PT638649E

PT638649E - Nova utilizacao de penicilina g acilase de alcaligenes faecalis

Info

Publication number: PT638649E
Application number: PT638649T
Authority: PT
Inventors: Erik De Vroom; Margaretha Van Der Mey
Original assignee: Dsm Nv
Priority date: 1993-08-05
Filing date: 1994-08-05
Publication date: 2000-04-28
Also published as: ATE186746T1; EP0638649A3; EP0638649B1; DE69421653D1; EP0638649A2; ES2141796T3

Description

éiS Gk°> V 1 Γ

DESCRIÇÃO "NOVA UTILIZAÇÃO DE PENICILINA G ACILASE DE ALCALI GENES FAECALIS" Área técnica A presente invenção relaciona-se com a utilização de penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis para a hidrólise da cadeia lateral acetilo opcionalmente substituída por fenilo ou heterociclo de alguns ácidos penicilânicos e cefalosporânicos e seus derivados.

Antecedentes e literatura relevante A penicilina G acilase (benzilpenicilina amidohidrolase, também designada por penicilina amidase; EC 3.5.1.11) é uma enzima utilizada comercialmente para hidrolizar penicilina G ou 3'-desacetoxicefalosporina G a ácido fenil acético e ácido 6-aminopenicilânico (6-APA) ou ácido 7-aminodesacetoxi-cefalosporânico (7-ADCA), respectivamente, os mais importantes intermediários para a produção industrial de penicilinas e cefalosporinas semi-sintéticas· Esta enzima também catalisa a reacção inversa, viz. a N-acilação de 6-APA e 7-ADCA com ésteres orgânicos para produzir os seus correspondentes compostos penicilina e 3-cefem N-acetilados. Ver os artigos de revisão de Vandamme, E. J., em: Microbial Enzymes and Bioconversions, E. H. Rose (Ed.), Economic Microbiology 5, 467-552 (1980); e P. B. Mahajan, Appl. Biochem. Biotechnol. 1, 83-86 (1982).

Na NL-7502291, DE-2458746, NL-7414302, NL-7416549, NL-7117696 e DE-3316796 foi descrita a desacilação de cefalosporinas com substituintes na posição 3", viz. um grupo 1 Γ

U -CH2 substituído. Contudo, os rendimentos referidos não são superiores a 92%. A actividade de desacilação de penicilina acilase de E. coli, aplicada a uma forma oxidada de benzilpenicilina, foi descrita em Tetrah. Lett. 29 (36), 4623-4624 (1988). Contudo, é referida uma protecção especial do grupo carboxi. Em J. Antibiotics 31 (8), 783-788 (1978) foi referido que os (S)sulfóxidos e a sulfona de benzilpenicilina não eram hidrolizados pela preparação de enzima de E. coli (penicilina G acilase). G. Álvaro et ai. (Enzyme Microb. Technol. 13, 210-214 (1991) descrevem a aplicação da referida inércia de sulfóxido de penicilina G em relação a ambas penicilina G acilase de Escherichia coli e de Kluyveromyces citrophila pela sua utilização como agente estabilizante na imobilização de penicilina G acilase.

Na EP-A-0453047 foi descrita uma nova penicilina G acilase originária de Alcaligenes faecalis.

Para além da boa estabilidade e actividade altamente específica da referida penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis, nunca foi referida ou sugerida a sua actividade enzimática sobre penicilinas com o carboxilo não protegido, com cadeias laterais G opcionalmente substituídas na posição 6, e cefalosporinas com cadeias laterais G opcionalmente substituídas na posição 7 e cadeias laterais 3-metilo opcionalmente substituídas.

Além disso, apesar do artigo em J. Antibiotics citado acima, verificou-se que, surpreendentemente, a enzima penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis pode ser aplicada para desacilar compostos penam e cefem S-oxidados bem como sulfonas. 2

Sumário da invenção A presente invenção proporciona a utilização de penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis para a desacilação da cadeia lateral em 6 ou 7 de, respectivamente, compostos penam ou cefem de fórmula (I):

COOH (I) em que

Rl é hidrogénio, hidroxilo, amina, halogéneo ou alquilo inferior; R2 é um fenilo opcionalmente substituído ou um anel heterociclico com 5 ou 6 membros;

Y é em que R3'é alcilideno inferior; e X é hidrogénio, halogéneo ou alcoxi inferior ou metilo opcionalmente substituído; n é 1 ou 2.

Formas de realização específicas A estirpe de Alcaligenes faecalis produtora de penicilina G acilase foi isolada tal como descrito na EP-A-0453047. A actividade de acilase é independente dos substituintes na posição 3 dos compostos cefem. Estes substituintes são, por 3 r \ι exemplo, hidrogénio, halogéneo, alcoxi inferior, metilo ou metilo substituído com, por exemplo, alcoxi inferior, alquil(inferior)tio, alcanoll(inferior)oxi, alcanoil(inferior)-tio, halogéneo ou S-R4, em que R4 é um anel heterociclico opcionalmente subtituldo.

Por inferior ao longo deste pedido entende-se 1-6 átomos de carbono. A reacção de desacilação é realizada com compostos penam e cefem, tendo cadeias laterais amino nas posições 6 e 7, respectivamente, substituídas com um fenilo opcionalmente substituído ou um anel heterociclico com 5 ou 6 membros. Os substituintes são, por exemplo, halogéneo, alcoxi inferior, metilo ou amina.

Um anel heterociclico é definido ao longo deste pedido como uma estrutura anelar insaturada compreendendo pelo menos um átomo de azoto, enxofre ou oxigénio, como por exemplo 2-tienilo. A reacção de desacilação pode ser realizada a 20-50°C, mais preferencialmente a 25-40°C, a um pH de 5-9, preferencialmente cerca de 7. O pH da mistura reaccional é levado a este valor pela adição de uma solução básica, preferencialmente compreendendo um hidróxido de metal alcalino (terroso) ou amoníaco.

Nalguns casos é preferível extrair o produto das soluções obtidas com um solvente orgânico inerte, preferencialmente 1-butanol, acetato de etilo, acetato de butilo, metil isobutil cetona ou tolueno a um pH de 0,1-2. A mistura reaccional é acidificada por utilização de uma solução concentrada de ácido inorgânico, por exemplo, cloreto de hidrogénio, brometo de hidrogénio ou ácido sulfúrico. Em seguida a fase orgânica é reextraida com água. O pH das camadas aquosas combinadas é levado a cerca de 3 com uma solução básica concentrada, 4 Γ

resultando na formação de uma suspensão contendo cristais brancos. A referida suspensão é agitada durante cerca de meia hora até duas horas, a 0-5°C, preferencialmente a 0-2°C. Após filtração, lavagem e secagem os cristais são isolados, com um rendimento de > ± 75%, mas na maior parte dos casos > 90%. Os compostos hidrolizados são obtidos com rendimentos elevados com purezas elevadas.

Preferencialmente, em processos industriais a penicilina G acilase é utilizada na forma imobilizada. O suporte sobre o qual é imobilizada tipicamente compreende gelatina opcionalmente com quitosana, óxido de alumínio, óxido de silício., resinas de troca iónica ou pérolas de acrilato, tais como, por exemplo, EUPERGIT®.

Os seguintes exemplos são apresentados apenas a titulo ilustrativo.

Exemplo 1

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo de 1,1-dióxido do ácido 6p-fenilacetamidopenicilânico

Uma suspensão de 46,0 g (126 mmoles) de 1,1-dióxido do ácido 6P-fenilacetamidopenicilânico em 200 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (63 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 630 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 5 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 174 mL de uma solução 1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução vermelha limpida assim obtida indicou a presença de 16,4 g (66,1 mmoles, 52,5%) de 1,1-dióxido de ácido 6p-aminopenicilânico e 13,5 g (99,2 mmoles, 78,7%) de ácido fenilacético. 5 t Γ

Exemplo 2

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo de Ιβ-óxido do ácido 6p-fenilacetamidopenicilânico

Uma suspensão de 774 mg (2,21 mmoles) de Ιβ-óxido do ácido 6β-£βηΐΐ3θβΐ3πιϊάορβηϊσϊ^ηϊοο em 22 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,2 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 44 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 4 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 22,3 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução límpida assim obtida indicou a presença de 300 mg (2,20 mmoles, 99,6%) de ácido fenilacético.

Exemplo 3

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo de Ιβ-óxido do ácido 7β-fenilacetamidodesacetoxicefalosporânico

Uma suspensão de 704 mg (2,02 mmoles) de Ιβ-óxido do ácido 7β-fenilacetamidodesacetoxicefalosporânico em 20 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 40 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 3 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 22,1 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução límpida assim obtida indicou a presença de 274 mg (2,01 mmoles, 99,5%) de ácido fenilacético. 6

Exemplo 4

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo de la-óxido do ácido 7p-fenilacetamidodesacetoxicefalosporânico

Uma suspensão de 696 mg (2,00 mmoles) de Ια-óxido do ácido 7p-fenilacetamidodesacetoxicefalosporânico em 20 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 40 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 3 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 15,1 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução ligeiramente turva assim obtida indicou a presença de 268 mg (1,97 mmoles, 98,5%) de ácido fenilacético.

Exemplo 5

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo do ácido 7β-fenilacetamido-3'-metilenodesacetoxicefalosporânico

Uma suspensão de 13,8 g (40,1 mmoles) de ácido 7β-fenilacetamido-3'-metilenodesacetoxicefalosporânico em 400 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (20 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 200 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 3 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 39,8 mL de uma solução 1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução límpida assim obtida indicou a presença de 8,76 g (38,7 mmoles, 96,4%) de ácido 7β- amino-3'-metilenodesacetoxicefalosporânico e 5,41 g (39,7 mmoles, 99,0%) de ácido fenilacético. Adiciona-se água à solução 7

aquosa para obter um volume final de 8 00 mL e esta solução é extraída com 160 mL de 1-butanól frio (5°C). Após separação da fase orgânica, a fase aquosa é adicionada a 5°C a 160 mL de 1-butanol saturado com água. Durante o procedimento acima o pH do sistema de duas fases resultante é mantido a 0,4 pela adição de uma solução 6 M de HC1 em água. Após separação da fase orgânica, a fase aquosa é lavada com 2 x 80 mL de 1-butanol saturado com água. As camadas orgânicas combinadas são reextraldas com 80 mL de água. A 10°C, as fases aquosas combinadas são lentamente adicionadas a 40 mL de água enquanto se mantém o pH da solução resultante a 3,0 com uma solução 4 M de NaOH em água. Durante este procedimento, formam-se cristais brancos. A suspensão assim obtida é agitada durante lha 0-2°C e o produto é recolhido por filtração e lavado com 80 mL de água e 80 mL de acetona. Após secagem durante 24 h a 30°C Sob vácuo, obtém-se 9,22 g de produto. A análise por Ifí rmn indicou que o teor de produto era 93%. O rendimento é portanto de 94,5%.

Exemplo 6

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo do ácido 7β-fenilacetamido-3'-etilidenodesacetoxicefalosporânico

Uma suspensão de 7,17 g (20,0 mmoles) de ácido 7β-fenilacetamido-3'-etilidenodesacetoxicefalosporânico em 200 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (10 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 100 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 10 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 18,8 mL de uma solução 1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução limpida assim obtida indicou a presença de 4,33 g (18,0 mmoles, 90,0%) de ácido 7β-3πιΐηο-3'-β^ϋάβηοάβ33θβ^χιαβί3ΐθ3ρο^ηίσο e 2,51 g (18,4 mmoles, 92,0%) de ácido fenilacético. A solução aquosa é 8

I ι (p ^ ^ extraída com 40 mL de 1-butanol frio (5°C). Após separação da fase orgânica, a fase aquosa é adicionada a 5°C a 40 mL de 1-butanol saturado com água. Durante o procedimento acima, o pH do sistema de duas fases resultante é mantido a 0,8 pela adição de uma solução 6 M de HC1 em água. Após separação da fase orgânica, a fase aquosa é lavada com 20 mL de 1-butanol saturado com água. A 10°C, a fase aquosa é lentamente adicionada a 10 mL de água enquanto se mantém o pH da solução resultante a 3,0 com uma solução 4 M de NaOH em água. Durante este procedimento, formam-se cristais brancos. A suspensão assim obtida é agitada durante 1 h a 0-2°C e o produto é recolhido por filtração e lavado com 20 mL de água e 20 mL de acetona. Após secagem durante 24 h a 30°C sob vácuo, obtém-se 4,47 g de produto. A análise por *Η RMN indicou que o teor de produto era 91,2%. O rendimento é portanto de 84,8%.

Exemplo 7

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo do ácido 7β-fenilacetamido-3'-nordesacetoxicefalosporânico

Uma suspensão de 637 mg (2,00 mmoles) de ácido 7β-fenilacetamido-3'-nordesacetoxicefalosporânico em 20 mL de água é levada a 32°C. e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,5 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 100 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 1,5 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 19,6 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se 1 g de penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada e continua-se a agitação durante mais 2 h. A quantidade total de NaOH 0,1 M consumida é de 21,1 mL. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração e lavada com 2 x 1 mL de água. O filtrado combinado é lavado com 5 mL de 1-butanol e a camada de 1-butanol é extraída com 2 x 1,5 mL de água. As camadas aquosas combinadas 9 p' ^—t são adicionadas a 20°C a 7,5 mL de 1-butanol saturado com água. Durante o procedimento acima, o pH do sistema de duas fases resultante é mantido a 1,0 pela adição de uma solução 1 M de HC1 em água. Após separação das fases, a fase de 1-butanol é extraída com 2 x 1,2 mL de água a pH 1,0. 0 pH das fases aquosas combinadas é elevado para 3,0 com uma solução 4 M de NaOH em água. A solução é concentrada por evaporação repetida com 1-butanol e o resíduo é seco a pressão reduzida e suspenso em acetona. O material não dissolvido foi obtido por filtração para dar, após secagem, 535 mg de material que foi triturado a 0°C com uma mistura de acetona/água (65/35, v/v) e suspenso em metanol. O composto desejado (85 mg) foi obtido por filtração e lavado com éter. Espectroscopia no IV e de RMN indicou que o composto era idêntico a uma amostra autêntica preparada por desacilação química.

Exemplo 8

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo do ácido 7β-fenilacetamido-3-metilenocefam-4p-carboxIlico

Uma suspensão de 1,01 g (2,59 mmoles) de ácido 7β-fenilacetamido-3-metilenocefam-4p-carboxílico em 26 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,6 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 50 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 3 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 2 8,1 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução límpida assim obtida indicou a presença de 525 mg (2,45 mmoles, 94,6%) de ácido 7β-amino-3-metilenocefam-4β-carboxílico e 335 mg (2,46 mmoles, 95,0%) de ácido fenilacético. 10

Exemplo 9

Hidrólise enzimática da cadeia lateral D-a-aminofenilacetilo do ácido 6β-(D-a-aminofenilacetamido)penicilânico (ampicilina)

Uma suspensão de 698 mg (2,00 mmoles) de ácido 6β-(D-a-aminof enilacetamido )penicilânico em 20 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 4 0 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 20 min enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 6,90 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução limpida assim obtida indicou a presença de 320 mg (1,48 mmoles, 74,0%) de ácido 6β- aminopenicilânico e 248 mg (1,64 mmoles, 82,0%) de fenilglicina. Exemplo 10

Hidrólise enzimática da cadeia lateral D-a-aminofenilacetilo do ácido 7β-(D-a-aminofenilacetamido)desacetoxicefalosporânico (cefalexina)

Uma suspensão de 700 mg (2,02 mmoles) de ácido 7β-(D-a-aminof enilacetamido) desacetoxicef alosporânico em 20 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 40 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 20 min enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 6,16 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução limpida assim obtida indicou a presença de 401 mg (1,87 mmoles, 92,6%) 11 Γ de ácido 7p-aminocefalosporânico e 295 mg (1,95 mmoles, 96,5%) de fenilglicina.

Exemplo 11

Hidrólise enzimática da cadeia lateral D-a-amino-p-hidroxifenilacetilo do ácido 6β-(D-a-amino-p-hidroxifenil-acetamido)penicilânico (amoxicilina)

Uma suspensão de 731 mg (2,00 mmoles) de ácido 6β-(ϋ-α-amino-p-hidroxifenil-acetamido)penicilânico em 20 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 40 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 4 h enquanto se mantém o pH da solução a 7.5 com 15,5 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração. A análise por HPLC da solução limpida assim obtida indicou a presença de 407 mg (1,88 mmoles, 94,0%) de ácido 6β-3ΐηΐηορβηΐσϊ1§ηίσο.

Exemplo 12

Hidrólise enzimática da cadeia lateral α-bromofenilacetilo de Ιβ-óxido do ácido 7β-(α-bromofenilacetamido)desacetoxi-cefalosporânico

Uma suspensão de 855 mg (2,00 mmoles) de Ιβ-óxido do ácido 7β-(α^Γθΐηοίenilacetamido)desacetoxicefalosporânico em 20 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (2,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 40 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 24 h enquanto se mantém o pH da solução a

7.5 com 3 8,7 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A 12 penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração para dar uma solução limpida. A análise por HPLC desta solução indicou a presença de 288 mg (1,89 mmoles, 94,5%) de ácido mandélico. Após liofilização, a análise por 1H RMN do sólido branco assim obtido indicou a presença de 416 mg (1,81 mmoles, 90,5%) de Ιβ-óxido de ácido 7β- aminocefalosporânico.

Exemplo 13

Hidrólise enzimática da cadeia lateral D-a-hidroxifenilacetilo do sal monossódico do ácido 7β-(D-α-hidroxifenilacetamido)-3 [(l-sulfometiltetrazol-5-il)tio]desacetoxicefalosporânico

Uma solução de 559 mg (0,99 mmoles) de sal monossódico do ácido 7β-(ϋ-α-1ιίάΓθχΐίβηϋ3σβΐ3πιϊάο)-3 [ (1-sulfometiltetrazol- 5-il)tio]desacetoxicefalosporânico em 10 mL de água é levada a 32°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 0,1 M de NaOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (1,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com 20 mL de água) e a mistura é agitada a 32°C durante 1 h enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com 10,5 mL de uma solução 0,1 M de NaOH em água. A penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada é removida por filtração para dar uma solução límpida. A análise por HPLC desta solução indicou a presença de 146 mg (0,96 mmoles, 97,0%) de ácido mandélico.

Exemplo 14

Hidrólise enzimática da cadeia lateral α-clorofenilacetilo do ácido 6β-(α-clorofenilacetamido)penicilânico

Uma solução de 0,2062 g (0,41 mmoles; 16,6 mM) de ácido 6β- (α-clorofenilacetamido)penicilânico em 25 mL de água é levada a 34°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 97,29 13 |j u, ^^ mM de KOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalís imobilizada (1,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com água) e a mistura é agitada a 34°C durante 70 minutos enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com uma solução 97,29 mM de KOH em água. Após aproximadamente 30 minutos (0,49 mmoles de KOH adicionados à mistura reaccional) a velocidade de consumo de KOH atinge um valor constante, provocado pela formação de HC1 como resultado da hidrólise quimica do ácido a-clorofenilacético.

Exemplo 15

Hidrólise enzimática da cadeia lateral 2-tiofenoacetilo do ácido 6β-(2-tiofenoacetamido)penicilânico

Uma solução de 0,4089 g (1,01 mmoles; 40,2 mM) de sal de potássio do ácido 6β-(2-tiofenoacetamido)penicilânico em 25 mL de água é levada a 34°C e o pH ajustado para 7,5 pela adição de uma solução 97,29 mM de KOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis imobilizada (1,0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com água) e a mistura é agitada a 34°C enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com uma solução 97,29 mM de KOH em água até cessar o consumo de KOH. Este ponto é atingido após a adição de 1,01 mmoles de KOH.

Exemplo 16

Hidrólise enzimática da cadeia lateral fenilacetilo de 7β-fenilacetamido-3-cefem-4-carboxilato de 3-(4-carbamoíl-quinucli-din-l-il-metilo) uma solução de 0,049 g (0,07 mmoles; 2,66 mM) de 7β-fenilacetamido-3-cefem-4-carboxilato de 3-(4-carbamoil-quinu-clidin-l-il-metilo) em 25 mL de água é levada a 34°C e o pH ajustado para 7,5 por adição de uma solução 8,14 mM de KOH em água. Adiciona-se penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis 14 imobilizada (1/0 g, pesados após filtração e lavagem das pérolas com água) e a mistura é agitada a 34°C enquanto se mantém o pH da solução a 7,5 com uma solução 8,14 mM de KOH em água até cessar o consumo de KOH. Este ponto é atingido após a adição de 0,074 mmoles de KOH.

Lisboa, 31 de Janeiro de 2000

AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE LNDUSTRIAL

15

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis para o processo de hidrólise da cadeia lateral em 6 ou 7 de, respectivamente, os compostos penam ou cefem de fórmula (I):

COOH em que Rl é hidrogénio, hidroxilo, amina, halogéneo ou alquilo inferior com 1-6 átomos de carbono; R2 é um fenilo opcionalmente substituído ou um anel heterociclico com 5 ou 6 membros;

^^CHR3' , , ou em que R3'é alcilideno inferior com 1-6 átomos de carbono; e X é hidrogénio, halogéneo ou alcoxi inferior com 1-6 átomos de carbono ou metilo opcionalmente substituído; n é 1 ou 2.
2. Utilização de penicilina G acilase de Alcaligenes faecalis de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo processo de hidrólise de 1,1-dióxido do ácido 6β-fenilacetamidopenicilânico, Ιβ-óxido do ácido 6β- fenilacetamidopenicilânico, Ιβ-óxido do ácido 7β- fenilacetamidodesacetoxicefalosporânico, Ια-óxido do ácido 1 3. 7p-fenilacetamidodesacetoxicefalosporânico, Ιβ-óxido do ácido 7β-(α-bromofenilacetamido)desacetoxicefalosporânico. Processo para a produção de um composto penam ou cefem de acordo com a fórmula (II):

COOH (II) compreendendo a hidrólise da cadeia lateral em 6 ou 7 de, respectivamente, os compostos penam ou cefem de fórmula geral (I):

em que Ri,. R2, Y, R3', χ e n são como definidos na reivindicação 1, em que a referida hidrólise é realizada por penicilina G acilase de Alcaligenes faecalls. Lisboa, 31 de Janeiro de 2000 agente oficial da propriedade industrial 2