KR20000053041A - 돌연변이 페니실린 ｇ 아실라제 - Google Patents

돌연변이 페니실린 ｇ 아실라제 Download PDF

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Abstract

본원은 변형된 효소 활성을 나타내는, 바람직하게는 E. coli로부터 기원한, 신규한 페니실린 G 아실라제를 제공한다. 이 페니실린 G 아실라제는 적어도 하나의 아미노산에 있어서 야생형 페니실린 G 아실라제와는 다른 아미노산을 갖는 페니실린 G 아실라제를 코드하는 유전자를 발현시키므로서 얻어질 수 있다.

Description

돌연변이 페니실린 Ｇ 아실라제 {Mutant Penicillin G Acylase}
오늘날 암피실린 (ampicillin), 아목시실린 (amoxicillin), 세팔렉신 (cephalexin), 세파드록실 (cefadroxil) 및 셉프로질 (cefprozil)과 같은 반합성 (semisynthetic) 베타-락탐 유도체 (beta-lactam derivatives)들은 화학적 방법에 의해 상업적 규모로 생산되고 있다. 이러한 항생제를 효소 촉매적으로 합성한다는 것은 효소 반응이 상업적 중요성을 갖을 수 있다는 명백한 하나의 예가 된다. 효소를 사용하는 것은 통상의 화학적 방법에 비하여 다음과 같은 몇가지 이점이 있다: (1) 독성 시약이나 용매의 사용을 피할 수 있는 점; (2) 효소의 특이성으로 인하여 항생제 핵의 카복실기 보호가 불필요 한 점; (3) 라세미화를 포함한 부반응 (side reaction)을 피할 수 있는 점.
이런 면에서, 페니실린 G 아실라제는 큰 장점이 있다. 페니실린 G 아실라제는 페니실린 G 아미다제 (penicillin G amidase) 또는 벤질페니실린 아미도하이드롤라제 (benzylpenicillin amidohydrolase) [EC. 3.5.1.11] 라고도 불리는 것으로서 자유 아민 형태 (6-APA와 그 유도체, 화학식 III 및 7-APA와 그 유도체, 화학식 IV)에 대하여 화학식 I 및 II를 갖는 페니실린의 6-아실기 또는 세팔로스포린의 7-아실기를 가수분해 할 수 있는 미생물의 하이드롤라제 그룹, 특히 박테리아로부터 기원한 것을 말한다.
상기 식에서,
R1은 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 히드록시페닐글리신, 페닐글리신 및 그들의 유도체, 또는 아세틸, 아디필 및 그들의 유도체이고,
R2및 R3은 하나 또는 그 이상의 O, S 또는 N 원자를 갖거나 갖지 않는 지방족 또는 방향족 화합물이며,
R4는 하나 또는 그 이상의 O, S 또는 N 원자를 갖거나 갖지 않는 지방족 또는 방향족 알콜이나 그들의 유도체이다.
다른 방향족 또는 지방족 (소수성, 또는 전하성/극성) 아실기도 다양한 정도로 (일반적으로 더 적게) 가수분해 될 수 있지만, 바람직한 아실기는 페닐아세틸이다. 상이한 아실기에 대한 선호도는 역반응의 경우 즉, 아실기와 6-APA 및 7-ACA (III 및 IV)간의 아미드 결합 형성과 같은 경우에는 반드시 위와 같지 않다. 예를 들어, 클로로아세틸기는 7-ACA에 방향족 아실기보다 훨씬 더 빨리 결합한다 (일본특허공개공보 JP08000284-A). 현재 시판되고 있는 베타-락탐 항생제의 많은 것들이 그 아실기가 다양한 범위의 소수성을 띄는 방향성 작용기들이다. 야생형 페니실린 G 아미다제는 이러한 항생제의 반합성 (semisynthesis)을 촉매할 수 있지만, 항생제를 생산하기에 적절하고 경제적인 조건에서는 반응이 완결 (go to completion)되기 어렵다. 따라서 이러한 반응의 생산 수율 (production yield)과 효율을 증대시키는 것이 기대된다.
변형된 아미노산을 가지므로서 기질 특이성이 바뀌거나 촉매활성이 변한 페니실린 G 아실라제에 관한 문헌들이 많다. 프리에토 등은 [I. Prieto et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33 (1990) 553-559] K. 시트로필라 (K. citrophila) 페니실린 G 아실라제의 Met168을 Ala, Asp, Val, Asn, 및 Tyr으로 치환하여 페니실린 G와 페니실린 V 디아실화의 변형된 카이네틱 파라미터 (kinetic parameter) 등을 얻었지만, Lys375를 Asn으로 치환하거나 His481을 Tyr으로 치환한 경우에는 그러하지 못하였다. 마틴 등은 문헌에서 [J. Martic & I. Prieto, Biochimica et Biophysica Acta 1037 (1990) 133-139] Met168이 Ala으로 바뀌므로서 기질 특이성이 달라지고 열안정성이 증가된 돌연변이 페니실린 G 아실라제에 관하여 기술하고 있다. 왕 민 등은 문헌에서 [Wang Min et al. Shiyan Shengwu Xuebao 24 (1991), 1, 51-54] E. coli 페니실린 G 아실라제의 Ser177을 Gly, Thr, Leu, Arg으로 치환하였더니 모두 효소가 불활성화 되었음을 보고하고 있다. 경숙 등과 [Kyeong Sook et al. Journal of Bacteriology 174 (1992) 6270-6276] 슬레이드 등은 [Slade et al. Eur. J. Biochem. 197 (1991) 75-80] Ser290이 E. coli 페니실린 G 아실라제의 필수 아미노산 잔기임을 확인하였다. Ser290을 Cys으로 치환한 경우 효소는 완전히 불활성화 되었다. 니에르바흐 등은 [Niersbach et al. Biotechnology Letters 17, 1, (1995) 19-24] E. coli 페니실린 G 아실라제의 Lys359를 Asp로 치환하였다. 이 돌연변이 효소는 페니실린 G를 가수분해하는 능력을 상실하였으나 프탈릴-L-로이신 (phthalyl-L-leucine) 및 프탈릴-L-프롤린을 가수분해하는 새로운 활성을 갖게 되었다. E. coli 페니실린 G 아실라제의 Trp431을 Arg으로 부위특이적 돌연변이 시킨 페니실린 G 아실라제는 알카리 pH에서 안정성이 증대되었음이 보고되었다 [Gabriel del Rio et al. Biotechnology and Bioengineering 48 (1995) 141-148].
발명자들은 본 명세서에서 야생형 효소와 비교할 때 변화된 효소활성을 가지는 돌연변이 페니실린 G 아실라제을 제공한다.
< 발명의 요약>
본 발명은 일면 돌연변이 페니실린 G 아실라제를 코드하도록 야생형, 특히 그 기원이 원핵생물인 DNA를 (E. coli 기원의 효소 구조는 제1A도 내지 1D에 도시되어 있다) 변형시키는 것에 관한 것이다. 타입 II 아실라제는 모두 공통적인 분자구조를 가지고 있다. 타입 II 아실라제는 작은 서브 유니트 (알파; 16-26 킬로달톤 (KDa))와 큰 서브 유니트 (베타; 54-66 킬로달톤 (KDa))로 구성된 이종다이머 (heterodimer)이다. 본 명세서에서 사용된 "페니실린 G 아실라제"란 용어는 원핵 타입 II 아실라제 뿐만이 아니라 그 전구효소 (preenzyme) 및 전전구효소 (preproenzyme)까지 포함하는 것을 의미한다. E. coli 야생형 페니실린 G 아실라제의 알파 서브 유니트에 대한 DNA 서열 (SEQ.ID.NO.:1) 및 해당 아미노산 서열 (SEQ.ID.NO.:2)을 제1A도에 나타내었다. E. coli 야생형 페니실린 G 아실라제의 베타 서브 유니트에 대한 DNA 서열 (SEQ.ID.NO.:3) 및 해당 아미노산 서열 (SEQ.ID.NO.:4)을 제1B도 내지 제1D도에 나타내었다. 본 발명에서는 하나 도는 그 이상의 특정 아미노산 잔기들이 천연의 아미노산 그릅에서 선택된 다른 아미노산 잔기들로 치환된다. 물론 본 발명의 돌연변이된 DNA 서열에는 원하는 부위에서 원하는 아미노산을 코드하도록 하기위해 필요한 변형이 가해진다. 구조의 변화는 야생형 페니실린 G 아실라제의 X-선 결정구조 (X-ray crystallographic structure)에 의거하여 정하였다. 본 발명에서의 각각의 치환에 대한 DNA 또는 아미노산 서열의 변화를 제2도에 나타내었다.
본 발명에서는 하나 또는 그 이상의 지정된 부위에 다음의 치환을 도입하였다 :
1. 알파 서브 유니트에 대하여:
DNA 염기쌍: A424-426 (MetA142 - Ala)
DNA 염기쌍: A436-438 (PheA146 - Ala)
2. 베타 서브 유니트에 대하여:
DNA 염기쌍: B70-72 (PheB24 - Ala, Leu, Val, Pro, Tyr, Met, Ser, Cys, Gly, Asp, Lys, Arg, Tyr, Thr, Ile, Glu, Gln, Asn 또는 His)
DNA 염기쌍: B166-168 (ValB56 - Ser 또는 Thr)
DNA 염기쌍: B529-531 (IleB177 - Phe)
위에 사용된 명명법에서 "A"는 알파 서브 유니트를 "B"는 베타 서브 유니트를 의미한다; 번호는 통상의 경우와 같이 아미노산 서열의 경우 N-말단에서 C-말단, DNA 서열의 경우 5＇에서 3＇순이다; 아미노산의 위치를 나타내는 숫자의 앞에 위치하는 아미노산은 야생형 아미노산을 나타내며 그 후에 위치하는 아미노산은 치환된 아미노산을 나타낸다. 예를 들어 "ValB56-Ser 또는 Thr"은 야생형 베타 서브 유니트의 56번 위치의 아미노산은 Val인 데 이것이 본원의 돌연변이 아실라제에서는 Ser 또는 Thr으로 치환된 것을 의미한다.
본원의 변형된 아실라제는 야생형 페니실린 G 아실라제와 비교하여 볼 때 변형된 효소 활성을 갖는다.
가장 바람직하게 변형된 (돌연변이) 페니실린 G 아실라제는 하나의 아미노산이 변형된 것으로 (PheB24-Ala), 야생형 효소보다 훨씬 높은 수율과 효율로 베타-락탐 항생제를 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 변형된 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미생물 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 숙주세포를 배양하고, 바람직하게는 그 후에 아실라제를 분리하는 단계를 포함하는 변형된 아살라제를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다는 측면은 베타-락탐 항상제 (예, 세파드록실, 셉프로질, 아목시실린)을 반합성하기 위하여 상기의 돌연변이 페니실린 G 아실라제를 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 기질의 농도, pH 값 및 온도와 같은 조건들은 후술하는 바와 같다. 돌연변이 페니실린 G 아실라제를 사용하는 경우 야생형 효소를 사용하는 것보다 반합성 반응의 수율과 효율이 훨씬 증대된다.
본 발명은 타입 II 페니실린 G 아실라제를 코딩하는 변형된 유전자, 상기 유전자에 의하여 코드되는 변형된 특성을 지닌 페니실린 G 아실라제 및 이러한 페니실린 G 아실라제를 사용하여 베타-락탐 항생제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1A는 E. coli 야생형 페니실린 G 아미다제 알파 서브 유니트 유전자의 핵산 서열 (DNA) 및 그 핵산 서열에 의하여 코드되는 해당 아미노산 서열.
도 1B는 E. coli 야생형 페니실린 G 아미다제 베타 서브 유니트 유전자의 핵산 서열 (DNA) 및 그 핵산 서열에 의하여 코드되는 해당 아미노산 서열.
도 1C는 도 1B의 계속.
도 1D는 도 1C의 계속.
도 2는 본 발명의 구체적인 돌연변위 부위에 해당하는 페니실린 G 아실라제 단편의 DNA 및 아미노산 서열. DNA 단편 1은 SEQ.ID.NO.:5, 아미노산 단편1은 SEQ.ID.NO.:6, DNA 단편2은 SEQ.ID.NO.:7, 아미노산 단편2은 SEQ.ID.NO.:8, DNA 단편3은 SEQ.ID.NO.:9, 아미노산 단편3은 SEQ.ID.NO.:10, DNA 단편4는 SEQ.ID.NO.:11, 아미노산 단편4는 SEQ.ID.NO.:12, DNA 단편5은 SEQ.ID.NO.:13, 아미노산 단편5은 SEQ.ID.NO.:14.
도 3은 페니실린 G 아실라제의 변형된 DNA 서열을 지닌 실시예 1의 PBM 벡터의 설명도.
도 4는 페니실린 G 아실라제의 기질 결합 부위 구조의 컴퓨터 그래픽 이미지. 명료성을 위하여 단백질의 골격 (backbone)그림을 생략한다. 그 부위를 구성하는 분리된 아미노산들은 스틱 구조 다이어그램 (stic structural diagram)으로 표시한다. 원자의 종류는, 폴리펩티드 골격 탄소, 흰색; 곁사슬 탄소, 밝은 회색; 질소, 진한 회색; 산소, 검정색과 같이 음영으로 표시한다. 절단되는 기질, 페닐아세틱 산은 부위의 중앙에서 화살표로 표시된다. B24의 페닐알라닌 곁사슬도 화살표로 표시된다. 보는 바와 같이, B24 잔기의 방향성 곁가지 고리 (aromatic side chain ring)는 그 부위의 중앙부에서 기질과 접촉하여 기질을 용매로부터 격리(shielding)시키는 중요한 위치를 점하고 있다. 이 이미지는 페닐아세틱 산 -페니실린 G 아실라제의 X-선 크리스탈로그래픽 좌표로부터 생성되었다.
본 발명의 주제인 페니실린 G 아실라제는 야생형 효소에 비하여 변형된 기질 특이성 및/또는 변형된 비활성(specific activity)을 갖는다. 본 발명의 효소는 특히 야생형의 효소에 비하여 향상된 수율 및/도는 효율을 갖는다. 본원발명의 변형된 효소를 사용하기 위한 최적 조건을 결정하기 위하여 통상적으로 행하는 실험들이 필요할 수 있다. 본원의 변형된 효소를 만들기 위하여 사용되는 야생형 효소는 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli), 클루이베라 시트로필라 (Kluyvera citrophila), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri), 슈도모나스 에스피 (Pseudomonas sp), 알칼리제네스 페칼리스 (Alkaligenes faecalis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 아트로박터 비스코서스 (Arthrobacter viscosus) 등과 같은 원핵생물들로부터 얻는다. 아실라제는 바람직하게는 다음과 같은 특성을 같는다 : (1) 원핵생물인 E. coli (예, ATCC 11105)로부터 분리된다. (2) 하나의 펩티드 체인 전구체로 번역된다 (3) 번역후 프로세싱되어 작은 N-말단 도메인 (알파 서브 유니트)과 큰 C-말단 도메인 (베타 서브 유니트)으로 구성된 이종다이머가 된다. 바람직한 알파 서브 유니트의 분자량은 약 24000이며 바람직한 베타 서브 유니트의 분자량은 약 64000이다. 원하는 효소의 활성형은 인발적으로 E. coli의 페리플라즘(periplasm)에서 발견된다.
최근의 LC-MS 데이터는 E. coli의 번역 후 프로세싱 (post-translational processing)에의해 알파 서브 유니트가 C-말단에서 10 내지 15 아미노산 정도, 아마도 12 또는 13아미노산이 절단되는 것을 암시하고 있다. 마찬가지로, 동 데이터는 번역 후 프로세싱에 의하여 N-말단 아미노산의 하나 또는 두 개가 제거되는 것을 나타내고 있다. 그러므로, 본 발명은 알파 서브 유니트의 N-말단에서 하나 또는 두 개의 아미노산이 절단되고/되거나 그 알파 서브 유니트 C-말단에서 아미노산이 10개 내지 15개 , 바람직하게는 아미노산이 12개 내지 13개가 절단된 돌연변이 페니실린 G 아실라제를 포함한다.
페니실린 G 아실라제의 기질 특이성은 돌연변이 효소가 페니실린 G에 천연적으로 존재하는 곁사슬인 페닐아세틸 이외의 곁사슬을 가지고 있는 페니실린 또는 세팔로스포린 유도체를 자르거나 합성할 수 있는 방향으로 변형시킨다. 페니실린 G 아실라제에 의하여 크게 영향을 받지 않는 곁 사슬의 예로는 디카복실산인 숙신산 (succinic acid), 글루타르 산 (glutaric acid), 아디프산 (adipic acid), 아미노아디프 산(aminoadipic acid) 등이 있다.
본 발명의 돌연변이 효소는 키랄 물질의 라세믹 혼합물을 거울상이성체로 전환하는데 있어서 유리한, 증가된 입체 특이성을 나타낼 수 있다. 이러한 특징은 아미노기나 (예를 들어, 암피실린, 세팔렉신, 아목시실린, 세파드록실, 세파클로르 (cefaclor)의 경우) 히드록시기 (예를 들어, 세파만돌(cefamandole)의 경우) 때문에 키랄 알파 탄소를 갖는 페닐아세틸 곁사슬이나 페닐아세틸 곁사슬의 활성화된 유도체의 (예, 페닐글리신-아미드 또는 그 에스테르, p-히드록시 페닐글리신-아미드 또는 그 에스테르 등등) 라세믹 혼합물로부터 거울이성질적으로 순수한 반합성 항생제를 생산하는 데 있어서 아실라제를 매우 유용한 것으로 만들 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 효소로부터 하나의 아미노산 잔기를 새로운 잔기로 치환하는 것에 관한 통상의 유전자 재조합 기술을 사용하여 만들어진 페니실린 G 돌연변이체들의 동정에 관한 것이다. 하이드롤라제 활성에 비하여 트랜스퍼라제 활성이 증가된 페니실린 G 아실라제 변이체들이 바람직하다. 이러한 효소가 합성에 더 유용하기 때문이다. 아목시실린, 세파드록실, 셉프로질, 그리고 세팔렉신과 같은 항생제를 효소적으로 합성하는 능력이 우수한 돌연변이들이 바람직하다.
특정 부위의 유전자에 돌연변이를 일으키는 것은 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 특정 부위의 DNA 서열을 변형시키는 방법으로 수행한다. 본 발명의 돌연변이 페니실린 G 아실라제는 다음 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다:
(1) 통상의 폴리머라제 연쇄반응 부위 특이적 돌연변이 (polymerase chain reaction site-directed mutagenesis)법에 의하여 페니실린 G 아실라제를 코딩하는 유전자의 특정 부위에 돌연변이를 도입하는 단계. 이들 돌연변이를 위한 특정 올리고뉴클레오티드들은 판매되는 재료로부터 합성하였다. 이 올리고뉴클레오티드들은 돌연변이에 해당하는 내부 부분을 제외하고는 돌연변이의 대상이 되는 것과 그 서열이 동일하다.
(2) 돌열변이된 유전자를 클로닝 벡터에 클로닝하는 단계.
(3) 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계.
(4) 숙주 세포를 적절한 배양액에서 배양하는 단계.
(5) 얻어진 돌연변이 페니실린 G 아실라제를 분리하고 고정화하는 단계.
(6) 상기 돌연변이들을 가수분해 및 합성 활성면에서 검정하는 단계.
본 방법에 의한 페니실린 G 아실라제의 돌연변이화는 새 기질 특이성 및/또는 변형된 효소 활성을 갖게 한다. 포인트 돌연변이 (point mutation)를 일이키기위하여서는 단백질 결정학, 분자 모델링, 분자생물학 및 단백질 화학 기술을 고려하여 적절한 방법을 선택한다. 본 발명에 따르면 특정 위치의 아미노산들이 효소의 활성 면에서 중요한 부위인 것으로 밝혀졌다. 그러한 잔기들로는 MetA142, PheA146, PheB24, ValB56 및 IleB177이 있다. 이런 잔기들은 X-선 결졍 구조로부터 확인되었다.
본 발명의 효소를 야생형 효소와 비교하는 경우 돌연변이 및 야생형 페니실린 G 아실라제가 조 세포 파쇄액 (crude cell lysate) 또는 고정화된 고상의 형태, 특히 후자의 형태로 존재한다. 본 발명의 효소로서 PheB24 - Ala 돌연변이를 가진 것은 향상된 베타-락탐 항생제를 합성 능력을 보이므로 바람직한 것이다.
본 발명은 본 발명의 핵산 서열이 숙주 세포에서 이를 발현시킬 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하도록 연결된 발현 벡터를 또한 포함한다. 바람직한 벡터들로는 제3도에 개시된 PBMPGA 플라스미드 같은 것들이 있다. 본 발명에서 유용한 발현 벡터들은 통상 복제 기원 (origin of replication), DNA 서열 앞 (즉, 위쪽)에 위치하는 포로모터 및 그 뒤에 돌연변이 아실라제의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 가지고 있다. 돌연변이 아실라제의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열 뒤에는 전사 종료 서열 (transcriptional termination signals)과 벡터의 나머지 부분들이 존재한다. 발현 벡터들은 공지 기술로 알려진 다른 DNA 서열, 예를 들어, 발현물의 안정성을 주기 위한 안정성 리더 (stability leader), 발현물이 분비되도록 하는 분비성 리더 (secretory leader), 구조 유전자의 발현을 조절할 수 있는 서열 (예, 성장 배지내의 영양소나 유도인자의 존재 가부에 의하여), 형징전환된 숙주세포에서 표현형 선발 (phenotypic selection)을 가능하게 하는 표시 서열 (marking sequences), 제한 효소의 절단 부위를 제공하는 서열들과 같은 것을 포함할 수 있다. 실제로 사용되는 발현 벡터들의 성질은 사용되는 숙주 세포와 양립 가능한 (compatible) 것이어야 한다. 예를 들어, E. coli 세포 시스템에서 클로닝을 할 때 발현 벡터는 E. coli 세포의 게놈으로부터 분리된 프로모터 (예, tac, lac 및 trp)를 가진 것이어야 한다. 다양한 E. coli 숙주에 대한 적절한 복제 기원은, 예를 들어, ColEI 플라스미드 복제 기원을 포함한다. 적절한 포로모터로는, 예를 들어, tac, lac, trp 및 E. coli로부터의 neo-r 유전자 프로모터와 같은 것을 포함한다. 적절한 종료서열에는, 예를 들어, 페니실린 G 아실라제, T7 파지 유전자 10 그리고 E. coli로부터의 neo-r 유전자 종료 서열들이 포함된다. 발현 벡터는 또한 선택 가능한 마커 (selectable marker)를 코딩하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 선택 가능한 마커는 항생물질 내성 (antibiotic resistance)인 것이 바람직하다. 선택 가능한 마커로는 암피실린 내성 및 네오마이신 내성이 자주 사용된다. 이러한 모든 물질은 공지이고 시판되고 있다.
원하는 코딩 및 조절 서열을 갖는 적절한 발현 벡터들은 알려진 통상의 유전자 재조합 기술을 사용하여 만들 수 있으며, 많은 방법들이 삼브룩(Sambrook et al.) 등의 문헌 분자클로닝 (Molecular Cloning)에 기술되어 있다: A laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
본 발명은 부차적으로 돌연변이 아실라제의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 지닌 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 바람직하게는 제2도에 도시된 하나 또는 그 이상의 돌열변이를 지닌 DNA서열 중 하나의 전부 도는 일부를 함유하는 발현 벡터를 가지고 있다. 더욱 바람직하게는 숙주 세포는 돌연변이 아실라제의 전부 도는 일부를 코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 복제 및/또는 발현을 지시하는 하나 또는 그 이상의 조절 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 가지고 있다. 적절한 숙주 세포로는, 예를 들어, 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드 (Life Technologies, Inc., P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20897)로부터 입수 가능한 E. coli HB101 (ATCC 33694); 노바겐 인코포레이티드 (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, Wi 53711)로부터 입수 가능한 BL21; 등과 같은 것들이 있다.
발현 벡터들은 여러가지 통상의 방법을 사용하여 숙주세포로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션(transfection)하는 것은 폴리에틸렌 글리콜 매개 원형질체 형질전환법 (polyethylene glycol mediated protoplast transformation)으로 수행될 수 있다. 그러나 숙주 세포에 발현 벡터를 도입하는 다른 방법들, 예를 들어, 엘렉트로포레이숀 (electroporation), 바이오리스틱 인젝션 (biolistic injection) 또는 원형질체 융합 (protoplast fusion) 같은 것들로도 행해질 수 있다.
일단, 발현벡터가 적절한 숙주 세포로 도입되면, 숙주 세포는 원하는 돌연변이 아실라제의 발현이 가능한 조건에서 배양될 수 있다.
플라스미드 pBMPGA ((pBMF1PGA)+)를 함유하는 숙주세포, E. coli BL21는 부다페스트 조약 하에, 1997년 9월 4일, 기탁번호 ATCC 98537로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture collection, Rockville, Maryland 20852)에 기탁되었다.
돌연변이 아실라제의 전부 또는 일부를 코드하는 DNA 서열을 함유하는 발현벡터를 포함한 숙주세포는 다음 다섯가지의 일반적인 방법 중의 하나 또는 그 이상의 방법에 의하여 확인할 수 있다: (a) DNA-DNA 혼성화(hybridization); (b) 마커 유전자 기능의 유무; (c) 숙주 세포에서 페니실린 G 아실라제의 mRNA 전사로 측정한 전사 수준; (d) 면역적 방법에 의한 유전 산물의 측정; 및 (e) 효소적 검정 (비색 검정 (colorimetric detection) 등).
본 발명의 발현 벡터, 플라스미드 또는 DNA 분자의 DNA 서열은 통상의 기술에 의하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 생거(Sanger et al.) 등에 의한 디데옥시 체인 터미네이션 (dideoxy chain termination) 방법, 또는 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)]에 기술된 맥삼-길버트 (Maxam-Gilbert) 방법을 사용할 수 있다.
물론, 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위한 모든 발현 벡터와 DNA 조절 서열이 다 똑같이 잘 작용하는 것은 아니라는 것을 알아야 한다. 마찬가지로 같은 발현 시스템에서 모든 숙주세포들이 동일하게 작용하는 것은 아니다. 그러나 당업자라면 여기에 제시된 기준으로부터 과도한 실험없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 발현 벡터들, DNA 조절 서열들 그리고 숙주세포들 중에서 선택 할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 동정된 모든 아미노산들은 천연의 L-배위의 것 (L-configuration)이다. 문헌 [J. Biol. Chem. 243, 3557-3559 (1969)]의 폴리펩티드 명명법 기준에 따른 아미노산 잔기에 대한 약어들을 하기 표에 나타내었다:
대응 약어의 표
기 호 아미노산
1문자 3문자
YGFMASILTVPKHQEWRDNC TyrGlyPheMetAlaserIleLeuThrValProLysHisGlnGluTrpArgAspAsnCys L- 티로신L- 글리신L- 페닐알라닌L- 메티오닌L- 알라닌L- 세린L- 이소로이신L- 로이신L- 트레오닌L- 발린L- 프롤린L- 리신L- 히스티딘L- 글루타민L- 글루탐산L- 트립토판L- 아르기닌L- 아스파르트산L- 아스파라긴L- 시스테인
모든 아미노산 서열은 본 명세서에서 좌에서 우로의 배향이 통상의 아미노-말단에서 카복시-발단 방향인 일반식으로 표현한다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게는 공지의 방법인 합성 수단, 즉 성분 아미노산으로부터 폴리펩티드를 화학 합성함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 휴톤 (Houghton) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 5131-5135 (1985)]에 기재된 고체상 방법 (solid phase procedure)을 사용할 수 있다. 돌연변이 아실라제를 코딩하는 DNA서열을 원색 숙주세포에서 제조하거나, 또는 돌연변이 아실라제를 코딩하는 DNA 서열에 의하여 코딩되는 mRNA의 시험관내 번역 (in vitro translation)에 의하여 폴리펩티드를 얻는 것이 바람직하다. 예를 들어, DNA 서열을 PCR을 사용하여 상기와 같이 합성한 후 적합한 발현 벡터내로 삽입하여, 적합한 숙주세포를 형질전환 시키는 데 사용할 수 있다. 이러서 재조합 숙주세포를 배양하여 효소를 생산한다. 상기 수단에 의한 폴리펩티드의 제조 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재되어 있다.
이러한 방법으로 제조한 폴리펩티드를 단리하고, 각종 단백질 정제 기술을 사용하여 어느 정도 정제할 수 있다. 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 면역친화도 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법들을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 폴리펩티드를 결정된 DNA 서열 및 이로부터 추정되는 아미노산 서열에 의해 규정하였다. 유전자 코드의 동의성 (degeneracy)에 의하여 대부분의 아미노산 잔기와 정지 신호 (stop signal)에 하나 이상의 코돈이 존재하므로 제1도에 나타낸 것과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다른 DNA 서열이 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 DNA 및 아미노산 서열의 대립형질 이형 (allelic variations)이 자연적으로 존재하거나, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 의도적으로 유도될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 이형은 전체 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 차이, 또는 상기 서열 중 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 역전 또는 첨가에 의해 나타날 수 있다. 이러한 아미노산의 치환은 예를 들면 관련된 잔기의 극성(polarity), 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성에 있어서의 유사성을 근거로하여 제조될 수 있다. 에를 들면, 음으로 대전된 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고, 양으로 대전된 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며, 유사한 친수성 값을 갖는 비전하 극성 헤드기 또는 비극성 헤드기가 있는 아미노산에는 로이신, 이소로이신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신이 포함된다. 그 외 의도된 이형에는 상기 폴리펩티드의 염 및 에스테르만이 아니라 상기 폴리펩티드의 전구체, 예를 들면 리더 서열로서 메티오닌이나 N-포밀메티오닌을 지닌 N-말단 치환체를 갖는 전구체가 포함된다.
본 발명은 또한 본원의 숙주세포를 돌연변이 아실라제를 생산하기에 적합한 조건에서 배양하여 본 발명의 돌연변이 페니실린 G 아실라제를 생산하는 방법을 포함한다. 박테리아 숙주 세포의 경우, 전형적이 배양 조건은 적절한 항생제와 유도 물질이 포함된 액상 배양이다. 배양액은 효소의 최적 생산을 위한 온도, 예를 들어 약 28℃ 내지 약 29℃에서 흔들거나 교반한다. 통상 사용되는 항생제에는 카나마이신 (canamycin), 클로람페니콜 (chloroamphenicol), 테트라사이클린 (tetracyclin) 등이 포함된다.
본 발명은 6-아미노-베타 락탐 또는 7-ACA 또는 그 염 또는 그 에스테르 각각과 아실화제 (acylating agent)를 아실화가 일어나기에 적합한 조건 하에서 본원 발명의 돌연변이 아실라제와 접촉시키는 것을 포함하는 반 합성 6-아실화 페니실란 산 (6-acylated penicillanic acid), 7-아실화 세팔로스포란 산 (7-acylated cephalosporanic acid) 또는 그들의 염 또는 에스테르을 제공하는 방법을 포함한다. 통상 사용되는 아실화제에는 아목시실린, 셉드록실, 셉프로질 등의 곁사슬 에스테르나 아미드가 포함된다. 통상 사용되는 아실화제에는 페닐글리신, 파라히드록시페닐글리신, 페닐아세틱산, 페녹시아세틱산, 그들의 에스테르 또는 아미드가 포함되며 이에 제한되지 않는다. 바람직한 아실화제는 위에 언급된 산의 에스테르들이다. 이 에스테르 들의 알콜 부분은 메탄올과 이들의 장쇄 유사체 (longer-chain analogues) 및 입체이성체들, 에틸렌 글리콜과 이들의 장쇄 유사체 및 입체이성체들을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직한 것은 에틸렌 글리콜 에스테르들이다. 통상의 아실화 조건은 중성 또는 이보다 낮은 pH의 수용액 완충제에서 지속적으로 저어주며 행하는 것이다. 통상 온도는 약 0℃ 내지 약 35℃ 이다. 상기 반응에 사용하는 돌연변이 아실라제는 숙주 세포로부터 직접 (in situ) 만든 것이거나 미리 만들어진 것일 수 있다. 만일 무세포 (cell-free) 아실라제를 사용하는 경우에는 조 세포 리세이트 (crude cell lysate) 이거나 부분적으로 단리된 것이거나 또는 순수하게 분리된 것일 수 있다. 돌연변이 아실라제를 고정화하는 것이 바람직하다. 여기서 사용되는 통상의 고정화 지지대는 셀라이트 (celite), 디칼라이트 (dicalite) 또는 UOP 비드 (UOP beads)를 포함한다.
하기의 실시예는 본 발명을 추가 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명을 상세히 이해하기 위하여 제공되는 것이다.
하기의 실시예에서, 일부 시약, 제한 효소 그리고 다른 재료들은 시판되는 것을 사용하였고 공급자의 지시사항에 따라 사용하였다. DNA의 분리, 동정 및 클로닝과 관련된 조작은 당업계에 잘 알려져 있으며 문헌으로부터 변형될 수 있다.
<실시예 1>
부위특이적 돌연변이 (Site-specific Mutagenesis)
선택된 부위에서의 아미노산 돌연변이는 상기한 PCR-부위특이적 방법으로 행하였다. 원하는 돌연변이를 일으키기 위하여 사용된 올리고뉴클레오티드는 판매되는 것을 구입하였다. 구체적으로 올리고뉴클레오티드는 다음 서열을 갖는다 :
<서열>
(1) 돌연변이 유전자 합성을 위한 주형으로 사용된 PBM 플라스미드에 (제3도) 페니실린 G 아실라제 유전자를 삽입한다.
(2) 돌연변이를 결정하는 내부 부분을 제외하고 돌연변이를 일으킬 부위의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제작한다.
(3) 통상의 PCR 기술을 사용하여, 합성 올리고뉴클레오티드를 주형에 결합시키고 그 주형을 증폭시킨다. 더블-스트랜드 (double-strand) 돌연변이를 일으키기 위하여 제 2회 PCR에 사용할 목적으로 메가프라이머 (megaprimer) 산물을 분리하였다. 돌연변이 DNA는 분리를 위한 아가로스 겔 (preparative agarose gel)로부터 분리하였다.
<실시예 2>
페니실린 G 아실라제의 클로닝 및 발현
돌연변이 페니실린 G 아실라제 유전자를 tac 프로모터를 가지고 있으며 락토오스 또는 IPTG에 의하여 유도되는 PBM 플라스미드에 클로닝한다. 재조합 플라스미드를 E. coli 그룹으로부터 선별한 숙주에 도입시킨다. 이 숙주를 적당한 조건에서 배양하여 콜로니를 선별한다.
(1) PBM 플라스미드와 돌연변이 효소를 코딩하는 DNA 서열을 모두 제한효소 HinIII 와 BamHI으로 자른다. 그 산물을 겔로 분리한다.
(2) 절단된 DNA 서열을 연결시킨 후 연결된 반응물의 일부 (aliquot)를 컴피턴트 (competent) E. coli 세포를 형질전환시키는 데 사용한다. 그 후 형질전환체를 카나마이신과 락토오스를 함유한 LB 플레이트 상에서 선별한다.
(3) 검정을 위하여, 각각의 콜로니들을 골라 카나마이신과 락토오스를 함유한 LB 플레이트에서 (28℃) 밤새 배양한다.
(4) 돌연변이를 확인하기 위하여, 암비온사 (Ambion Inc.)의 키트를 사용하였다. 이 방법은 특정 RNase가 하나의 잘못 매치된 염기쌍이 있는 곳에서 이중나선 RNA를 선택적으로 자르므로서 돌연변이가 일어났음을 알려주는 것에 기원한다.
<실시예 3>
미생물의 배양
카나마이신 30 μg/ml이 첨가된 루리아 베르투니 배양액 (Luria Bertuni medium broth) 100ml이 들어 있는 500 ml 엘렌마이어 플라스크에 형질전환된 E. coli 콜로니들로 종균 배양 (seed cultures)을 접종한다. 종균 플라스크를 5 시간동안 28℃에서 배양한다. 배양액 50 ml을 사용하여 2 리터 탱크를 접종한다. 기본 배지는 0.3% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.2% MgSO4, 0.05% (NH4)2SO4, 0.003% Fe2SO4, 0.001% MnSO4, 0.3% 효모 추출액 및 카나마이신 30 μg/ml이다. 용액의 pH는 6.8-7.2이다. 탱크는 pH가 조절되는 공급 방식 (pH-regulated feeding profile)으로 운용한다. 탱크에 20% NZ 아민, 20% 글루코스 및 카나마이신을 첨가한다. 발효액을 30℃에서 다량의 폭기(aeration)하에 44시간 동안 배양한다.
<실시예 4>
E. coli로부터 페니실린 G 아실라제의 분리 및 고정화
전체 배양액을 미세유체화 (microfluidized)하여 세포를 파쇄한다. 10% 셀라이트를 첨가하고 0.2-0.25% 의 PEI를 더하여 배양액을 맑게 하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, 여과하고 맑은 배양액을 얻기 위하여 같은 부피의 물로 세척하였다. 맑아진 배양액을 30,000 MWCO 막을 통과시켜 원래 부피의 5%로 초여과 (ultrafiltration)하였다.
(1) UOP-알루미늄 비드에로 고정화
초여과된 배양액을 UOP 비드와 섞어 10℃에서 밤새도록 교반한다. 비드를 세척한 후 4℃에서 저장한다.
(2) 디아칼리트에로의 고정화
초여과된 배양액에 4% 트리톤 X- 100, 5% 바이오크릴 (biocryl) 및 이소프로파놀을 30%가 되도록 더하여 혼합물을 1시간 동안 교반한후 여과하였다. 여과액에 1% 스피드플러스 (Speedplus)를 첨가하고 50% PEG를 더하여 최종 농도를 15%로 만든다. 혼합물을 15분 동안 교반한 후 최종 농도 0.4%가 되도록 50% 글루타르알데하이드를 부가하였다. 상온에서 15분 동안 고정화시켰다. 효소를 여과하고 세액이 무색이 될때까지 물로 세척하였다. 전 과정을 통하여 pH는 7.2 내지 7.6을 유지하였다
<실시예 5>
페니실린 G 아실라제의 가수분해 활성 측정
(1) 시판되는 기질인 6-니트로-3-(페닐-아세트아미도) 벤조산 (6-nitro-3-(phenyl-acetamido) benzoic acid)을 사용한 측정
세포 배양액 샘플 20 μl를 pH 7.4의 0.2M 포타슘 포스페이트 완충제 (potassium phosphate buffer)에 0.1%의 기질이 들어있는 96-웰 미소적량판 (96-well microtiterplate)의 웰에 더하였다. 반응은 450 nm에서 분광광도법 (spectrophotometrically) 으로 측정하였다.
2. p-디메틸-아미노벤즈알데하이드 (p-Dimethyl-Aminobenzaldehyde) (p-DAB)를 사용한 측정
세포 배양액 샘플 1ml을 음파 파쇄한 후 200 mM 포타슘 포스페이드 완충제 (pH 7.5) 내에 들어있는 4.5% K 페니실린 G를 1ml 더한다. 37℃에서 교반하면서 15분 동안 반응시킨다. 1 ml의 99.0% 아세토니트릴과 1.0% 초산을 더한다. 섞어서 원심분리한다. 상층액 1ml에 p-DAB 시약 3 ml을 더한다. (p-DAB 시약을 만들기 위하여; 1 분량의 10 mg/ml p-DAB에 6 분량의 아세트산나트륨 완충제를 섞는다). 4 분동안 반응시킨 후 415nm에서 값을 읽는다. 6APA의 100 μg/ml을 기준 계수로 하여 IU/ml을 계산한다.
<실시예 6>
페니실린 G 아실라제의 합성 활성의 측정
(1) 세파드록실:
p-히드록시페닐글리신의 히드록시에틸 염 10.5g을 물 37.5ml에 녹인다. 수산화암모늄을 사용하여 pH를 8.0으로 조정한다. 4.8g의 7-ADCA를 더하여 녹인다 (pH 7.5). 6N HCl을 사용하여 pH를 7로 조정한다. 부피를 60ml로 만든다. 반응액을 각 5ml의 12개의 동 분량으로 나눈다. 고정화된 페니실린 G 아실라제를 최종 농도 40 IU/ml이 되게 더한다. HPLC 측정을 위하여 정하여진 시간에 일정량을 덜어 낸다.
(2) 셉프로질 합성
pH가 8.26이 되도록 4.5g의 에스테르 염을 60ml의 물에 더한다. 7-PACA 3.6g을 더한다. pH가 8.26이 되도록 수산화암모늄 1.72ml을 첨가한다. 에스테르를 4.5g 더하고 pH를 7.56으로 한다. 반응액을 12개의 동량으로 나눈다. 고정화된 페니실린 G 아실라제를 최종 농도 40 IU/ml이 되게 더한다. HPLC 측정을 위하여 정하여진 시간에 일정량을 덜어 낸다.
(3) 아목시실린 측정
3.5g의 에스테르 염을 12.5ml의 물에 더한다. 수산화암모늄을 사용하여 pH를 8.0으로 맞춘다. 1.6g의 6-APA를 더하여 녹이고 pH를 7.0으로 맞춘다. 부피를 20ml로 만든다. 반응액을 동량의 5ml 4개로 나눈다. 고정화된 페니실린 G 아실라제를 최종 농도 40 IU/ml이 되게 더한다. HPLC 측정을 위하여 정하여진 시간에 일정량을 덜어 낸다.
(4) HPLC 측정
샘플을 다음과 같이 처리한다:
200 μl의 샘플에 pH7.4, 20mM KP 완충제 1ml을 더한 후, 원심분리하여 그 상층액 200 μl를 HPLC 바이알에 넣는다. 완충제 800 μl를 더하고, 측정을 위하여 10μl를 주사한다. 각 반응에 대한 HPLC측정은 표 1에 나타낸 바와 같다.
베타-락탐 항생제의 합성을 위한 효소 반응 혼합물의 조성을 분석하기 위한 HPLC 실험절차
항생제 컬럼 용매
셉프로질과아목시실린 마이크로-본다펙 C-18,30 cm x 0.25 인치,워터즈 어소시에이츠 0.1N 수산화칼륨0.00693 M 테트라부틸암모늄 히드록시드10% 메탄올, pH 7.0
셉프로질 페노메넥스페노스피어 ODS % 마이크론,4.6 mm x 5.0 cm 24% 아세토니트릴, 0.16% KH2PO4, 0.2% NaSDS, pH 2.6
베타 서브 유니트의 24번 위치 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 돌연변이 페니실린 G 아실라제는 비록 25%의 가수분해 활성을 나타냈지만 탁원한 베타-락탐 항생제 합성능력을 나타내었다. 이 돌연변이 페니실린 G 아실라제를 F1이라고 칭한다. 이러한 결과들을 표 2 내지 표 12 에 나타내었다.
야생형 및 돌연변이 페니실린 G 아실라제의 합성 대 가수분해 활성
돌연변이 가수분해 합성
야생형 100 % 100%
Met 142 - Ala 10 % 0 %
Val 56 - Thr 4 % 127 %
Phe 146 - Ala 5 % 0 %
Phe 24 - Ala 25 % 330 %
Phe 24 - Val 36 % 3 %
Phe 24 - Leu 80 % 229 %
배양물 25 ml을 30 μg/ml의 카나마이신이 포함된 루리아-베르타이니 배양액에 접종하여 28℃에서 밤새 교반하였다. 배양물에 800 μm IPTG를 더하여 4 시간동안 유도하였다. 세포를 10배로 농축하여 음파파쇄하였다.
가수분해는 미세적량판을 사용하여 결정하였다. 기질은 0-0.2 M 포타시움 포스페이트 완충제에 들어있는 0.1% 니트로-(페닐아세타미도) 벤조산이었다. 값은 야생형의 %로 표시하였다.
합성 활성은 히드록시 에틸 에스테르 및 7-ADCA와 4시간 동안 반응시킨 후에 세파드록실 생성을 측정하였다. 측정은 HPLC를 사용하였다. 활성은 야생형의 %로 표시하였다.
페니실린 G 아실라제의 베타 24 잔기 (페닐알라닌)를 각 가능한 아미노산으로 치환하였다. 각각의 구조에 대한 합성 및 가수분해 활성을 3번의 독립된 실험에서 분석하였다. 그 평균값을 아래에 기재한다:
아미노산 변이 가수분해 합성
알라닌 22% 330%
발린 36% 3%
로이신 80% 227%
아스파르트산 10% 4%
히스티딘 7% 6%
리신 5% 0
메티오닌 7% 0
프롤린 8% 31%
세린 39% 23%
티로신 2% 0
아르기닌 7% 4%
아스파라긴 8% 6%
글루탐산 7% 0
글루타민 3% 28%
이소로이신 8% 4%
트레오닌 20% 6%
트립토판 9% 9%
글리신 27% 19%
시스테인 26% 0%
알라닌+Val(B)56-Thr 0% 0%
로이신+Val(B)56-Thr 6% 0%
셉프로질의 합성 수율에 대한 온도의 영향
온도 야생형 PGA FI 돌연변이 PGA
37℃ 80% 99%
상온 85% 98%
10℃ 90% 100%
반응은 pH 7.5에서 7-PACA에 대하여 2.3 몰 당량의 에스테르를 가지고 행한다. 120분 동안 7PACA가 셉프로질로 전환된 값을 백분률로 표시하였다.
세파드록실의 합성 수율에 대한 온도의 영향
온도 야생형 PGA FI 돌연변이 PGA
37℃ 79% 95%
상온 86% 91%
10℃ 83% 95%
반응은 pH 7.0에서 7-ADCA에 대하여 2.3 몰 당량의 에스테르를 가지고 행한다. 120분 동안 7-ADCA가 세파드록실로 전환된 값을 백분률로 표시하였다.
셉프로질의 합성 수율에 대한 효소 농도의 영향
고정화 효소의 그람 수 야생형 PGA FI 돌연변이 PGA
0.4g 88% 100%
0.2g 90% 100%
0.1g 90% 98%
반응은 pH 7.5, 상온에서 7-PACA에 대하여 2.3 몰 당량의 에스테르를 가지고 행한다. 120분 동안 7-PACA가 셉프로질로 전환된 값을 백분률로 나타내었다.
세파드록실의 합성 수율에 대한 효소 농도의 영향
고정화 효소의 그람수 야생형 PGA FI 돌연변이 PGA
0.7g 89% 95%
0.35g 81% 95%
0.175g 79% 97%
반응은 pH 7.0, 상온에서 7-ADCA에 대하여 1.9 몰 당량의 에스테르를 가지고 행한다. 120분 동안 7-PACA가 세프로실로 전환된 값을 백분률로 표시하였다.
셉프로질의 합성 수율에 대한 아실 공여자 (acyl donor)농도의 영향
7-PACA에 대한 에스테르의 몰 당량 야생형 PGA FI 돌연변이 PGA
2.3 91% 100%
1.5 86% 99%
1.45 83% 99%
1.38 83% 99%
1.3 85% 99%
1.2 80% 96%
반응은 pH 6.5, 상온에서 행한다. 고정화 효소 0.2g을 반응물에 더한다. 120분 동안 7-PACA가 세프로실로 전환된 값을 백분률로 나타내었다.
세파드록실의 합성 수율에 대한 아실 공여자 (acyl donor) 농도의 영향
7-ADCA에 대한 에스테르의 몰 당량 야생형 PGA FI 돌연변이 PGA
1.89 81% 96%
1.63 73% 90%
반응은 pH 7.0, 상온에서 행한다. 고정화 효소 0.2g을 반응물에 더한다. 120분 동안 7-ADCA가 세파드록실로 전환된 값을 백분률로 나타내었다.
야생형 대 돌연변이 페니실린 G 아실라제의 아목시실린 반합성
WT PGA F1 PGA
잔존하는 %6APA 잔존하는 %에스테르 잔존하는 %6APA 잔존하는 %에스테르
58 62 52 58
30 27 12 4
20 17 9 1
셉프로질 반합성의 최적 조건
온도 상온
pH 6.5
에스테르 농도 1.2-1.3 몰 당량
효소 농도 5 ml 부피내의 0.2g
세파드록실 반합성의 최적 조건
온도 상온
pH 7.0
에스테르 농도 1.89 몰 당량
효소 농도 5 ml 부피내의 0.2g

Claims (31)

  1. A142, A146, B24, B56 또는 B177에 해당하는 부위 하나 또는 그 이상에서 아미노산 치환이 일어난 원핵생물의 돌연변이 페니실린 G 아실라제.
  2. 제1항에 있어서, E. coli로부터 기원하는 돌연변이 아실라제
  3. 제2항에 있어서, 상기 아미노산의 치환이 아래의 하나 또는 그 이상의 것인 돌연변이 아실라제:
    A142의 Met이 Ala으로;
    A146의 Phe이 Ala으로;
    B24의 Phe이 Ala, Leu, Val, Pro, Tyr, Met, Ser, Cys, Gly, Asp, Lys, Arg, Tyr, Thr, Ile, Glu, Gln, Asn 또는 His으로;
    B56의 Val이 Ser 또는 Thr으로;
    B177의 Ile이 Phe으로.
  4. 제1항에 있어서, A142의 Met이 Ala으로 치환된 돌연변이 아실라제.
  5. 제1항에 있어서, A146의 Phe이 Ala으로 치환된 돌연변이 아실라제.
  6. 제1항에 있어서, B24의 Phe이
    Ala, Leu, Val, Pro, Tyr, Met, Ser, Cys, Gly, Asp, Lys, Arg, Typ, Thr, Ile, Glu, Gln, Asn 또는 His으로 치환된 돌연변이 아실라제.
  7. 제1항에 있어서, B56의 Val이 Ser 또는 Thr으로 치환된 돌연변이 아실라제.
  8. 제1항에 있어서, B177의 Ile이 Phe으로 치환된 돌연변이 아실라제.
  9. 제1항에 있어서, B24의 Phe이 Ala으로 치환된 돌연변이 아실라제.
  10. PheB24-Ala의 치환을 가진 E. coli 돌연변이 타입 II 페니실린 G 아실라제
  11. 제1항에 있어서, 알파 서브 유니트의 N-말단에서 1 또는 2개 아미노산이 절단되거나; 알파 서브 유니트의 C-말단에서 10 내지 15개 아미노산이 절단되거나; 또는 알파 서브 유니트의 N-말단에서 1 또는 2개 아미노산이 절단되고 알파 서브 유니트의 C-말단에서 10 내지 15개 아미노산이 절단된 돌연변이 아실라제.
  12. 제11항에 있어서, 알파 서브 유니트의 C-말단에서 12 또는 13개 아미노산이 절단된 돌연변이 아실라제.
  13. 제1항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 핵산 서열.
  14. 제2항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  15. 제3항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  16. 제4항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  17. 제5항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  18. 제6항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  19. 제7항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  20. 제8항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  21. 제9항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  22. 제10항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  23. 제11항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  24. 제12항의 돌연변이 아실라제를 코딩하는 제13항의 핵산서열.
  25. 제13항에 있어서, DNA인 핵산 서열.
  26. 숙주세포에서 그 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 제13항의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  27. 제26항의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  28. 제27항의 숙주세포를 돌연변이 아실라제를 생산하기에 적합한 조건에서 배양하는 것을 포함하는 돌연변이 페니실린 G 아실라제의 제조방법.
  29. 6-아미노 베타 락탐, 그들의 염 또는 에스테르 각각과, 7-ACA 및 아실화제를 아실화가 일어나기에 적합한 조건에서 제1항의 돌연변이 아실라제와 접촉시키는 것을 포함하는 반합성 6-아실화 페니실란 산, 7-아실화 세파로스포란 산, 그들의 염 또는 에스테르의 제조방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 돌연변이 아실라제가 고정화된 것인 제조방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 돌연변이 아실라제가 아미노산 B24 (Phe)이 Ala으로 치환된 것인 제조방법.
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