CN115418331A - 一种产青霉素g酰基转移酶自诱导培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基及其应用。配方为：蛋白胨5～20g/L、酵母粉5～20g/L、硫酸铵2～8g/L、磷酸氢二钠5～15g/L、磷酸二氢钾2～6g/L、硫酸镁0.5～2.5g/L、甘油6～20g/L、葡萄糖2～5g/L、乳糖0～10g/L。本发明还提供了利用该自诱导培养基发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法。使用本发明提供的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基诱导培养含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌时，乳糖的诱导能力相对较弱，能够避免前体蛋白在细胞质中的过度积累，给翻译后修饰过程以充足的时间，从而减少包涵体的形成，能够明显提高青霉素G酰基转移酶发酵酶活，达到52U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基及其应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
青霉素G酰基转移酶是半合成β-内酰胺类抗生素工业的重要酶，主要用于促使D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐和6-APA缩合成阿莫西林。
在基因工程菌中表达青霉素G酰基转移酶时，一般选用强启动子T7的表达系统。在这类表达系统中，T7RNA聚合酶能特异识别T7启动子，从而开启下游基因的大量转录，有效地启动目的蛋白青霉素G酰基转移酶的表达。
但是基于T7启动子的表达系统也有其不足之处。青霉素G酰基转移酶的表达需要用 IPTG诱导，步骤比较繁琐。而且一定浓度的IPTG会对细菌产生毒性，直接影响青霉素G酰基转移酶的表达效率。此外，目前培养大肠杆菌一般使用LB培养基，其组分之一是胰蛋白胨，由于胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白后的产物，而酪蛋白一般是从牛奶或大豆中提取的，因此，胰蛋白胨中存在的微量乳糖成分会促进细菌产生非目的性表达，从而影响青霉素G酰基转移酶表达量。
利用自诱导培养基培养细菌使之表达外源蛋白的方法解决了上述技术问题。在培养基中同时加入葡萄糖和乳糖，大肠杆菌会优先利用葡萄糖，在葡萄糖耗尽前不会诱发lac启动子；当葡萄糖耗尽时，乳糖发挥作用，开启lac启动子诱导外源蛋白表达，而乳糖的代谢产物也同时作为细菌生长的碳源。自诱导的方法省去了监测培养基的菌密度和添加IPTG诱导蛋白表达的步骤，一方面使得实验操作更加简洁，另一方面避免了IPTG对细菌的毒害作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基，所述培养基配方为：蛋白胨5～20g/L、酵母粉5～20g/L、硫酸铵2～8g/L、磷酸氢二钠5～15g/L、磷酸二氢钾2～6g/L、硫酸镁0.5～2.5g/L、甘油6～20g/L、葡萄糖2～5g/L、乳糖0～10g/L。
根据本发明优选的，所述培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钠10g/L，磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁1.5g/L、甘油20g/L、葡萄糖3g/L、乳糖5g/L。
本发明还提供了上述自诱导培养基在发酵生产青霉素G酰基转移酶中的应用。该产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基用于对含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌进行培养和发酵生产青霉素G酰基转移酶，生产的青霉素G酰基转移酶可以用于合成阿莫西林。
一种利用上述自诱导培养基发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，包括步骤如下：
(1)获取含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落，置于甘油中保存；
(2)将含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落接种于LB 液体培养基中培养，在35～40℃、180～220rpm下培养2～8h，获得种子液；然后以8～12％的接种量将种子液接种于产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基中，在35～40℃、180～220rpm下诱导培养5～15h；当溶解氧(DO)上升至65～75％时，流加甘油和乳糖，在27～37℃下，继续诱导培养10～20h，得到含青霉素G酰基转移酶的发酵液。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述种子液的接种量为8～12％。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述甘油流加速度为5～15ml/L/h，添加至产青霉素G 酰基转移酶自诱导培养基中甘油浓度为400～600g/L。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述乳糖流加速度为5～30ml/L/h，添加至产青霉素G 酰基转移酶自诱导培养基中乳糖浓度为5～20g/L。
根据本发明优选的，步骤(2)中，流加甘油和乳糖后诱导培养温度为30℃。
有益效果：
1、本发明的自诱导培养基利用乳糖作为底物诱导目的蛋白表达，与IPTG诱导生产青霉素G酰基转移酶相比，可调控性强，在使用本发明提供的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基诱导培养含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌时，乳糖的诱导能力相对较弱，能够避免前体蛋白在细胞质中的过度积累，给翻译后修饰过程以充足的时间，从而减少包涵体的形成，能够明显提高青霉素G酰基转移酶发酵酶活。并且使用了价格低廉、绿色环保的乳糖代替IPTG，大大地降低了生产成本。
2、本发明提供的青霉素G酰基转移酶生产方法，在发酵培养过程中流加甘油和乳糖，并限定了诱导温度，使得青霉素G酰基转移酶活达到52U/mL，对开发生产青霉素G酰基转移酶的生产工艺具有重要的指导意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌，该基因工程菌为实验室前期构建。利用常规的PCR技术进行目的基因的扩增，并通过酶切、连接技术将目的基因与载体pET-28a连接，将连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α，扩增后，挑阳性克隆子培养，质粒提取，即可得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑阳性克隆，得到含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌。该菌种的青霉素G酰基转移酶表达基因和T7启动子均为一般现有序列。
实施例1
一种发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，包括步骤如下：
(1)自诱导培养基：蛋白胨15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钠12g/L，磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁1g/L、甘油18g/L、葡萄糖2g/L、乳糖7g/L，用纯水配制；
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用纯水配制，pH7.0；
(2)培养，获取含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落，置于甘油中保存；
(3)将0.5mL含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的甘油菌种接种于100mL 的LB液体培养基中培养，在37℃、200rpm下培养5h，至OD600为1.0～2.0之间，获得种子液；然后以10％体积百分比的接种量将种子液接种至5L自诱导培养基中，在37℃、200rpm下诱导培养10h；当溶解氧(DO)上升至70％时，按10ml/L/h的速度流加甘油、30ml/L/h的速度流加乳糖，添加至甘油浓度为500g/L，乳糖浓度为10g/L，在37℃下，继续诱导培养12h，得到含青霉素G酰基转移酶的发酵液；
本实施例发酵方法做3个平行实验，然后将得到的发酵液于10000rpm离心10min，收集菌体细胞，将菌体细胞重悬浮于磷酸缓冲液中进行高压均质破菌，破菌液检测青霉素G酰基转移酶酶活平均为36U/mL。
酶活测定方法：准确移取破菌液5.0ml，加入预热到28℃的20ml底物6-APA与D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐中，开启搅拌，在磁力搅拌水槽内控制反应温度28℃,反应中用0.1mol/L氢氧化钠滴定液调节PH值为8.0，计时，保持pH反应5-10分钟,记录加碱量和反应时间。
酶活计算：
V2：滴定完后，滴定仪读数(ml)V1：滴定前，滴定仪读数(ml)；
Min：反应所用时分钟S：反应所用时秒；
V样：粗酶液体积(ml)C：NaOH滴定液的摩尔浓度为0.1mol/L。
实施例2
一种发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，包括步骤如下：
(1)自诱导培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钠10g/L，磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁1.5g/L、甘油20g/L、葡萄糖3g/L、乳糖5g/L，用纯水配制；
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用纯水配制，pH7.0；
(2)培养，获取含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落，置于甘油中保存；
(3)将0.5mL含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的甘油菌种接种于100mL 的LB液体培养基中培养，在37℃、200rpm下培养5h，至OD600为1.0～2.0之间，获得种子液；然后以10％体积百分比的接种量将种子液接种至5L自诱导培养基中，在37℃、200rpm下诱导培养10h；当溶解氧(DO)上升至70％时，按10ml/L/h的速度流加甘油、30ml/L/h的速度流加乳糖，添加至甘油浓度为600g/L，乳糖浓度为15g/L，在30℃下，继续诱导培养18h，得到含青霉素G酰基转移酶的发酵液。
本实施例发酵方法做3个平行实验，然后将得到的发酵液于10000rpm离心10min，收集菌体细胞，将菌体细胞重悬浮于磷酸缓冲液中进行高压均质破菌，破菌液检测青霉素G酰基转移酶酶活平均为52U/mL。
对比例1
一种发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，包括步骤如下：
(1)发酵培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钠10g/L，磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁1.5g/L、甘油20g/L、葡萄糖3g/L，用纯水配制；
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用纯水配制，pH7.0；
(2)培养，获取含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落，置于甘油中保存；
(3)将0.5mL含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的甘油菌种接种于100mL 的LB液体培养基中培养，在37℃、200rpm下培养5h，至OD600为1.0～2.0之间，获得种子液；然后以10％体积百分比的接种量将种子液接种至5L发酵培养基中，在37℃、200rpm下诱导培养10h；当溶解氧(DO)上升至70％时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，再按10ml/L/h的速度流加甘油，添加至甘油浓度为500g/L，在37℃下，继续诱导培养18h，得到含青霉素 G酰基转移酶的发酵液。
本实施例发酵方法做3个平行实验，然后将得到的发酵液于10000rpm离心10min，收集菌体细胞，将菌体细胞重悬浮于磷酸缓冲液中进行高压均质破菌，破菌液检测青霉素G酰基转移酶酶活平均为26U/mL。
对比例2
一种发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，包括步骤如下：
(1)发酵培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钠10g/L，磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁1.5g/L、甘油20g/L、葡萄糖3g/L，用纯水配制；
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用纯水配制，pH7.0；
(2)培养，获取含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落，置于甘油中保存；
(3)将0.5mL含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的甘油菌种接种于100mL 的LB液体培养基中培养，在37℃、200rpm下培养5h，至OD600为1.0～2.0之间，获得种子液；然后以10％体积百分比的接种量将种子液接种至5L发酵培养基中，在37℃、200rpm下诱导培养10h；当溶解氧(DO)上升至70％时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，再按10ml/L/h的速度流加甘油，添加至甘油浓度为400g/L，在30℃下，继续诱导培养18h，得到含青霉素 G酰基转移酶的发酵液。
本实施例发酵方法做3个平行实验，然后将得到的发酵液于10000rpm离心10min，收集菌体细胞，将菌体细胞重悬浮于磷酸缓冲液中进行高压均质破菌，破菌液检测青霉素G酰基转移酶酶活平均为35U/mL。
实施例1～2和对比例1～2所制备的青霉素G酰基转移酶酶活对比如表1所示。
表1
| 培养基 | 诱导剂 | 诱导温度 | 平均酶活(U/ml) | |
| 实施例1 | LB+自诱导培养基 | 乳糖 | 37℃ | 36 |
| 实施例2 | LB+自诱导培养基 | 乳糖 | 30℃ | 52 |
| 对比例1 | LB+发酵培养基 | IPTG | 37℃ | 26 |
| 对比例2 | LB+发酵培养基 | IPTG | 30℃ | 35 |
由表1可见，本发明实施例2采用LB液体培养基结合自诱导培养基在30℃诱导表达，所制备的青霉素G酰基转移酶酶活酶活可达到52U/ml。说明本发明的自诱导培养基利用乳糖作为底物诱导目的蛋白表达，与IPTG诱导生产青霉素G酰基转移酶相比，可调控性强，在使用本发明提供的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基诱导培养含有T7启动子和青霉素G 酰基转移酶表达基因的大肠杆菌时，乳糖的诱导能力相对较弱，能够避免前体蛋白在细胞质中的过度积累，给翻译后修饰过程以充足的时间，从而减少包涵体的形成，能够明显提高青霉素G酰基转移酶发酵酶活，对开发生产青霉素G酰基转移酶的工艺具有重要的指导意义。
Claims (8)
1.一种产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基，其特征在于，所述培养基配方为：蛋白胨5～20g/L、酵母粉5～20g/L、硫酸铵2～8g/L、磷酸氢二钠5～15g/L、磷酸二氢钾2～6g/L、硫酸镁0.5～2.5g/L、甘油6～20g/L、葡萄糖2～5g/L、乳糖0～10g/L。
2.如权利要求1所述的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基，其特征在于，配方为：蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钠10g/L，磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁1.5g/L、甘油20g/L、葡萄糖3g/L、乳糖5g/L。
3.权利要求1或2所述的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基在发酵生产青霉素G酰基转移酶中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述的产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)获取含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落，置于甘油中保存；
(2)将含有T7启动子和青霉素G酰基转移酶表达基因的大肠杆菌的单菌落接种于LB液体培养基中培养，在35～40℃、180～220rpm下培养2～8h，获得种子液；然后以8～12％的接种量将种子液接种于产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基中，在35～40℃、180～220rpm下诱导培养5～15h；当溶解氧(DO)上升至65～75％时，流加甘油和乳糖，在27～37℃下，继续诱导培养10～20h，得到含青霉素G酰基转移酶的发酵液。
5.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述种子液的接种量为8～12％。
6.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述甘油流加速度为5～15ml/L/h，添加至产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基中甘油浓度为400～600g/L。
7.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乳糖流加速度为5～30ml/L/h，添加至产青霉素G酰基转移酶自诱导培养基中乳糖浓度为5～20g/L。
8.如权利要求4所述的发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，流加甘油和乳糖后诱导培养温度为30℃。
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2022
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