CN110592055B - 一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体 - Google Patents

一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体 Download PDF

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CN110592055B CN201911050495.8A CN201911050495A CN110592055B CN 110592055 B CN110592055 B CN 110592055B CN 201911050495 A CN201911050495 A CN 201911050495A CN 110592055 B CN110592055 B CN 110592055B
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    • G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体，属于酶工程领域。编码所述肌酸水解酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。所得肌酸水解酶突变体的半衰期相比野生型分别提高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍，更适合工业应用。

Description

一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术
肌酸水解酶(Creatinase，EC 3.5.3.3，简称CRE)是酶促检测法中检测肌酐的一种必不可少的酶，主要来源于微生物。在一些研究中发现一些属的菌株能够通过诱导产生肌酸水解酶并在细胞中积累。这些细菌有假单胞菌属、梭菌、黄杆菌属、芽孢菌属、产碱菌属等等。但由于原始菌的肌酸水解酶产量很低，且诱导剂的价格较高，不适合进行工业化大规模生产。同时，对肌酸水解酶的性质分析发现其具有底物亲和力低、热稳定性差等特点。而在实际应用中需要有大量的酶，不利于工业生产。
目前对肌酸水解酶性质分析比较深入的菌株主要是恶臭假单胞菌、节杆菌和产碱杆菌。综合分析不同来源的肌酸水解酶学性质，多数肌酸水解酶的最适反应pH范围为7.0～8.0，在中性、弱碱和弱酸条件下保持稳定。已报道的肌酸水解酶的最适反应温30～40℃，而热稳定性不是很理想，在45℃以下相对稳定，温度一旦高于45℃，酶活会迅速下降。因此，对肌酸水解酶的热稳定性研究很有必要。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体。
编码所述肌酸水解酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供一种获得上述肌酸水解酶突变体的方法，包括以下步骤：PCR获得编码突变体的核苷酸序列，连接表达载体，转化E.coli BL21，以TB培养基培养重组菌，使之表达突变体。
本发明还提供表达上述肌酸水解酶突变体的基因工程菌，是以pET-20b为载体构建重组表达载体，转化宿主BL21(DE3)。
本发明还提供一种肌酐检测试剂盒，含有所述的肌酸水解酶突变体。
本发明的有益效果在于：提高肌酸水解酶的热稳定性，所得肌酸水解酶突变体的半衰期相比野生型分别提高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍，更适合工业应用。
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L。
TB培养基：蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油10g/L、KH2PO4 2.32g/L、K2HPO416.43g/L。
采用分光光度法测定肌酸水解酶酶活。单位酶活定义：1min内将肌酸水解产生1μmol尿素所需要的酶量。酶活测定条件为：在试管中加入900μL肌酸溶液，在室温中平衡5min。后加入100μL待测酶液，在37℃反应10min，然后向反应体系中加入2mL对-二甲胺基苯甲醛溶液终止反应，并置于25℃温育20min，在435nm处测定吸光度值，以水调零。空白管是在肌酸溶液中先加入对-二甲氨基苯甲醛，后加入待测酶液，其它步骤与测定管一致。
实施例1高热稳定性突变菌株的获得
利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计多对引物，以载体pET20J(烟草节杆菌肌酸酶的高效异源表达与应用分析[J].食品与生物技术学报)为模板对第368位和第195位两个位点进行饱和突变。编码野生肌酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
PCR反应条件为98℃3min，34个循环(98℃3min、58℃30S、72℃1min30S)、72℃10min。PCR扩增体系：模板1μl、上下游引物各1μl，2x PrimeStar 24μl、灭菌的双蒸水24μl。PCR结束后，加入5μl的FD Buffer、1μl的DpnI消化1h。
将含有编码突变体的基因的质粒，转化E.coli BL21，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转化至TB培养基，接种量为3％。菌体长到OD600为3时，加入IPTG，使其终浓度为0.6mmol/L，并将培养温度降到30℃，培养8h。收集发酵后的菌体，超声破碎后测定相同温度下保温不同时间的酶活。筛选到Pet20J-V368L、Pet20J-K195C、Pet20J-K195L、Pet20J-K195V、Pet20J-K195T五个正向突变株，分别对应肌酸水解酶突变体V368L、肌酸水解酶突变体K195C、肌酸水解酶突变体K195L、肌酸水解酶突变体K195V、肌酸水解酶突变体K195T。
实施例2肌酸水解酶的纯化
破碎大肠杆菌后进行硫酸铵沉淀，选择55％--75％硫酸铵饱和度的沉淀，用少量磷酸盐缓冲液(PH 7.0)溶解蛋白沉淀，透析24h除去酶液中的硫酸铵。根据肌酸水解酶的等电点性质，选择QFF柱进行离子交换纯化。QFF柱以磷酸盐缓冲液平衡30min，将粗酶液注入纯化柱中，用含有1M NaCl的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白。
实施例3突变体的纯酶液的性质测定
将纯化后的各肌酸水解酶突变体稀释，测定突变体在50℃下保温不同时间的酶活并计算其半衰期(t1/2,min)，发现五个突变体V368L、K195V、K195T、K195C、K195L较WT分别提高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍(如表1所示)。除此之外，K195C的Km值较WT下降了72.4％，K195V和K195C的比酶活较WT分别提高了41.9％、47.9％。
表1酶学性质
Figure BDA0002255216420000031
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性提高的肌酸水解酶突变体
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<213> 烟草节杆菌
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accgacggcg cccacaactg ggccaccacc cgcaagcttc agcgcggcga catcctgtcg 780
ctgaactgct tccccatgac ttccggctac tacaccgcac tggagcgcac cctgttcctg 840
ggcgagccgg atgcccgcag cctggaactg tggaacatca acgtcgaggt gcacaagcgc 900
ggcctggagc tgatcaagcc cggtgctgtc tgcaaggaca tcgccgccga gctgaacgag 960
atctacatcg cccacggcct gctgccgaac cgcaccttcg gctacggcca ctccttcggc 1020
gtgctctcgc actactacgg acgtgaagcc ggtctggagc tgcgcgagga cattgagact 1080
gtcctggagc caggcatggt cgtctcgatg gaaccgatga tcaccgtcat ggacggcgag 1140
ccaggtgccg gcggctaccg cgagcacgac atcctggtca tcggcgagga taacaccgtt 1200
gagaacatca ccaagttcgg tttcggtccg gagaacaaca tcatcgacgc gtaa 1254

Claims (7)

1.一种肌酸水解酶，其特征在于，编码所述肌酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
2.编码权利要求1所述肌酸水解酶的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。
4.一种获得权利要求1所述肌酸水解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：PCR获得编码权利要求1所述肌酸水解酶的核苷酸序列，连接表达载体，转化E.coli BL21，以TB培养基培养重组菌，使之表达利要求1所述肌酸水解酶。
5.一种表达权利要求1所述肌酸水解酶的基因工程菌，其特征在于，是以pET-20b为载体构建重组表达载体，转化宿主BL21(DE3)。
6.权利要求1所述肌酸水解酶在制备肌酐检测试剂盒中的应用。
7.一种肌酐检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的肌酸水解酶。
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