JP3468216B2 - 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子および同遺伝子のクローニング - Google Patents
酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子および同遺伝子のクローニングInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酸化還元酵素、同
酵素を含有する新規遺伝子、同遺伝子を含有するベクタ
ーおよび同ベクターで形質転換した形質転換体に関す
る。
酵素を含有する新規遺伝子、同遺伝子を含有するベクタ
ーおよび同ベクターで形質転換した形質転換体に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来、ジケトン化合物に対し還元能を有
する酸化還元酵素産生微生物としては、サッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が知られて
いる。しかし、当該サッカロミセス セレビシエで、た
とえば芳香族ジケトン化合物の１種であるベンジル（be
nzil）を還元した場合には、ラセミ体のベンゾインが生
成し、当該微生物産生酵素は立体選択性が低いという難
点がある（Chemistry Letters、１１９１〜１１９２
頁、１９８８年）。芳香族ジケトン化合物であるベンジ
ルに対し不斉還元能を有する酸化還元酵素を産生する微
生物としては、キサントモナス オリゼー（Xanthomona
s oryzae）も知られている。同酵素産生微生物でベンジ
ルを不斉還元した場合には、還元生成物として立体選択
的に（Ｒ）−ベンゾインを生成する（Chemistry Letter
s、１１１１〜１１１２頁、１９８５年）。
する酸化還元酵素産生微生物としては、サッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が知られて
いる。しかし、当該サッカロミセス セレビシエで、た
とえば芳香族ジケトン化合物の１種であるベンジル（be
nzil）を還元した場合には、ラセミ体のベンゾインが生
成し、当該微生物産生酵素は立体選択性が低いという難
点がある（Chemistry Letters、１１９１〜１１９２
頁、１９８８年）。芳香族ジケトン化合物であるベンジ
ルに対し不斉還元能を有する酸化還元酵素を産生する微
生物としては、キサントモナス オリゼー（Xanthomona
s oryzae）も知られている。同酵素産生微生物でベンジ
ルを不斉還元した場合には、還元生成物として立体選択
的に（Ｒ）−ベンゾインを生成する（Chemistry Letter
s、１１１１〜１１１２頁、１９８５年）。
【０００３】また、サッカロミセス セレビシエは、脂
肪族ジケトン化合物である４−クロロアセト酢酸エステ
ルを還元して４−ヒドロキシブタン酸エステルとする７
種類の酵素を産生することが知られているが、これら７
種酵素の全ての遺伝子は単離されるに至っておらず（化
学と生物、第３５号、５９０〜５９８頁、１９９７
年）、それらのアミノ酸配列も、２種類の酵素について
サッカロミセス セレビシエのゲノム配列から類推され
ているにすぎない（Biosci. Biotech. Biochem.、第６
０号、１５３８〜１５３９頁、１９９６年）。
肪族ジケトン化合物である４−クロロアセト酢酸エステ
ルを還元して４−ヒドロキシブタン酸エステルとする７
種類の酵素を産生することが知られているが、これら７
種酵素の全ての遺伝子は単離されるに至っておらず（化
学と生物、第３５号、５９０〜５９８頁、１９９７
年）、それらのアミノ酸配列も、２種類の酵素について
サッカロミセス セレビシエのゲノム配列から類推され
ているにすぎない（Biosci. Biotech. Biochem.、第６
０号、１５３８〜１５３９頁、１９９６年）。
【０００４】バチラス セリウス（Bacillus cereus）
に関しては、非ジケトン化合物である９−フルオレノン
のカルボニル基に対し還元能を示すことが知られている
が（Biosci. Biotechnol. Biochem.、第６２号、８１４
〜８１５頁、１９９８年）、当該微生物の芳香族ジケト
ン化合物に対する還元能はこれまで全く報告されていな
い。
に関しては、非ジケトン化合物である９−フルオレノン
のカルボニル基に対し還元能を示すことが知られている
が（Biosci. Biotechnol. Biochem.、第６２号、８１４
〜８１５頁、１９９８年）、当該微生物の芳香族ジケト
ン化合物に対する還元能はこれまで全く報告されていな
い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記の
状況下、種々研究を重ねた結果、バチラス セリウスＴ
ｉｍ−ｒ０１（通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０）が芳香族
ジケトン化合物に対し不斉還元能を有し、たとえばベン
ジルを不斉還元して（Ｓ）−ベンゾインを生成する、新
規酸化還元酵素を産生することを見出した。しかし、当
該菌株の生菌体を用いた場合には、当該酸化還元酵素の
発現量はその培養条件に大きく影響される。また、当該
菌株を長時間培養しながら還元反応を行なった場合に
は、逆反応が起こり不斉還元生成物の収量が減少するな
どの欠点を有していた。
状況下、種々研究を重ねた結果、バチラス セリウスＴ
ｉｍ−ｒ０１（通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０）が芳香族
ジケトン化合物に対し不斉還元能を有し、たとえばベン
ジルを不斉還元して（Ｓ）−ベンゾインを生成する、新
規酸化還元酵素を産生することを見出した。しかし、当
該菌株の生菌体を用いた場合には、当該酸化還元酵素の
発現量はその培養条件に大きく影響される。また、当該
菌株を長時間培養しながら還元反応を行なった場合に
は、逆反応が起こり不斉還元生成物の収量が減少するな
どの欠点を有していた。
【０００６】そこで本発明者らは、バチラス セリウス
Ｔｉｍ−ｒ０１菌株の染色体ＤＮＡから酸化還元酵素を
コードする新規遺伝子を同定し、同遺伝子のオープンリ
ーディングフレーム（以下ＯＲＦと略称する）を決定し
た。さらに引き続き、本発明者らは、同遺伝子を含有す
る組換えベクターによって形質転換した形質転換体を得
て、本発明を完成させたものである。
Ｔｉｍ−ｒ０１菌株の染色体ＤＮＡから酸化還元酵素を
コードする新規遺伝子を同定し、同遺伝子のオープンリ
ーディングフレーム（以下ＯＲＦと略称する）を決定し
た。さらに引き続き、本発明者らは、同遺伝子を含有す
る組換えベクターによって形質転換した形質転換体を得
て、本発明を完成させたものである。
【０００７】したがって本発明は、芳香族ジケトン化合
物に対して不斉還元能を示し、たとえばベンジルに適用
した場合には（Ｓ）−ベンゾインを立体選択的に生成す
る、酸化還元酵素、同酵素をコードする新規遺伝子、同
遺伝子を含有する組換えベクターおよび同ベクターによ
って形質転換された形質転換体をそれぞれ提供すること
を目的とする。
物に対して不斉還元能を示し、たとえばベンジルに適用
した場合には（Ｓ）−ベンゾインを立体選択的に生成す
る、酸化還元酵素、同酵素をコードする新規遺伝子、同
遺伝子を含有する組換えベクターおよび同ベクターによ
って形質転換された形質転換体をそれぞれ提供すること
を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、以下に示
す発明を提供することで、前記課題を解決するものであ
る。
す発明を提供することで、前記課題を解決するものであ
る。
【０００９】（１）配列表の配列番号２に示したアミノ
酸配列を有する酸化還元酵素。 （２）配列表の配列番号１に示した塩基配列でコードさ
れる酸化還元酵素。 （３）配列表の配列番号１に示した塩基配列を有する酸
化還元酵素遺伝子。 （４）配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列をコー
ドする酸化還元酵素遺伝子。 （５）配列表の配列番号１に示した塩基配列と相補的な
塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡま
たはオリゴヌクレオチド。 （６）配列表の配列番号１に示した塩基配列と相補的な
塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡが
コードするアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリ
ペプチド。 （７）配列表の配列番号１に示した塩基配列と相補的な
塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを
発現させることによって得られるタンパク質またはポリ
ペプチド。 （８）前記（３）または（４）記載の遺伝子を含有する
組換えベクター。 （９）ベクターがｐＵＣ１９である前記（８）記載の組
換えベクター。 （１０）前記（８）または（９）記載の組換えベクター
で形質転換された形質転換体。 （１１）宿主細胞が微生物である前記（１０）記載の形
質転換体。 （１２）当該微生物が大腸菌である前記（１１）記載の
形質転換体。
酸配列を有する酸化還元酵素。 （２）配列表の配列番号１に示した塩基配列でコードさ
れる酸化還元酵素。 （３）配列表の配列番号１に示した塩基配列を有する酸
化還元酵素遺伝子。 （４）配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列をコー
ドする酸化還元酵素遺伝子。 （５）配列表の配列番号１に示した塩基配列と相補的な
塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡま
たはオリゴヌクレオチド。 （６）配列表の配列番号１に示した塩基配列と相補的な
塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡが
コードするアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリ
ペプチド。 （７）配列表の配列番号１に示した塩基配列と相補的な
塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを
発現させることによって得られるタンパク質またはポリ
ペプチド。 （８）前記（３）または（４）記載の遺伝子を含有する
組換えベクター。 （９）ベクターがｐＵＣ１９である前記（８）記載の組
換えベクター。 （１０）前記（８）または（９）記載の組換えベクター
で形質転換された形質転換体。 （１１）宿主細胞が微生物である前記（１０）記載の形
質転換体。 （１２）当該微生物が大腸菌である前記（１１）記載の
形質転換体。
【００１０】これらの酸化還元酵素、同酵素を含有する
遺伝子、同遺伝子を含有するベクターおよび同ベクター
で形質転換した形質転換体は、以下説明するごとき実施
の態様に基づいて得ることができる。以下、本発明につ
いて詳細に説明する。
遺伝子、同遺伝子を含有するベクターおよび同ベクター
で形質転換した形質転換体は、以下説明するごとき実施
の態様に基づいて得ることができる。以下、本発明につ
いて詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明によれば、バチラス セリ
ウスＴｉｍ−ｒ０１株をそれ自体公知の方法で培養して
当該微生物の培養菌体を得た後、溶菌処理などを行な
い、染色体ＤＮＡを得る。染色体ＤＮＡの回収は常法に
したがい適宜実施できるが、グラム陽性菌である当該微
生物は、大腸菌に比べて溶菌しにくい性質をもつため、
たとえば酵母・グラム陽性菌用の市販ＤＮＡ抽出・回収
キット、たとえば宝酒造株式会社製Ｇｅｎとるくん（商
標）を用いて実施するのが好ましい。
ウスＴｉｍ−ｒ０１株をそれ自体公知の方法で培養して
当該微生物の培養菌体を得た後、溶菌処理などを行な
い、染色体ＤＮＡを得る。染色体ＤＮＡの回収は常法に
したがい適宜実施できるが、グラム陽性菌である当該微
生物は、大腸菌に比べて溶菌しにくい性質をもつため、
たとえば酵母・グラム陽性菌用の市販ＤＮＡ抽出・回収
キット、たとえば宝酒造株式会社製Ｇｅｎとるくん（商
標）を用いて実施するのが好ましい。
【００１２】ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端ま
たは平滑末端を生じさせる制限酵素を作用させて部分消
化し、ＤＮＡ断片混合物を得る。制限酵素は、当業者に
より適宜選択することができる。また当該制限酵素処理
における反応温度や反応時間などの反応条件は、選択し
た酵素に応じて適宜条件設定することができる。
たは平滑末端を生じさせる制限酵素を作用させて部分消
化し、ＤＮＡ断片混合物を得る。制限酵素は、当業者に
より適宜選択することができる。また当該制限酵素処理
における反応温度や反応時間などの反応条件は、選択し
た酵素に応じて適宜条件設定することができる。
【００１３】このようにして得られるＤＮＡ断片混合物
から、たとえば通常のアガロース電気泳動法により、２
〜４ｋｂのＤＮＡ断片混合物を得る。これらのＤＮＡ断
片は、必要とあれば、フェノール抽出などの精製手段に
より精製し、さらにたとえばエタノール沈殿法の濃縮手
段により濃縮することができる。また、市販のＤＮＡ回
収キット、たとえばＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（バイオラッド社
（BIO-RAD）製）、を用いてアガロースゲルからＤＮＡ
を回収してもよい。このようにして得られたＤＮＡ断片
は、２つ以上の挿入断片によるライゲーションを防ぐ目
的で、ＤＮＡの突出末端の一部をポリメラーゼ、たとえ
ばクレノウフラグメント（Klenow fragment）、を用い
て埋めてもよい。
から、たとえば通常のアガロース電気泳動法により、２
〜４ｋｂのＤＮＡ断片混合物を得る。これらのＤＮＡ断
片は、必要とあれば、フェノール抽出などの精製手段に
より精製し、さらにたとえばエタノール沈殿法の濃縮手
段により濃縮することができる。また、市販のＤＮＡ回
収キット、たとえばＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（バイオラッド社
（BIO-RAD）製）、を用いてアガロースゲルからＤＮＡ
を回収してもよい。このようにして得られたＤＮＡ断片
は、２つ以上の挿入断片によるライゲーションを防ぐ目
的で、ＤＮＡの突出末端の一部をポリメラーゼ、たとえ
ばクレノウフラグメント（Klenow fragment）、を用い
て埋めてもよい。
【００１４】一方、本発明に用いるベクターはいかなる
ものでもよく、たとえばプラスミドベクター、バクテリ
オファージベクター、レトロウイルスベクター、バキュ
ロウイルスベクターおよびパピローマウイルスベクター
などを挙げることができる。具体的には、たとえばベク
ターｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）を用いるの
が好ましい。
ものでもよく、たとえばプラスミドベクター、バクテリ
オファージベクター、レトロウイルスベクター、バキュ
ロウイルスベクターおよびパピローマウイルスベクター
などを挙げることができる。具体的には、たとえばベク
ターｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）を用いるの
が好ましい。
【００１５】ついで、ＤＮＡ断片を挿入するために、前
記ベクターに制限酵素を作用させて完全に消化する。当
該制限酵素は、挿入断片とライゲーションし得るような
末端を生じるものであれば、いずれのものを用いてもよ
い。制限酵素による消化反応の反応温度、反応時間など
の反応条件は、選択した酵素に応じて適宜条件設定する
ことができる。また、これらのベクターを、必要とあれ
ばフェノール抽出などの精製手段により精製し、さらに
たとえばエタノール沈殿法の濃縮手段により濃縮するこ
とができる。用いる制限酵素によっては、制限酵素によ
る消化処理後、挿入断片とライゲーションし得るように
ベクターの突出末端の一部をポリメラーゼ、たとえばク
レノウフラグメント、を用いて埋めてもよい。さらに、
ベクターのセルフライゲーションを防ぐために、たとえ
ば仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼなどによるホ
スファターゼ処理を行なってもよい。
記ベクターに制限酵素を作用させて完全に消化する。当
該制限酵素は、挿入断片とライゲーションし得るような
末端を生じるものであれば、いずれのものを用いてもよ
い。制限酵素による消化反応の反応温度、反応時間など
の反応条件は、選択した酵素に応じて適宜条件設定する
ことができる。また、これらのベクターを、必要とあれ
ばフェノール抽出などの精製手段により精製し、さらに
たとえばエタノール沈殿法の濃縮手段により濃縮するこ
とができる。用いる制限酵素によっては、制限酵素によ
る消化処理後、挿入断片とライゲーションし得るように
ベクターの突出末端の一部をポリメラーゼ、たとえばク
レノウフラグメント、を用いて埋めてもよい。さらに、
ベクターのセルフライゲーションを防ぐために、たとえ
ば仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼなどによるホ
スファターゼ処理を行なってもよい。
【００１６】前記処理工程において、染色体ＤＮＡとベ
クターを消化するための制限酵素の組み合わせとして
は、この技術分野でそれ自体公知の組合せを適宜使用す
ることができる。たとえばベクターがｐＵＣ１９である
場合には、たとえばＳａｕ３ＡＩとＳａｌＩ、Ｓａｕ３
ＡＩとＢａｍＨＩ、ＡｌｕＩとＳｍａＩ、ＨａｅＩＩＩ
とＳｍａＩ、ＲｓａＩとＳｍａＩまたはＥｃｏＲＩとＥ
ｃｏＲＩなどの組み合わせを用いることができる。本発
明においては、Ｓａｕ３ＡＩとＳａｌＩの組合せを用い
るのが好ましい。またＳａｕ３ＡＩとＳａｌＩの組合せ
を用いる場合は、各々のＤＮＡ突出末端を、たとえばク
レノウフラグメントなどのポリメラーゼを用いて、２塩
基分埋めておくのが望ましい。
クターを消化するための制限酵素の組み合わせとして
は、この技術分野でそれ自体公知の組合せを適宜使用す
ることができる。たとえばベクターがｐＵＣ１９である
場合には、たとえばＳａｕ３ＡＩとＳａｌＩ、Ｓａｕ３
ＡＩとＢａｍＨＩ、ＡｌｕＩとＳｍａＩ、ＨａｅＩＩＩ
とＳｍａＩ、ＲｓａＩとＳｍａＩまたはＥｃｏＲＩとＥ
ｃｏＲＩなどの組み合わせを用いることができる。本発
明においては、Ｓａｕ３ＡＩとＳａｌＩの組合せを用い
るのが好ましい。またＳａｕ３ＡＩとＳａｌＩの組合せ
を用いる場合は、各々のＤＮＡ突出末端を、たとえばク
レノウフラグメントなどのポリメラーゼを用いて、２塩
基分埋めておくのが望ましい。
【００１７】ついで、前記のようにして得たバチラス
セリウスＴｉｍ−ｒ０１由来ＤＮＡ断片混合物と消化さ
れたベクターを混合し、これにリガーゼ、たとえばＴ４
ＤＮＡリガーゼ、を作用させて組換えベクターを得るこ
とができる。好ましくはライゲーションキット、たとえ
ばＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（商
品名、宝酒造株式会社製）、を用いて規定の条件にてラ
イゲーション反応を行なうことにより、組換えベクター
を得る。
セリウスＴｉｍ−ｒ０１由来ＤＮＡ断片混合物と消化さ
れたベクターを混合し、これにリガーゼ、たとえばＴ４
ＤＮＡリガーゼ、を作用させて組換えベクターを得るこ
とができる。好ましくはライゲーションキット、たとえ
ばＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（商
品名、宝酒造株式会社製）、を用いて規定の条件にてラ
イゲーション反応を行なうことにより、組換えベクター
を得る。
【００１８】このようにして得た組換えベクターを既知
の形質転換法により宿主に導入する。この形質転換は常
法（たとえばMethods Enzymol.、第２０４号、６３〜１
１３頁、１９９１年）により、好適に実施することがで
きる。本発明における宿主細胞としては、前記組換えベ
クターが複製可能なものであれば制限なく使用すること
ができる。宿主細胞の具体例としては、たとえば大腸菌
および酵母のような微生物、ｓｆ９株のような昆虫細
胞、またはＣＯＳ細胞のような動物細胞などを挙げるこ
とができる。
の形質転換法により宿主に導入する。この形質転換は常
法（たとえばMethods Enzymol.、第２０４号、６３〜１
１３頁、１９９１年）により、好適に実施することがで
きる。本発明における宿主細胞としては、前記組換えベ
クターが複製可能なものであれば制限なく使用すること
ができる。宿主細胞の具体例としては、たとえば大腸菌
および酵母のような微生物、ｓｆ９株のような昆虫細
胞、またはＣＯＳ細胞のような動物細胞などを挙げるこ
とができる。
【００１９】つぎに、得られた形質転換体の中から酸化
還元酵素を生産するものを選択する。たとえば、ベンジ
ルを含む寒天培地上に形質転換体のコロニーを形成さ
せ、コロニーの周囲に形成されるハローによって酸化還
元酵素産生菌、すなわち新規な酸化還元酵素遺伝子を含
む形質転換体を選択することができる。ここでハローと
は、ベンジルが還元されることによってコロニーの周囲
に形成される透明の帯をいう。本発明者らは、新規酸化
還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターをｐＵＣ−Ｂ
Ｃ−Ｂ１と命名した。
還元酵素を生産するものを選択する。たとえば、ベンジ
ルを含む寒天培地上に形質転換体のコロニーを形成さ
せ、コロニーの周囲に形成されるハローによって酸化還
元酵素産生菌、すなわち新規な酸化還元酵素遺伝子を含
む形質転換体を選択することができる。ここでハローと
は、ベンジルが還元されることによってコロニーの周囲
に形成される透明の帯をいう。本発明者らは、新規酸化
還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターをｐＵＣ−Ｂ
Ｃ−Ｂ１と命名した。
【００２０】前記の組換えベクター、すなわちｐＵＣ−
ＢＣ−Ｂ１、の塩基配列は、常法のジデオキシ法により
決定することができる。具体的には、トランスポゾンを
利用する方法、たとえばＥＺ：：ＴＮ（商標）＜ＫＡＮ
−１＞ＩｎｓｅｒｔｉｏｎＫｉｔ（商品名、エピセンタ
ーテクノロジーズ社（Epicentre Technologies Corpora
tion）製）、を用いて塩基配列決定を行なうことができ
る。該トランスポゾンの両末端にはプライマーがハイブ
リダイズし得る塩基配列が存在するので、トランスポゾ
ンをｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１中に挿入させた後に、それぞれ
のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、挿入断片の全長
塩基配列を決定することができる。この結果、ｐＵＣ−
ＢＣ−Ｂ１の挿入断片は、２４３８ｂｐであることが判
明した。
ＢＣ−Ｂ１、の塩基配列は、常法のジデオキシ法により
決定することができる。具体的には、トランスポゾンを
利用する方法、たとえばＥＺ：：ＴＮ（商標）＜ＫＡＮ
−１＞ＩｎｓｅｒｔｉｏｎＫｉｔ（商品名、エピセンタ
ーテクノロジーズ社（Epicentre Technologies Corpora
tion）製）、を用いて塩基配列決定を行なうことができ
る。該トランスポゾンの両末端にはプライマーがハイブ
リダイズし得る塩基配列が存在するので、トランスポゾ
ンをｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１中に挿入させた後に、それぞれ
のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、挿入断片の全長
塩基配列を決定することができる。この結果、ｐＵＣ−
ＢＣ−Ｂ１の挿入断片は、２４３８ｂｐであることが判
明した。
【００２１】このようにして塩基配列を決定し、当該塩
基配列から考えられる数個のＯＲＦそれぞれについての
アミノ酸配列を、たとえばＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ国際塩基配列データベースなどの相同性検索用
データベースにおいて既知のアミノ酸配列との相同性を
検索した。この結果、配列表の配列番号２に示す２４９
残基からなるアミノ酸配列が、セピアプテリン還元酵素
に類似性を有するバチラス ズブチルス（Bacillus sub
tilis）のｙｕｅＤ遺伝子でコードされるアミノ酸配列
およびサッカロミセス セレビシエのＯＲＦ ＹＩＲ０
３６Ｃでコードされるアミノ酸配列に対して、それぞれ
４０％および３０％の類似性を有するという知見を得
た。一方、前記のＥＺ：：ＴＮキットを用いるｐＵＣ−
ＢＣ−Ｂ１へのトランスポゾンの挿入により、前記の２
４９アミノ酸残基をコードするＯＲＦ中にトランスポゾ
ンが挿入された場合には、ハローが形成されなくなった
ことから、該ＯＲＦが目的の酸化還元酵素をコードして
いると考えられる。終止コドンを含めた該ＯＲＦを、配
列表の配列番号１に示す。
基配列から考えられる数個のＯＲＦそれぞれについての
アミノ酸配列を、たとえばＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ国際塩基配列データベースなどの相同性検索用
データベースにおいて既知のアミノ酸配列との相同性を
検索した。この結果、配列表の配列番号２に示す２４９
残基からなるアミノ酸配列が、セピアプテリン還元酵素
に類似性を有するバチラス ズブチルス（Bacillus sub
tilis）のｙｕｅＤ遺伝子でコードされるアミノ酸配列
およびサッカロミセス セレビシエのＯＲＦ ＹＩＲ０
３６Ｃでコードされるアミノ酸配列に対して、それぞれ
４０％および３０％の類似性を有するという知見を得
た。一方、前記のＥＺ：：ＴＮキットを用いるｐＵＣ−
ＢＣ−Ｂ１へのトランスポゾンの挿入により、前記の２
４９アミノ酸残基をコードするＯＲＦ中にトランスポゾ
ンが挿入された場合には、ハローが形成されなくなった
ことから、該ＯＲＦが目的の酸化還元酵素をコードして
いると考えられる。終止コドンを含めた該ＯＲＦを、配
列表の配列番号１に示す。
【００２２】本発明によれば、前記のごとき実施態様に
より、酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子、同遺
伝子を含有するベクターおよび同ベクターで形質転換さ
れた形質転換体が提供される。ただし、本発明に係る酸
化還元酵素遺伝子としては、当該酵素の酸化還元活性を
付与するものであればどのようなものでもよい。たとえ
ば、配列表１の塩基配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換または付加された配列を作製すること
は、現在の科学分野の技術水準をもってすれば、当業者
にとって極めて容易である。また、当該遺伝子の５´末
端側にプロモーターやエンハンサーをといった塩基配列
を付加すること、および／または３´末端側にポリＡ付
加シグナル塩基配列を付加することも当業者にとって極
めて容易である。したがって、配列表の配列番号１に示
した塩基配列の５´末端側や３´末端側および／または
それらの間に１つ以上の塩基の付加、欠失、挿入を有す
る塩基配列からなる本発明の酸化還元酵素遺伝子は、本
発明に包含される。さらに本発明は、配列表の配列番号
１に示した塩基配列に相補的なＤＮＡ、配列表の配列番
号１に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮ
ＡにハイブリダイズするＤＮＡおよびオリゴヌクレオチ
ドをも包含する。さらには、本発明の酸化還元酵素の検
出もしくは精製を容易にするために、本酸化還元酵素の
アミノ末端側やカルボキシル末端側に別の蛋白質、たと
えば大腸菌のβ−ガラクトシダーゼまたはヒスチジンタ
グ、を遺伝子工学的手法などを用いて付加すること、ま
たは本酸化還元酵素の機能をより深く解析する為に同様
の方法を用いてアミノ酸配列の一部を欠失、置換するこ
となどは当業者にとって極めて容易である。本発明は、
このような当該酸化還元酵素の変異体も包含するもので
ある。さらに本発明は、配列表の配列番号１に示した塩
基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダ
イズするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するタン
パク質またはポリペプチドをも包含する。
より、酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子、同遺
伝子を含有するベクターおよび同ベクターで形質転換さ
れた形質転換体が提供される。ただし、本発明に係る酸
化還元酵素遺伝子としては、当該酵素の酸化還元活性を
付与するものであればどのようなものでもよい。たとえ
ば、配列表１の塩基配列において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換または付加された配列を作製すること
は、現在の科学分野の技術水準をもってすれば、当業者
にとって極めて容易である。また、当該遺伝子の５´末
端側にプロモーターやエンハンサーをといった塩基配列
を付加すること、および／または３´末端側にポリＡ付
加シグナル塩基配列を付加することも当業者にとって極
めて容易である。したがって、配列表の配列番号１に示
した塩基配列の５´末端側や３´末端側および／または
それらの間に１つ以上の塩基の付加、欠失、挿入を有す
る塩基配列からなる本発明の酸化還元酵素遺伝子は、本
発明に包含される。さらに本発明は、配列表の配列番号
１に示した塩基配列に相補的なＤＮＡ、配列表の配列番
号１に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮ
ＡにハイブリダイズするＤＮＡおよびオリゴヌクレオチ
ドをも包含する。さらには、本発明の酸化還元酵素の検
出もしくは精製を容易にするために、本酸化還元酵素の
アミノ末端側やカルボキシル末端側に別の蛋白質、たと
えば大腸菌のβ−ガラクトシダーゼまたはヒスチジンタ
グ、を遺伝子工学的手法などを用いて付加すること、ま
たは本酸化還元酵素の機能をより深く解析する為に同様
の方法を用いてアミノ酸配列の一部を欠失、置換するこ
となどは当業者にとって極めて容易である。本発明は、
このような当該酸化還元酵素の変異体も包含するもので
ある。さらに本発明は、配列表の配列番号１に示した塩
基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダ
イズするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するタン
パク質またはポリペプチドをも包含する。
【００２３】
【実施例】本発明を以下に実施例をあげて説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】実施例１
（１）菌体からの染色体ＤＮＡ回収方法
バチラス セリウスＴｉｍ−ｒ０１菌株のシングルコロ
ニーを１０ｍｌのＰＮＥ培地（培地の組成：ポリペプト
ン１０ｇ／ｌ、カツオ魚肉エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナト
リウム２ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に接種し、３７℃で２４
時間振とう培養した。培養終了後に遠心分離し、上清を
除いて菌体を得、当該菌体に酵母・グラム陽性菌用Ｇｅ
ｎとるくん（商標、宝酒造株式会社製）のＧｅｎＴＬＥ
溶液Ｉ１８０μｌを添加後、直ちに２０秒間ボルテック
スにて強く撹拌した。ついで、ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩ２
０μｌを添加して５秒間ボルテックスにて撹拌し、７０
℃で１０〜１５分間インキュベートして溶菌させた後、
ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩＩ１００μｌを添加してよく混和
した。氷中で５分間放置した後遠心し、上清を別のチュ
ーブに移して等量のイソプロパノールを加え、よく混和
した。その後、さらに遠心して上清を除き、沈殿を７０
％エタノールで洗浄し、数秒間軽く遠心して上清を除い
た。沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）３００μｌに溶解し、７．５Ｍ
酢酸アンモニウム１５０μｌとエタノール４５０μｌを
加えて混和し、糸状のＤＮＡ沈殿をピペットチップの先
で絡め取り、ＴＥ緩衝液３００μｌに溶解した。
ニーを１０ｍｌのＰＮＥ培地（培地の組成：ポリペプト
ン１０ｇ／ｌ、カツオ魚肉エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナト
リウム２ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に接種し、３７℃で２４
時間振とう培養した。培養終了後に遠心分離し、上清を
除いて菌体を得、当該菌体に酵母・グラム陽性菌用Ｇｅ
ｎとるくん（商標、宝酒造株式会社製）のＧｅｎＴＬＥ
溶液Ｉ１８０μｌを添加後、直ちに２０秒間ボルテック
スにて強く撹拌した。ついで、ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩ２
０μｌを添加して５秒間ボルテックスにて撹拌し、７０
℃で１０〜１５分間インキュベートして溶菌させた後、
ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩＩ１００μｌを添加してよく混和
した。氷中で５分間放置した後遠心し、上清を別のチュ
ーブに移して等量のイソプロパノールを加え、よく混和
した。その後、さらに遠心して上清を除き、沈殿を７０
％エタノールで洗浄し、数秒間軽く遠心して上清を除い
た。沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）３００μｌに溶解し、７．５Ｍ
酢酸アンモニウム１５０μｌとエタノール４５０μｌを
加えて混和し、糸状のＤＮＡ沈殿をピペットチップの先
で絡め取り、ＴＥ緩衝液３００μｌに溶解した。
【００２５】このようにして得られたＤＮＡ量は、数回
分を合わせて２２０μｇであった。該ＤＮＡには多くの
ＲＮＡも混在していた。
分を合わせて２２０μｇであった。該ＤＮＡには多くの
ＲＮＡも混在していた。
【００２６】（２）染色体ＤＮＡ挿入断片の調製
前記（１）で調整した染色体ＤＮＡ５０μｇ、制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造株式会社製）２．５ユニットおよ
びＳａｕ３ＡＩ緩衝液（５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチ
オトレイトール、１０００ｍＭ塩化ナトリウム）５０μ
ｌに純水を加えて全量５００μｌとし、３７℃で２０分
間反応させることにより該染色体ＤＮＡを部分消化し
た。
Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造株式会社製）２．５ユニットおよ
びＳａｕ３ＡＩ緩衝液（５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチ
オトレイトール、１０００ｍＭ塩化ナトリウム）５０μ
ｌに純水を加えて全量５００μｌとし、３７℃で２０分
間反応させることにより該染色体ＤＮＡを部分消化し
た。
【００２７】ついで、部分消化した反応液をフェノール
抽出後、７．５Ｍ酢酸アンモニウム２５０μｌとイソプ
ロパノール７５０μｌを加えて混和し、ＤＮＡを沈殿さ
せた。再度イソプロパノール沈殿を行ない、遠心して上
清を除き、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。
抽出後、７．５Ｍ酢酸アンモニウム２５０μｌとイソプ
ロパノール７５０μｌを加えて混和し、ＤＮＡを沈殿さ
せた。再度イソプロパノール沈殿を行ない、遠心して上
清を除き、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。
【００２８】つぎに、前記の方法で得たＤＮＡ断片、５
ｍＭのｄＡＴＰ（デオキシＡＴＰ）およびｄＧＴＰ（デ
オキシＧＴＰ）を各５μｌ、緩衝液（１００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍ
Ｍジチオトレイトール）５μｌ、クレノウフラグメント
（宝酒造株式会社製）８ユニットに純水を加えて全量５
０μｌとし、２２℃で１０分間反応させて、Ｓａｕ３Ａ
Ｉによる消化で生じた５´突出末端の半分を埋めた。し
たがって該染色体ＤＮＡ断片においては、ＧＡが５´突
出末端となる。ついで、該ＤＮＡ断片を０．８％のアガ
ロースゲルを用いた電気泳動により展開し、２〜４ｋｂ
のＤＮＡ断片を含む画分をゲルから切り出して、Ｐｒｅ
ｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（バイオラッド社製）によりＤＮＡ断片を回収
した。すなわち、ＤＮＡ断片を含むアガロースゲルをＰ
ｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ結合緩衝液１ｍｌに溶解し、Ｐｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅのマトリックス２０μｌにＤＮＡを
吸着させた。ついで、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄液６
００μｌで２回洗浄した後、ＴＥ緩衝液３０μｌ中で５
０℃で５分間インキュベートし、ＤＮＡ断片を溶出して
回収した。
ｍＭのｄＡＴＰ（デオキシＡＴＰ）およびｄＧＴＰ（デ
オキシＧＴＰ）を各５μｌ、緩衝液（１００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍ
Ｍジチオトレイトール）５μｌ、クレノウフラグメント
（宝酒造株式会社製）８ユニットに純水を加えて全量５
０μｌとし、２２℃で１０分間反応させて、Ｓａｕ３Ａ
Ｉによる消化で生じた５´突出末端の半分を埋めた。し
たがって該染色体ＤＮＡ断片においては、ＧＡが５´突
出末端となる。ついで、該ＤＮＡ断片を０．８％のアガ
ロースゲルを用いた電気泳動により展開し、２〜４ｋｂ
のＤＮＡ断片を含む画分をゲルから切り出して、Ｐｒｅ
ｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（バイオラッド社製）によりＤＮＡ断片を回収
した。すなわち、ＤＮＡ断片を含むアガロースゲルをＰ
ｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ結合緩衝液１ｍｌに溶解し、Ｐｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅのマトリックス２０μｌにＤＮＡを
吸着させた。ついで、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄液６
００μｌで２回洗浄した後、ＴＥ緩衝液３０μｌ中で５
０℃で５分間インキュベートし、ＤＮＡ断片を溶出して
回収した。
【００２９】（３）ベクターの調製
つぎに、ｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）２μ
ｇ、制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造株式会社製）１５ユニッ
ト、ＳａｌＩ緩衝液（５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオト
レイトール、１０００ｍＭ塩化ナトリウム）３μｌに純
水を加えて全量３０μｌとし、３７℃で２時間反応させ
ることにより該ベクターを完全に消化した。ついで、前
記反応液、５ｍＭのｄＴＴＰ（デオキシＴＴＰ）および
ｄＣＴＰ（デオキシＣＴＰ）各４μｌ、ＳａｌＩ緩衝液
１μｌならびに２ユニットのクレノウフラグメントに純
水を加えて全量４０μｌとし、２２℃で５分間反応させ
て、ＳａｌＩによる消化で生じた５´突出末端の半分を
埋めた。したがって該ｐＵＣ１９における５´突出末端
は、ＴＣである。
ｇ、制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造株式会社製）１５ユニッ
ト、ＳａｌＩ緩衝液（５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオト
レイトール、１０００ｍＭ塩化ナトリウム）３μｌに純
水を加えて全量３０μｌとし、３７℃で２時間反応させ
ることにより該ベクターを完全に消化した。ついで、前
記反応液、５ｍＭのｄＴＴＰ（デオキシＴＴＰ）および
ｄＣＴＰ（デオキシＣＴＰ）各４μｌ、ＳａｌＩ緩衝液
１μｌならびに２ユニットのクレノウフラグメントに純
水を加えて全量４０μｌとし、２２℃で５分間反応させ
て、ＳａｌＩによる消化で生じた５´突出末端の半分を
埋めた。したがって該ｐＵＣ１９における５´突出末端
は、ＴＣである。
【００３０】（４）挿入断片とベクターとのライゲーシ
ョン ＧＡが５´突出末端である該染色体ＤＮＡおよびＴＣが
５´突出末端である該ｐＵＣ１９ＤＮＡを２：１のモル
比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）の緩衝液ＡをＤＮ
Ａ溶液に対して４倍量添加し、さらに酵素液ＢをＤＮＡ
溶液と等量添加する。１６℃で１時間ライゲーション反
応を行なった。これにより、バチラス セリウスの染色
体ＤＮＡライブラリーを完成させた。該ライブラリーを
２５ｎｇ用いて、常法にしたがい作製した大腸菌ＤＨ５
α株（ギブコBRLライフテクノロジー社（GibcoBRL Life
Technologies）製）のコンピテント細胞を形質転換さ
せた（Methods Enzymol.、第２０４号、６３〜１１３
頁、１９９１年）。すなわち、該染色体ＤＮＡライブラ
リーのうち、５ｎｇのベクターを含む反応液を、ＤＨ５
α株コンピテント細胞２００μｌに加え、穏かに混和し
た後、氷中で３０分間放置した。ついで、４２℃で６０
秒間インキュベートし、氷中で１〜２分間冷却した後、
ＳＯＣ培地（培地組成：トリプトン２０ｇ／ｌ、酵母エ
キス５ｇ／ｌ、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩
化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ硫酸
マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を１ｍｌ加え、３
７℃で１時間インキュベートした。
ョン ＧＡが５´突出末端である該染色体ＤＮＡおよびＴＣが
５´突出末端である該ｐＵＣ１９ＤＮＡを２：１のモル
比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）の緩衝液ＡをＤＮ
Ａ溶液に対して４倍量添加し、さらに酵素液ＢをＤＮＡ
溶液と等量添加する。１６℃で１時間ライゲーション反
応を行なった。これにより、バチラス セリウスの染色
体ＤＮＡライブラリーを完成させた。該ライブラリーを
２５ｎｇ用いて、常法にしたがい作製した大腸菌ＤＨ５
α株（ギブコBRLライフテクノロジー社（GibcoBRL Life
Technologies）製）のコンピテント細胞を形質転換さ
せた（Methods Enzymol.、第２０４号、６３〜１１３
頁、１９９１年）。すなわち、該染色体ＤＮＡライブラ
リーのうち、５ｎｇのベクターを含む反応液を、ＤＨ５
α株コンピテント細胞２００μｌに加え、穏かに混和し
た後、氷中で３０分間放置した。ついで、４２℃で６０
秒間インキュベートし、氷中で１〜２分間冷却した後、
ＳＯＣ培地（培地組成：トリプトン２０ｇ／ｌ、酵母エ
キス５ｇ／ｌ、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩
化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ硫酸
マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を１ｍｌ加え、３
７℃で１時間インキュベートした。
【００３１】実施例２
実施例１で形質転換した大腸菌を、ジメチルスルホキシ
ドに溶解した０．１Ｍベンジル溶液をプレート１枚あた
り４０μｌ塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に蒔
き、３７℃で一晩培養したところ、２７１０個のコロニ
ーが観察された。さらに室温に放置し、ハロー形成を待
った。すなわち、大腸菌のコロニーの周辺のベンジルが
還元されてベンゾインが生成されると、溶解度が上が
り、ハローが形成される現象を利用して、ベンジル還元
酵素を持つクローンのスクリーニングの指標とした。そ
の結果、ハロー形成したコロニーは７個あり、最も早い
ものでは、形質転換した菌液を蒔いてから３０時間でハ
ローを形成した。
ドに溶解した０．１Ｍベンジル溶液をプレート１枚あた
り４０μｌ塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に蒔
き、３７℃で一晩培養したところ、２７１０個のコロニ
ーが観察された。さらに室温に放置し、ハロー形成を待
った。すなわち、大腸菌のコロニーの周辺のベンジルが
還元されてベンゾインが生成されると、溶解度が上が
り、ハローが形成される現象を利用して、ベンジル還元
酵素を持つクローンのスクリーニングの指標とした。そ
の結果、ハロー形成したコロニーは７個あり、最も早い
ものでは、形質転換した菌液を蒔いてから３０時間でハ
ローを形成した。
【００３２】得られた７個のコロニーを液体培養ＬＢ培
地（培地の組成：トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５
ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）２ｍ
ｌに接種して、３７℃で１２時間振とう培養した。基質
の０．１Ｍベンジルを２０μｌ（最終濃度１ｍＭ）添加
した後、さらに２４時間培養した。酢酸エチルで菌液か
ら基質と生成物を抽出し、ヘキサン：エーテル：酢酸
（容量比４５：５：１）を溶媒とした薄層クロマトグラ
フィーで展開し、ベンジル還元活性を再確認した。その
結果、活性を示したのは、最も早くハローを形成した菌
体のみであった。そこで本発明者らは、この菌体が有す
る組換えベクターをｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と命名した。
地（培地の組成：トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５
ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）２ｍ
ｌに接種して、３７℃で１２時間振とう培養した。基質
の０．１Ｍベンジルを２０μｌ（最終濃度１ｍＭ）添加
した後、さらに２４時間培養した。酢酸エチルで菌液か
ら基質と生成物を抽出し、ヘキサン：エーテル：酢酸
（容量比４５：５：１）を溶媒とした薄層クロマトグラ
フィーで展開し、ベンジル還元活性を再確認した。その
結果、活性を示したのは、最も早くハローを形成した菌
体のみであった。そこで本発明者らは、この菌体が有す
る組換えベクターをｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と命名した。
【００３３】つぎに、ＥＺ：：ＴＮ（商標）＜ＫＡＮ−
１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、エピセンタ
ーテクノロジーズ社（Epicentre Technologies Corpora
tion）製）を用いて、ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１の挿入断片の
塩基配列を決定した。すなわち、ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１
０．２μｇ、ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と等モルの＜ＫＡＮ＞
トランスポゾン（０．１ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、ＥＺ：：
ＴＮ１０倍反応緩衝液（０．５Ｍトリス酢酸（ｐＨ７．
５）、１．５Ｍ酢酸カリウム、１００ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、４０ｍＭスペルミジン）１μｌ、およびＥＺ：：
ＴＮトランスポザーゼ１ユニットに純水を加えて全量１
０μｌとし、３７℃で２時間インキュベートした。つい
で、ＥＺ：：ＴＮ反応停止液（１％ＳＤＳ溶液）１μｌ
を加え、７０℃で１０分間インキュベートしてトランス
ポザーゼを失活させた。当該反応液３μｌを用いて、実
施例１と同様に大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、カナマ
イシンとアンピシリンを含む寒天培地に蒔いて、３７℃
で一晩培養したところ、約２０００個のコロニーが形成
された。
１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、エピセンタ
ーテクノロジーズ社（Epicentre Technologies Corpora
tion）製）を用いて、ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１の挿入断片の
塩基配列を決定した。すなわち、ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１
０．２μｇ、ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と等モルの＜ＫＡＮ＞
トランスポゾン（０．１ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、ＥＺ：：
ＴＮ１０倍反応緩衝液（０．５Ｍトリス酢酸（ｐＨ７．
５）、１．５Ｍ酢酸カリウム、１００ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、４０ｍＭスペルミジン）１μｌ、およびＥＺ：：
ＴＮトランスポザーゼ１ユニットに純水を加えて全量１
０μｌとし、３７℃で２時間インキュベートした。つい
で、ＥＺ：：ＴＮ反応停止液（１％ＳＤＳ溶液）１μｌ
を加え、７０℃で１０分間インキュベートしてトランス
ポザーゼを失活させた。当該反応液３μｌを用いて、実
施例１と同様に大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、カナマ
イシンとアンピシリンを含む寒天培地に蒔いて、３７℃
で一晩培養したところ、約２０００個のコロニーが形成
された。
【００３４】つぎに、シングルコロニーを液体ＬＢ培地
３．５ｍｌに接種して、３７℃で一晩振とう培養した。
培養後、市販のプラスミドＤＮＡ調製キットであるＦｌ
ｅｘｉＰｒｅｐ（商標）キット（アマシャムファルマシ
アバイオテク社（amersham pharmacia biotech）製を用
い、菌液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡを精製し
た。すなわち、培養後に菌体を回収し、該菌体に溶液Ｉ
（１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、４００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＩ）を添加
し、ボルテックスにて懸濁する。ついで、溶液ＩＩ（１
Ｍ 水酸化ナトリウム、５．３％（重量／容量）ＳＤ
Ｓ）２００μｌを添加し穏かに混和した後、溶液ＩＩＩ
（３Ｍカリウム、５Ｍ酢酸）２００μｌを添加し混和し
た。遠心して得た上清に対しイソプロパノール沈澱を行
なった後、遠心によりＤＮＡの沈澱を得た。Ｓｅｐｈａ
ｇｌａｓ（商標）ＦＰ（７Ｍグアニジン−塩酸、５０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）
１５０μｌを添加して懸濁し、該ＤＮＡを溶解させた。
ついで遠心して上清を除き、洗浄緩衝液（２０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、６０％エタノール）２００μｌを添
加して懸濁し、再び遠心により沈澱を得た。該沈殿に７
０％エタノール３００μｌを添加し、ボルテックスにて
軽く撹拌した。再び遠心して沈澱を得、ボルテックスに
て軽く撹拌し、沈澱を室内で１０分間乾燥させた。つい
で、ＴＥ緩衝液で溶出することにより、ＤＮＡを回収し
た。
３．５ｍｌに接種して、３７℃で一晩振とう培養した。
培養後、市販のプラスミドＤＮＡ調製キットであるＦｌ
ｅｘｉＰｒｅｐ（商標）キット（アマシャムファルマシ
アバイオテク社（amersham pharmacia biotech）製を用
い、菌液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡを精製し
た。すなわち、培養後に菌体を回収し、該菌体に溶液Ｉ
（１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、４００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＩ）を添加
し、ボルテックスにて懸濁する。ついで、溶液ＩＩ（１
Ｍ 水酸化ナトリウム、５．３％（重量／容量）ＳＤ
Ｓ）２００μｌを添加し穏かに混和した後、溶液ＩＩＩ
（３Ｍカリウム、５Ｍ酢酸）２００μｌを添加し混和し
た。遠心して得た上清に対しイソプロパノール沈澱を行
なった後、遠心によりＤＮＡの沈澱を得た。Ｓｅｐｈａ
ｇｌａｓ（商標）ＦＰ（７Ｍグアニジン−塩酸、５０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）
１５０μｌを添加して懸濁し、該ＤＮＡを溶解させた。
ついで遠心して上清を除き、洗浄緩衝液（２０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、６０％エタノール）２００μｌを添
加して懸濁し、再び遠心により沈澱を得た。該沈殿に７
０％エタノール３００μｌを添加し、ボルテックスにて
軽く撹拌した。再び遠心して沈澱を得、ボルテックスに
て軽く撹拌し、沈澱を室内で１０分間乾燥させた。つい
で、ＴＥ緩衝液で溶出することにより、ＤＮＡを回収し
た。
【００３５】当該プラスミドはＫＡＮ−１トランスポゾ
ンが挿入されたｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１（以下ｐＫＢＣ−Ｂ
１とする）であり、ＫＡＮ−１トランスポゾンの末端部
分にはＫＡＮ−１ＦＰ−１プライマーとＫＡＮ−１ＲＰ
−１プライマーがハイブリダイズし得る塩基配列が存在
している。そこで、ＫＡＮ−１ＦＰ−１またはＫＡＮ−
１ＲＰ−１プライマーを用いてｐＫＢ−Ｂ１の塩基配列
をよむことにより、ＫＡＮ−１トランスポゾンの挿入さ
れた部位の両側の塩基配列を決定した。ついで、トラン
スポゾンの挿入部位が異なる複数のｐＫＢＣ−ＢＣ１に
おいても、挿入断片の塩基配列を決定することにより、
ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１に挿入されているバチラス セリウ
ス由来ＤＮＡ断片の全塩基配列を決定することができ
た。同定したｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１の挿入断片は２４３８
ｂｐであることが判明し、該挿入断片上には数個のＯＲ
Ｆが考えられた。
ンが挿入されたｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１（以下ｐＫＢＣ−Ｂ
１とする）であり、ＫＡＮ−１トランスポゾンの末端部
分にはＫＡＮ−１ＦＰ−１プライマーとＫＡＮ−１ＲＰ
−１プライマーがハイブリダイズし得る塩基配列が存在
している。そこで、ＫＡＮ−１ＦＰ−１またはＫＡＮ−
１ＲＰ−１プライマーを用いてｐＫＢ−Ｂ１の塩基配列
をよむことにより、ＫＡＮ−１トランスポゾンの挿入さ
れた部位の両側の塩基配列を決定した。ついで、トラン
スポゾンの挿入部位が異なる複数のｐＫＢＣ−ＢＣ１に
おいても、挿入断片の塩基配列を決定することにより、
ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１に挿入されているバチラス セリウ
ス由来ＤＮＡ断片の全塩基配列を決定することができ
た。同定したｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１の挿入断片は２４３８
ｂｐであることが判明し、該挿入断片上には数個のＯＲ
Ｆが考えられた。
【００３６】つぎに、当該ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＤ
ＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベ
ースの塩基配列データベースにおいて既知の塩基配列と
の相同性を検索したが、当該塩基配列と高い相同性を有
する塩基配列は得られなかった。そこで、考えられるＯ
ＲＦ毎に、そのＯＲＦがコードするアミノ酸配列をＤＤ
ＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベ
ースのアミノ酸配列データベースにて相同検索したとこ
ろ、配列表の配列番号２に示した２４９残基からなるア
ミノ配列が、バチラス ズブチルスのｙｕｅＤ遺伝子で
コードされるアミノ酸配列（２４３アミノ酸残基）と４
０％の相同性を有していた。該ＹｕｅＤタンパク質の機
能は不明であるが、そのアミノ酸配列はセピアプテリン
（sepiapterin）還元酵素に高い相同性を有していた。
該セピアプテリン還元酵素は、葉酸代謝において次の反
応を触媒する。 （６Ｒ）−ラクトイル−５，６，７，８−テトラヒドロ
プテリン＋２ＮＡＤＰＨ→テトラヒドロプテリン＋２Ｎ
ＡＤＰ+
ＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベ
ースの塩基配列データベースにおいて既知の塩基配列と
の相同性を検索したが、当該塩基配列と高い相同性を有
する塩基配列は得られなかった。そこで、考えられるＯ
ＲＦ毎に、そのＯＲＦがコードするアミノ酸配列をＤＤ
ＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベ
ースのアミノ酸配列データベースにて相同検索したとこ
ろ、配列表の配列番号２に示した２４９残基からなるア
ミノ配列が、バチラス ズブチルスのｙｕｅＤ遺伝子で
コードされるアミノ酸配列（２４３アミノ酸残基）と４
０％の相同性を有していた。該ＹｕｅＤタンパク質の機
能は不明であるが、そのアミノ酸配列はセピアプテリン
（sepiapterin）還元酵素に高い相同性を有していた。
該セピアプテリン還元酵素は、葉酸代謝において次の反
応を触媒する。 （６Ｒ）−ラクトイル−５，６，７，８−テトラヒドロ
プテリン＋２ＮＡＤＰＨ→テトラヒドロプテリン＋２Ｎ
ＡＤＰ+
【００３７】また、サッカロミセス セレビシエのＯＲ
Ｆ ＹＩＲ０３６Ｃでコードされるアミノ酸配列とも３
０％の類似性を有するという知見も得た。このＹＩＲ０
３６Ｃタンパク質の機能は不明であるが、そのアミノ酸
配列は酸化還元酵素の１種である短鎖アルコール脱水素
酵素に類似性を有していることが知られている。
Ｆ ＹＩＲ０３６Ｃでコードされるアミノ酸配列とも３
０％の類似性を有するという知見も得た。このＹＩＲ０
３６Ｃタンパク質の機能は不明であるが、そのアミノ酸
配列は酸化還元酵素の１種である短鎖アルコール脱水素
酵素に類似性を有していることが知られている。
【００３８】ＹｕｅＤタンパク質から推定した当該ＯＲ
Ｆが酸化還元機能を有することを確かめるために、塩基
配列を決定する過程において該ＯＲＦ上にトランスポゾ
ンが挿入されたｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１を、ベンジルを塗っ
たアンピシリン含有寒天プレートにて２５℃で３６〜４
８時間培養した。培養後に観察したところ、ハローを形
成したコロニーはみられなかった。したがって、該ＯＲ
Ｆがベンジル還元酵素をコードしていると判断した。終
止コドンを含めた該ＯＲＦを、配列表の配列番号１に示
す。
Ｆが酸化還元機能を有することを確かめるために、塩基
配列を決定する過程において該ＯＲＦ上にトランスポゾ
ンが挿入されたｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１を、ベンジルを塗っ
たアンピシリン含有寒天プレートにて２５℃で３６〜４
８時間培養した。培養後に観察したところ、ハローを形
成したコロニーはみられなかった。したがって、該ＯＲ
Ｆがベンジル還元酵素をコードしていると判断した。終
止コドンを含めた該ＯＲＦを、配列表の配列番号１に示
す。
【００３９】
【発明の効果】本発明者らは、芳香族ジケトン化合物の
新規不斉酸化還元酵素、たとえばベンジルを基質として
（Ｓ）−ベンゾインを選択的に生成することができる酸
化還元酵素、を初めて提供し、また同酸化還元酵素の遺
伝子、同遺伝子を含有する組換えベクターおよびその形
質転換体を提供した。本発明の遺伝子を用いれば、芳香
族ジケトン化合物に対し不斉還元能を示す新規酸化還元
酵素を種々の宿主細胞で発現させることができ、またこ
のような形質転換体を用いて発現させた酸化還元酵素
は、生菌体を用いた場合のように培養条件に影響される
ことなく酸化還元酵素反応を行なうことができる。ま
た、生菌体を用いた場合には、毒性のある基質を用いる
ことができないが、本発明に係る酵素を用いれば、この
ような制約なく酸化還元反応を行なうことが可能であ
り、本発明の酸化還元酵素は多くの化学反応に応用する
ことができる。
新規不斉酸化還元酵素、たとえばベンジルを基質として
（Ｓ）−ベンゾインを選択的に生成することができる酸
化還元酵素、を初めて提供し、また同酸化還元酵素の遺
伝子、同遺伝子を含有する組換えベクターおよびその形
質転換体を提供した。本発明の遺伝子を用いれば、芳香
族ジケトン化合物に対し不斉還元能を示す新規酸化還元
酵素を種々の宿主細胞で発現させることができ、またこ
のような形質転換体を用いて発現させた酸化還元酵素
は、生菌体を用いた場合のように培養条件に影響される
ことなく酸化還元酵素反応を行なうことができる。ま
た、生菌体を用いた場合には、毒性のある基質を用いる
ことができないが、本発明に係る酵素を用いれば、この
ような制約なく酸化還元反応を行なうことが可能であ
り、本発明の酸化還元酵素は多くの化学反応に応用する
ことができる。
【００４０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Arakawakagakukougyou kabushikigaisha
<120> An oxido-reductase, A gene encoding the enzyme, and Cloning of the
gene
<130> JP-12216
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 1
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccactcaa 60
ttgttagaag aaagtacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaataa agaacttact 120
aaacttgcag agcaatataa cagcaattgc atttttcatt ccttagatct tcaagatgta 180
cataacttag aaactaactt taaagaaatc atttcatcca ttaaagaaga caatgtatcc 240
tctattcatt taattaataa tgcaggtaca gttgcaccta tgaagccgat tgaaaaagca 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattcttaca 360
tctacgttta tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgcgttat aaatatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc ttatttcgga tggggcgctt attgtacgac gaaagctggt 480
gtaaatatgt ttacacaatg cgtagcaact gaagaagtgg aaaaagaata tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcccccgg tgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgtgaaaca 600
gctaaagaag acttcacaaa tttagaccgc ttcattgcat taaaagaaga aggaaagcta 660
ttatcacctg aatatgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga ggaattccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 2
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Glu Ser Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Lys Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Ile Phe His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Lys Glu Ile Ile Ser Ser Ile Lys Glu Asp Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Glu Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Val Glu Lys Glu
165 170 175
Tyr Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ala Gln Ile Arg Glu Thr Ala Lys Glu Asp Phe Thr Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Glu Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 丸山 励治
富山市寺町けや木台52 つかさハイツ寺
町203号
(72)発明者 糸井 泰
大阪府大東市南新田１丁目21−502
(56)参考文献 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，1988年，７，1191−1192
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，1985年，８，1111−1112
Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．,
2001年，75／６，630−633
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09 - 15/90
C12N 1/21
C12N 9/02
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】 配列表の配列番号２に示したアミノ酸配
列を有する酸化還元酵素。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に示した塩基配列で
コードされる酸化還元酵素。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１に示した塩基配列を
有する酸化還元酵素遺伝子。 - 【請求項４】 配列表の配列番号２に示したアミノ酸配
列をコードする酸化還元酵素遺伝子。 - 【請求項５】 請求項３または４記載の遺伝子を含有す
る組換えベクター。 - 【請求項６】 ベクターがｐＵＣ１９である請求項５記
載の組換えベクター。 - 【請求項７】 請求項５または６記載の組換えベクター
で形質転換された形質転換体。 - 【請求項８】 宿主細胞が微生物である請求項７記載の
形質転換体。 - 【請求項９】 当該微生物が大腸菌である請求項８記載
の形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000257829A JP3468216B2 (ja) | 2000-08-28 | 2000-08-28 | 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子および同遺伝子のクローニング |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000257829A JP3468216B2 (ja) | 2000-08-28 | 2000-08-28 | 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子および同遺伝子のクローニング |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002065267A JP2002065267A (ja) | 2002-03-05 |
| JP3468216B2 true JP3468216B2 (ja) | 2003-11-17 |
Family
ID=18746230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000257829A Expired - Fee Related JP3468216B2 (ja) | 2000-08-28 | 2000-08-28 | 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子および同遺伝子のクローニング |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3468216B2 (ja) |
-
2000
- 2000-08-28 JP JP2000257829A patent/JP3468216B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００１年，７５／６，６３０−６３３ |
| Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８５年，８，１１１１−１１１２ |
| Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８８年，７，１１９１−１１９２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002065267A (ja) | 2002-03-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |