HU226348B1

HU226348B1 - Mutant penicillin g acylases

Info

Publication number: HU226348B1
Application number: HU9904162A
Authority: HU
Inventors: Jiri Novotny; John J Usher; Brenda J White; Li You
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1996-11-05
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2008-09-29
Also published as: CA2270400C; ATE402997T1; AU718648B2; EP0961825B1; EP0961825A4; HUP9904162A3; US6403356B1; IL129055A; DE69738873D1; HUP9904162A2; KR100570244B1; HK1024933A1; JP4080542B2; JP2001503272A; AU5248698A; IL129055A0; KR20000053041A; EP0961825A1; WO1998020120A1; CA2270400A1

Description

A találmány tárgyát II típusú G-penicillin-acilázokat kódoló mutáns gének, ezen gének által kódolt, megváltoztatott tulajdonságú G-penicillin-acilázok és β-laktámantibiotikumok ezen G-penicillin-acilázok alkalmazásával végzett szintézisére szolgáló eljárások képezik.

Jelenleg félszintetikus β-laktámszármazékokat, például ampicillint, amoxicillint, cefalexint, cafadroxilt és a cefprozilt kémiai eljárásokkal ipari méretekben állítanak elő. Ezen antibiotikumok szintézisének enzimes katalizálása nyilvánvaló példája olyan enzimatikus reakciónak, amely ipari jelentőségű lehet. Az enzimes megközelítésnek számos előnye van a szokásos kémiai eljárásokkal szemben: (1) toxikus reagensektől és oldószerektől mentes; (2) az enzimspecifitás szükségtelenné teszi a központi antibiotikumvázon lévő karboxilcsoportok védelmét;

(3) mellékreakcióktól, például racemizációtól mentes.

Ebben az összefüggésben a G-penicillin-aciláz óriási előnnyel rendelkezik. A G-penicillin-aciláz, melyet G-penicillin-amidáznak vagy benzil-penicillin-amidohidroláznak (EC.3.5.1.11.) is hívnak, mikroorganizmusokból, különösen baktériumokból származó hidrolázok olyan csoportját jelenti, amelyek képesek az (I) és (II) általános képletű penicillinek 6-acilcsoportját vagy cefalosporinok 7-acilcsoportját hldrolizálni a megfelelő szabad aminformává [6-APA (vagy 6-APS) és (lll) általános képletű származékai vagy 7-ACA (vagy 7-ACS) és (IV) általános képletű származékai].

(Hl) / R2 ⁰ I

C0R4 (iv)

A képletekben:

R¹ jelentése fenil-acetil-, fenoxi-acetil-, hidroxi-fenil-glicil-, fenil-glicil-csoport vagy származékaik, acetil-, adipilcsoport vagy származékaik;

R³, R⁴ jelentése alifás vagy aromás csoport egy vagy több O-, S-, N-atommal;

R⁴ jelentése alifás vagy aromás alkohol vagy származékai egy vagy több 0-, S-, N-atommal.

(A 6-APA vagy 6-APS a 6-amino-penicillánsav, a

7-ACA vagy 7-ACS a 7-amino-cefalosporánsav elterjedten használt rövidítése.)

Az acilcsoport előnyösen fenil-acetil-csoport, bár más aromás és alifás (hidrofób vagy töltött/poláros) acilcsoportok is hidrolizálhatók különböző fokig (általában kisebb mértékben). A különböző acilcsoportok előnyben részesítése nem szükségszerűen helyénvaló a fordított irányú reakcióhoz, azaz amidkötések kialakulásához az acilcsoportok és a 6-APA és 7-ACA között [(III) és (IV) általános képlet]. Például klór-acetilcsoportot sokkal gyorsabban rá lehet vinni 7-ACA-ra, mint a legtöbb aromás acilcsoportot (JP08000284-A számú szabadalmi irat). Sok, jelenleg forgalomban lévő β-laktámantibiotikum esetén az acilcsoportok aromás csoportok, amelyek különböző mértékű hidrofobitással rendelkeznek. A vad típusú G-penicillin-amidáz képes katalizálni ezen antibiotikumok félszintézisét (amidkötés kialakítását), de a reakciók ritkán játszódnak le teljes mértékben az antibiotikumok előállításánál alkalmazott megfelelő vagy gazdaságos körülmények között. Nagymértékben kívánatos ezen reakciók termelési hozamának és hatékonyságának javítása.

Az irodalomban sok közlemény jelent meg olyan G-penicillin-acilázokról, amelyekben aminosavcsoportokat változtattak, ennek következtében megváltoztatott szubsztrátspecifitást vagy katalitikus aktivitást mutattak. Prieto és munkatársai [Appl. Microbiol. Biotechnol. 33, 553-559 (1990)] K. citrophiliából származó G-penicillin-acilázban a Met168-at helyettesítették Alá-, Asp-, Val-, Asn- és Tyr-csoportokkal, amely módosított kinetikai paraméterek közötti G-penicillin- és V-penicillin-dezacilezést eredményezett; Asn helyettesítése Lys375-re vagy Tyr helyettesítése His481-re ezt nem eredményezte. Martin és munkatársai [Biochimica et Biophysica Acta 1037, 133-139 (1990)] leírtak egy olyan mutáns G-penicillin-acilázt, amely eltérő szubsztrátspecifitással és fokozott hőstabilitással rendelkezett, ha a Met168-at Ala-ra cserélték. Wang Min és munkatársai [Shiyan Shengwu Xuebao 24, 1, 51-54 (1991)] leírták, hogy E. coliból származó G-penicillin-acilázban Seri 77 helyettesítése Gly-, Thr-, Leu-, Arg-ra valamennyi esetben inaktív enzimeket eredményezett. Kyeong Sook és munkatársai [Journal of Bacteriology 174, 6270-6276 (1992)] és Slade és munkatársai [Eur. J. Biochem. 197, 75-80 (1991)] kimutatták, hogy a Ser290 esszenciális aminosavcsoport az E. coliból származó G-penicillin-acilázban. Ser290 helyettesítése Cys-szel teljesen inaktiválta az enzimet. Niersbach és munkatársai [Biotechnology Letters 17, 1, 19-24 (1995)] a Gly359-et cserélték aszparaginsavra E. coliból származó G-penicillin-acilázban. A mutáns enzim

HU 226 348 Β1 elvesztette G-penicillint hidrolizáló képességét, de új aktivitást mutatott, képes volt ftalil-L-leucint és ftalil-glicil-L-prolint hidrolizálni. Bázikus pH-η fokozott stabilitást mutatott a helyspecifikus mutagenezissel előállított, E. coliból származó G-penicillin-aciláz-mutáns, amelyben Trp431-et Arg-ra cseréltek [Gábriel dél Rio et al., Biotechnology and Bioengineering 48, 141-148 (1995)].

A WO 96/05318 számú szabadalmi irat közöl különböző mutáns G-penicillin-acilázokat olyan aminosavcserékkel A. faecalisban, Escherichia coliban, Kluyvera citrophilában és más baktériumokban, amelyek az enzim szubsztrátspecifitása szempontjából fontosak.

A találmány tárgyát a vad típusú enzimhez képest megváltoztatott aktivitással rendelkező, mutáns G-penicillin-acilázok képezik.

A találmány szerinti megoldás egyik vonatkozásában, előnyösen prokarióta szervezetekből származó, II típusú, vad típusú G-penicillin-aciláz DNS-szekvenciája (az E. coliból származó enzim szerkezetét az 1A-1D. ábrákon mutatjuk be) úgy van megváltoztatva, hogy mutáns G-penicillin-acilázokat kódol. Valamennyi II típusú aciláz közös molekuláris struktúrával rendelkezik. A II típusú acilázok heterodimerek, amelyek egy kis alegységből (alfa; 16-26 kilodalton; kD) és egy nagy alegységből (béta; 16-26 kD) állnak. A „G-penicillin-aciláz” kifejezésen a leírásban prokarióta, II típusú acilázt értünk, valamint ennek proenzim- és preproenzimformáit. E. coliból származó, vad típusú G-penicillin-aciláz alfa-alegységének DNS-szekvenciáját (SEQ.ID.NO.:1) és a megfelelő aminosavszekvenciáját (SEQ.ID.NO.:2) az 1A. ábrán mutatjuk be. E. coliból származó, vad típusú G-penicillin-aciláz béta-alegységének DNS-szekvenciáját (SEQ.ID.NO.:3) és a megfelelő aminosavszekvenciát (SEQ.ID.NO.:4) az 1B-1D. ábrákon mutatjuk be. A találmány szerint a béta-alegységben a 24-helyzetben levő Phe-t helyettesítjük Ala-val vagy Leu-val. Természetesen a találmány szerinti mutáns DNS-szekvenciákban abból a célból végezzük a megfelelő változtatásokat a DNS-szekvenciában, hogy kívánt aminosava(ka)t a kívánt helyzetedben kódoljon. A szerkezeti változtatásokat a vad típusú G-penicillin-aciláz röntgendiffrakciós szerkezetére alapozva határoztuk meg. A DNS- és aminosavszekvenciában a találmány szerinti, egyes szubsztitúciókat (PheB24 - Alá vagy Leu) a 2. ábrán mutatjuk be.

A találmány szerint az alábbiak közül egy vagy több helyen hozunk létre szubsztitúciót:

1. Az alfa-alegységben:

A424—426. DNS-bázispár (MetA142 - Alá),

A436-438. DNS-bázispár (PheA146 - Alá).

2. A béta-alegységben:

B70-72. DNS-bázispár (PheB24 - Alá, Leu, Val,

Pro, Tyr, Met, Ser, Cys, Gly, Asp, Lys, Arg, Tyr,

Thr, Ile, Glu, Gin, Asn vagy His),

B166-168. DNS-bázispár (ValB56 - Ser vagy Thr),

B529-531. DNS-bázispár (lleB 177 - Phe).

A fentebb használt nómenklatúrában „A” az alfa-alegységet, „B” a béta-alegységet jelenti; a helyzetek számozása szokásos módon történt, aminosavszekvenciák esetén aminoterminálistól a karboxiterminális felé, DNS-szekvenciák esetén pedig az 5'-végtől a 3’-vég felé; az aminosavhelyzetet jelző szám előtt álló aminosav a vad típusú aminosavat jelenti, az aminosavhelyzetet jelző szám után álló aminosav pedig a szubsztituáló aminosavat jelenti, például „ValB56 - Ser vagy Thr” azt jelenti, hogy a vad típusú béta-alegység 56. helyzetében lévő aminosav valin, amely helyett szerin vagy treonin van a találmány szerint előállított mutáns acilázban.

A találmány szerint megváltoztatott acilázok a megfelelő vad típusú G-penicillin-acilázhoz viszonyítva megváltoztatott aktivitásokkal rendelkeznek.

A legelőnyösebben megváltoztatott (mutáns) G-penicillin-aciláz egyetlen aminosawáltoztatással rendelkezik (PheB24 - Alá), és szignifikánsan nagyobb hozammal és hatékonysággal képes szintetizálni β-laktámantibiotikumokat, mint a vad típusú enzim.

A találmány tárgyát képezik egy másik vonatkozásában vektorok, amelyek a találmány szerinti megváltoztatott nukleinsavszekvenciákat tartalmaznak, valamint a vektorokkal transzformált mikroorganizmus-gazdasejtek. A találmány tárgyát képezik eljárások is a megváltoztatott acilázok előállítására, amelyben a találmány szerinti gazdasejteket tenyésztjük, és azt követően előnyösen izoláljuk az acilázt.

A találmány tárgyát képezik még egy további vonatkozásban eljárások a mutáns G-penicillin-aciláz alkalmazására β-laktámantibiotikumok (például cefadroxil, cefprozil, amoxicillin) félszintézisére. Ennek körülményeit, például szubsztrátkoncentrációkat, pH-értékeket és hőmérsékleteket az alábbiakban ismertetjük. A félszintézis-reakciók hozamai és hatékonyságai a mutáns G-penicillin-aciláz alkalmazásával a vad típusú enzimhez viszonyítva előnyösen javultak.

Az ábrák rövid magyarázata

IA. ábra: E. coliból származó, vad típusú G-penicillin-amidáz-gén alfa-alegységének nukleotidszekvenciája (DNS-szekvenciája) és a nukleotldszekvencia által kódolt, megfelelő aminosavszekvencia.

IB. ábra: E. coliból származó, vad típusú G-penicillin-amidáz-gén béta-alegységének nukleotidszekvenciája (DNS-szekvenciája) és a nukleotldszekvencia által kódolt, megfelelő aminosavszekvencia.

IC. ábra: Az 1B. ábra folytatása.

ID. ábra: Az 1C. ábra folytatása.

2. ábra: A G-penicillin-aciláz találmány szempontjából jelentőséggel rendelkező fragmentumai, amelyek a találmány szerinti mutációk pontos helyét szemléltetik. Az 1. DNS-fragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:5, az 1. aminosavfragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:6, a

2. DNS-fragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:7, a 2. aminosavfragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:8, a

3. DNS-fragmentum azonosító száma:

HU 226 348 Β1

SEQ.ID.N0.:9, a 3. aminosavfragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:10, a

4. DNS-fragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:11, a 4. aminosavfragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:12 és az 5. aminosavfragmentum azonosító száma: SEQ.ID.NO.:14.

3. ábra: PBM-vektor szemléltetése, amely az 1.

példában leírtak szerint G-penicillin-aciláz mutáns DNS-szekvenciáját tartalmazza.

4. ábra: G-penicillin-acilázban lévő szubsztrátkötőhely szerkezetének számítógépes grafikával való leképezése. A tisztán láthatóság kedvéért a fehérjevázat nem mutatjuk. A kötőhelyet alkotó, izolált aminosavakat „pálcikákból álló, szerkezeti diagramként mutatjuk be. Az atomtípusokat a szürke különféle árnyalataival kódoljuk, azaz a polipeptidvázhoz tartozó szénatomokat fehérrel; az oldalláncok szénatomjait világosszürkével; a nitrogéneket sötétszürkével; az oxigéneket feketével. A hasított szubsztrátot, a fenilecetsavat egy nyíllal jelöljük a hasítóhely közepén. A B24 fenil-alanin-oldalláncot szintén egy nyíllal jelöljük. Amint látható, a B24-csoport aromás oldailáncgyűrűje fontos pozíciót foglal el a hasítóhely közepén, a szubsztráttal érintkezésben, és megvédi a szubsztrátot az oldószertől. A leképezést a fenil-ecetsav/G-penicillinaciláz komplex röntgenkrisztallográfiás koordinátáiból készítettük.

A találmány tárgyát képező G-penicillin-acilázok a vad típusú enzimhez képest megváltoztatott szubsztrátspecifitással és/vagy megváltoztatott specifikus aktivitással rendelkeznek. A találmány szerinti enzimek a vad típusú enzimhez képest előnyösen fokozott hozamot és/vagy hatékonyságot biztosítanak. Lehetséges, hogy rutinkísérletek szükségesek annak meghatározása céljából, hogy milyen optimális körülmények szükségesek a találmány szerint megváltoztatott enzimek alkalmazásához. A találmány szerint alkalmazott vad típusú enzim prokariótákból származik, például Escherichia coliból, Kluyvera citrophilából, Providencia rettgeriből, Pseudomonas sp.-ből, Alcaligenes faecalisból, Bacillus megateriumból, Arthrobacter viscosusból és hasonlókból. Az aciláz előnyösen az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: (1) prokarióta E. coliból (például ATCC 11105. számú törzsből) izolált, (2) egyetlen peptidláncprekurzorként transzlálódik, (3) transzláció után heterodimerré processzálódik, amely egy kis N-terminális doménből (az alfa-alegység) és egy nagyobb C-terminális doménből (a béta-alegység) áll. Az alfa-alegység molekulatömege előnyösen körülbelül 24 000, a béta-alegység molekulatömege előnyösen körülbelül 62 000. Az enzim előnyös aktív formája tipikusan E. coli periplazmájában található.

A jelenleg ismert LC-MS-adatok alapján feltételezzük, hogy E. coliban a poszttranszlációs processzálás alatt az alfa-alegység a C-terminálisnál körülbelül 10-15 aminosawal rövidül, legvalószínűbb esetben 12 vagy 13 aminosawal. Ehhez hasonlóan ugyanezek az adatok azt mutatják, hogy a poszttranszlációs processzálás alatt az alfa-alegység az N-terminálisnál 1 vagy 2 aminosawal rövidül. Tehát a találmány tárgyát olyan mutáns G-penicillin-aciláz képezi, amelyben az N-terminális 1 vagy 2 aminosawal rövidül, és/vagy amelyben az alfa-alegység a C-terminálisnál 10-15 aminosawal, előnyösen 12 vagy 13 aminosavval rövidül.

Szubsztrátspecifitásában ezen a módon megváltoztatott G-penicillin-acilázokkal elértük, hogy a mutáns enzimek képesek fenil-acetiltől (amely a G-penicillin természetes oldallánca) eltérő oldallánccal rendelkező penicillin- és cefalosporinszármazékokat hasítani vagy szintetizálni. Olyan oldalláncok, amelyekre G-penicillinaciiáz jelenleg nincs szignifikáns hatással, például borostyánkősavból, glutársavból, adipinsavból, aminoadipinsavból és hasonló dikarbonsavakból származó acilcsoportok.

A találmány szerinti mutáns enzimek fokozott sztereospecifitást mutathatnak, amely javított enantiomerfelesleget eredményezhet királis vegyületek racém keverékeinek konverziójában. Az acilázok ezen tulajdonsága hasznossá teheti azokat enantiomerek tekintetében tiszta félszintetikus antibiotikumok szintézisében fenil-acetil-oldalláncok vagy fenil-acetil-oldalláncok aktivált származékainak (például fenil-glicin-amidok vagy azok észterei, p-hidroxi-fenil-glicin-amidok vagy azok észterei és hasonlók) racém keverékeiből, amelyek királis alfa-szénatomot tartalmaznak egy aminocsoport (mint például ampicillinben, cefalexinben, amoxicillinben, cefadroxilban, cafaklorban) vagy egy hidroxilcsoport (mint például cefamandolban) jelenléte miatt.

Leírjuk olyan G-penicillin-aciláz-mutánsok azonosítását is, amelyek vad típusú enzimből származnak, a szakember által ismert rekombináns DNS technológia alkalmazásával, amelyben egy aminosavcsoportot helyettesítettünk egy új csoporttal. A mutánsokat hidrolitikus és szintetikus aktivitásukra egyaránt analizáltuk. Olyan G-penicillin-aciláz-variánsokat részesítünk előnyben, amelyek transzferázaktivitása javult hidrolázaktivitásukhoz képest. Ez az enzimet hasznosabbá teszi szintetikus átalakításokban. Antibiotikumok, például amoxicillin, cefadroxil, cefprozil és cefalexin enzimatikus szintézisének hatékonyságában javított mutánsokat részesítünk előnyben.

Mutációt úgy vihetünk egy gén meghatározott helyeire, hogy szintetikus oligonukleotidok alkalmazásával módosítjuk a DNS-szekvencia egy meghatározott helyét. A találmány szerinti G-penicillin-aciláz mutánsait az alábbi eljárás szerint állítjuk elő:

(1) Mutációt viszünk be a G-penicillin-acilázt kódoló gén meghatározott helyeire standard polimeráz-láncreakciót alkalmazó helyspecifikus mutagenezissel. Ezen mutációkhoz a szükséges, specifikus oligonukleotidokat kereskedelmi forrásokból szintetizáltatjuk. Az oligonukleotidok homológok a mutagenizálandó szekvenciához, kivéve a mutációt meghatározó belső szakaszt.

HU 226 348 Β1 (2) A mutagenizált gént egy klónozóvektorba klónozzuk.

(3) A rekombináns vektorral egy gazdatörzset transzformálunk.

(4) A gazdatörzset alkalmas tenyésztő tápközegben tenyésztjük.

(5) Az így kapott, mutáns G-peniciilin-acilázt elkülönítjük és immobilizáljuk.

(6) Meghatározzuk a mutánsok hidrolitikus és szintetikus aktivitását.

G-penicillin-aciláznak a fentiek szerint végzett mutagenezise új szubsztrátspecifitást és/vagy megváltoztatott enzimaktivitást visz be. Pontmutációk bevitelére racionális megközelítést alkalmazunk, fehérjekrisztallográfiára, molekulamodellezésre, molekuláris biológiára és fehérjekémiai technikákra támaszkodva. A találmány szerint speciális aminosavhelyzeteket azonosítottunk, mint az enzim katalitikus tulajdonságainak szempontjából fontos helyzeteket. Ezek a csoportok: MetA142, PheA146, PheB24, ValB56 és IleBI 77. Ezen csoportok azonosítása röntgenkrisztallográfiás szerkezetre alapult.

Az enzimeknek a vad típusú enzimmel való összehasonlítása céljából a mutáns és a vad típusú G-penicillin-aciláz sejtlizátumok vagy immobilizált szilárd anyag formájában vannak, előnyösen ez utóbbiban. A találmány szerinti enzim PheB24 - Ala mutációval rendelkezik, amely javított szintetikus aktivitást mutat β-laktámantibiotikumok esetén, ezért ezt részesítjük előnyben.

A találmány tárgyát képezi olyan expressziós vektor is, amely egy találmány szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolódva olyan promoterszekvenciához, amely képes annak expresszióját vezérelni gazdasejtben. Vektorként előnyösen plazmidokat alkalmazunk, például a 3. ábrán bemutatott PBMPGA-plazmidot. A találmány szerinti megoldásban használható expressziós vektorok tipikusan replikációs origót, a DNS-szekvencia előtt (azaz szintézisiránnyal szemben) elhelyezkedő promotert, és azt követően a mutáns aciláz egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak. A mutáns aciláz egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát transzkripciós terminációs szekvencia és a vektor többi része követi. Az expressziós vektorok tartalmazhatnak más, a szakember által ismert DNS-szekvenciákat is, például stabilitást biztosító vezetőszekvenciákat, amelyek biztosítják az expressziós termék stabilitását, szekréciós vezetőszekvenciákat, amelyek az expressziós termék szekrécióját biztosítják, a strukturális gén expressziójának modulációját (például tápanyagok jelenlétével vagy hiányával, vagy a növesztési tápközeg által tartalmazott más indukálószerrel) lehetővé tevő szekvenciákat, markerszekvenciákat, amelyek képesek fenotipikus szelekciót biztosítani transzformált gazdasejtekben, és olyan szekvenciákat, amelyek hasítóhelyeket biztosítanak restrikciós endonukleázok számára. A konkrét esetben alkalmazott expressziós vektor jellemzőinek kompatibilisnek kell lenni az alkalmazandó gazdasejttel. Például ha E. coli sejtrendszerbe klónozunk, az expressziós vektornak tartalmaznia kell E. coli sejtek genomjából izolált promotereket (például tac, lac és trp). Különféle E. coli gazdaszervezetbe megfelelő replikációs origó például a ColE1-plazmid replikációs origója. Megfelelő promoterek például tac-, lac- és trppromoter és az E. coliból származó neo-r-gén promotere. Megfelelő terminációs szekvenciák például az E. coliból származó G-penicillin-aciláz, T7-fág-gén-10 és a neo-r-gén terminátorai. Olyan expressziós vektor is előnyösen alkalmazható, amely szelektálható markert kódoló szekvenciát tartalmaz. A szelektálható marker előnyösen antibiotikumrezisztencia. Szelektálható markerként kedvezően ampicillinrezisztenciát vagy neomicinrezisztenciát alkalmazhatunk. Valamennyi említett anyag a szakember által ismert és a kereskedelemben rendelkezésre áll.

A kívánt kódoló- és szabályozószekvenciákat tartalmazó, megfelelő expressziós vektorokat előállíthatjuk standard rekombináns DNS-technikák alkalmazásával, amelyek közül sokat Sambrook és munkatársai leírtak, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual című könyvükben, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan expressziós vektort tartalmazó gazdasejtek, amelyek a mutáns aciláz egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak. A gazdasejtek előnyösen olyan expressziós vektort tartalmaznak, amely a 2. ábrán bemutatott egy vagy több mutációval rendelkező DNSszekvencia egészét vagy részét tartalmazza. Továbbá a gazdasejtek előnyösen olyan expressziós vektort tartalmaznak, amely egy vagy több szabályozó DNSszekvenciát tartalmaz, amelyek képesek a mutáns aciláz egészét vagy részét kódoló DNS-szekvencia replikációját és/vagy expresszióját vezérelni, és ahhoz működőképesen kapcsolódnak. Megfelelő gazdasejtek például a Life Technologies, Inc. cégtől (P. O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20897) származó E. coli HB101-törzs (ATCC 33694); a Novagen, Inc. cégtől (597 Science Drive, Madison, Wl 53711) származó BL21-törzs és hasonlók.

Expressziós vektorokat különféle, a szakember által ismert módszerekkel vihetünk be gazdasejtekbe. Például gazdasejtek expressziós vektorokkal való transzfekcióját polietilénglikollal médiáit protoplaszttranszformációs eljárás alkalmazásával hajthatjuk végre. Más módszereket is alkalmazhatunk azonban expressziós vektorok gazdasejtekbe való bevitelére, például elektroporációt, biolisztikus injektálást vagy protoplasztfúziót.

Ha egy expressziós vektort bevittünk alkalmas gazdasejtbe, a gazdasejtet olyan körülmények között tenyészthetjük, amely lehetővé teszi a kívánt, mutáns aciláz expresszióját.

A pBMPGA-plazmidot [(pBMF1PGA)+j tartalmazó E. coli BL21 gazdasejtet az „American Type Culture Collection-ban deponáltuk (Rockville, Maryland 20852) a Budapesti Szerződésnek megfelelően, 1997. szeptember 4-én, és az ATCC 98537 jelölést kapta.

A gazdasejteket, amelyek mutáns aciláz egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó exp5

HU 226 348 Β1 ressziós vektort tartalmaznak, az alábbi öt általános megközelítés közül egy vagy több alkalmazásával azonosíthatjuk: (a) DNS-DNS-hibridizáció; (b) markergénfunkciók jelenléte vagy hiánya; (c) a transzkripció mértékének meghatározása a gazdasejtben lévő G-penicilHn-aciláz-mRNS termelődésének mérésével; (d) a géntermék immunológiai detektálásával; és (e) enzimaktivitást mérő vizsgálati eljárással (kolorimetriás detektálással stb.).

A találmány szerinti expressziós vektorok, plazmidok vagy DNS-molekulák DNS-szekvenciáit szakember által ismert, különféle módszerek alkalmazásával határozhatjuk meg. Például Sanger és munkatársai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] didezoxi-láncterminációs módszerrel; vagy a Maxam-Gilbert-módszer [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)] alkalmazásával.

Természetesen meg kell értenünk, hogy az expressziós vektorok és DNS-szabályozó szekvenciák nem egyformán fognak működni a találmány szerinti DNS-szekvenciák expressziójában. A gazdasejtek ugyancsak nem egyformán fognak működni ugyanazzal az expressziós rendszerrel. Azonban szakember képes választani az expressziós vektorok, DNS-szabályozó szekvenciák és gazdasejtek közül a leírás szerint anélkül, hogy felesleges kísérleteket végezne, és anélkül, hogy eltérne a találmány igényelt oltalmi körétől.

A leírásban azonosított valamennyi aminosav természetes, L-konfigurációban van. A standard polipeptidnómenklatúrát betartva [J. Bioi. Chem. 243, 3557-3559 (1969)] az alábbi táblázatban bemutatott rövidítéseket használtuk az aminosavcsoportok jelölésére.

Megfeleltetések táblázata

Jel	Aminosav
1 betűs	3 betűs
Y	Tyr	L-tirozin
G	Gly	L-glicin
F	Phe	L-fenil-alanin
M	Met	L-metionin
A	Alá	L-alanin
S	Ser	L-szerin
I	Ile	L-izoleucin
L	Leu	L-leucin
T	Thr	L-treonin
V	Val	L-valin
P	Pro	L-prolin
K	Lys	L-lizin
H	His	L-hisztidin
Q	Gin	L-glutamin
E	Glu	L-glutaminsav
W	Trp	L-triptofán

Jel	Aminosav
1 betűs	3 betűs
R	Arg	L-arginin
D	Asp	L-aszparaginsav
N	Asn	L-aszparagin
C	Cys	L-cisztein

A leírásban közölt valamennyi aminosavszekvenciát a szokásos irányban közlünk, balról jobbra haladva az aminoterminálistól a karboxiterminálisig.

A találmány szerinti polipeptidekhez szintetikus úton juthatunk, azaz a polipeptid kémiai szintézisével az alkotó aminosavakból, szakember által ismert eljárások alkalmazásával. Például Huoghton és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 5131-5135 (1985)] által leírt szilárd fázisú eljárást alkalmazhatunk. A polipeptideket előnyösen prokarióta gazdasejtekben állítjuk elő, a mutáns acilázt kódoló DNS-szekvencia expressziójával vagy a mutáns acilázt kódoló DNS-szekvenciának megfelelő mRNS in vitro transzlációjával. A DNS-szekvenciát szintetizálhatjuk például PCR alkalmazásával a fentebb leírtak szerint, és alkalmas expressziós vektorba inszertálhatjuk, amelyet viszont egy alkalmas gazdasejt transzformálására alkalmazunk. A rekombináns gazdasejtet azután tenyészthetjük az enzim termelése céljából. Polipeptidek termelésére szolgáló ilyen technikák a szakember által ismertek, és a leírásban is ismertetünk ilyet.

Az így termelt polipeptideket azután izolálhatjuk, és bizonyos fokig tisztíthatjuk különböző fehórjetisztítási technikák alkalmazásával. Például kromatográfiás eljárásokat, például ioncserélő kromatográfiát, gélszűrést és immunaffinitás-kromatográfiát alkalmazhatunk.

A találmány szerinti polipeptideket a meghatározott DNS- és levezetett aminosavszekvenálással definiáljuk. A genetikai kód degenerált természetének következtében, amelyet az eredményez, hogy a legtöbb aminosavnak és stopszignálnak egynél több kodon felel meg, ugyanazt az aminosavszekvenciát kódoló, az

1. ábrán bemutatott DNS-szekvencián kívül más DNSszekvenciákat is alkalmazhatunk a találmány szerinti polipeptidek előállítására. Továbbá nyilvánvaló, hogy ezen DNS- és aminosavszekvenciák allélvariációi természetes körülmények között léteznek, vagy szándékosan bevihetők szakember által ismert módszerek alkalmazásával. Ezen variációknak az egész szekvenciában egy vagy több aminosavkülönbség, vagy egy vagy több aminosav deléciója, szubsztitúciója, inszerciója, inverziója vagy addíciója felelhet meg a szekvenciában. Ilyen aminosavcseréket végezhetünk például az érintett csoportok polaritásában, töltésében, oldhatóságában, hidrofobitásában, hidrofilitásában és/vagy az amfipatikus természetében lévő hasonlóság alapján. Például negatívan töltött aminosavak közé tartozik az aszparaginsav és a glutaminsav; pozitívan töltött aminosavak közé tartozik a lizin és az arginin; töltéssel nem rendelkező, poláros csoportokkal vagy nempolá6

HU 226 348 Β1 ros csoportokkal rendelkező aminosavak közé tartoznak az alábbiak: leucin, izoleucin, valin, glicin, alanin, aszparagin, glutamin, szerin, treonin, fenil-alanin, tirozin. Más variációkat is figyelembe vehetünk, például a fentebb említett polipeptidek sóit és észtereit, valamint a fentebb említett polipeptidek prekurzorait, például olyanokat, amelyek N-terminális szubsztituensekkel rendelkeznek, például metionin, vezetőszekvenciaként alkalmazott N-formil-metionin. Valamennyi ilyen variációt a találmány által igényelt oltalmi körbe tartozónak tekintünk.

A találmány tárgyát képezi eljárás a találmány szerinti mutáns G-penicillin-aciláz előállítására is, amelyben a találmány szerinti gazdasejtet tenyésztjük olyan körülmények között, amely megfelelő a találmány szerinti mutáns aciláz termelődéséhez. Bakteriális gazdasejtek alkalmazása esetén a tenyésztést tipikusan megfelelő antibiotikumot és indukáló ágenst tartalmazó, folyékony tápközegben végezzük. A tenyészetek rázatott vagy kevertetett tenyészetek olyan hőmérsékleten tartva, amely az enzim termelődéséhez optimális, például körülbelül 28 °C-29 °C. Tipikusan alkalmazott antibiotikumok például kanamicin, kloramfenikol, tetraciklin és hasonlók. Tipikusan alkalmazott indukáló ágensek például IPTG, laktóz és hasonlók.

A találmány tárgyát képezi eljárás félszintetikus,

6- acilezett penicillánsav, 7-acilezett cefalosporánsav vagy ezek sójának vagy észterének előállítására is, amelyben a megfelelő 6-amino-p-laktámot vagy

7- ACA-t vagy ezek sóját vagy észterét érintkeztetjük egy acilező ágenssel és a találmány szerinti mutáns acilázzal olyan körülmények között, amely alkalmas az acilezés végbemenetelére. Tipikus acilező ágensek közé tartoznak például az amoxicillin, cefadroxil, cefprozil stb. oldalláncainak észterei vagy amidjai. Tipikus acilező ágensek például fenil-glicin, para-hidroxi-fenilglicin, fenil-ecetsav, fenoxi-ecetsav, és ezek észterei vagy amidjai. Az acilező ágens előnyös formája a fentebb említett savak észtere. Ezen észterek alkoholrésze például metanol és több szénatomos analógjai és ezek sztereoizomerjei. A legelőnyösebbek az etilénglikol észterei. Az acilezés körülményei tipikusan: vizes puffer, semleges vagy alacsonyabb pH-η, állandó kevertetés közben. A hőmérséklet tipikusan körülbelül 0 °C-tól körülbelül 35 °C-ig terjed. A fentebb leírt eljárásban alkalmazott mutáns acilázt előállíthatjuk in situ a gazdasejtekben, vagy már a szintézis előtt előállíthatjuk a gazdasejtek alkalmazásával. Ha sejtmentes mutáns acilázt alkalmazunk, akkor az lehet nyers sejtlizátum, lehet részlegesen tisztított vagy lehet homogenitásig tisztított. A mutáns aciláz előnyösen immobilizálva van. Az immobilizáló hordozó tipikusan például celit, dikalit vagy UOP-gyöngyök.

Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást tovább szemléltetjük. A példákkal nem kívánjuk korlátozni a találmány igényelt oltalmi körét, hanem a találmány szerinti megoldás további megértését kívánjuk elősegíteni.

Az alábbi példákban alkalmazott néhány reagenst, restrikciós enzimet és más anyagokat kereskedelmi forrásból szereztünk be, és a gyártó utasításai szerint alkalmaztuk. A tisztításhoz, jellemzéshez és a DNSklónozáshoz alkalmazott eljárások szakember által jól ismertek, és közleményekben hozzáférhetők és módosíthatók.

1. példa

Helyspacifikus mutagenezis

Kiválasztott helyzetekben aminosavmutációkat állítunk elő a fentebb leírt PCR-helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával. A kívánt mutációk bevitelére alkalmazott oligonukleotidokat kereskedelmi úton szereztük be. Az oligonukleotidok az alább megadott 15-38. azonosító számú szekvenciákkal (SEQ.ID.N0.:15-SEQ. ID.NO.:38) meghatározott szekvenciájúak:

(1) 5’CAGAGAAGCGGTTTGCCGCGGTGCCCCACAAATATC3' (SEQ.ID.NO.:15)-A:142 MET-ALA (2) 5'CGCTAGTGCTATCAGAGGCGCGGTTTGCCATGGTGCC3’ (SEQ.ID.NO.:16)-A:146 PHE-ALA (3) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:17)-B:24 PHE-ALA (4) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCCAACTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:18)-B:24 PHE-VAL (5) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCGAACTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:19)-B:24 PHE-LEU (6) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCCCACTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:20)-B:24 PHE-GLY (7) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCATCCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:21)-B:24 PHE-MET (8) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCACACTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:22)-B:24 PHE-CYS (9) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCAGACTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:23)-B:24 PHE-SER (10) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCGGTCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:24)-B:24 PHE-PRO (11) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCCTGCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:25)-B:24 PHE-ASP (12) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCGTGCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEQ.ID.NO.:26)-B:24 PHE-HIST (13) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCATACTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:27)-B:24 PHE-TYR (14) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCTTTCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEQ.ID.NO.:28)-B:24 PHE-LYS (15) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCCCTCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:29)-B:24 PHE-ARG

HU 226 348 Β1 (16) 5’CACACCATTATGACCAAAAGACAGCCCAGGATAGGCAAAT3’ (SEQ.ID.NO.:30)-B:56 VAL-SER (17) 5’CACACCATTATGACCAAAAGTCAGCCCAGGATAGGCAAAT'3' (SEQ.ID.NO.:31)-B:56 VAL-THRE (18) 5'GCGAAACAAGCACTGGACCTTCAAACTGGTACTATGCTG3’ (SEQ.ID.NO.:32)-B:177 ILE-PHE (19) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCAATCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:33)-B:24 PHE-ILE (20) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCAGTCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:34)-B:24 PHE-THR (21) 5’AGCCAGGCCCATACCAGCCTTGCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:35)-B:24 PHE-GLN (22) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCATTCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:36)-B:24 PHE-ASN (23) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCTTCCTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:37)-B:24 PHE-GLU (24) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCCCACTGCGGACCATTTACCATG3’ (SEQ.ID.NO.:38)-B:24 PHE-TYRP (1) G-penicillin-aciláz génjét PBM-plazmidba (3. ábra) inszertáljuk, amelyet templátként alkalmazunk a mutáns gén szintézisére.

(2) Egy oligonukleotidot tervezünk, amely komplementer a mutagenizálandó szekvenciával, kivéve a mutációt meghatározó belső szakaszt.

(3) Standard PCR-technika alkalmazásával a szintetikus oligonukleotidot a templáthoz hibridizáltatjuk, és a templátot amplifikáljuk. A „megaprimer” terméket tisztítjuk, és egy második PCR-ben alkalmazzuk dupla szálú mutáns előállítására. A mutáns DNS-t azután preparatív agarózgélen tisztítjuk.

2. példa

Mutáns G-penicillin-aciláz klónozása és expresszálása

A mutáns G-penicillin-aciláz-gént PBM-plazmidba klónozzuk, amely tac-promotert tartalmaz, és laktózzal vagy IPTG-vel indukálható. A rekombináns plazmidok E. coli csoportból szelektált gazdaszervezetbe vihetők. Ezeket a mikroorganizmusokat azután megfelelő körülmények között tenyésztjük, és kolóniákat szelektálunk.

(1) A PBM-plazmidot és a mutagenizált enzimet kódoló DNS-szekvenciát egyaránt Hindlll és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük. A termékeket gélen tisztítjuk.

(2) Az emésztett DNS-szekvenciákat ligáljuk, és a ligálási reakcióból vett aliquotot használjuk kompetens E. coli sejtek transzformálására. A transzformánsokat azt követően kanamicint és laktózt tartalmazó LB-tenyésztőtálcákon szelektáljuk.

(3) A vizsgálati eljáráshoz egyedi kolóniákat választunk, és egy éjszakán át növesztjük azokat 28 °C-on, laktózt és kanamicint tartalmazó LB-tápközegben.

(4) A mutációk igazolása céljából Ambion Inc. cégtől beszerzett reagenskészletet alkalmazunk. Az eljárás arra a tényre alapul, hogy bizonyos RNázok képesek szelektíven hasítani dupla szálú RNS-t annál a helyzetnél, ahol egyetlen tévesen párosított („mismatched”) bázispár található, jelezve, hogy mutáció történt.

3. példa

Mikroorganizmus tenyésztése

Transzformált E. coli kolóniákat alkalmazunk előrázott tenyészetek oltására 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba, amelyek 30 g/ml kanamicinnel kiegészített Luria Bertuni tápközeget tartalmaznak. Az előrázott lombikokat 5 óra hosszáig tenyésztjük 28 °C-on. 50 ml tenyészetet használunk 2 literes fermentortank beoltására. Az alaptápközeg 0,3% dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,2% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2% magnézium-szulfátot, 0,05% ammónium-szulfátot, 0,003% vas(ll)-szulfátot, 0,001% mangán-szulfátot, 0,3% élesztőkivonatot és 30 g/ml kanamicint tartalmaz. A pH=6,8-7,2 volt. A fermentortankokat pH-szabályozott tápanyag-adagolással futtatjuk. A fermentorokat 20% NZ-aminnal, 20% glükózzal és kanamicinnel egészítjük ki. A fermentortenyészetet 44 óra hosszáig tenyésztjük 30 °C-on, nagymértékű levegőztetéssel.

4. példa

E. coliból származó G-penicillin-aciláz izolálása és immobilizálása

A teljes fermentlevet mikrofluidizáljuk a sejtek feltárása céljából. 10% Celitet és 0,2-0,25% PEl-t adagolunk hozzá a fermentlé tisztázása céljából. A keveréket egy óra hosszáig kevertetjük, szűrjük és azonos térfogatú vízzel mossuk, így tiszta fermentléhez jutunk. A tiszta fermentlevet ultraszűrjük 30 000 MWCOmembránon, eredeti térfogatának 5%-áig.

(1) Immobilizálás UOP-alumlnium-gyöngyökhöz

Az ultraszűrt fermentlevet UOP-gyöngyökkel rázatjuk egy éjszakán át 10 °C-on. A gyöngyöket vízzel mossuk és 4 °C-on tároljuk.

(2) Immobilizálás Diacalite-hez

4% Triton Χ-100-at, 5% Biocrylt és 30%-ig izopropilalkoholt adunk az ultraszűrt fermentléhez, és az elegyet 1 óra hosszáig kevertetjük és leszűrjük. A szűrlethez 1% „Speedplus-t adunk, és 50% PEG-et adunk 15% végkoncentrációig, és a keveréket 15 percig kevertetjük, és 50% glutáraldehidet adunk hozzá 0,4% végkoncentrációban. Az immobilizálás lefolyására 15 percet hagyunk szobahőmérsékleten. Az enzimet leszűrjük, és vízzel mossuk, ameddig a mosófolyadék színtelen lesz. ApH-t7,2 és 7,6 között tartjuk az eljárás alatt.

5. példa

Vizsgálati eljárás G-penicillin-aciláz hidrolitikus aktivitásának meghatározására (1) Vizsgálati eljárás a kereskedelemben kapható szubsztrát, a 6-nitro-3-(fenil-acetamido)-benzoesav alkalmazásával:

μΙ sejttenyészetből vett mintát adunk 96 mérőhelyet tartalmazó mikrotitertálca mérőhelyeire, amelyek

HU 226 348 Β1

0,1% szubsztrátot tartalmaznak 0,2 M kálium-foszfátpufferben, melynek pH-ja 7,4. A reakciót spektrofotometriásán követjük.

(2) Vizsgálati eljárás p-(dimetll-amino)-benzaldehid (p-DAB) alkalmazásával:

ml sejttenyészetből vett mintát szonikálunk, és 1 ml 4,5% G-penicillin-káliumsót adunk hozzá 200 mM kálium-foszfát-pufferben (pH=7,5). 15 percig rázatva inkubáljuk 37 °C-on. 1 ml, 99,0% acetonitrilt és 1,0% ecetsavat adunk hozzá. Összekeverjük és lecentrifugáljuk. 1 ml felülúszóhoz adunk 3 ml p-DAB-reagenst. (A p-DAB-reagens elkészítése: 1 rész 10 mg/ml p-DAB-ot és 6 rész nátrium-acetát-puffert összekeverünk.) 4 percig inkubáljuk és 415 nm-en leolvassuk. lU/ml-t számítunk 100 pg/ml 6-APA-ra kapott, standard faktor alkalmazásával.

6. példa

G-penicillin-aciláz szintetikus aktivitásának meghatározása (1) Cefadroxil

10,5 g p-hidroxi-fenil-glicin hidroxi-etil-sóját feloldjuk 37,5 ml vízben. pH-ját 8,0-re állítjuk ammónium-hidroxiddal. Hozzáadunk 4,8 g 7-ADCA-t (pH=7,5) és feloldjuk. pH-ját 7,0-re állítjuk 6 M sósavval. Térfogatát kiegészítjük 60 ml-re. A reakciókeveréket elosztjuk 12 egyenlő részre, egyenként 5-5 ml-re. Hozzáadunk immobilizált G-penicillin-acilázt 40 lU/ml végkoncentrá10 cióban. Meghatározott időnként aliquotokat veszünk HPLC vizsgálati eljáráshoz.

(2) Cefprozilszintézis

4.5 g észtersót adunk 60 ml vízhez, pH-ját 8,26-ra állítjuk. Hozzáadunk 3,6 g 7-PACA-t. Hozzáadunk 1,72 ml ammónium-hidroxidot, hogy pH-ját 8,26-ra állítsuk. Hozzáadunk 4,5 g észtert, pH-ját 7,56-ra állítjuk. A reakciókeveréket elosztjuk 12 egyenlő részre. Hozzáadunk immobilizált G-penicillin-acilázt 40 lU/ml végkoncentrációban. Meghatározott időnként aliquotokat veszünk HPLC vizsgálati eljáráshoz.

(3) Amoxicillin vizsgálati eljárás

3.5 g észtersót adunk 12,5 ml vízhez. pH-ját 8,0-re állítjuk ammónium-hidroxiddal. Hozzáadunk 1,6 g 6-APA-t, feloldjuk, és pH-ját 7,0-re állítjuk. Térfogatát kiegészítjük 20 ml-re. A reakciókeveréket elosztjuk 4 egyenlő, 5 ml-es részre. Hozzáadunk immobilizált G-penicillin-acilázt 40 lU/ml végkoncentrációban. Meghatározott időnként aliquotokat veszünk HPLC vizsgálati eljáráshoz.

(4) HPLC vizsgálati eljárás

A mintákat az alábbiak szerint kezeljük:

200 μΙ mintához hozzáadunk 1 ml, 20 mM KP-puffert, melynek pH-ja 7,4, centrifugáljuk, és 200 μΙ felülúszót veszünk ki HPLC-csövekbe. 800 μΙ puffért adunk hozzá, és 10 μΙ-t injektálunk a vizsgálati eljáráshoz. Az egyes reakciónál alkalmazott HPLC vizsgálati eljárásokat bemutatjuk az 1. táblázatban.

1. táblázat β-Laktámantibiotikumok szintézisére szolgáló, enzimes reakciókeverékek összetételének analízisére alkalmazott HPLC-eljárások

Antibiotikum	Oszlop	Oldószer
Cefprozil és amoxicillin	Micro-Bondapak-C-18, 30 cm*0,25 inch, Waters Associates	0,1 N kálium-hidroxid 0,00693 M tetrabutil-ammónium-hidroxid 10% metanol, pH=7,0
Cefprozil	Phenomex Phenosphere ODS 5 mikron, 4,6 mm*5,0 cm	24% acetonitril 0,16% KH₂PO₄, 0,2% NaSDS pH=2,6

Azt találtuk, hogy a mutáns G-penicillin-aciláz alkal- 45 mazásával, amelyben alanint szubsztituáltunk fenil-alaninra a béta-alegység 24. helyzetében, β-laktámantibiotikumok kiváló szintézisét értük el, bár a hidrolitikus aktivitás 25%-át mutatta. Ezt a mutáns G-penicillin-acilázt F1-nek jelöltük. Az eredményeket a 2-12. tábláza- 50 tokban mutatjuk be.

2. táblázat

Vad típusú és mutáns G-penicillin-acilázokkal elérhető szintézis és hidrolízis

Mutáns	Hidrolízis	Szintézis
Vad típus	100%	100%
Met142-Ala	10%	0%

Mutáns	Hidrolízis	Szintézis
Val56-Thr	4%	127%
Phe146-Ala	5%	0%
Phe24-Ala	25%	330%
Phe24-Val	36%	3%
Phe24-Leu	80%	229%

ml tenyészetet oltunk 30 pg/ml kanamicint tartalmazó Luria-Bertaini-féle tápközegbe, és egy éjszakán át rázatjuk 28 °C-on. A tenyészeteket 800 pm IPTG-vel indukáljuk 4 óra hosszáig. A sejteket 10-ére töményítjük és szonikáljuk.

A hidrolízis mértékét mikrotitertálcás vizsgálati eljárás alkalmazásával határozzuk meg. A szubsztrát

HU 226 348 Β1

0,1% nitro-(fenil-acetamido)-benzoesav 0-0,2 M kálium-foszfát-pufferben. Az adatokat a vad típusra vonatkoztatott %-ban fejezzük ki.

A szintézis mértékét a képződött cefadroxil mennyisége alapján határozzuk meg 4 óra inkubálás után hidroxi-etil-észterrel és 7-ADCA-val. A vizsgálati eljárást HPLC-vel végezzük. Az aktivitást a vad típusra vonatkoztatott %-ban fejezzük ki.

3. táblázat

G-penicillin-aciláz béta-24. helyzetét (fenil-alanin) szubsztituáljuk valamennyi lehetséges aminosawal. Analizáljuk a szintetikus és hidrolitikus aktivitást valamennyi konstrukció esetén három külön kísérletben. Az átlagolt adatokat az alábbiakban soroljuk fel.

Aminosavcsere	Hidrolízis	Szintézis
Alanin	22%	330%
Valin	36%	3%
Leucin	80%	227%
Aszparaginsav	10%	4%
Hisztidin	7%	6%
Lizin	5%	0%
Metionin	7%	0%
Prolin	8%	31%
Szerin	39%	23%
Tirozin	2%	0%
Arginin	7%	4%
Aszparagin	8%	6%
Glutaminsav	7%	0%
Glutamin	3%	28%
Izoleucin	8%	4%
Treonin	20%	6%
Triptofán	9%	9%
Glicin	27%	19%
Cisztein	26%	0%
Alanin+Val(B)56-Thr	0%	0%
Leucin+Val(B)56-Thr	6%	0%

4. táblázat

A hőmérséklet hatása cefprozil szintézishozamára

A reakciót pH=7,5-en végezzük, az észter 2,3-szeres moláris feleslegében 7-PACA-ra vonatkoztatva.

A 7-PACA cefprozillá való 120 perc alatti, százalékos konverzióját közöljük.

Hőmérséklet	Vad típusú PGA	F1-mutáns PGA
37 ’C	80%	99%
Szobahőmérséklet	85%	98%
10 ’C	90%	100%

5. táblázat

A hőmérséklet hatása cefadroxil szintézishozamára A reakciót pH=7,0-en végezzük, az észter 1,9-szeres moláris feleslegében 7-ADCA-ra vonatkoztatva.

A 7-ADCA cefadroxillá való 120 perc alatti, százalékos konverzióját közöljük.

Hőmérséklet	Vad típusú PGA	F1-mutáns PGA
37 ’C	79%	95%
Szobahőmérséklet	86%	91%
10’C	83%	95%

6. táblázat

Enzimkoncentrációk hatása cefprozil szintézishozamára

A reakciót pH=7,5-en, szobahőmérsékleten végezzük az észter 2,3-szeres moláris feleslegében 7-PACA-ra vonatkoztatva.

Immobilizált enzim mennyisége (g)	Vad típusú PGA	F1-mutáns PGA
0,4 g	88%	100%
0,2 g	90%	100%
0,1 g	90%	98%

7. táblázat

Enzimkoncentrációk hatása cefadroxil szintézishozamára

A reakciót pH=7,0-en, szobahőmérsékleten végezzük az észter 1,9-szeres moláris feleslegében 7-ADCA-ra vonatkoztatva.

Immobilizált enzim mennyisége (g)	Vad típusú PGA	F1-mutáns PGA
0,7 g	89%	95%
0,35 g	81%	97%
0,175 g	79%	97%

8. táblázat

Az acildonor-koncentráció hatása cefprozil szintézishozamára

A reakciót pH=6,5-en, szobahőmérsékleten végezzük úgy, hogy 0,2 g immobilizált enzimet adunk a reakciókhoz.

Észter/7-PACA moláris aránya	Vad típusú PGA	F1-mutáns PGA
2,3	91%	100%
1,5	86%	99%

HU 226 348 Β1

8. táblázat (folytatás)

Észter/7-PACA moláris aránya	Vad típusú PGA	F1-mutáns PGA
1,45	83%	99%
1,38	83%	99%
1,3	85%	99%
1,2	80%	96%

9. táblázat

Az acildonor-koncentráció hatása cefadroxil szintézishozamára

A reakciót pH=7,0-en, szobahőmérsékleten végezzük úgy, hogy 0,2 g immobilizált enzimet adunk a reakciókhoz.

Észter/7-ADCA moláris aránya	Vad típusú PGA	F1-mutáns PGA
1,89	81%	96%
1,63	73%	90%

10. táblázat

Amoxicillin félszintézise vad típusú és mutáns G-penicillin-acilázzal

Vad típusú PGA	F1 PGA
Megmaradt 6-APA (%)	Megmaradt észter (%)	Megmaradt 6-APA (%)	Megmaradt észter (%)
58	62	52	58
30	27	12	4
20	17	9	1

11. táblázat

Cefprozil félszintézisének optimalizált körülményei

Hőmérséklet	Szobahőmérséklet
pH	6,5
Észterkoncentráció	1,2-1,3 moláris felesleg
Enzimkoncentráció	0,2 g 5 ml térfogatban

12. táblázat

Cefadroxil félszintézisének optimalizált körülményei

Hőmérséklet	Szobahőmérséklet
pH	7,0
Észterkoncentráció	1,89 moláris felesleg
Enzimkoncentráció	0,2 g 5 ml térfogatban

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. Mutáns II típusú E. coli G-penicillin-aciláz, amelyben a mutáció a B24 helyzetben levő Phe aminosavcseréje Ala-ra vagy Leu-ra.

2. Az 1. igénypont szerinti mutáns aciláz, amelyben az alfa-alegység N-terminális vége 1 vagy 2 aminosavval rövidített; az alfa-alegység C-terminális vége 10-15 aminosawal rövidített; vagy mind az alfa-alegység N-terminális vége 1 vagy 2 aminosawal rövidített, mind az alfa-alegység C-terminális vége 10-15 aminosawal rövidített; és az illető rövidítés a II típusú E. coli G-penicillin-aciláz E. coliban végbemenő poszttranszlációs feldolgozásával kapható.

3. A 2. igénypont szerinti mutáns aciláz, amelyben az alfa-alegység C-terminális vége 12 vagy 13 aminosawal rövidített.

4. Nukleinsavszekvencia, amely az 1. igénypont szerinti mutáns acilázt kódol.

5. A 4. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, amely a 2. vagy 3. igénypont szerinti mutáns acilázt kódol.

6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, amely DNS.

7. Expressziós vektor, amely egy 4. vagy 5. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolódva egy olyan promoterszekvenciához, amely képes expresszióját vezérelni egy gazdasejtben.

8. Gazdasejt, amely a 7. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmaz.

9. Eljárás mutáns G-penicillin-aciláz előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 8. igénypont szerinti gazdasejtet a mutáns aciláz termelésére alkalmas körülmények között tenyésztünk.

10. Eljárás egy 6-acilezett penicillánsav, 7-acilezett cefalosporánsav, 7-acilezett cefalosporánsavszármazék vagy ezek sója vagy észtere közül választható félszintetikus β-laktámantibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő 6- vagy 7-amino-6-laktámot vagy sóját vagy észterét és egy acilező ágenst érintkezésbe hozunk egy 1-3. igénypontok bármelyike szerinti mutáns acilázzal az acilezés végbemeneteléhez alkalmas körülmények között.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immobilizált mutáns acilázt alkalmazunk.

12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy acilező ágensként p-hidroxi-fenil-glicint vagy észterét vagy amidját alkalmazzuk.

13. A 10. igénypont szerinti eljárás egy félszintetikus 7-acilezett cefalosporánsav, 7-acilezett cefalosporánsavszármazék vagy sója vagy észtere előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő 7-amino-cefalosporánsavat, 7-amino-cefalosporánsav-származékot vagy sóját vagy észterét és egy acilező ágenst érintkezésbe hozunk egy 1-3. igénypontok bármelyike szerinti mutáns acilázzal az acilezés végbemeneteléhez alkalmas körülmények között.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás egy félszintetikus 7-acilezett cefalosporánsav vagy sója vagy észtere

HU 226 348 Β1 előállítására, azzal jellemezve, hogy 7-ACA-t vagy sóját vagy észterét és egy acilező ágenst érintkezésbe hozunk egy 1-3. igénypontok bármelyike szerinti mutáns acilázzal az acilezés végbemeneteléhez alkalmas körülmények között.

15. A 13. igénypont szerinti eljárás cefadroxil előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő 7-amino-cefalosporánsav-származékként 7-ADCA-t és acilező ágensként egy p-hidroxi-fenil-glicin-észtert vagy -amidot alkalmazunk.

16. A 13. igénypont szerinti eljárás cefprozil előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő 7-amino-cefalosporánsav-származékként 7-PACA-t és acilező ágensként egy p-hidroxi-fenil-glicin-észtert vagy -amidot alkalmazunk.

17. A 10. igénypont szerinti eljárás egy félszintetikus 6-acilezett penicillánsav vagy sója vagy észtere előállítására, azzal jellemezve, hogy 6-APA-t vagy egy sóját vagy észterét és egy acilező ágenst érintkezésbe hozunk egy 1-3. igénypontok bármelyike szerinti mutáns acilázzal az acilezés végbemeneteléhez alkalmas körülmények között.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy félszintetikus 6-acilezett penicillánsavként amoxicillint állítunk elő.

19. Eljárás egy 6-acilezett penicillánsav, 7-acilezett cefalosporánsav, 7-acilezett cefalosporánsavszármazék vagy ezek sója vagy észtere dezacilezésére a megfelelő 6-amino-penicillánsawá, 7-amino-cefalosporánsavvá, 7-amino-cefalosporánsav-származékká vagy ezek sójává vagy észterévé, azzal jellemezve, hogy a megfelelő 6- vagy 7-acilezett vegyületet egy 1-3. igénypontok bármelyike szerinti mutáns acilázzal hozzuk érintkezésbe a dezacilezés végbemeneteléhez alkalmas körülmények között.

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 6- vagy 7-acilezett vegyületként egy 6-(fenil-acetil)-penicillánsavat, egy 7-(fenil-acetil)-cefalosporánsavat, egy 7-(fenil-acetil)-cefalosporánsavszármazékot vagy ezek sóját vagy észterét alkalmazzuk.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 6-(fenil-acetil)-penicillánsavként G-penicillint alkalmazunk.