FR2990698A1 - Laccase de podospora anserina et ses applications - Google Patents

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Abstract

La présente invention se rapporte à une nouvelle laccase de Podospora anserina, à son procédé de préparation ainsi qu'à son utilisation notamment pour la délignification du papier, comme décolorant, dépolluant et désodorisant ou encore pour réduire l'oxygène.

Description

LACCASE DE PODOSPORA ANSERINA ET SES APPLICATIONS La présente invention se rapporte à une nouvelle laccase isolée à partir de Podospora anserina, à son procédé de préparation ainsi qu'à son utilisation notamment pour la délignification du papier, comme décolorant, dépolluant et désodorisant ou encore pour réduire l'oxygène.
Les laccases sont des enzymes à cuivre qui oxydent les polyphénols en utilisant l'oxygène comme accepteur final d'électrons. Elles sont présentes dans les plantes, dans de très nombreux champignons (dégradation de la lignine) ainsi que dans quelques bactéries. La structure des laccases est telle que leur site actif est constitué de 4 atomes de cuivre, un de type 1 (Ti), isolé, responsable de l'oxydation des phénols et un cluster de 3 atomes de cuivre (un de type 2, T2, et deux de type 3, T3) responsable de l'activation du 02. Le mécanisme d'action des laccases et notamment le rôle du centre métallique, reste mal connu ; il est admis un mécanisme en deux temps : 1. le cuivre Ti arrache un électron au substrat ; 2. l'électron est transféré au centre T2/T3 sur une distance d'environ 12,5 À. Après complète réduction du centre trinucléaire, la réduction de l'oxygène moléculaire intervient. OH 4 e 4e 4 02 20H2 4 02 20H2 OH Lip^-Pakymérisation Schéma général de la réaction d'oxydation des phénols par les laccases Les inventeurs ont maintenant identifié une nouvelle laccase produite par Podospora anserina qui présente des caractéristiques plus avantageuses que les laccases disponibles dans le commerce, notamment celle de Trametes versicolor. Selon un premier objet, l'invention se rapporte à la laccase purifiée et 25 isolée de Podospora anserina de SEQ. ID. N°1 ; cette enzyme correspond à une protéine prédite par le séquençage du génome de Podospora anserina (traduite à partir du gène

Claims (22)

  1. REVENDICATIONS1. ayant le numéro d'accession B2ANK8 dans la base de REVENDICATIONS1. ayant le numéro d'accession B2ANK8 dans la base de données UniProt, ce gène complet a pour séquence SEQ. ID. N°2) à l'exception des 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale de la protéine ; en particulier, la laccase purifiée (pureté > 95%) selon l'invention présente un pourcentage d'identité d'au moins 90%, et par ordre de préférence 5 croissant au moins 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, par rapport à la laccase de Podospora anserina de SEQ. ID. N°1, elle catalyse la réaction d'oxydation de noyaux phénoliques et est liée à quatre atomes de cuivre ; la séquence d'acides nucléiques SEQ. ID. N°4 (correspondant à la SEQ. ID. N°2 à l'exclusion du fragment codant pour les 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale) code pour cette laccase de SEQ. ID. 10 N°1. La laccase de SEQ. ID. N°3 est également un objet de la présente invention, la laccase de SEQ. ID. N°3 diffère de la laccase de SEQ. ID. N°1 en ce qu'elle comporte un acide aminé additionnel, une sérine, en position N-terminale ; cette laccase est obtenue en exprimant dans la levure Pichia pastoris la molécule d'acide nucléique de SEQ. 15 ID. N°4 clonée dans le vecteur d'expression pFD56 dont la construction est telle qu'elle permet l'expression d'une protéine portant une sérine additionnelle en position N-terminale. La laccase de SEQ. ID. N°5, qui correspond au polypeptide codé par la SEQ. ID. N°2 et qui comporte les 30 acides aminés de l'extrémité N-terminale, est 20 également un objet de la présente invention. De façon générale, les inventeurs ont constaté que les modifications de séquences introduites à l'extrémité N-terminale, qu'il s'agisse d'ajout d'acides aminés ou de substitution, délétion ou insertion au sein de l'extrémité N-terminale dans la limite du maintien d'une identité d'au moins 90% avec la SEQ. ID. N°1, n'affectaient pas les 25 propriétés enzymatiques de la laccase selon l'invention. L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de la laccase de Podospora anserina (SEQ. ID. N°1) comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. 30 Le pourcentage d'identité peut être calculé par l'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402). Les programmes BLAST sont mis en oeuvre sur la fenêtre de comparaison constituée de la totalité de la SEQ. ID. N°1 indiquée comme séquence de référence.Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X% d'identité avec une séquence de référence est défini, dans la présente invention, comme un peptide dont la séquence peut inclure jusque 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles dudit peptide de référence. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Une séquence protéique SEQ. ID. N°5 prédite à partir du séquençage systématique du génome de Podospora anserina est décrite dans la base de données UniProt (numéro d'accession B2ANK8) ; il convient de souligner que les informations présentées dans la base de données UniProt sont prédictives et putatives, elles ne résultent pas de l'isolement et de la caractérisation expérimentales de protéines de Podospora anserina. En outre, la base de données UniProt n'indique aucune activité enzymatique précise pour cette protéine prédite. La nouvelle laccase selon l'invention présente des propriétés améliorées par rapport aux laccases disponibles dans le commerce issues de Trametes versicolor, Rhus vernicifèra, Agaricus bisporus ou encore Pleurotus ostreatus. La présente invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique codant pour la laccase selon l'invention ; de préférence, il s'agit d'une molécule d'acide nucléique de séquence choisie parmi la SEQ. ID. N°2 ou de façon préférentielle, il s'agit de la SEQ. ID. N°4 codant pour la laccase de Podospora anserina clivée au niveau des 30 premiers acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale de la protéine. La molécule d'acide nucléique codant pour la laccase selon l'invention peut être clonée dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide, puis transformée dans un hôte approprié tel qu'une bactérie, une levure ou encore une culture cellulaire. Par vecteur d'expression, on entend un vecteur possédant une région permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique codante entre les signaux indispensables à son expression, notamment, un promoteur (constitutif ou inductible), un site de fixation des ribosomes, un signal de terminaison de transcription et, éventuellement, un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique. La présente invention se rapporte encore à un vecteur d'expression comprenant ladite molécule d'acide nucléique et à une cellule hôte transformée avec ledit vecteur d'expression et exprimant une laccase selon l'invention.L'introduction du vecteur d'expression dans la cellule hôte peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier, par modification de la perméabilité membranaire de la cellule hôte, par exemple en présence d'ions calcium, ou par électroporation. Après culture des cellules hôtes transformées pour exprimer la laccase selon l'invention, lesdites cellules peuvent être récupérées par centrifugation, lysées afin de libérer les enzymes dont ladite laccase selon l'invention. Selon une variante préférée de l'invention, la lacccase selon l'invention est produite par la levure Pichia pastoris. Pour permettre la surproduction et la sécrétion de la laccase dans le milieu de culture de la levure Pichia pastoris, la molécule d'acide nucléique de SEQ. ID. N°4, codant pour la laccase de séquence SEQ. ID. N°3 lorsqu'elle est clonée dans le vecteur pFD56 comme décrit ci-après, est introduite par recombinaison homologue dans le génome de la levure, au niveau du gène A0X1. Pour cela, le plasmide pFD56, une fois linéarisé par digestion avec l'enzyme pmeI, est introduit dans la levure par électroporation et les clones positifs sont sélectionnés sur milieu YPD + agar contenant de la zéocine à 100p,g/ml. A partir d'un clone isolé sur boite de Pétri, une préculture de 200 mL de milieu YPD supplémentée en zéocine (100 ktg/mL) est ensemencée. Après une nuit sous agitation à 220 rpm et à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10 minutes à 4000 rpm et le culot est repris dans 200 ml d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant 1mM de CuSO4 dans un Erlenmeyer de 5L est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2 heures avant d'ajouter 0,5% de méthanol pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant 5 jours afin d'obtenir le maximum d'enzymes. Pour la mise en oeuvre de cette méthode, on peut, sans caractère limitatif, utiliser le matériel suivant : - vecteur pour l'expression dans Pichia pastoris (pFD56): plasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la laccase de Podospora anserina en phase avec le facteur de 30 sécrétion a-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur A0X1 inductible au méthanol. - souche de levure Pichia pastoris GS115 utilisée pour la production de la laccase selon l'invention après intégration de la cassette issue du vecteur pFD56 contenant le promoteurA0X1, le peptide signal a-factor et la séquence ADN codant la laccase de Podospora anserina. - Milieux de culture : Milieu riche YPD (pour levure) : 1% yeast extract 2% bacto-peptone 2% glucose pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu minimum MMH (pour levure) : 1,34% yeast nitrogen base 1% Casamino acid 0,4% histidine 4*10-5 % Biotine pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu riche LB (pour bactérie) : Tryptone 10 g/L Extrait de levure 5 g/L NaC1 5 g/L H20 distillée qsp 1L pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C. Selon une autre variante, Escherichia cou i peut être choisie comme micro-organisme hôte, les plasmides qui peuvent alors être utilisés sont notamment les plasmides pBluescript, pUC18, pET, pGEX, pGS, pMAL-c2 ou similaires. Selon cette variante de préparation de la laccase selon l'invention, la 25 laccase est avantageusement exprimée par une bactérie E. cou i transformée avec un vecteur d'expression pET2la codant pour une enzyme accolée à une étiquette 6HIS en position C-terminale. Ce procédé est rapide et simple ; en effet, l'induction de l'expression de la laccase de Podospora anserina dans la bactérie E. cou i s'effectue en 4 à 24 heures. 30 En outre, l'étiquette 6HIS permet la purification de la laccase de Podospora anserina par chromatographie d'affinité sur une résine nickel en une seule étape pour l'obtention d'une enzyme pure. Pour la mise en oeuvre de ce procédé de préparation, l'homme du métier choisit la cellule hôte en fonction du vecteur d'expression utilisé.De préférence, lorsque le vecteur d'expression pET2 1 a est utilisé, on choisit une cellule hôte exprimant la T7 RNA polymérase telles que les souches d'E. colt BL21 DE3, BL21-SI, BL21 pLys, Novablue(DE3) ou BL21 Star. La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation d'une laccase selon l'invention comprenant les étapes de : a) préparation de cellules hôtes, exprimant la laccase selon l'invention ; b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ; c) récupération du milieu de culture et élimination des cellules hôtes, par exemple par centrifugation ; d) traitement du milieu de culture obtenu à l'étape c) par chromatographie d'interactions hydrophobes ; e) récupération de ladite laccase purifiée. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé selon l'invention est tel que : - la souche de levure Pichia pastoris utilisée est la souche GS115 ; - le vecteur d'expression dans Pichia pastoris (pFD56) est le plasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la laccase de Podospora anserina en phase avec le facteur de sécrétion a-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur A0X1 inductible au méthanol ; - la culture réalisée à l'étape b) comprend au moins une étape de culture en phase liquide, sous agitation, à une température comprise entre 18 et 37°C, de préférence 25°C, au cours de laquelle, l'expression de la laccase est induite par l'ajout de méthanol ; l'induction par ajout de méthanol pouvant éventuellement être renouvelée. Lorsque le procédé est mis en oeuvre selon ces conditions préférées, il permet la production de la laccase avec un temps d'induction court, de l'ordre de 3 à 7 jours ; la purification de la laccase est réalisée en une seule étape de chromatographie d'interactions hydrophobes et la laccase ainsi produite comporte bien les quatre atomes de cuivre nécessaires à son activité. Lorsque la laccase selon l'invention est produite par une souche telle qu'Escherichia cou, alors le procédé de préparation d'une laccase selon l'invention comprend les étapes de : a) préparation de cellules hôtes, exprimant la laccase selon l'invention ; b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ;c) lyse des cellules hôtes ; d) traitement du lysat obtenu à l'étape c) par chromatographie d' affinité ; e) récupération de ladite laccase purifiée. Il est également possible de produire une laccase en présence d'agents dénaturants comme l'urée, le chlorure de guanidium, le SDS, le triton... ; la laccase ainsi produite sera alors dépourvue de cuivre et pourra être activée par l'ajout d'atomes de cuivre. La Demanderesse a démontré que la laccase selon l'invention présente 10 des propriétés électrochimiques meilleures que les laccases vendues dans le commerce (voir le point 10 de la partie expérimentale), en particulier celle de Trametes versicolor. Ainsi, de par leurs propriétés enzymatiques avantageuses, les laccases selon l'invention présentent un intérêt particulier dans les applications suivantes : - Utilisation dans l'industrie papetière. 15 Les applications les plus habituelles des laccases concernent la délignification et/ou le blanchiment de la pate à papier. Dans la préparation industrielle de papier, la séparation et la dégradation de la lignine dans la pâte de bois sont classiquement obtenues en utilisant du chlore et/ou des oxydants chimiques ; ces méthodes conventionnelles présentent l'inconvénient d'être 20 polluantes. Les laccases selon l'invention offrent une alternative avantageuse pour réaliser la délignification mais aussi le blanchiment de la pate à papier sans chlore. - Utilisation comme décolorant. La capacité qu'ont les laccases à blanchir le papier peut s'appliquer dans d'autres domaines : les laccases selon l'invention peuvent également être utilisées pour 25 éliminer l'encre du papier et/ou le décolorer, notamment en vue de son recyclage ; elles peuvent également être utilisées pour le traitement des tissus, en particulier le blanchiment du coton ou pour produire la couleur indigo décolorée des jean' s. - Utilisation comme dépolluant. Une autre application très fréquente des laccases concerne leur utilisation 30 comme dépolluant ; cette enzyme peut en effet dégrader un large spectre de contaminants environnementaux indésirables incluant des phénols (polluant phénolique éventuellement chlorés) et des matières plastiques. Une utilisation avantageuse des laccases selon l'invention concerne ainsi la dépollution de produits à base de phénol. - Utilisation comme désodorisant et dans des compositions détergentes.Grace à leur capacité de dégrader des polluants, les laccases permettent également de désodoriser des matériaux comme les tissus ; elles sont ainsi utiles dans des compositions détergentes pour le lavage du linge ou de la vaisselle. - Utilisation dans l'industrie alimentaire. Les laccases sont utilisées dans l'industrie alimentaire comme conservateur de produit alimentaire, en particulier comme additif afin d'éliminer des réactifs oxydants (désoxygénation), par exemple pour la stabilisation des jus de fruits et du vin. Elles sont également utilisées comme exhausteur de goût de produit 10 alimentaire ; par exemple, elles sont impliquées dans le précédé de préparation du cacao pour en exhausser le goût (trempage dans une solution de laccase avant de sécher et griller). Les laccases selon l'invention ont encore comme intérêt de permettre la réticulation des protéines du lactosérum en oligo- ou polymères et conduire ainsi à la 15 formation de gels (Faergemand et al. 1998 J. Agric. Food Chem.46, 1326-1333 ; Mattinen et al. 2005 FEBS Journal 272, 3640-3650). - Utilisation pour la mise en oeuvre de synthèses organiques. Les laccases interviennent dans le procédé de production d'éthanol à partir de matière première recyclée. 20 - Utilisation dans le domaine pharmaceutique. Là encore, les laccases sont utiles pour la synthèse de composés anesthésiques, anti-inflammatoires, antibiotiques ou encore de l'iode. - Utilisation dans le domaine cosmétique. De nombreux développements sont réalisés dans le domaine cosmétique, 25 il s'agit en particulier d'utilisation comme réactifs dans des compositions de teinture d'oxydation où les laccases permettent la préparation de produit moins irritant. Elles permettent également la préparation de produit éclaircissant pour la peau. Enfin, elles peuvent être utilisées dans des déodorants ou des produits d'hygiène comme le savon et le dentifrice. 30 - Utilisation pour la fabrication d'électrodes et de biopiles. La laccase selon l'invention présente un intérêt particulier pour la fabrication d'électrodes sur lesquelles l'enzyme est immobilisée. Ainsi, la présente invention se rapporte également à des électrodes à laccase comprenant un matériau conducteur tel qu'un métal conducteur, notamment, duplatine, du cuivre, de l'argent, de l'aluminium, de l'or ou de l'acier ou du carbone, comme du carbone vitreux, des fibres de carbone, des fibres de nanotubes de carbone ou encore en diamant... ledit matériau conducteur est recouvert d'un dépôt comprenant au moins une laccase selon l'invention ; ledit dépôt pouvant en outre comprendre un polymère redox pour améliorer la conduction électrique entre l'enzyme et l'électrode ainsi que la stabilité du système. Le polymère redox peut être par exemple choisi parmi les polymères à base de ferrocène, d'osmium et de ruthénium et les polymères conducteurs tels que par exemple le polypyrrole et la polyananilline. Les méthodes d'immobilisation de la laccase sur ledit matériau conducteur peuvent être choisies parmi les méthodes classiques à la disposition de l'homme du métier qui comprennent notamment l'inclusion de la laccase dans une matrice polymérique, l'adsorption de la laccase à la surface de la membrane polymérique, la fixation par liaison covalente, l'électrodéposition (Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, N°5, 810-813) ou encore la technique décrite dans la Demande de Brevet Américain US 2009/0053582. Selon une variante de réalisation, l'électrode à laccase sur laquelle est immobilisée la laccase est également recouverte d'une membrane qui évite le détachement de ladite enzyme de l'électrode. Selon les applications envisagées, ladite membrane peut être constituée de nafion, de cellulose ou de tout matériau biocompatible, c'est-à-dire compatible avec un environnement physiologique. La présente invention se rapporte ainsi également à un biocapteur à oxygène, de composés phénoliques ou d'amines aromatiques constitué d'une électrode à laccase selon l'invention. De façon générale, un biocapteur consiste en une électrode sur laquelle est immobilisé un biorécepteur capable de reconnaître une cible biologique ; la fixation de la cible biologique sur le biorécepteur conduit à des modifications physico-chimiques de la membrane et la production d'un signal électrique par un transducteur électrochimique (ampérométrique, potentiométrique, conductimétrique,...) accolé à l'électrode. Dans le cas présent, le biorécepteur est une laccase selon l'invention et la cible biologique est un composé choisi parmi le l'oxygène, des composés phénoliques ou des amines aromatiques. La présente invention se rapporte aussi à un capteur à oxygène constitué d'une électrode selon l'invention.L'électrode à laccase selon l'invention peut encore être avantageusement utilisée à titre de cathode dans une biopile enzymatique ; la Figure lA représente schématiquement le principe de fonctionnement d'une biopile enzymatique. Les biopiles enzymatiques selon l'invention sont des dispositifs comprenant une électrode à laccase (lacca) à titre de cathode et une anode où une réaction d'oxydation d'un substrat se produit (catalysée par l'« enzyme X ») ; à titre d'illustration, le substrat peut être du glucose et l'« enzyme X» la glucose oxydase, une telle pile présente un intérêt particulier lorsque la biopile est implantée chez un individu pour une application médicale ; le substrat peut aussi être choisi, par exemple, parmi des nitrites, nitrates, sulfures, urates, ascorbates, glutamates, pyruvates, lactates, de la cellulose.., si une application en dépollution est envisagée, le choix de l'enzyme se fera alors en fonction du substrat à dégrader, à titre d'exemple, les enzymes suivantes peuvent être utilisées, le type de substrat qu'elles peuvent dégrader est mentionné entre parenthèse : la glucose oxydase (glucose ou tous les sucres étant oxydés par cette enzyme), la lactate oxydase (lactate), la pynivate oxydase (pyruvate), l'alcool oxydase (alcool), la cholestérol oxydase (cholestérol), la glutamate oxydase (glutamate), la pyranose oxydase (pyranose), la choline oxydase (choline), la cellobiose déshydrogénase (cellobiose), la glucose déshydrogénase (glucose ou tous les sucres étant oxydés par cette enzyme), la pyranose déshydrogénase (pyranose), la fructose déshydrogénase (fructose), l'aldéhyde oxydase (aldéhyde), la gluconolactone oxydase (glucunolactone), l'alcool déshydrogénase (alcool), l'ascorbate oxydase (oxygène ou ascorbate) ou encore la sulfure dioxygénase (sulfure). Le procédé d'oxydation et de réduction concomitant aux électrodes de la biopile produit un courant électrique. La Figure 1B illustre plus spécifiquement une biopile enzymatique à glucose ; une telle biopile enzymatique consiste en deux électrodes modifiées par l'immobilisation d'enzymes. Une glucose oxydase (G0x) est fixée sur l'anode (I) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur « / » et une laccase (LAC) est fixée sur la cathode (2) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur «II ». En fonctionnement, à l'anode, les électrons sont transférés du glucose présent dans le fluide physiologique vers la G0x, puis de la GOx au polymère conducteur « / » et du polymère conducteur « / » vers l'anode. A la cathode, les électrons sont transférés de la cathode vers le polymère conducteur «II », puis vers la laccase et enfin de la laccase à l'oxygène présent dans le fluide physiologique. Il est à noter qu'une biopile peut aussi éventuellement fonctionner en modifiant les électrodes avec leurs enzymes respectives et en rajoutant des médiateurssolubles, tels que le ferrocèneméthanol pour l'anode et le ferricyanure de potassium pour la cathode, et en rajoutant le cas échéant une membrane séparant l'anode et la cathode. Une telle biopile peut être utilisée comme une source d'énergie miniaturisée et être implantée dans un organisme vivant. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : Figures La Figure lA représente schématiquement le principe de fonctionnement 10 d'une biopile enzymatique ; la Figure 1B représente une biopile enzymatique à glucose. La Figure 2 représente la carte plasmidique du vecteur pFD56. La Figure 3 est un graphe représentant l'activité catalytique de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction de la concentration d'ABTS à 37°C. La Figure 4 est un graphe représentant l'activité catalytique de la laccase 15 de SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction de la concentration de SGZ à 37°C. La Figure 5 est une courbe représentant l'activité relative de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction du pH sur l'oxydation de l'ABTS. La Figure 6 illustre la stabilité de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention à différents pH à 4°C. 20 La Figure 7 est un graphe représentant l'activité relative de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction de la température sur l'oxydation de l'ABTS. La Figure 8 est un graphe représentant la stabilité de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction du temps à 37°C et 60°C sur l'oxydation de l'ABTS. La Figure 9 représente l'effet du NaCl sur l'activité de la laccase de 25 SEQ. ID. N°3 selon l'invention à pH 7. EXEMPLE I. Préparation de la laccase issue du champignon Podospora anserina Matériels 1. Souche bactérienne d'Escherichia coui 30 DH5a : supE44, AlacU169, ()80 /acZDM15), hsdR17 , recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl (Hanahan, 1983). Cette souche est utilisée pour l'amplification de plasmide lors des étapes de construction du vecteur d'expression protéique.
  2. 2. Vecteur pFD56 : Plasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention issue de Podospora anserina en phase avec le facteur de sécrétion a-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur A0X1 inductible au méthanol ; le plasmide est représenté à la Figure 2.
  3. 3. Souche de la levure Pichia pastoris GS115 : souche de levure Pichia pastoris utilisée pour la production de la Laccase après intégration de la cassette issue du vecteur PFD56 contenant le promoteur A0X1, le peptide signal a-factor et la séquence ADN codant la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention 10 issue de Podospora anserina.
  4. 4. Milieu de culture Milieu riche YPD (pour levure) : 1% yeast extract 2% bacto-peptone 15 2% glucose pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu minimum MMH (pour levure) : 1,34% yeast nitrogen base 1% Casamino acid 20 0,4% histidine 4*10-5 % Biotine pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu riche LB (pour bactérie) : Tryptone 10 g/L 25 Extrait de levure 5 g/L NaCl 5 g/L H20 distillée qsp 1L pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Techniques de génie génétique 30
  5. 5. Transformation des bactéries supercompétentes Les bactéries DH5, supercompétentes sont préparées à l'aide de la méthode d'Inoue (Sambrook et Russel).
  6. 6. Transformation de la levure Pichia pastoris L'ADN est introduit dans la levure Pichia pastoris GS115 par électroporation sur un Eppendorf Eporator (Eppendorf, France).
  7. 7. Préparation de l'ADN Un kit de purification d'ADN plasmidique (Qiagen) est utilisé pour les préparations d'ADN en petite et grande quantité.
  8. 8. Séquençage de l'ADN double brin L'ADN double brin est séquencé par la société Millegen (Toulouse, France).
  9. 9. Construction du vecteur d'expression de la laccase Le gène de séquence SED. ID. N°4 correspondant à la séquence codant la laccase de Podospora anserina (accession B2ANK8) tronqué de la partie codant pour les 30 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale a été synthétisé par la société Genecust Europe (Luxembourg). Les sites de restriction NheI et NotI ont été respectivement ajoutés en 3' et 5' de la séquence pour faciliter le clonage. Le plasmide pPICZa ainsi que le gène synthétisé ont alors été traités avec les deux enzymes de restrictions NheI et NotI et les produits de digestion ont été purifiés sur gel avec le kit « nucleospin ». Le gène de la laccase est alors ligué dans le plasmide par co-incubation avec la T4 DNA Ligase à 37°C sur la nuit. Les plasmides néoformés (pFD56) sont alors sélectionnés et amplifiés par transformation de bactéries DH5a sur boite contenant de la zéocine à 25g/ml.
  10. 10. Intégration de la séquence codant la laccase dans le génome de Pichia pastoris Pour permettre la surproduction et la sécrétion de l'enzyme dans le milieu de culture de la levure Pichia pastoris, le gène correspondant est introduit par recombinaison homologue au niveau du gène A0X1. Pour cela, le plasmide pFD56 une fois linéarisé par digestion avec l'enzyme pmeI, est introduit dans la levure par électroporation et les clones positifs sont sélectionnés sur milieu YPD + agar contenant de la zéocine à 100p,g/ml. La séquence du plasmide ainsi obtenu est la SEQ. ID. N°6. Production, purification et caractérisation de l'enzyme laccase issue de Podospora anserina. Production de la laccase L'enzyme laccase de SEQ. ID. N°3 est produite par la levure Pichia pastoris via une induction au méthanol. Pour ce faire, une préculture de 200 mL de milieu YPD supplémentée en zéocine (100 itg/mL) est ensemencée par la souche GS115 ayantintégré la cassette contenue sur le plasmide pFD56. Après une nuit sous agitation à 220 rpm et à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10min à 4000rpm et le culot est repris dans 200m1 d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant 2mM de CuSO4 dans un Erlenmeyer de 5L est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2hrs avant d'ajouter 0.5% de méthanol pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant 5jours afin d'obtenir le maximum d'enzymes. Pour récupérer les protéines sécrétées, la culture de 2L est centrifugée et le surnageant contenant l'enzyme d'intérêt est concentré sur une cellule d'agitation avec une membrane YM10 d'un seuil de coupure de 10kDa pour atteindre un volume de 4-5m1 final. Purification de la laccase par chromatographie d'interactions hydrophobes Une fois concentré, 1.7M d'ammonium sulfate est ajouté au 4-5m1 du surnageant de culture avant d'être filtré sur filtre de 0.221.tm pour être injecté sur une colonne de chromatographie d'interactions hydrophobes, une Pheny1HP de 60m1 (GE 15 Healthcaree), couplée au système AKTA purifier (GE Healthcaree), équilibrée dans un tampon Potassium phosphate 50mM, (NH4)2SO4 1.7M, pH 6. L'élution est réalisée par un gradient de 0% à 100% d'un tampon Potassium phosphate 50mM pH 6 sous un débit de 2,5 mL/min. Les fractions contenant la protéine laccase sont identifiées par un test d'activité à l'ABTS et sont rassemblées, concentrées et stockées dans un tampon 20 Potassium phosphate 50mM pH 6 par centrifugation sur membrane Amicon YM10. A ce stade, la protéine est pure et peut être conservée à -20°C sous forme soluble. En comparant avec d'autres laccases disponibles commercialement, il apparait un réel avantage d'utilisation de cette protéine vis-à-vis du protocole de purification. En effet, une seule étape de purification est nécessaire pour l'obtention d'une 25 enzyme pure en opposition avec les successions de chromatographie (size exclusion, échangeuse anionique ou cationique, hydrophobe...) utilisées pour les autres enzymes [1]. II. Caractérisation de l'enzyme 1. Mesure de la concentration La concentration en enzyme d'une solution est calculée à partir d'une 30 gamme BSA selon la technique Bradford [2]. 2. Test enzymatique Les tests enzymatiques sont effectués à l'aide d'un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0.1M citrate/phosphate à 37°C dans un volume de 3mL en suivant l'oxydation de différents substrats à une longueur d'onde donnée en fonction du temps.L'activité spécifique de l'enzyme est exprimée en !moles de substrats oxydés par minute et par mg de protéine. Les substrats utilisés dans cette étude sont : l'ABTS (s420 ,,i 36 mM-1 cm-1) et la syringaldazine, SGZ (6530. = 64 mM-1 cm-1). Etude des propriétés enzymatiques de la laccase de Podospora anserina. Détermination des constantes cinétiques (ccat) et de Michaelis (Km) à l'état stationnaire 3. ABTS Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0.1M citrate/phosphate pH 3.4. La concentration en ABTS varie dans le test de 0 à 1.5mM. Le test est déclenché par l'ajout d'enzyme. Les points expérimentaux sont analysés par régression non linéaire selon le modèle de Michaelis-Menten à l'aide du logiciel Sigma-plot 6.0 selon l'équation ci-dessous: Modèle de Michaelis-Menten ks, = kcat * [S] / (Km + [S]) Résultats : kcat = 1372 s-1,Km = 307 1.1.M La Figure 3 représente l'activité catalytique de la laccase de SEQ. ID. N°3 en fonction de la concentration d'ABTS à 37°C. 4. Syringaldazine (SGZ) Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon citrate-phosphate 50mM pH 7. La concentration en SGZ, diluée dans le méthanol, varie dans le test de 0 à 5011M. Le test, déclenché par l'ajout d'enzyme, consiste à suivre l'oxydation de la SGZ à 530nm par changement colorimétrique (8530. = 64 mM-1 cm 1). Résultats : kcat = 1.3s-1, Km = 10.9 ktM Ces résultats sont présentés à la Figure 4. 5. Activité en fonction du pH L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 3 à 7 dans un tampon 0.1M citrate/phosphate en utilisant l'ABTS à 1mM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotomètre Varian. L'activité est suivie par 30 l'oxydation de l'ABTS aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 420nm. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. La Figure 5 représente l'activité relative de la laccase de SEQ. ID. N°3 en fonction du pH sur l'oxydation de l'ABTS.6. Stabilité en fonction du pH L'enzyme à une concentration de 0.15mg/m1 est préincubée dans un tampon phosphate-citrate 50mM (ou Tris-H2SO4 50mM pour pH 8 et 9) à un pH donné à 4°C. A des temps réguliers, des prélèvements de 5gL sont effectués et l'activité résiduelle de l'enzyme incubée aux différents pH est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian à 440nm dans un tampon 0.1M citrate/phosphate pH 3.4 à 37°C, en présence de 1501.1M d'ABTS. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure 6. 7. Activité en fonction de la température L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction de la température est réalisée dans un tampon 0.1M citrate/phosphate pH 4 en présence de 0,5mM d'ABTS. La température varie de 15 à 80°C. Le suivi de l'activité s'effectue sur un spectrophotomètre Varian CARY UV Biomelt régulé en température. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure 7. 8. Stabilité de l'enzyme en fonction de la température L'enzyme est préincubée à une concentration de 0.15 mg/mi dans un bain à sec à 60°C et à 37°C dans un tampon Potassium phosphate 50 mM pH 6. A des temps réguliers, des prélèvements de 51..tL sont effectués et l'activité résiduelle de l'enzyme incubée à ces températures est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian à 440nm dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate pH 3.4 à 37°C, en présence de 150 tM d'ABTS. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure 8. 9. Etude de l'activité enzymatique en présence de NaCl Pour vérifier l'influence du chlorure de sodium (présent en milieu physiologique) sur l'activité de la laccase, des concentrations croissantes en NaC1 ont été ajoutées au test d'activité consistant à suivre l'oxydation à 530nm de la SGZ à 37°C dans un tampon phosphate-citrate 50mM pH 7. Comme le montre la Figure 9 (Effet du NaCl sur l'activité de la laccase à 30 pH 7), en présence de 150mM de NaCl, concentration correspondant aux conditions physiologiques, l'enzyme présente encore 70% d'activité d'oxydation. 10. Mesures électrochimiques Pour démontrer l'avantage de cette nouvelle enzyme et à titre d'exemple comparatif, deux électrodes enzymatiques ont été préparées comprenant soit la laccase deSEQ. ID. N°3 selon la présente invention, soit la laccase de Trametes versicolor (la laccase communément utilisée en électrochimie) et un polymère redox. A pH 7 et en présence de Cl, le courant catalytique pour la réduction d'02 est 40 % plus important pour l'électrode modifiée avec la nouvelle enzyme. En outre, la stabilité dans le temps est 200% plus importante. Références bibliographiques 1. Colao, M.C., et al., Heterologous expression of lcc 1 gene from Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Microb Cell Fact, 2006. 5: p. 31. 2. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of micro gram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54. 3. Kataoka, K., et al., High-level expression of Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase in Pichia pastoris, and its facile purification and characterization. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 77-83. 4. Sakasegawa, S., et al., Bilirubin oxidase activity of Bacillus subtilis CotA. Appl Environ Microbiol, 2006. 72(1): p. 972-5. 5. Felsenfeld, G., The determination of cuprous ion in copper proteins. Arch Biochem Biophys, 1960. 87: p. 247-51.20REVÊNDICATIONS 1. Laccase purifiée caractérisée en ce qu'elle présente un pourcentage d'identité d'au moins 90% par rapport à la laccase de Podospora anserina de SEQ. ID. N°1 ; en ce qu'elle catalyse la réaction d'oxydation de noyaux phénoliques et en ce qu'elle est liée à quatre atomes de cuivre. 2. Laccase purifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les laccases de séquence SEQ. ID. N°1, 3 et 5. 3. Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2. 4. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, de séquence choisie parmi la SEQ. ID. N°2 et 4. 5. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 3 ou 4. 6. Cellule hôte exprimant une laccase selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec un vecteur d'expression selon la revendication 5. 7. Procédé de préparation d'une laccase selon la revendication 1 comprenant les étapes de : a) préparation de cellules hôtes selon la revendication 6; b) mise en culture de cellules hôtes préparées à l'étape a) ; c) récupération du milieu de culture et élimination desdites cellules hôtes dans le cas des protéines sécrétées ou lyse des cellules hôtes ; d) traitement du milieu ou lysat obtenu à l'étape c) par chromatographie d'interactions hydrophobes ; e) récupération de ladite laccase purifiée, caractérisé en ce que ladite cellule hôte préparée à l'étape a) est une souche de levure Pichia pastoris transformée avec le vecteur pFD56 et en ce que l'expression de la laccase est induite par l'ajout de méthanol. 8. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 comme réactif dans une composition de teinture d'oxydation des fibres kératiniques. 9. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour la délignification et/ou le blanchiment de pâte à papier. 10. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 comme décolorant, notamment des encres pour papier et du tissu.
  11. 11. Utilisatiori de la laCcase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour former des gels par réticulation des protéines du lactosérum.
  12. 12. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 comme conservateur de produit alimentaire.
  13. 13. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 comme exhausteur de goût de produit alimentaire.
  14. 14. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour la dépollution des produits à base de phénol.
  15. 15. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans des compositions détergentes, notamment pour le lavage du linge ou de la vaisselle.
  16. 16. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans des produits d'hygiène, tel que les déodorants, le savon et le dentifrice.
  17. 17. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour la production d'éthanol.
  18. 18. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour la synthèse de composés pharmaceutiques.
  19. 19. Electrode à laccase comprenant un matériau conducteur recouvert d'un dépôt comprenant au moins une laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2.
  20. 20. Biocapteur à oxygène, composés phénoliques ou amines organiques, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode selon la revendication 19.
  21. 21. Capteur à oxygène, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode selon la revendication 19.
  22. 22. Biopile enzymatique comprenant une anode sur laquelle est immobilisée une enzyme catalysant une réaction d'oxydation et une électrode selon la revendication 19 à titre de cathode.
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