CN117660429A - 一种阿拉伯糖异构酶突变体及其构建方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿拉伯糖异构酶突变体及其构建方法、应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明在大肠杆菌来源阿拉伯糖异构酶的基础上，筛选获得两株单点酶活提高的突变菌株V230L、A313E以及一株组合突变体V230L/A313E。三株突变体在酶活显著提高的同时，热稳定性也有较好的表现。本发明中的这些突变体比天然阿拉伯糖异构酶更适用于工业生产，具有非常巨大的应用前景和产业价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的阿拉伯糖异构酶突变体及其构建方法、应用，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4)，属于阿拉伯糖异构酶家族。该酶可将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖，也可将D-半乳糖异构化为D-塔格糖，是一种工业应用价值极高的异构酶。D-塔格糖是一种天然存在的稀有己酮糖，是D-果糖的差向异构体，也是D-半乳糖的醛酮同分异构体。D-塔格糖的甜味与蔗糖最为相似，且甜味刺激比蔗糖更快，但产生的热量值却仅相当于蔗糖的30％，且没有后味及其它不良风味，是一种公认的低热量甜味剂，在食品、医药等产业中具有广阔的应用前景，而阿拉伯糖异构酶是目前生物酶法工业化生产D-塔格糖最经济的酶。
目前已报道的野生型阿拉伯糖异构酶在生物催化过程中显示出有限的酶活，如来源于大肠杆菌K12的阿拉伯糖异构酶，该酶是D-塔格糖生物转化中最常用的一种酶，但其在酶学性质上存在许多缺陷，如在最适催化温度和pH、底物亲和性和酶活力等方面仍不能达到实际生产需求。
然而，大多数研究只是通过优化酶法合成条件来提高产物的产量，经过生产工艺优化的阿拉伯异构酶在工业应用中仍然令人不甚满意。因此，对阿拉伯糖异构酶进行分子修饰以提高其活力的研究将是本发明的研究重点。
发明内容
为了解决目前野生型阿拉伯糖异构酶活力达不到产业化要求的问题，本发明提供了一种阿拉伯糖异构酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位和/或第313位的氨基酸进行突变得到的。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供一种阿拉伯糖异构酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位和/或第313位的氨基酸进行突变得到。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位的缬氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为：V230L，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶第313位的丙氨酸突变为谷氨酸得到的，命名为：A313E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位缬氨酸突变为亮氨酸，同时将第313位的丙氨酸突变为谷氨酸得到的，命名为：V230L/A313E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明第二方面，提供一种编码所述阿拉伯糖异构酶突变体的基因。
本发明第三方面，提供一种携带所述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体或pDXW-10载体中的任一种作为表达载体。
本发明第四方面，提供一种包含所述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或酵母菌(Saccharomyces)中的任一种为表达宿主。
本发明第五方面，提供一种提高阿拉伯糖异构酶酶活的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位和/或第313位的氨基酸进行突变。
本发明第六方面，提供一种所述重组载体或所述重组细胞在制备阿拉伯糖异构酶中的应用。
本发明第七方面，提供一种所述突变体或所述基因或所述重组载体或所述重组细胞在转化D-半乳糖生产D-塔格糖中的应用。
本发明还提供一种制备上述突变体的方法，具体步骤如下：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的阿拉伯糖异构酶araA与重组质粒酶切连接，得到含有阿拉伯糖异构酶araA的重组质粒；以该含有阿拉伯糖异构酶araA的重组质粒为模板，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有编码突变体基因的载体；
(2)将含有编码突变体基因的载体转化到宿主细胞内，得到重组细胞；
(3)对所述重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后培养发酵产酶，获得含有阿拉伯糖异构酶突变体的粗酶液。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明在天然阿拉伯糖异构酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造阿拉伯糖异构酶分子结构，分析了突变后残基对酶活的影响，并最终获得了两株单点突变稳定性提高的突变菌株V230L、A313E以及组合突变株V230L/A313E。
(2)天然阿拉伯糖异构酶的比酶活为34.5U/mg，本发明提供的阿拉伯糖异构酶突变体V230L在50℃时比酶活为84.2U/mg，是天然阿拉伯糖异构酶的比酶活的2.44倍；阿拉伯糖异构酶突变体A313E在50℃时比酶活为89.5U/mg，是天然阿拉伯糖异构酶的比酶活的2.59倍；V230L/A313E在50℃时比酶活为127.3U/mg，是天然阿拉伯糖异构酶的比酶活的3.69倍。
(3)本发明提供的阿拉伯糖异构酶突变体在酶活显著提高后，仍具有良好的热稳定性。其中，在酶催化活性基本不变的情况下在45℃热处理20min后，突变体V230L和A313E以及组合突变体V230L/A313E分别保留51.7％、48.5％和95.3％的相对酶活，对照组则仅仅保留15.2％的相对酶活。
(4)本发明所得的阿拉伯糖异构酶突变体在比酶活显著提高和热稳定性改善后，对催化D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率也有提升。天然阿拉伯糖异构酶的转化率为30％，本发明提供的阿拉伯糖异构酶突变体V230L在50℃时转化率为35％，是天然阿拉伯糖异构酶的转化率的1.17倍；阿拉伯糖异构酶突变体A313E在50℃时转化率为38％，是天然阿拉伯糖异构酶的转化率的1.27倍；V230L/A313E在50℃时转化率为40％，是天然阿拉伯糖异构酶的转化率的1.33倍。
(5)本发明所得的阿拉伯糖异构酶突变体比野生型更适合于催化D-半乳糖生成D-塔格糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。
附图说明
图1是pH 7.0、37℃条件下反应20min后构建的突变菌株的比酶活；
图2是45℃条件下野生型阿拉伯糖异构酶及阿拉伯糖异构酶突变体V230L、A313E、V230L/A313E的半衰期；
图3是pH对野生型阿拉伯糖异构酶及阿拉伯糖异构酶突变体V230L、A313E、V230L/A313E酶活的影响；
图4是温度对野生型阿拉伯糖异构酶及阿拉伯糖异构酶突变体V230L、A313E、V230L/A313E酶活的影响；
图5是50℃转化条件下野生型阿拉伯糖异构酶及阿拉伯糖异构酶突变体V230L、A313E、V230L/A313E催化D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
下述实施例中所涉及的pMA5载体为本发明团队实验室保藏。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl。
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加2％琼脂。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
阿拉伯糖异构酶酶活测定方法：酶活测定反应体系(1mL)：100g/L底物、200μL纯酶、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(0.2mol/L，pH 7.0)，37℃下反应20min，沸水浴终止反应。
蛋白质浓度测定采用Bradford法测定。
酶活定义：标准条件下(pH 7.0、37℃)以半乳糖为底物，每分钟催化生成1μmol产物塔格糖所需酶量为一个酶活单位。
比酶活：定义为单位蛋白的酶活U/mg。
阿拉伯糖异构酶转化率测定方法：转化反应体系(30mL)：100g/L半乳糖、15mL粗酶液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(0.2mol/L，pH 7.0)，50℃下反应60h，沸水浴终止反应。
实施例1
含阿拉伯糖异构酶突变体的重组质粒在大肠杆菌中的构建
(1)含有野生型的阿拉伯糖异构酶araA的重组质粒的构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司基因合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型的阿拉伯糖异构酶araA，将其与pMA5载体采用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶酶切后连接，制备得到重组载体pMA5-araA。
阿拉伯糖异构酶araA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MTIFDNYEVWFVIGSQHLYGPETLRQVTQHAEHVVNALNTEAKLPCKLVLKPLGTTPDEITAICRDANYDDRCAGLVVWLHTFSPAKMWINGLTMLNKPLLQFHTQFNAALPWDSIDMDFMNLNQTAHGGREFGFIGARMRQQHAVVTGHWQDKQAHERIGSWMRQAVSKQDTRHLKVCRFGDNMREVAVTDGDKVAAQIKFGFSVNTWAVGDLVQVVNSISDGDVNALVDEYESCYTMTPATQIHGKKRQNVLEAARIELGMKRFLEQGGFHAFTTTFEDLHGLKQLPGLAVQRLMQQGYGFAGEGDWKTAALLRIMKVMSTGLQGGTSFMEDYTYHFEKGNDLVLGSHMLEVCPSIAAEEKPILDVQHLGIGGKDDPARLIFNTQTGPAIVASLIDLGDRYRLLVNCIDTVKTPHSLPKLPVANALWKAQPDLPTASEAWILAGGAHHTVFSHALNLNDMRQFAEMHDIEITVIDNDTRLPAFKDALRWNEVYYGFRR
阿拉伯糖异构酶araA的核苷酸序列：
ATGACGATTTTTGATAATTATGAAGTGTGGTTTGTCATTGGCAGCCAGCATCTGTATGGCCCGGAAACCCTGCGTCAGGTCACCCAACATGCCGAGCACGTCGTTAATGCGCTGAATACGGAAGCGAAACTGCCCTGCAAACTGGTGTTGAAACCGCTGGGCACCACGCCGGATGAAATCACCGCTATTTGCCGCGACGCGAATTACGACGATCGTTGCGCTGGTCTGGTGGTGTGGCTGCACACCTTCTCCCCGGCCAAAATGTGGATCAACGGCCTGACCATGCTCAACAAACCGTTGCTGCAATTCCACACCCAGTTCAACGCGGCGCTGCCGTGGGACAGTATCGATATGGACTTTATGAACCTGAACCAGACTGCACATGGCGGTCGCGAGTTCGGCTTCATTGGCGCGCGTATGCGTCAGCAACATGCCGTGGTTACCGGTCACTGGCAGGATAAACAAGCCCATGAGCGTATCGGCTCCTGGATGCGTCAGGCGGTCTCTAAACAGGATACCCGTCATCTGAAAGTCTGCCGATTTGGCGATAACATGCGTGAAGTGGCGGTCACCGATGGCGATAAAGTTGCCGCACAGATCAAGTTCGGTTTCTCCGTCAATACCTGGGCGGTTGGCGATCTGGTGCAGGTGGTGAACTCCATCAGCGACGGCGATGTTAACGCGCTGGTCGATGAGTACGAAAGCTGCTACACCATGACGCCTGCCACACAAATCCACGGCAAAAAACGACAGAACGTGCTGGAAGCGGCGCGTATTGAGCTGGGGATGAAGCGTTTCCTGGAACAAGGTGGCTTCCACGCGTTCACCACCACCTTTGAAGATTTGCACGGTCTGAAACAGCTTCCTGGTCTGGCCGTACAGCGTCTGATGCAGCAGGGTTACGGCTTTGCGGGCGAAGGCGACTGGAAAACTGCCGCCCTGCTTCGCATCATGAAGGTGATGTCAACCGGTCTGCAGGGCGGCACCTCCTTTATGGAGGACTACACCTATCACTTCGAGAAAGGTAATGACCTGGTGCTCGGCTCCCATATGCTGGAAGTCTGCCCGTCGATCGCCGCAGAAGAGAAACCGATCCTCGACGTTCAGCATCTCGGTATTGGTGGTAAGGACGATCCTGCCCGCCTGATCTTCAATACCCAAACCGGCCCAGCGATTGTCGCCAGCTTGATTGATCTCGGCGATCGTTACCGTCTACTGGTTAACTGCATCGACACGGTGAAAACACCGCACTCCCTGCCGAAACTGCCGGTGGCGAATGCGCTGTGGAAAGCGCAACCGGATCTGCCAACTGCTTCCGAAGCGTGGATCCTCGCTGGTGGCGCGCACCATACCGTCTTCAGCCATGCACTGAACCTCAACGATATGCGCCAATTCGCCGAGATGCACGACATTGAAATCACGGTGATTGATAACGACACACGCCTGCCAGCGTTTAAAGACGCGCTGCGCTGGAACGAAGTGTATTACGGGTTTCGTCGCTAA
(2)含有突变体的重组载体的获得：
利用全质粒PCR技术，以步骤(1)制备得到的重组载体pMA5-araA为模板，分别对第99位、第163位、第190位、第270位、第286位、第349位、第382位、第230位、第313位以及第230和313位(这里是指对第230和313位同时进行定点突变)的氨基酸进行定点突变，分别获得含有突变体基因的重组质粒pMA5-W99L、pMA5-W163K、pMA5-R190P、pMA5-G270Q、pMA5-K286H、pMA5-S349W、pMA5-L382V、pMA5-V230L、pMA5-A313E、pMA5-V230L/A313E。
分别设计的引物序列如下：
W99L-F:TTTTCCCCGGCCAAAATGCTTATCAACGGCCTGACCATGCTC，如SEQ ID NO:6所示；
W99L-R:TGTTGAGCATGGTCAGGCCGTTGATAAGCATTTTGGCCG，如SEQ ID NO:7所示；
W163K-F:AACAAGCACATGAGCGTATCGGCTCCAAGATGCGTCAGGCG GT，如SEQ ID NO:8所示；
W163K-R:TTAGAGACCGCCTGACGCATCTTGGAGCCGATACGCTC，如SEQ ID NO:9所示；
R190P-F:CCGTCATCTGAAAGTCTGCCCTTTTGGCGATAACATGCGTGA AGTAGC，如SEQ IDNO:10所示；
R190P-R:CGCATGTTATCGCCAAAAGGGCAGACTTTCAGATGACGGGTA TCC，如SEQ ID NO:11所示；
V230L-F:GGCGATGTTAACGCGCTGCTAGATGAGTACGAAAGCTGC，如SEQ ID NO:12所示；
V230L-R:TGGTGTAGCAGCTTTCGTACTCATCTAGCAGCGCGTTAACAT CGCCATCGCT，如SEQID NO:13所示；
G270Q-F:GATGAAGCGTTTCCTGGAACAAGGTCGATTCCACGCGTTC，如SEQ ID NO:14所示；
G270Q-R:TGGTGAACGCGTGGAATCGACCTTGTTCCAGGAAACGCTTC AT，如SEQ ID NO:15所示；
K286H-F:TTTGAAGATTTGCACGGTCTGCATCAGCTTCCTGGTCTGGCC GTA，如SEQ ID NO:16所示；
K286H-R:CGCTGTACGGCCAGACCAGGAAGCTGATGCAGACCGTGCA AATCT，如SEQ ID NO:17所示；
A313E-F:GGGCGAAGGCGACTGGAAAACTGCCGAACTGCTTCGCATC，如SEQ ID NO:18所示；
A313E-R:TTCATGATGCGAAGCAGGGTTCCAGTTTTCCAGTCGCCT，如SEQ ID NO:19所示；
S349W-F:AATGACCTGGTGCTCGGCTGGCATATGCTGGAAGTCTGTCCG T，如SEQ ID NO:20所示；
S349W-R:GATCGACGGACAGACTTCCAGCATATGCCAGCCGAGCACCA G，如SEQ ID NO:21所示；
L382V-F:GACGATCCTGCCCGCGTTATCTTCAACACTCAAACCGG，如SEQ ID NO:22所示；
L382V-R:CCGGACCGGTTTGAGTGTTGAAGATAACGCGGGCAGGATC，如SEQ ID NO:23所示。
其中，PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性5min；然后进入30个循环；95℃变性30S，72℃退火30S，58℃延伸3.5min，4℃保温。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
将最终扩增片段用Dpn I酶在37℃水浴锅中作用1h用于去除模板，然后将PCR混合物化学转化到E.coli JM109感受态细胞中，转化液涂布至含氨苄青霉素(200μg/mL)LB固体培养基上，提取质粒并测序，测序工作由苏州金唯智公司完成。
实施例2
产阿拉伯糖异构酶突变体重组枯草芽孢杆菌工程菌的构建及阿拉伯糖异构酶的分离、纯化
(1)分别将实施例1得到的重组质粒pMA5-araA、pMA5-W99L、pMA5-W163K、pMA5-R190P、pMA5-G270Q、pMA5-K286H、pMA5-S349W、pMA5-L382V、pMA5-V230L、pMA5-A313E、pMA5-V230L/A313E，通过化学转化到B.subtilis 168感受态细胞中，分别制备得到基因工程菌：B.subtilis13032/pMA5-araA、B.subtilis13032/pMA5-W99L、B.subtilis13032/pMA5-W163K、B.subtilis13032/pMA5-R190P、B.subtilis13032/pMA5-G270Q、B.subtilis13032/pMA5-K286H、B.subtilis13032/pMA5-S349W、B.subtilis13032/pMA5-L382V、B.subtilis13032/pMA5-V230L、B.subtilis13032/pMA5-A313E、B.subtilis13032/pMA5-V230L/A313E。
(2)分别将步骤(1)制备得到的基因工程菌接种至10mL含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，制备得到种子液；
将制备得到的种子液分别按照2％(v/v)的接种量转接至100mL含有100μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养24h，得到发酵液。将制备得到的发酵液分别在8000×g、4℃条件下离心处理5min得到细胞菌体，并将细胞在洗涤3次后，用10mL50mM的柠檬酸钠磷酸二氢钠缓冲液(pH 8.0)重新悬浮。
在细胞悬浮液中加入20μL 100mg/L溶菌酶后，用超声破碎仪在冰浴条件下处理重悬后的细胞30min，离心30min(8000×g，4℃)，所得上清液即为粗酶液；
通过0.22-μm过滤器过滤上清液部分，然后进一步加载到1mLNi亲和柱上，该亲和柱用50mM洗涤缓冲液(20mM Tris和500mM NaCl，pH 7.4)预平衡，然后洗脱缓冲液(20mMTris、500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)用线性梯度洗脱未结合蛋白和阿拉伯糖异构酶；分别制备得到含有野生型araA的纯酶液、含有W99L的纯酶液、含有W163K的纯酶液、含有R190P的纯酶液、含有G270Q的纯酶液、含有K286H的纯酶液、含有S349W的纯酶液、含有L382V的纯酶液、含有V230L的纯酶液、含有A313E的纯酶液以及含有V230L/A313E的纯酶液。
(3)对步骤(2)制备得到的纯酶液进行比酶活测定
分别检测步骤(2)制备得到的含有野生型araA的纯酶液、含有W99L的纯酶液、含有W163K的纯酶液、含有R190P的纯酶液、含有G270Q的纯酶液、含有K286H的纯酶液、含有S349W的纯酶液、含有L382V的纯酶液、含有V230L的纯酶液、含有A313E的纯酶液以及含有V230L/A313E的纯酶液的比酶活，结果如表1和图1所示。
表1不同阿拉伯糖异构酶的比酶活
注：表1仅列出比酶活最大的三种阿拉伯糖异构酶的比酶活
实施例3
阿拉伯糖异构酶突变体酶学性质
1、热稳定性
为了测试单点突变对热稳定性的影响，对实施例2制备得到的比酶活最大的三种纯酶在50℃下孵育20min后进行酶活测定实验，得到其剩余酶活。以未经孵育的初始纯酶作为100％，测定其相对酶活力。
结果显示，突变体V230L和A313E以及组合突变体V230L/A313E分别保留51.7％，48.5％和95.3％的相对酶活，对照组(含有野生型araA的纯酶)则仅仅保留15.2％的相对酶活；而其他突变体的相对酶活均在20％以下。因此本发明的突变体V230L和A313E以及组合突变体V230L/A313E在酶活显著提高的基础上具有良好的稳定性。
2、半衰期
分别取实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型araA的纯酶液、含有V230L的纯酶液、含有A313E的纯酶液及含有V230L/A313E的纯酶液置于50℃恒温水浴中，每隔一段时间取样一次，根据阿拉伯糖异构酶酶活测定方法测其残留酶活，比较其热稳定性，得到野生型araA以及其突变体的半衰期结果如表2和图2所示。
表2不同阿拉伯糖异构酶的半衰期
3、最适pH
将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型araA的纯酶液、含有V230L的纯酶液、含有A313E的纯酶液及含有V230L/A313E的纯酶液置于含有柠檬酸/磷酸钠(pH6.0～8.0)、Tris/盐酸(pH8.0～9.0)、甘氨酸/氢氧化钠(pH9.0～10.0)的50mM缓冲液中，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图3所示。
结果显示，突变体的最适pH为9.0，与野生型类似。
4、最适温度
将实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型araA的纯酶液、含有V230L的纯酶液、含有A313E的纯酶液及含有V230L/A313E的纯酶液置于含有柠檬酸/磷酸钠(pH8.0)的50mM缓冲液中，设置反应温度为30～70℃，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图4所示。
结果显示，突变体的最适温度为50℃，与野生型类似。
5、阿拉伯糖异构酶的动力学参数
以半乳糖为底物，在标准测定条件下测定了实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型araA的纯酶液、含有V230L的纯酶液、含有A313E的纯酶液及含有V230L/A313E的纯酶液的动力学参数。其中，D-半乳糖底物浓度分别为13.6、25.2、53.1、109、156、234、301和605mM；纯酶液的添加量为10μg，在40℃条件下反应10min，反应结束后，利用GraphPad Prism 8.0对实验数据进行回归分析，确定Vmax和Km值。结果如表3所示。
结果显示，与野生型相比，突变体表现出相似的活性。这些突变体的Km和Kcat/Km等动力学参数变化较小，表明突变对酶的催化性质影响不大。
表3不同阿拉伯糖异构酶的动力学参数
6、阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖生成D-塔格糖转化率
以半乳糖为底物，在转化条件(pH 7.0、50℃)下测定了实施例2步骤(2)制备得到的含有野生型araA的粗酶液、含有V230L的粗酶液、含有A313E的粗酶液及含有V230L/A313E的粗酶液的转化率。其中，D-半乳糖底物浓度为100g/L；粗酶液的添加量为15mL，在50℃条件下反应60h，反应结束后，计算转化率。结果如表4及图5所示。
表4不同阿拉伯糖异构酶的转化率
结果显示，与野生型相比，本发明构建得到的三种突变体表现出更高的转化率。
本发明构建得到的阿拉伯糖异构酶突变体V230L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
MTIFDNYEVWFVIGSQHLYGPETLRQVTQHAEHVVNALNTEAKLPCKLVLKPLGTTPDEITAICRDANYDDRCAGLVVWLHTFSPAKMWINGLTMLNKPLLQFHTQFNAALPWDSIDMDFMNLNQTAHGGREFGFIGARMRQQHAVVTGHWQDKQAHERIGSWMRQAVSKQDTRHLKVCRFGDNMREVAVTDGDKVAAQIKFGFSVNTWAVGDLVQVVNSISDGDVNALLDEYESCYTMTPATQIHGKKRQNVLEAARIELGMKRFLEQGGFHAFTTTFEDLHGLKQLPGLAVQRLMQQGYGFAGEGDWKTAALLRIMKVMSTGLQGGTSFMEDYTYHFEKGNDLVLGSHMLEVCPSIAAEEKPILDVQHLGIGGKDDPARLIFNTQTGPAIVASLIDLGDRYRLLVNCIDTVKTPHSLPKLPVANALWKAQPDLPTASEAWILAGGAHHTVFSHALNLNDMRQFAEMHDIEITVIDNDTRLPAFKDALRWNEVYYGFRR
阿拉伯糖异构酶突变体A313E的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
MTIFDNYEVWFVIGSQHLYGPETLRQVTQHAEHVVNALNTEAKLPCKLVLKPLGTTPDEITAICRDANYDDRCAGLVVWLHTFSPAKMWINGLTMLNKPLLQFHTQFNAALPWDSIDMDFMNLNQTAHGGREFGFIGARMRQQHAVVTGHWQDKQAHERIGSWMRQAVSKQDTRHLKVCRFGDNMREVAVTDGDKVAAQIKFGFSVNTWAVGDLVQVVNSISDGDVNALVDEYESCYTMTPATQIHGKKRQNVLEAARIELGMKRFLEQGGFHAFTTTFEDLHGLKQLPGLAVQRLMQQGYGFAGEGDWKTAELLRIMKVMSTGLQGGTSFMEDYTYHFEKGNDLVLGSHMLEVCPSIAAEEKPILDVQHLGIGGKDDPARLIFNTQTGPAIVASLIDLGDRYRLLVNCIDTVKTPHSLPKLPVANALWKAQPDLPTASEAWILAGGAHHTVFSHALNLNDMRQFAEMHDIEITVIDNDTRLPAFKDALRWNEVYYGFRR
阿拉伯糖异构酶突变体V230L/A313E的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：
MTIFDNYEVWFVIGSQHLYGPETLRQVTQHAEHVVNALNTEAKLPCKLVLKPLGTTPDEITAICRDANYDDRCAGLVVWLHTFSPAKMWINGLTMLNKPLLQFHTQFNAALPWDSIDMDFMNLNQTAHGGREFGFIGARMRQQHAVVTGHWQDKQAHERIGSWMRQAVSKQDTRHLKVCRFGDNMREVAVTDGDKVAAQIKFGFSVNTWAVGDLVQVVNSISDGDVNALLDEYESCYTMTPATQIHGKKRQNVLEAARIELGMKRFLEQGGFHAFTTTFEDLHGLKQLPGLAVQRLMQQGYGFAGEGDWKTAELLRIMKVMSTGLQGGTSFMEDYTYHFEKGNDLVLGSHMLEVCPSIAAEEKPILDVQHLGIGGKDDPARLIFNTQTGPAIVASLIDLGDRYRLLVNCIDTVKTPHSLPKLPVANALWKAQPDLPTASEAWILAGGAHHTVFSHALNLNDMRQFAEMHDIEITVIDNDTRLPAFKDALRWNEVYYGFRR
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种阿拉伯糖异构酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位和/或第313位的氨基酸进行突变得到。
2.根据权利要求1所述的阿拉伯糖异构酶突变体，其特征在于，
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位的缬氨酸突变为亮氨酸；或
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第313位的丙氨酸突变为谷氨酸；或
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位缬氨酸突变为亮氨酸，同时将第313位的丙氨酸突变为谷氨酸。
3.编码权利要求1或2所述的阿拉伯糖异构酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其是以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体或pDXW-10载体中的任一种作为表达载体。
6.一种包含权利要求4所述重组载体的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌或酵母菌中的任一种为表达宿主。
8.一种提高阿拉伯糖异构酶酶活的方法，其特征在于，
是将权利要求1所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的阿拉伯糖异构酶的第230位和/或第313位的氨基酸进行突变。
9.一种权利要求4所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞在制备阿拉伯糖异构酶中的应用。
10.一种权利要求1所述的突变体或权利要求3所述的基因或权利要求4所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞在转化半乳糖生产D-塔格糖中的应用。
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