CN103320453A

CN103320453A - 一种短小芽孢杆菌漆酶基因及其表达与应用

Info

Publication number: CN103320453A
Application number: CN2013102612421A
Authority: CN
Inventors: 管政兵; 廖祥儒; 张宁; 宋晨萌
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明涉及一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）L-9漆酶基因cotA及其重组表达与应用，属于生物工程领域。本发明从短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）L-9中分离获得cotA，构建表达载体pColdII-cotA并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)实现高效表达，所得重组酶该漆酶具耐碱性环境和耐高温能力佳的优点，对偶氮类染料和蒽醌类染料均具有很好的脱色效果，具有重大应用潜力。

Description

一种短小芽孢杆菌漆酶基因及其表达与应用

技术领域

本发明涉及一种漆酶基因，尤其是一种短小芽孢杆菌漆酶基因及其表达与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

漆酶（Laccase,E.C.1.10.3.2）是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应，在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。

漆酶按来源不同可分为三大类：植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。植物漆酶主要由漆树漆液分离而得。真菌漆酶来源更为广泛（存在于多种担子菌中），具单电子氧化还原电位高、催化活性强等优点，既能催化底物的氧化聚合又能对木质素进行催化降解，是一直以来人们重点研究的漆酶种类。细菌漆酶则发现相对较晚，最初是1993年由Givaudan等人首先在一种生脂固氮螺菌中鉴定出来的。随后，科研人员又陆续在交替单胞菌、大肠杆菌、假单胞菌、粘质沙雷氏菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、极端耐碱芽孢杆菌、灰色链霉菌等细菌中发现了不同种类的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽孢杆菌的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌的CueO蛋白、灰色链霉菌的EpoA蛋白等，这些细菌漆酶与真菌漆酶蛋白结构相似，都具有4个铜离子结合位点。

由于真菌来源漆酶在工作环境pH偏碱性时活性非常低或几乎没有，热稳定性也较差，且丝状真菌生长周期长，培养基要求高，菌丝在发酵罐中易受到高剪切力的损伤，这大大限制了真菌漆酶在工业上的应用。研究揭示，细菌来源漆酶虽氧化活性普遍略低于真菌来源漆酶，然而它们往往具有一些自身独特的优点：如无需糖基化修饰、热稳定性好、酶活性的最适pH范围广等，这些性质正是目前漆酶工业应用所急需的。

据最新资料统计，我国每年印染废水排放量占总工业废水排放量的35％，己成为危害最大的重要污染源，大部分合成染料都难以被微生物降解。这些染料化合物通常被用于纺织、食品、塑胶和生物医学的着色剂，每年全世界商用染料使用达7×10⁵吨，种类达1×10⁴种，其中5～10％的染料都以工业污水形式排放出来。有色污水直接释放到环境中，许多染料在厌氧环境下可能转化为有毒物质或致癌物质，众多国家相继都颁布了严厉的法规来限制工业染料污水的排放。由于染料自身特殊的化学结构，使用物理或化学法（凝结、臭氧、活性炭）处理往往效果不佳，且还易造成二次污染。研究表明，生物法（使用漆酶、锰过氧化物酶等）具有脱色率高、运行成本低、绿色环保的优势，是处理印染废水的潜在有效手段，是当前印染废水脱色研究的热点。绝大多数排放的工业印染污水往往温度很高且pH值偏碱。在各类来源的漆酶中，真菌漆酶由于只在pH偏酸环境下具有较好的脱色效果，在偏碱性条件下难以发挥作用，且耐热温度低于细菌漆酶，所以细菌漆酶凭借其独特优势在工业印染废水处理中更具应用潜力。

因此，挖掘能耐受高温和高pH值（耐碱）条件的细菌漆酶基因并实现规模化生产具有重要研究意义和应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新的短小芽孢杆菌漆酶基因cotA，其特征在于其核苷酸序列如以下1）或2）所示：

1）其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

2）在1）限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的漆酶的核苷酸序列。

所述基因编码的蛋白质及含有所述基因的转基因细胞系、基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明保护的范围。

本发明的第二个目的是提供一种高产漆酶的重组大肠杆菌及其构建、表达方法。

所述高产漆酶的重组大肠杆菌的构建方法为选取大肠杆菌冷休克表达载体pColdII，构建重组表达载体pColdII-cotA，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主进行表达，具体步骤如下：

（1）提取短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）L-9的总基因组DNA，以其为模板，利用引物g3和g4通过PCR扩增得到1533bp的漆酶基因cotA；

（2）设计引物g5和g6，利用PCR向B.pumilus L-9漆酶的DNA编码框5’和3’两侧分别引入KpnΙ和EcoR Ι限制性酶切位点（下划线显示）；

（3）选取大肠杆菌冷休克表达载体pColdII，构建重组表达载体pColdII-cotA，将重组表达质粒pColdII-cotA转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子并测序验证；

所述B.pumilus L-9购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC1.1172；

所述PCR引物g3：5′-ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTG-3′，g4：5′-TTACTGGATGATATCCATCGGCCGCATC-3′，g5：5′-TCAGGAGGTACCATGAACCTAGAAAAATTTGTTG-3′，g6：5′-ACTGAGGAATTCTTACTGGATGATATCCATCG-3′。

所述重组菌生产漆酶的步骤为：利用IPTG对重组菌产漆酶进行诱导表达，诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni⁺柱亲和层析法纯化得到可溶性漆酶，咪唑洗脱浓度为500mM；所述诱导表达条件为将含重组表达质粒pColdII-cotA的大肠杆菌BL21(DE3)在37°C、250rpm条件下培养至OD₆₀₀=0.5，随后转入15°C培养并加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导表达24h，转速160rpm；培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH7.4。

本发明首次从B.pumilus L-9中分离、鉴定了漆酶基因，由于B.pumilus野生菌株的漆酶蛋白CotA只表达于芽孢外壁上而不分泌到胞外，且表达水平一般很低，远远达不到工业化应用要求，因此选用大肠杆菌重组表达系统生产漆酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求。本发明利用大肠杆菌BL21(DE3)成功高可溶性表达获得了B.pumilus L-9漆酶蛋白，并对表达的漆酶蛋白进行了纯化及免疫印迹分析。所得重组酶对碱性、高温、有机溶剂和酶抑制剂均有很好的耐受性。

本发明的第三个目的在于提供上述重组漆酶在印染废水脱色中的应用，尤其是对偶氮类和蒽醌类染料脱色的应用。

本发明分析了纯化的重组漆酶对2种代表性偶氮类和2种代表性蒽醌类染料的脱色作用，偶氮类染料和蒽醌类染料是目前印染工业上使用量最大的两种染料类型。实验结果显示在中性环境pH7.0，作用10h后，该漆酶对2种偶氮类染料reactive red11和reactive blue171的脱色率分别达到96%和94%，对2种蒽醌类染料reactive blue4和reactive brilliant blue的脱色率分别达到92%和94%。实验结果还显示在碱性环境pH9.0，作用10h后，对同样2种偶氮类染料的脱色率分别达到96%和95%，对同样2种蒽醌类染料的脱色率分别达到90%和91%。以上数据表明该漆酶对偶氮类染料和蒽醌类染料均具有很好的脱色效果，具有重大应用潜力。

本发明所得重组漆酶以SGZ为底物时，最适作用pH为7.2；以2,6-DMP为底物时，最适作用pH为7.8，最适作用pH值均高于（耐碱性能力）其他已报道过的微生物来源漆酶；该漆酶以SGZ为底物时，最适作用温度为80°C，最适作用温度优于其他已报道过的微生物来源漆酶；且该漆酶pH稳定性及温度稳定性都非常好，表明该漆酶具耐碱性环境和耐高温能力佳的优点，在多个工业行业特别是印染废水脱色中应具有重大应用潜力。另外，部分抑制剂和有机溶剂在中、高浓度下均不能抑制本发明所获重组漆酶的活性，特别是能耐受1mol/L的NaCl，表明该漆酶耐受卤素环境能力较强，能应用于含高浓度卤素的印染废水的脱色中。

附图说明

图1为PCR扩增的B.pumilus L-9漆酶基因cotA、蛋白质序列的功能区预测及BLASTp相似性检索部分结果；其中（A）M:DL2000Marker；1:漆酶基因cotA；（B）B.pumilus L-9漆酶蛋白序列保守功能区预测。

图2为利用“同源模建”法预测的B.pumilus L-9漆酶晶体结构；其中（A）：“cartoon”模式显示；（B）：“spacefill”模式显示。

图3为B.pumilus L-9漆酶的大肠杆菌重组表达、纯化、活性染色及免疫印迹鉴定图；其中泳道M-1-2-3为SDS-PAGE图谱；泳道4为非变性PAGE图谱；泳道5为硝酸纤维素膜显色图谱；M：蛋白质分子量标准；1：未诱导组（对照）；2：诱导组；3：经Ni⁺柱亲和层析法纯化得到的可溶性漆酶；4：可溶性漆酶经非变性电泳后，与底物ABTS发生显色反应；5：漆酶经免疫印迹技术转移到硝酸纤维素膜上后被anti-His₆.tag单克隆抗体特异性识别、显色。

图4为纯化的B.pumilus L-9重组漆酶的最适作用pH和pH稳定分析性；（A）：ABTS,pH3.0-6.5;SGZ,pH6.0-8.5;2,6-DMP,pH6.5-9.0；（B）：pH3.0,ABTS;pH7.0,SGZ;pH9.0,2,6-DMP。

图5为纯化的B.pumilus L-9重组漆酶的最适作用温度和温度稳定性分析。

图6为不同浓度有机溶剂对纯化的B.pumilus L-9重组漆酶活性影响的分析。

图7为分析纯化的B.pumilus L-9重组漆酶在中性或碱性条件下分别对2种偶氮类和2种蒽醌类染料的脱色作用；（A）：在pH7.0条件下，缓冲液为柠檬酸-磷酸缓冲液；（B）：在pH9.0条件下，缓冲液为Tris–HCl。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1PCR扩增B.pumilus L-9漆酶基因cotA、蛋白质序列功能区预测

应用细菌基因组DNA抽提试剂盒（TaKaRa公司）按照其操作手册提取B.pumilus L-9菌体基因组总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。根据GenBank数据库中已公开的其他短小芽孢杆菌菌株的漆酶基因序列设计上下游引物：g3（SEQ ID NO:3，5′-ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTG-3′）与g4（SEQ ID NO:4，5′-TTACTGGATGATATCCATCGGCCGCATC-3′），应用PCR方法，以上述B.pumilus L-9基因组为模板，以上述g3及g4为特异性引物，扩增出B.pumilus L-9漆酶基因全长编码框序列（1533bp）（如图1A所示），随即利用T-A克隆法将所获基因亚克隆入pMD18-T载体，送测序公司对其碱基序列进行测定。PCR反应条件为：以基因组DNA为模板，在50μL反应体系中，加入5×PCR反应缓冲液10μL、25mM MgSO₄ 2μL、2.5mMdNTP混合物4μL、10μM的上下游引物各5μl、Ex Taq酶（Takara公司）1μL及DNA模板2μL，补水至50μL。PCR循环参数为：94°C预变性5min，再进行30个循环（94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸2min），最后于72℃延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用割胶回收试剂盒回收1533bp的DNA条带，置4℃保存。将所得序列提交http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTp/，在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要序列数据库进行相似性搜索分析，表明该漆酶具有细菌漆酶特有的保守结构区（如图1B所示），基因序列与已报道过的其他短小芽孢杆菌漆酶基因的序列相似性低于96%，推导氨基酸序列相似性低于95%。其基因具有SEQ ID NO.1序列，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2利用“同源模建”法获得B.pumilus L-9漆酶晶体预测结构

将B.pumilus L-9漆酶的氨基酸序列提交SWISS-MODEL蛋白质在线模建服务器（http://swissmodel.expasy.org/）进行同源建模，服务器自动分析获取的最适建模模板为B.subtilis MB24漆酶I494A突变体晶体结构（PDB文件:2wsdA），随后利用RasWin Molecular Graphics Program（RasMol,156version2.7.2）software package（http://www.umass.edu/microbio/rasmol/）示图软件显示的B.pumilus L-9漆酶晶体预测结构如图2所示。

实施例3B.pumilus L-9漆酶的大肠杆菌重组表达、纯化、活性染色及免疫印迹鉴定

由于B.pumilus野生菌株的漆酶蛋白CotA只表达于芽孢外壁上而不分泌到胞外，且表达水平一般很低，远远达不到工业化应用要求，因此选用大肠杆菌重组表达系统生产漆酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求。设计引物g5：(SEQ ID NO:5，5′-TCAGGAGGTACCATGAACCTAGAAAAATTTGTTG-3′)和g6：(SEQ ID NO:6，5′-ACTGAGGAATTCTTACTGGATGATATCCATCG-3′)，利用PCR将B.pumilus L-9漆酶的DNA编码框5’和3’两侧分别引入KpnΙ和EcoRΙ限制性酶切位点（下划线显示），通过双酶切、分子连接等基因操作将漆酶基因插入到商业化表达质粒pColdII（TaKaRa公司），构建重组质粒pColdII-cotA。随后将pColdII-cotA转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子，随后利用IPTG进行重组L-9漆酶的诱导表达。

培养基成分为：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，pH7.4。诱导表达条件为：将重组表达质粒pColdII-cotA转化大肠杆菌BL21(DE3)，含重组质粒的工程菌在37°C条件下培养至OD₆₀₀=0.5，随后转入15°C培养并加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导表达24h，转速160rpm。收集菌体，SDS-PAGE分析全菌总蛋白显示，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量～65kD一致。在此条件下，重组漆酶的表达量约占菌体总蛋白量的30%，大部分为可溶性状态，大大超过了B.pumilus L-9自身的漆酶产量。

诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni⁺柱亲和层析法纯化得到可溶性漆酶，咪唑洗脱浓度为500mM。随后以ABTS为底物，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行重组漆酶的活性染色分析；进一步利用免疫印迹法对重组漆酶进行表达鉴定分析（如图3所示）。上述相关方法均采用常规操作步骤。以上实验结果充分表明已成功重组表达、纯化获得可溶性漆酶。

实施例4纯化的B.pumilus L-9重组漆酶最适作用pH和pH稳定性分析

采用常规测定方法，分别使用ABTS、SGZ、2,6-DMP作为底物，反应温度均为50°C。1个酶活单位定义为1分钟内氧化1μM底物所需的酶量。实验结果充分表明重组漆酶具有长时间耐碱性环境佳的优点（如图4所示）。

实施例5纯化的B.pumilus L-9重组漆酶最适作用温度和温度稳定性分析。

采用常规测定方法，使用SGZ作为底物，反应pH为6.9。1个酶活单位定义为1分钟内氧化1μM底物SGZ所需的酶量。实验结果充分表明重组漆酶具有长时间耐高温环境佳的优点（如图5所示）。

实施例6不同浓度有机溶剂对B.pumilus L-9重组漆酶活性影响的分析

采用常规测定方法，使反应底物为2,6-DMP，反应pH为7.8，反应温度为50°C，反应时间为5h。实验结果充分表明重组漆酶具有耐受一定浓度的常见有机溶剂的优点（如图6所示）。

实施例7B.pumilus L-9重组漆酶在中性或碱性条件下对偶氮类和蒽醌类染料的脱色率测定。

采用常规测定方法：反应体系为6mL，染料浓度5mM，漆酶浓度14.5U/L，介体浓度0.1mM，反应温度为50°C，pH分别为7.0和9.0。在pH7.0条件下，缓冲液为柠檬酸-磷酸缓冲液；在pH9.0条件下，缓冲液为Tris–HCl。实验结果显示在中性环境pH7.0，作用10h后，该漆酶对2种偶氮类染料reactive red11和reactiveblue171的脱色率分别达到96%和94%，对2种蒽醌类染料reactive blue4和reactive brilliant blue的脱色率分别达到92%和94%。结果还显示在碱性环境pH9.0，作用10h后，对同样2种偶氮类染料的脱色率分别达到96%和95%，对同样2种蒽醌类染料的脱色率分别达到90%和91%（如图7所示）。以上数据表明该重组漆酶对偶氮类染料和蒽醌类染料均具有很好的脱色效果，具有重大应用潜力。

实施例8不同浓度酶抑制剂对B.pumilus L-9重组漆酶活性影响的分析

采用常规测定方法，反应底物为2,6-DMP，反应pH为7.8，反应温度为50°C，反应时间为5h。实验结果充分表明重组漆酶具有耐受一定浓度的常见酶抑制剂的优点（如表1所示）。

表1不同浓度酶抑制剂对纯化的B.pumilus L-9重组漆酶活性影响的分析

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

Claims

1.一种短小芽孢杆菌漆酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下1）或2）所示：

1）其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质。

3.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。

4.含有权利要求1所述基因的基因工程菌。

5.含有权利要求1所述基因的表达载体或克隆载体。

6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，优选重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

7.一种权利要求6所述生产漆酶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，选取大肠杆菌冷休克表达载体pColdII，构建重组表达载体pColdII-cotA，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主进行表达。

8.一种权利要求6所述生产漆酶的重组大肠杆菌生产漆酶的方法，其特征在于，利用IPTG对重组菌产漆酶进行诱导表达，诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni⁺柱亲和层析法纯化得到可溶性漆酶，咪唑洗脱浓度为500mM；所述诱导表达条件为将含重组表达质粒pColdII-cotA的大肠杆菌BL21(DE3)在37°C、250rpm条件下培养至OD₆₀₀=0.5，随后转入15°C培养并加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导表达24h，转速160rpm；培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH7.4。

9.权利要求1所述基因在印染废水脱色中的应用。