物的转化体中表达前述基因即可，可使用任何。作为例子，可举出上文中作为宿主微生物为酵母时能够用作新导入的启动子的启动子的例子而记载的启动子。

另外，前述表达载体可含有分泌信号。由此，在重组微生物产生所期望的酶的情况下，能够将该酶分泌至细胞外。

作为分泌信号，只要能够从成为宿主微生物的酵母分泌所期望的酶即可，没有特别限定。基于分泌效率的观点，优选使用α因子信号序列、蔗糖酶信号序列、酸性磷酸酶信号序列、葡糖淀粉酶信号序列等。

作为具有以上那样的启动子序列、分泌信号的表达载体，具体而言，可举出pRS423、pRS424、YEplac195等。

对于以丝状菌作为宿主微生物时能够使用的表达载体而言，除了前述基因的核苷酸序列以外，基于前述基因的表达效率的观点，优选还含有启动子序列。作为启动子序列，只要能够在以丝状菌作为宿主微生物的转化体中表达前述基因即可，可使用任何。作为例子，可举出上文中作为宿主微生物为丝状菌时能够用作新导入的启动子的启动子的例子而记载的启动子。

对于丝状菌而言合适的表达载体记载于van den Hondel，C.A.M.J.J.等(1991)In：Bennett，J.W.and Lasure，L.L.(eds.)More gene Manipulations in Fungi.AcademicPress，PP.396-428。

另外，也可使用如pUC18、pBR322、pUC100、pSL1180(Pharmacia Inc.制)、pFB6及曲霉(Aspergillus)pRAX、木霉(Trichoderma)pTEX等常用的其他表达载体。

对于以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌等原核生物作为宿主微生物时能够使用的表达载体而言，除了前述基因的核苷酸序列以外，基于前述基因的表达效率的观点，优选还含有启动子序列。另外，除了启动子序列以外，还可含有核糖体结合序列、转录终止序列等。

作为启动子序列的例子，可举出上文中作为宿主微生物为原核生物时能够用作新导入的启动子的启动子的例子而记载的启动子。

作为核糖体结合序列，可举出来源于大肠杆菌或来源于枯草芽孢杆菌的序列，但只要为在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等所期望的宿主微生物内发挥功能的序列即可，没有特别限定。

作为前述核糖体结合序列，可举出例如通过DNA合成来制备与16S核糖体RNA的3’末端区域互补的序列中的、具有4个以上连续核苷酸的共有序列而得到的序列等。

转录终止序列不一定是必需的，可利用ρ因子非依赖性的转录终止序列，例如脂蛋白终止子、trp操纵子终止子等。

这些控制区域在表达载体上的序列顺序没有特别限定，若考虑转录效率，则期望自5’末端侧上游以启动子序列、核糖体结合序列、编码目标酶的基因、转录终止序列的顺序排列。

作为宿主微生物为原核生物时能够使用的表达载体的具体例子，可举出具有能够在大肠杆菌中自主复制的区域的pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3、pSC101、具有能够在枯草芽孢杆菌中自主复制的区域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1、φ105等。

另外，作为能够在2种以上的宿主微生物内自主复制的表达载体的例子，可利用pHV14、TRp7、YEp7及pBS7等作为表达载体。

需要说明的是，从宿主微生物的菌体外导入基因时，该基因可以是具有宿主微生物的基因组中不存在的核苷酸序列的基因，也可以是具有存在于宿主微生物的基因组中的核苷酸序列的基因。即使宿主微生物的基因组中原本存在相同的基因，通过从菌体外导入基因也能得到更强的基因表达，利用增强的酶活性，能够进一步提高吡哆胺或其盐的生产效率。

从菌体外(细胞外)向菌体内(细胞内)导入基因时所需要的基因组DNA的制备、DNA的切割及连接、转化、PCR(链式聚合酶反应，Polymerase Chain Reaction)、作为引物使用的寡核苷酸的设计、合成等的方法可使用本领域技术人员所熟知的通常的方法来实施。这些方法记载于Sambrook，J.等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等。可举出例如使用感受态细胞的方法、使用电穿孔的方法。

作为宿主微生物，只要是在存在编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因时能够使它们表达的微生物即可，没有特别限定。作为宿主微生物的例子，可举出酵母、丝状菌、及原核生物。作为酵母的例子，可举出酿酒酵母等酵母(Saccharomyces)属的酵母、粟酒裂殖酵母等裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属的酵母、汉逊酵母(Hansenula)属的酵母、及毕赤酵母(Pichia)属的酵母。作为丝状菌的例子，可举出里氏木霉或绿色木霉等木霉(Trichoderma)属丝状菌、黑曲霉或米曲霉等曲霉(Aspergillus)属丝状菌、特异腐质霉(Humicola insolens)等腐质霉(Humicola)属丝状菌、及解纤维枝顶孢霉或梭链枝顶孢霉等枝顶孢霉(Acremonium)属的丝状菌。另外，作为原核生物的例子，可举出大肠杆菌等埃希氏菌(Escherichia)属细菌、希瓦氏菌属菌株AC10等希瓦氏菌(Schewanella)属细菌、百脉根中慢生根瘤菌等中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)属细菌、苜蓿根瘤菌等根瘤菌(Rhizobium)属细菌、枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌(Bacillus)属枯草芽孢杆菌等枯草芽孢杆菌、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)等链霉菌(Streptomyces)属放线菌等放线菌。

通过向这些宿主微生物中导入(转化)例如含有所期望的基因的表达载体，从而能够将所期望的基因导入至宿主微生物中。并且，被导入的基因利用例如表达载体中含有的启动子的活性而能够在得到的重组微生物中高水平表达。

作为将表达载体等重组DNA移入宿主微生物的细胞的方法，例如，宿主微生物为大肠杆菌时，可使用基于钙处理的感受态细胞法、电穿孔法等。通过培养如此得到的重组微生物，能够以高表达量稳定地生产导入的基因所编码的酶。

另外，编码这些酶的DNA可从重组微生物中取出，也可使其移入其他微生物。另外，也可容易地实施下述操作：使用该DNA作为模板，利用PCR来扩增编码酶的DNA片段，用限制性内切酶等进行处理后，使其与其他载体DNA片段结合，重新导入宿主微生物中。

<吡哆胺或其盐的制造方法>

一实施方式中，吡哆胺或其盐的制造方法包括使本公开文本涉及的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐在氧存在下接触从而生产吡哆胺或其盐的工序。

作为吡哆醇的盐的例子，可举出吡哆醇与酸形成的盐。作为酸的例子，可举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等。吡哆醇的盐为例如吡哆醇盐酸盐。

作为吡哆胺的盐的例子，可举出吡哆胺与酸形成的盐。作为酸的例子，可举出盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、磷酸等。从作为医药使用的观点考虑，吡哆胺的盐优选为向医药用途中的应用进展最大的吡哆胺二盐酸盐。

需要说明的是，将这样的使用重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物制造吡哆胺或其盐的方法也简称为“使用重组微生物的吡哆胺或其盐的制造方法”。

所谓重组微生物的培养物，是指培养重组微生物而得到的、包含菌体和周围的培养基等的产物。酶被分泌至细胞外时，通过使用这样的培养物，从而底物与酶更容易接触，能够提高生产吡哆胺或其盐的效率。但是，也可不使用培养物，例如，也可将预先制备的经干燥或冷冻的重组微生物的细胞直接添加至反应体系。

培养重组微生物时，作为培养基，只要是含有适量的碳源、氮源、无机物及其他营养素的培养基，则可使用合成培养基或天然培养基中的任何。培养可在含有前述培养成分的液体培养基中使用振荡培养、通气搅拌培养、连续培养或分批补料式培养(fed-batchculture)等通常的培养方法进行。

更具体而言，前述重组微生物的培养的条件与原本的宿主微生物的培养条件同样，可使用已知的条件。

作为用于培养基的成分，可使用已知的成分。例如，可适当组合使用肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨、NZ胺及马铃薯等有机营养源、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉及有机酸等碳源、硫酸铵、尿素及氯化铵等氮源、磷酸盐、镁、钾及铁等无机营养源、维生素类。

需要说明的是，在利用前述含有筛选标记的表达载体转化得到的重组微生物的培养中，例如，在前述筛选标记具有耐药性时，使用含有与其对应的药剂的培养基，在前述筛选标记为营养缺陷性时，使用不含有与其对应的营养素的培养基。

培养条件根据前述重组微生物、培养基、培养方法的种类适当选择即可，只要是重组微生物生长、能够生产吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶的条件即可，没有特别限制。

培养基的pH在例如4～8的范围内选择即可，也可以是5～8的范围。

培养温度为例如20℃～45℃，优选为24℃～37℃。对于培养而言，根据微生物的种类，可进行好氧培养，也可进行厌氧培养。

培养时间为例如1天～7天。培养时间可以以目标酶的产生量成为最大的方式进行设定。

另外，所谓前述重组微生物的处理物，是指在不丧失重组微生物所产生的吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶的活性的范围内对重组微生物进行任意的处理而得到的产物。作为这样的处理，可举出例如包括选自由加热处理、冷却处理、机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、自体消化、表面活性剂处理及酶处理(例如细胞溶解处理)组成的组中的1种以上的处理等。即使由于这样的处理而导致重组微生物自身死亡，只要该微生物所产生的酶的活性残留，则可用于反应。

所谓前述培养物的处理物，是指在不丧失重组微生物所产生的吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶的活性的范围内对重组微生物的培养物进行任意的处理而得到的产物。作为这样的处理，可举出包括选自由加热处理、冷却处理、细胞的机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、细胞的自体消化、表面活性剂处理、酶处理(例如细胞破坏处理)、细胞分离处理、纯化处理及提取处理组成的组中的1种以上的处理。例如，可将重组微生物的细胞从培养基等中分离，将分离后的细胞添加至反应体系。这样的分离可使用过滤或离心分离等手段。或者，可实施用于将吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶、以及过氧化氢分解酶(存在时)从夹杂物中分离的纯化处理，将包含通过该纯化处理得到的酶的溶液添加至反应体系。或者，可将使用甲醇、乙腈等有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂对培养物进行提取而得到的提取物添加至反应体系。这样的纯化物或提取物可不包含重组微生物的细胞。即使该微生物的细胞不存在，只要酶的活性残留，则可用于反应。

上述那样的细胞的破碎或者溶解处理可通过按照溶菌酶处理、冻融、超声波破碎等已知的方法破坏重组微生物的细胞膜来进行。

本公开文本涉及的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐的接触优选在以下这样的条件下进行。

接触优选在含有作为底物的吡哆醇或其盐的溶液中进行。对于溶液的pH而言，只要可维持吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶的酶活性则没有特别限定，优选为6.0～9.0，更优选为7.0～8.5。只要可维持吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶的酶活性，则溶液的温度也没有特别限定，优选为20～70℃，更优选为25℃～50℃。

作为溶液的介质，可使用水或水性介质、有机溶剂、或者水或水性介质与有机溶剂的混合液。作为水性介质，可使用例如磷酸缓冲液、HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N-乙磺酸)缓冲液、Tris[三(羟基甲基)氨基甲烷]盐酸缓冲液等缓冲液。作为有机溶剂，只要是不抑制反应的有机溶剂则可以是任何，可使用例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。

重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐的接触在氧存在下进行。这是因为，在吡哆醇氧化酶将吡哆醇或其盐氧化时会消耗氧。作为反应体系中的氧浓度，例如，可以使含有吡哆醇或其盐、和前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液向大气开放、即与大气接触而进行反应；或者，使其与含有以体积比计为0.1～20％、0.5～10％、或1～5％的氧的气体接触而进行反应。作为这样的溶液中的溶解氧量，可以是0.1mg～13mg氧/L、0.5mg～10mg氧/L、或者1mg～8mg氧/L。

需要说明的是，前述重组微生物具有编码能生成氧的过氧化氢分解酶的基因时，即使降低氧浓度、或者在减少或阻挡氧的供给的条件下，仍然能够进行反应。例如，也能在将反应体系密封的条件、对反应体系进行了氮气吹扫(氮气置换)的条件下进行反应。

本公开文本涉及的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐的接触优选在振荡或搅拌下进行。例如，这样的接触可在溶液中进行。例如，可向含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液中以底物溶液的形态或者固体的形态添加吡哆醇或其盐。另外，可向含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液中进一步添加由吡哆胺合成酶消耗的氨基酸。前述氨基酸可以以被包含在含有吡哆醇或其盐的底物溶液中的状态，与吡哆醇或其盐一同被添加至含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液。另外，前述氨基酸可以以被包含在与含有吡哆醇或其盐的底物溶液不同的底物溶液中的状态、或者以固体的形态被添加至含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液。

在反应开始时或反应中途，为了将反应液的pH维持为合适的范围，也可添加酸、碱。作为可添加至反应溶液的碱的例子，除了氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物以外，还可举出氢氧化铵、氢氧化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、焦磷酸钾、氨等溶解于水而使液性为碱性的物质。作为可添加至反应溶液的酸的例子，可举出盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、磷酸等。

上述接触可在例如空气气氛下进行，也可在部分脱氧气氛下进行。脱氧气氛可通过利用非活性气体的置换、减压、沸腾、将它们组合来达成。至少优选利用非活性气体的置换、即使用非活性气体气氛。作为上述非活性气体，可举出例如氮气、氦气、氩气、二氧化碳等，优选为氮气。但是，由于在吡哆醇氧化酶将吡哆醇氧化时会消耗氧，因此优选为不除去氧的气氛。

优选实施方式中，所使用的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物包含前述吡哆醇氧化酶及前述吡哆胺合成酶。因此，通过前述接触，共存于反应溶液中的前述吡哆醇氧化酶及前述吡哆胺合成酶协同作用，以高生产效率生产吡哆胺或其盐。需要说明的是，前述重组微生物的处理物或前述培养物的处理物并非必须包含存活状态的前述重组微生物，但从能够基于代谢而持续地供给参与反应的物质的观点考虑，优选包含存活状态的前述重组微生物。

对于重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的添加时期而言，可在反应开始时一并添加，也可在反应中分批地或连续地添加。同样地，成为原料的吡哆胺可在反应开始时一并添加，也可在反应中分批地或连续地添加。

反应溶液可包含利用吡哆胺合成酶生成吡哆胺或其盐时所消耗的氨基酸。该氨基酸可在反应开始时一并添加，也可在反应中分批地或连续地添加。例如，使用吡哆胺-丙酮酸转氨酶作为吡哆胺合成酶时，反应溶液可包含L-丙氨酸及D-丙氨酸中的一者以上。另外，使用吡哆胺-草酰乙酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶作为吡哆胺合成酶时，反应溶液可包含L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、及D-谷氨酸中的至少一者。需要说明的是，氨基酸也可能根据周围的环境而以盐的形式存在，本说明书中，也将这些包括在内记载为氨基酸。例如，L-谷氨酸的记载不仅包括未形成盐的L-谷氨酸，也包括形成了盐的L-谷氨酸(例如L-谷氨酸钠一水合物)。对于形成了盐的情况下的反离子而言，作为阳离子，可举出钠离子、钾离子等；作为阴离子，可举出氯化物离子、乙酸根离子、硝酸根离子等。

吡哆醇或其盐在反应溶液中的浓度可以是例如0.1mM～500mM、或者0.4mM～200mM、或者0.5mM～100mM、或者0.8mM～50mM。吡哆醇或其盐的浓度升高时，存在吡哆醇氧化酶的酶活性被抑制的趋势。因此，优选吡哆醇或其盐在反应溶液中的浓度不过度升高。即，可对吡哆醇或其盐在反应溶液中的浓度进行控制以使其维持为例如上述范围内的浓度。例如，本公开文本涉及的吡哆胺或其盐的制造方法可包括以下的(A)及(B)中的任一者或两者：

(A)向含有前述重组微生物或前述重组微生物的培养物、或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液中连续添加或分多次添加吡哆醇或其盐；

(B)在含有前述重组微生物或前述重组微生物的培养物、或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液中，进行控制以使得前述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸的摩尔浓度相对于吡哆醇或其盐的摩尔浓度而言成为1倍以上。

作为前述氨基酸，可举出L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸等。

为了进行如上所述的控制，例如，可将吡哆醇或其盐分多次添加至反应溶液中，而非一并添加全部量。吡哆醇的浓度由于反应进行而降低，因此，通过隔开时间间隔而添加吡哆醇或其盐，能够避免吡哆醇或其盐的浓度变得过高。作为这样的逐次添加，可举出例如隔开0.5小时～10小时的范围内的时间间隔、添加2次以上、优选3次以上吡哆醇或其盐。另外，也可向反应溶液中连续地添加吡哆醇或其盐。在连续性的添加的情况下，也可通过调节其添加速度来避免吡哆醇或其盐的浓度变得过高。为了进行该调节，可以在特定的时机对反应溶液中的吡哆醇或其盐的浓度进行测定，也可以连续地进行监控。

另外，前述氨基酸(在利用吡哆胺合成酶生成吡哆胺或其盐时所消耗的氨基酸)的浓度可以是例如0.1mM～2000mM、或者0.2mM～1000mM、或者0.4mM～500mM、或者0.5mM～400mM、或者1mM～300mM、或者2mM～250mM。添加氨基酸的方式没有特别限定，可以一并添加全部量，可以分多次添加，也可以连续地添加。作为这样的逐次添加，可举出例如隔开0.5小时～10小时的范围内的时间间隔、添加2次以上、优选3次以上氨基酸。对于添加氨基酸的时机而言，可以与在分多次添加吡哆醇或其盐的情况下添加吡哆醇或其盐的时机为同时，也可以与其分开地添加。

前述氨基酸(在利用吡哆胺合成酶生成吡哆胺或其盐时所消耗的氨基酸)的浓度(摩尔浓度)优选维持为高于吡哆醇或其盐的浓度(摩尔浓度)。通过将前述氨基酸的浓度维持为高于吡哆醇或其盐的浓度，能够使反应的平衡朝向有利于吡哆胺或其盐的方向移动，从而能够进一步提高吡哆胺或其盐的生产效率。较之吡哆醇或其盐的摩尔浓度而言，前述氨基酸的摩尔浓度优选为1.0倍以上，更优选为1.5倍以上，进一步优选为2.0倍以上，进一步优选为5.0倍以上，也可以为10.0倍以上。

作为使前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐接触的方法，可举出下述方法：将前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物加入含有吡哆醇或其盐的溶液，一边搅拌一边使反应进行的方法；将前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物加入含有吡哆醇或其盐的溶液，一边振荡一边使反应进行的方法；将前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐在溶液中充分地混合后，静置使反应进行的方法等。基于反应效率的观点，可优选举出将前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物加入含有吡哆醇或其盐的溶液，一边搅拌一边使反应进行的方法。

作为可用于反应的反应容器，没有特别限定。优选为下述反应容器，所述反应容器能够以将添加的前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与含有吡哆醇或其盐的溶液充分混合的方式进行搅拌，并且，具有调节温度的功能以保持吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶处于最适宜温度范围内。

对于前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐的接触时间(反应时间)而言，只要可维持吡哆醇氧化酶及吡哆胺合成酶的酶活性则没有特别限定，例如为30分钟～100小时，或者也可以为2小时～50小时。另外，反应可以以批量式进行，可以以半批量式(在反应中途分多次添加底物及前述微生物、前述培养物或前述处理物中的一方或两方)进行，也可以以连续式进行。在半批量式、连续式的情况下，实施供给新的原料及前述重组微生物、前述培养物或前述处理物中的一方或两方等操作，因此，反应时间的上限没有特别限定。

上述的方法中，通过以吡哆醇或其盐作为原料并使用本公开文本涉及的重组微生物或前述培养物、或者前述重组微生物或前述培养物的处理物，能够廉价地以高生产效率制造吡哆胺或其盐，而无需像化学合成方法的情况那样经过烦杂的步骤。通过上述的方法得到的吡哆胺或其盐可用于制造例如利用其生理活性的制品。例如，可用于糖尿病、动脉粥样硬化症、慢性肾功能衰竭、阿尔茨海默型认知症等由于AGE的蓄积导致的疾病、精神分裂症的预防、治疗、健康食品、化妆品这样的用途。

需要说明的是，本公开文本中，用语“工序”不仅包括独立的工序，即使在无法与其他工序明确区分的情况下，只要能达成该工序所期望的目的，则也包括于本用语中。另外，本说明书中使用“～”示出的数值范围表示包含“～”的前后所记载的数值(分别作为最小值及最大值)在内的范围。

本公开文本中，提及组合物中的各成分的量的情况下，组合物中存在多种属于各成分的物质时，只要没有特别的说明，则表示存在于组合物中的该多种物质的总量。

实施例

通过以下的实施例进一步说明实施方式，但本公开文本不受以下实施例的任何限定。另外，只要没有特别的说明，则表示实施例的组合物中的所含成分量的“％”是以质量为基准。

<分析条件>

吡哆醇盐酸盐、吡哆醛盐酸盐、吡哆胺二盐酸盐通过高效液相色谱法进行定量。它们的分析条件如下。

色谱柱：Shodex(注册商标)Asahipak ODP-506E(昭和电工株式会社)

保护柱：Shodex(注册商标)Asahipak ODP-50G 6A(昭和电工株式会社)

柱温：30℃

泵流速：1.0ml/min

洗脱液：50mM磷酸缓冲液(pH2.0)

检测：UV254nm

比较例1 pno表达株的制备

委托GenScript公司合成将来源于微黄微杆菌的吡哆醇-4-氧化酶基因按大肠杆菌进行密码子优化而得到的基因，得到具有序列号9的核苷酸序列的合成DNA。使用该合成DNA作为模板，以具有序列号12的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增包含目的基因的DNA片段。用BamHI及SalI处理该扩增后的DNA片段，将得到的DNA片段与pUC18(Takara Bio Inc.制)的利用BamHI及SalI得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号9的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-pno。此处，pno为吡哆醇-4-氧化酶的简称。

实施例1 ppat-pno表达株的制备

委托GenScript公司合成将来源于百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号10的核苷酸序列的合成DNA。使用该合成DNA作为模板，以具有序列号14的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号15的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增包含目的基因的DNA片段。用EcoRI及BamHI处理该扩增后的DNA片段，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理比较例1中制备的pUC18-pno而得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号10所示的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-ppat-pno。此处，ppat为吡哆胺-丙酮酸转氨酶的简称。

实施例2 ppat-pno-kat表达株的制备

委托GenScript公司合成将来源于西尔李斯特菌的过氧化氢酶基因的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号11的核苷酸序列的合成DNA。用SalI及HindIII处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用SalI及HindIII处理实施例1中制备的pUC18-ppat-pno而得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。此处，kat为过氧化氢酶的简称。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号11所示的碱基序列。将得到的质粒命名为pUC18-ppat-pno-kat。

实施例3 aspC-pno表达株的制备

使用大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板，以具有序列号16的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号17的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增包含来源于大肠杆菌W3110的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶基因的DNA片段。用EcoRI及BamHI处理该扩增后的DNA片段，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理实施例1中制备的pUC18-pno而得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号8所示的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-aspC-pno。此处，aspC为吡哆胺-草酰乙酸转氨酶的简称。

实施例4 aspC-pno-kat表达株的制备

委托GenScript公司合成将来源于西尔李斯特菌的过氧化氢酶基因的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号11的核苷酸序列的合成DNA。用SalI及HindIII处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用SalI及HindIII处理实施例3中制备的pUC18-aspC-pno而得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。此处，kat为过氧化氢酶的简称。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号11所示的碱基序列。将得到的质粒命名为aspC-pno-kat。

试验1以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造

将使用pUC18、比较例1、及实施例1中制备的质粒各自转化而得到的DH5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于800μl水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及L-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(200mM)及L-丙氨酸(800mM)的底物液。使用氢氧化钠将底物液的pH调节为pH8.0。在2.0ml管中将100μl底物液与300μl菌体悬浮液混合，打开管盖，于37℃以1,000rpm振荡6小时。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析。将作为其结果而得到的反应收率示于表1。需要说明的是，表1所示的所谓收率，表示得到的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量相对于底物液中的吡哆醇盐酸盐的摩尔量之比。

[表1]

表1

如表1所示，编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因这两者被从细胞外导入时，以高生产效率生产了吡哆胺二盐酸盐。另外，推测在含有比较例1中制备的质粒的转化体中，发生了吡哆醛与氨基供体的自发性反应。如上所述，该自发性反应的情况下生成副产物，因此无法得到高的吡哆胺生产效率。表1的结果中，使用了含有比较例1中制备的质粒的转化体的情况下也未得到高的吡哆胺生产效率。

试验2以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造

将使用pUC18及实施例3中制备的质粒各自转化而得到的DH5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于800μl水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及L-谷氨酸钠一水合物，配制含有吡哆醇盐酸盐(200mM)及L-谷氨酸钠一水合物(800mM)的底物液。使用氢氧化钠将底物液的pH调节为pH8.0。在2.0ml管中将300μl底物液与900μl菌体悬浮液混合，打开管盖，于37℃以1,000rpm振荡24小时。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析。将作为其结果而得到的反应收率示于表2。需要说明的是，表2所示的所谓收率，表示得到的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量相对于底物液中的吡哆醇盐酸盐的摩尔量之比。

表2

[表2]

如表2所示，编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因被从细胞外导入时，以高生产效率生产了吡哆胺二盐酸盐。

试验3以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(氧浓度的研究)

将使用实施例1中制备的质粒(pUC18-ppat-pno)转化而得到的DH5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于800μl水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及L-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(200mM)及L-丙氨酸(800mM)的底物液。使用氢氧化钠将底物液的pH调节为pH8.0。在2.0ml管中将100μl底物液与300μl菌体悬浮液混合。反应如下进行：在打开管盖的条件、闭合管盖的条件、及进行氮气吹扫后闭合盖的条件下，于37℃以1,000rpm振荡24小时。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析。将作为其结果而得到的反应收率示于表3。需要说明的是，表3所示的所谓收率，表示得到的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量相对于底物液中的吡哆醇盐酸盐的摩尔量之比。

表3

[表3]

如表3所示，使用从细胞外导入编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因而得到的重组微生物生产吡哆胺或其盐的情况下，较之限制了氧的供给的条件下而言，未限制氧的供给的条件下吡哆胺或其盐的收率更高。

试验4以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(由过氧化氢分解酶带来的效果的研究)

将使用实施例1中制备的质粒(pUC18-ppat-pno)及实施例2中制备的质粒(pUC18-ppat-pno-kat)各自转化而得到的DH5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于800μl水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及L-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(200mM)及L-丙氨酸(800mM)的底物液。使用氢氧化钠将底物液的pH调节为pH8.0。在2.0ml管中将100μl底物液与300μl菌体悬浮液混合。反应通过在闭合管盖的条件下于37℃以1,000rpm振荡24小时而进行。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析。将利用了使用pUC18-ppat-pno转化而得到的DH5a的情况下的吡哆胺二盐酸盐的生成量设为1.0的情况下，利用了使用pUC18-ppat-pno-kat转化而得到的DH5α的情况下的吡哆胺二盐酸盐的生成量的相对值(PM生成速率比)示于表4。

表4

[表4]

如表4所示，可知通过使本公开文本涉及的重组微生物还具有编码过氧化氢分解酶的基因，从而在限制了氧供给的条件下的吡哆胺或其盐的生产效率进一步提高。

试验5以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(由过氧化氢分解酶带来的效果的研究)

将使用实施例3中制备的质粒(pUC18-aspC-pno)及实施例4中制备的质粒(pUC18-aspC-pno-kat)各自转化而得到的DH5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于800μl水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及L-谷氨酸钠一水合物，配制含有吡哆醇盐酸盐(200mM)及L-谷氨酸钠一水合物(800mM)的底物液。使用氢氧化钠将底物液的pH调节为pH8.0。在2.0ml管中将100μl底物液与300μl菌体悬浮液混合。反应通过在闭合管盖的条件下于37℃以1,000rpm振荡24小时而进行。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析。将利用了使用pUC18-aspC-pno转化而得到的DH5α的情况下的吡哆胺二盐酸盐的生成量设为1.0的情况下，利用了使用pUC18-aspC-pno-kat转化而得到的DH5α的情况下的吡哆胺二盐酸盐的生成量的相对值(PM生成速率比)示于表5。

表5

[表5]

如表5所示，可知通过使本公开文本涉及的重组微生物还具有编码过氧化氢分解酶的基因，从而在限制了氧供给的条件下的吡哆胺或其盐的生产效率进一步提高。

如此表明，根据本公开文本涉及的吡哆胺或其盐的制造方法，能够从吡哆醇或其盐以高生产效率廉价地生产吡哆胺或其盐。

试验6(参考)：pno的吡哆醇浓度的研究

将使用比较例1中制备的质粒(pUC18-pno)转化而得到的DH5α接种于500ml试管中的2ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于37℃振荡培养24小时。将培养液以13,000rpm离心分离3分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于1,000μl水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mM)的底物液。使用氢氧化钠将该底物液调节为pH8.0。将规定量的底物溶液、100μl的Tris-HCl(1M)、100μl菌体悬浮液及水混合，在2.0ml管中配制吡哆醇盐酸盐的浓度为表6所示各浓度的1,000μl反应液。反应通过闭合管盖于37℃以1,000rpm振荡24小时而进行。采集一部分反应液，实施离心分离，通过于415nm处测定吸光度来对生成的吡哆醛盐酸盐进行定量。将各吡哆醇盐酸盐浓度下的PL生成量以相对于吡哆醇盐酸盐浓度为0.8mM的情况下的吡哆醛盐酸盐而言的相对值(PL生成量比)示于表6。

表6

[表6]

如表6所示，在使反应溶液中的吡哆醇盐酸盐的浓度增加至一定值以上的情况下，PL生成量比反而减少。即，观察到了对于吡哆醇氧化酶的酶活性的抑制。

试验7以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(将原料全都一并添加全部量)

将使用实施例1中制备的质粒(pUC18-ppat-pno)转化而得到的DH5α接种于2000ml具挡板锥形瓶中的400ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于10ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐，使用氢氧化钠调节为pH8.0，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mM)的底物液(1)。用水溶解L-丙氨酸，使用氢氧化钠调节为pH8.0，配制含有L-丙氨酸(1,000mM)的底物液(2)。向100ml具挡板锥形瓶中添加4.0ml菌体悬浮液、4.0ml底物液(1)、2.0ml底物液(2)，于37℃以200rpm振荡24小时使其反应。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析吡哆胺二盐酸盐的浓度。结果示于图1。图1～图3中，PN表示吡哆醇盐酸盐的浓度，PL表示吡哆醛盐酸盐的浓度，PM表示吡哆胺二盐酸盐的浓度。另外，hr表示时间的单位“小时”。

如图1所示，即使自最初即添加高浓度的吡哆醇盐酸盐及L-丙氨酸的全部量，吡哆胺二盐酸盐的生产仍然得以进行。

试验8以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(吡哆醇盐酸盐及L-丙氨酸一同分多次添加)

用水溶解吡哆醇盐酸盐，使用氢氧化钠调节为pH8.0，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mM)的底物液(1)。用水溶解L-丙氨酸，使用氢氧化钠调节为pH8.0，配制含有L-丙氨酸(1,000mM)的底物液(2)。向100ml具挡板锥形瓶中添加4.0ml菌体悬浮液、0.5ml底物液(1)及0.25ml底物液(2)，于37℃以200rpm振荡使其反应。在反应开始后1小时后进一步添加0.5ml底物液(1)及0.25ml底物液(2)。在反应开始后7小时后进一步添加0.5ml底物液(1)及0.25ml底物液(2)。使反应持续至反应开始后24小时后。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析吡哆胺二盐酸盐的浓度。结果示于图2。该试验中，吡哆醇盐酸盐和L-丙氨酸每次均以等摩尔添加。

如图2所示，即使是较多量的吡哆醇盐酸盐，在分多次添加、而非自最初即添加全部量时，吡哆胺二盐酸盐的生产效率也进一步提高。可以推测其原因在于，通过分成多次进行添加，吡哆醇的浓度被保持为较低的浓度，吡哆醇氧化酶的活性更容易发挥。

试验9以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(分多次添加吡哆醇盐酸盐、且一并添加L-丙氨酸)

用水溶解吡哆醇盐酸盐，使用氢氧化钠调节为pH8.0，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mM)的底物液(1)。用水溶解L-丙氨酸，使用氢氧化钠调节为pH8.0，配制含有L-丙氨酸(1,000mM)的底物液(2)。向100ml具挡板锥形瓶中添加4.0ml菌体悬浮液、0.5ml底物液(1)及2.0ml底物液(2)，于37℃以200rpm振荡使其反应。在反应开始后1小时后进一步添加0.5ml底物液(1)，在反应开始后7小时后进一步添加0.5ml底物液(1)。使反应持续至反应开始后24小时后。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析吡哆胺二盐酸盐的浓度。结果示于图3。该试验中，较之吡哆醇盐酸盐的摩尔浓度而言，L-丙氨酸的摩尔浓度始终维持为更高水平。

由图2与图3的比较可知，将L-丙氨酸的浓度维持为高于吡哆醇盐酸盐的浓度时，即使是较多量的吡哆醇盐酸盐，吡哆胺二盐酸盐的生产效率也进一步提高。推测这可能是因为，由于存在浓度高于吡哆醇盐酸盐的L-丙氨酸，反应的平衡对于生成吡哆胺而言更为有利。

参考例1 ppat表达株的制备

委托GenScript公司合成将来源于百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号10的核苷酸序列的合成DNA。使用该合成DNA作为模板，以具有序列号51的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号52的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增包含目的基因的DNA片段。用EcoRI及BamHI处理该扩增后的DNA片段，将得到的DNA片段与pUC18(Takara Bio Inc.制)的利用EcoRI及BamHI得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号10的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-ppat。此处，ppat为吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的简称。

参考例2.ppat-plr表达株的制备

委托GenScript公司合成将来源于酿酒酵母的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号53的核苷酸序列的合成DNA。使用该合成DNA作为模板，以具有序列号54的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号55的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增包含目的基因的DNA片段。用SalI及HindIII处理该扩增后的DNA片段，将得到的DNA片段与用SalI及HindIII处理参考例1中制备的pUC18-ppat而得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号53的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-ppat-plr。此处，plr为吡哆醛还原酶基因(相当于吡哆醇脱氢酶)的简称。

参考例3 ppat-adh表达株的制备

委托GenScript公司合成向来源于希瓦氏菌属菌株AC10的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为D198A的突变、且按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号56的核苷酸序列的合成DNA。使用该合成DNA作为模板，以具有序列号57的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号58的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增包含目的基因的DNA片段。用BamHI及SalI处理该扩增后的DNA片段，将得到的DNA片段与用BamHI及SalI处理参考例1中制备的pUC18-ppat而得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养该转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号56的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-ppat-adh。此处，adh为丙氨酸脱氢酶基因的简称。

参考例4 ppat-adh-plr表达株的制备

委托GenScript公司合成向来源于希瓦氏菌属菌株AC10的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为D198A的突变、且按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号56的核苷酸序列的合成DNA。使用该合成DNA作为模板，以具有序列号57的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号58的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增包含目的基因的DNA片段。用BamHI及SalI处理该扩增后的DNA片段，将得到的DNA片段与用BamHI及SalI处理参考例2中制备的pUC18-ppat-plr而得到的处理物使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养该转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号56的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-ppat-adh-plr。

参考例5 adh-plr表达质粒的制备

使用Ligation High(东洋纺株式会社制)将用SalI及HindIII处理参考例2中制备的pUC18-ppat-plr并回收而得到的吡哆醛还原酶基因(plr)片段、用BamHI及SalI处理参考例3中制备的pUC-ppat-adh并回收而得到的丙氨酸脱氢酶基因(adh)片段、和pUC18的利用BamHI及HindIII得到的处理物进行连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒，将得到的质粒命名为pUC18-adh-plr。

参考例6 Msppat-adh-plr表达质粒的制备

委托Eurofins公司合成将来源于中慢生根瘤菌属菌株YR577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入EcoRI、在3’末端导入BamHI而得到的基因，得到具有序列号32的核苷酸序列的合成DNA。用EcoRI/BamHI处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理参考例5中制备的pUC18-adh-plr而得到的DNA片段使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号32的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-Msppat-adh-plr。

参考例7 Psppat-adh-plr表达质粒的制备

委托Eurofins公司合成将来源于氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入EcoRI、在3’末端导入BamHI而得到的基因，得到具有序列号33的核苷酸序列的合成DNA。用EcoRI/BamHI处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理参考例5中制备的pUC18-adh-plr而得到的DNA片段使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号33的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-Psppat-adh-plr。

参考例8 Blppat-adh-plr表达质粒的制备

委托Eurofins公司合成将来源于岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入EcoRI、在3’末端导入BamHI而得到的基因，得到具有序列号34的核苷酸序列的合成DNA。用EcoRI/BamHI处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理参考例5中制备的pUC18-adh-plr而得到的DNA片段使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号34的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-Blppat-adh-plr。

参考例9 Ssppat-adh-plr表达质粒的制备

委托Eurofins公司合成将来源于抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入EcoRI、在3’末端导入BamHI而得到的基因，得到具有序列号35的核苷酸序列的合成DNA。用EcoRI/BamHI处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理参考例5中制备的pUC 18-adh-plr而得到的DNA片段使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号35的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-Ssppat-adh-plr。

参考例10 Rsppat-adh-plr表达质粒的制备

委托Eurofins公司合成将来源于根瘤菌属菌株AC44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入EcoRI、在3’末端导入BamHI而得到的基因，得到具有序列号36的核苷酸序列的合成DNA。用EcoRI/BamHI处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理参考例5中制备的pUC18-adh-plr而得到的DNA片段使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号36的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-Rsppat-adh-plr。

参考例11 Etppat-adh-plr表达质粒的制备

委托Eurofins公司合成将来源于托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入EcoRI、在3’末端导入BamHI而得到的基因，得到具有序列号37的核苷酸序列的合成DNA。用EcoRI/BamHI处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理参考例5中制备的pUC18-adh-plr而得到的DNA片段使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号37的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-Etppat-adh-plr。

参考例12 Hgppat-adh-plr表达质粒的制备

委托Eurofins公司合成将来源于人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入EcoRI、在3’末端导入BamHI而得到的基因，得到具有序列号38的核苷酸序列的合成DNA。用EcoRI/BamHI处理该合成DNA，将得到的DNA片段与用EcoRI及BamHI处理参考例5中制备的pUC18-adh-plr而得到的DNA片段使用Ligation High(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺株式会社制)。在LB琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的DNA片段的核苷酸序列为序列号38的核苷酸序列。将得到的质粒命名为pUC18-Hgppat-adh-plr。

试验10以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造

将使用参考例6～参考例12中制备的质粒各自转化而得到的DH5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于30℃振荡培养24小时。取40ml培养液，以5000rpm离心分离5分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于0.9ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及L-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mM)及L-丙氨酸(500mM)的底物液。使用25％氨水将底物液的pH调节为pH8.0。将400μl底物液、500μl水与100μl菌体悬浮液混合，使其于37℃反应1小时。采集一部分反应液，在上述的分析条件下分析。结果示于表7。需要说明的是，表7所示的所谓吡哆胺生产量以将参考例4中制备的ppat-adh-plr表达株所生产的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量设为100而得到的相对量表示。

[表7]

如表7所示，通过导入来源于中慢生根瘤菌属菌株YR577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于根瘤菌属菌株AC44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、或来源于人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因作为编码吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因来代替参考例4中使用的来源于百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因，也能够从吡哆醇盐酸盐生产吡哆胺二盐酸盐。虽然这些参考例是使用吡哆醇脱氢酶的例子、而未使用吡哆醇氧化酶，但表明了这些吡哆胺-丙酮酸转氨酶能够作为本公开文本中的吡哆胺合成酶发挥功能。

将于2017年5月12日提出申请的日本专利申请2017-095572号的公开内容整体通过参照并入本说明书中。

本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术标准通过参照被并入本说明书中，各文献、专利申请及技术标准通过参照被并入的程度与具体且分别地记载的情况的程度相同。

Claims

1.重组微生物，其具有编码吡哆醇氧化酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因，所述吡哆胺合成酶具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，

2.如权利要求1所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶为吡哆胺-丙酮酸转氨酶、吡哆胺-草酰乙酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶或磷酸吡哆胺转氨酶。

3.如权利要求1或2所述的重组微生物，其中，所述吡哆醇氧化酶由酶编号EC1.1.3.12表示。

4.如权利要求1～3中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇氧化酶的基因来源于微黄微杆菌。

5.如权利要求1～4中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇氧化酶的基因

(a)具有序列号5的核苷酸序列；或者

6.如权利要求1～5中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶包含下述的部分氨基酸序列(c)、部分氨基酸序列(d)、部分氨基酸序列(e)、部分氨基酸序列(f)、部分氨基酸序列(g)及部分氨基酸序列(h)中的至少一者，且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，

(c)X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃(序列号39)

X₈表示L、M、I或V，

X₉表示H或Q，

X₁₀表示G、C或A，

X₁₁表示E或D，

X₁₂表示P或A，

X₁₃表示V、I、L或A；

(d)X₁₄X₁₅TPSGTX₁₆X₁₇(序列号40)

X₁₄表示H或S，

X₁₅表示D或E，

X₁₆表示I、V或L，

X₁₇表示N或T；

(e)X₁₈DX₁₉VSX₂₀X₂₁(序列号41)

X₁₈表示V、I或A，

X₁₉表示A、T或S，

X₂₀表示S、A或G，

X₂₁表示F、W或V；

(f)X₂₂X₂₃X₂₄KCX₂₅GX₂₆X₂₇P(序列号42)

X₂₂表示G或S，

X₂₃表示P、S或A，

X₂₄表示N、G、S、A或Q，

X₂₅表示L或M，

X₂₆表示A、S、C或G，

X₂₇表示P、T、S或A；

(g)X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁SX₃₂GX₃₃X₃₄(序列号43)

X₂₈表示G或D，

X₂₉表示V或I，

X₃₀表示V、T、A、S、M、I或L，

X₃₁表示F、M、L、I或V，

X₃₂表示S、G、A、T、I、L或H，

X₃₃表示R、M或Q，

X₃₄表示G、R、A、D、H或K；

(h)X₃₅X₃₆RX₃₇X₃₈HMGX₃₉X₄₀A(序列号44)

X₃₅表示L或V，

X₃₆表示T、I、V或L，

X₃₇表示I、V或L，

X₃₈表示G或S，

X₃₉表示P、A或R，

X₄₀表示T、V或S。

7.如权利要求1～6中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶由酶编号EC2.6.1.30表示。

8.如权利要求1～7中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因来源于百脉根中慢生根瘤菌。

9.如权利要求1～8中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因

10.如权利要求1～5中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶由酶编号EC2.6.1.31或EC2.6.1.1表示。

11.如权利要求1～5及10中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因来源于大肠杆菌。

12.如权利要求1～5及10～11中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因

(a)具有序列号8的核苷酸序列；或者

13.如权利要求1～11中任一项所述的重组微生物，其还具有编码过氧化氢分解酶的基因，所述过氧化氢分解酶具有从过氧化氢生成氧的酶活性。

14.如权利要求13所述的重组微生物，其中，所述编码过氧化氢分解酶的基因是从菌体外导入的基因，或者是内源于菌体但其表达得到增强的基因。

15.如权利要求13或14所述的重组微生物，其中，所述过氧化氢分解酶由酶编号EC1.11.1.6表示。

16.如权利要求13～15中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码过氧化氢分解酶的基因

(a)具有序列号7的核苷酸序列；或者

17.如权利要求1～16中任一项所述的重组微生物，所述重组微生物为重组大肠杆菌。

18.吡哆胺或其盐的制造方法，其中，使权利要求1～17中任一项所述的重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物与吡哆醇或其盐接触，在氧存在下生成吡哆胺或其盐。

19.如权利要求18所述的制造方法，其中，所述重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物包含所述吡哆醇氧化酶及所述吡哆胺合成酶。

20.如权利要求19所述的制造方法，其中，所述重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物还包含过氧化氢分解酶。

21.如权利要求18～20中任一项所述的制造方法，其中，所述重组微生物或所述培养物的处理物是利用包括选自由加热处理、冷却处理、细胞的机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、细胞的自体消化、表面活性剂处理、酶处理、细胞分离处理、纯化处理及提取处理组成的组中的1种以上的处理而得到的处理物。

22.如权利要求18～21中任一项所述的制造方法，其包括以下的(A)及(B)中的任一者或两者：

23.如权利要求22所述的制造方法，其中，所述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸为L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酸或D-谷氨酸。