CN105296442A - 一种高催化活性的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体 - Google Patents

一种高催化活性的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种底物特异性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明以本实验室前期构建的双突变体L386W/G417L？CotA漆酶基因为模板，进一步将双突变体的第152位Asp分别突变为Phe、Cys、Tyr、Trp，随后以野生型CotA漆酶为对照，发现复合突变体L386W/G417L/D152C对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高的催化活性和专一性，提升了短小芽胞杆菌CotA漆酶的工业应用前景。

Description

一种高催化活性的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体
技术领域
本发明涉及一种催化活性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
漆酶(laccase,E.C.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应，在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。
漆酶按来源不同可分为三大类：植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。细菌漆酶包括芽胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌的CueO蛋白、灰色链霉菌的EpoA蛋白等，与真菌及植物漆酶蛋白结构相似，都具有4个铜离子结合位点。
本实验室前期已从自行筛选的短小芽胞杆菌菌株W3(BacilluspumilusW3)中克隆并重组表达了CotA漆酶，研究发现该CotA漆酶相对其它种类漆酶具备以下优点：碱性pH下酶活性高、耐高温且热稳定性好、能耐受高浓度有机溶剂及卤素离子环境等，这些优良特性正是目前漆酶在印染废水处理领域进行工业化应用所急需的。然而，野生短小芽胞杆菌CotA漆酶天然表达量非常低，且底物专一性较差，催化活性偏低，成为工业化应用的瓶颈。因此本发明利用基因工程和酶工程手段，提高短小芽胞杆菌CotA漆酶的催化活性，进一步提高其工业化应用前景。
发明内容
本发明提供了一种短小芽胞杆菌漆酶突变体，该突变体以本实验室前期已改造获得的双突变体L386W/G417L漆酶基因为模板，进一步将双突变体的第152位天冬氨酸(Asp，D)分别突变为苯丙氨酸(Phe，F)、半胱氨酸(Cys，C)酪氨酸(Tyr，Y)、色氨酸(Trp，W)，随后以野生型CotA漆酶为对照，最终选择出对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高专一性的突变体。
所述B.pumilusCotA漆酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中的B.pumilusCotA漆酶氨基酸序列一致(由本实验室提交，GenBank登录号：KF040050)。
所述突变体是将双突变体L386W/G417L漆酶基因中第152位的Asp分别突变成了Phe、Cys、Tyr、Trp，分别命名为L386W/G417L/D152F、L386W/G417L/D152C、L386W/G417L/D152Y、L386W/G417L/D152W。
附图说明
图1：野生短小芽胞杆菌CotA漆酶三维模拟结构
图2：构建突变体质粒过程的分子操作原理示意图
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1野生短小芽胞杆菌CotA漆酶的表达与纯化。
从甘油管接种前期构建的重组表达菌株CotA/pColdII/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)过夜培养，按2％接种量将种子接入LB液体发酵培养基(含100mg/L)。大肠杆菌在37℃培养2h后，加入0.4mM终浓度的IPTG进行诱导，并在15℃摇床继续发酵培养24h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min去除上清，收集菌体。将收集的菌体用磷酸盐缓冲液重悬，重悬后用超声波细胞破碎仪将菌体破碎释放胞内蛋白，破碎完成后，将破碎的液体于4℃、8000rpm离心10min收集上清。收集的上清用于CotA漆酶蛋白纯化。
由于重组表达的CotA漆酶蛋白带有多聚组氨酸标签(His6.tag)，因此使用镍离子亲和层析方法分离目标蛋白。镍离子亲和层析纯化步骤：(1)平衡：用10倍柱体积的20mM缓冲液(含5mM的咪唑)平衡HisTrapHP镍离子柱(1mL)；(2)上样：预先处理好的样品以1mL/min的流速上样；(3)洗脱：用高浓度咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱条件下峰型对应的管号，并做酶活检测。最终获得纯化好的野生型CotA漆酶。
实施例2CotA漆酶突变体构建并制备
(1)定点突变
以前期构建成功的双突变体L386W/G417L的B.pumilusCotA漆酶基因序列为模板，将漆酶中第152位的天冬氨酸(Asp)分别突变成苯丙氨酸(Phe)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)，命名为L386W/G417L/D152F、L386W/G417L/D152C、L386W/G417L/D152Y、L386W/G417L/D152W。
引入D152F突变的定点突变引物为：
正向引物5’-ACATTGTGGTATCACTTTCATGCCATGGCA-3’(下划线为突变位点)
反向引物5’-AAGTGATACCACAATGTGCATGCTTGCTGG-3’(下划线为突变位点)
引入D152C突变的定点突变引物为：
正向引物5’-ACATTGTGGTATCACTGTCATGCCATGGCA-3’(下划线为突变位点)
反向引物5’-CAGTGATACCACAATGTGCATGCTTGCTGG-3’(下划线为突变位点)
引入D152Y突变的定点突变引物为：
正向引物5’-ACATTGTGGTATCACTATCATGCCATGGCA-3’(下划线为突变位点)
反向引物5’-AGTGATACCACAATGTGCATGCTTGCTGGT-3’(下划线为突变位点)
引入D152W突变的定点突变引物为：
正向引物5’-ACATTGTGGTATCACTGGCATGCCATGGCA-3’(下划线为突变位点)
反向引物5’-CCAGTGATACCACAATGTGCATGCTTGCTG-3’(下划线为突变位点)
利用上述引物，以双突变体质粒pColdII-CotA(WL)为模板，进行PCR反应。反应均在50μL体系中进行，反应条件为：95℃预变性3min，随后进行25个循环(95℃20s,57℃20s,72℃6min)，循环后72℃延伸7min，最后4℃保温。取10μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。检测到有目的产物后加1μLDMT酶于剩余的PCR产物中，混匀，37℃孵育1小时。将孵育处理后的产物全部经1％琼脂糖凝胶电泳分离、切胶，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。回收的目的片段经突变片段组装后转化到DMT感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃过夜培养，从平板上挑10个单菌落进行菌落PCR验证，从验证成功的菌落中挑3个单菌落接入LB液体培养基，10h后将每个菌液保存到两个甘油管中，一份-20℃保藏，一份用于测序。将测序正确的突变体从甘油管接种到LB液体培养基中过夜培养，过夜后先保存甘油管，然后将剩余菌液抽提质粒并转化接入BL21(DE3)感受态细胞。
(2)突变体酶的表达与纯化
突变体表达及纯化过程如实施例1所述。
实施例3CotA漆酶突变体酶活分析。
(1)酶活单位定义
采用ABTS方法测定漆酶酶活时，定义每分钟转化1μmol底物时所需要的酶量作为一个活力单位。
(2)酶活力测定步骤
预热：取2.4mLpH4.0的柠檬酸缓冲液于试管中，在试管中加入0.5mLABTS溶液(ABTS的终浓度为0.5mM)置于37℃水浴锅中预热2min。
反应：加入0.1mL样品酶液，震荡均匀。
测量：将震荡均匀的样品用分光光度计进行动力学测量，在420nm波长下测量30s内每秒钟OD值的变化量(反应速率为匀速反应)并计算酶活力。
实施例4漆酶动力学参数测定
以不同浓度的ABTS作为底物来测定纯酶的动力学参数。在3mL的反应体系中ABTS的终浓度范围是5-500μM。3mL的反应体系包括2mL柠檬酸缓冲液(0.1M；pH4.0)、0.1mL纯酶液、0.9mL的ABTS溶液(根据终浓度取相应体积的ABTS母液后用去离子水稀释至0.9mL)。将反应体系置于37℃水浴锅中反应片刻，在420nm波长下测定30s内每秒钟OD值的变化量(反应速率为匀速反应)。根据酶活力公式计算酶活。以作图，得出一直线。直线的斜率为与纵轴的交点与横轴的交点这样可以求出动力学参数Vmax和Km，测出蛋白含量后就能求出kcat。
酶活力公式：酶活力
式中：ΔOD-吸光度OD的变化值V总-反应体系的体积
n-酶液稀释倍数Δt-反应时间
V0-酶液的体积ε-底物的摩尔吸光系数
实施例5漆酶突变体的催化活性分析
以ABTS为底物测定了野生型和突变体漆酶的动力学参数Vmax、Km、kcat、kcat/Km。
表1野生型(WT)和突变体漆酶的动力学参数
Km值可以判断酶的专一性和天然底物，最适底物时酶的亲和力最大Km最小。
在一定酶浓度，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。
kcat表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数通称为催化常数，其值越大表示酶的催化效率越高。
kcat/Km是酶和底物反应形成的表观二级速率常数，有时也称为专一性常数。
从表1可以计算得出，突变体与野生型漆酶相比，L386W/G417L/D152C的催化效率和专一性有最大的提高。突变体L386W/G417L/D152C的催化效率是野生型的2.6倍，ABTS底物专一性是野生型的4.0倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种短小芽胞杆菌CotA漆酶的突变体，其特征在于，是以L386W/G417L双突变的短小芽胞杆菌CotA漆酶基因为模板将其第152位的Asp分别突变为Phe、Cys、Tyr、Trp。
2.权利要求1所述的突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)以前期构建的双突变体质粒pColdII-CotA(WL)为模板，采用滚环PCR的方法，设计引物时在重叠区域引入突变位点，利用PCR扩增质粒pColdII-CotA(WL)得到含有编码CotA漆酶突变体的基因序列的开环重组载体；
(2)在PCR产物中加DMT酶消化PCR产物，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳回收片段；
(3)利用特殊的重组酶和同源重组原理，将开环重组载体无缝拼接，形成环状结构；
(4)将环状质粒转化到DMT感受态细胞中，平板培养挑取单菌落测序，为的是提取到正确突变质粒；
(5)将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。
3.根据权利2所述的方法，其特征在于，还进一步包括使用AVANT蛋白纯化仪和HisTrapHP1mL镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱对漆酶进行纯化。
4.根据权利2所述的方法，其特征在于，将步骤(5)获得的重组菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600≈0.5，迅速降温至15℃静置至少30min，加入最终浓度0.4mM的诱导剂IPTG诱导，24h时离心获得沉淀，用缓冲液重悬，即为粗酶液。复合突变体L386W/G417L/D152C对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高的催化活性，是野生型的2.6倍，且专一性是野生型的4.0倍。
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